Summary
该方案介绍了腹动静脉瘘（AVF）小鼠出生后右心室容积超负荷（VO）模型的建立和确认，该模型可用于研究VO如何促进出生后心脏发育。
Abstract
右心室 （RV） 容量超负荷 （VO） 在先天性心脏病患儿中很常见。鉴于不同的发育阶段，与成人相比，儿童心室心肌对VO的反应可能不同。本研究旨在使用改良的腹动静脉瘘在小鼠中建立出生后 RV VO 模型。为了确认 VO 的产生以及 RV 的以下形态学和血流动力学变化，进行了为期 3 个月的腹部超声、超声心动图和组织化学染色。结果，在出生后小鼠中进行的手术显示出可接受的存活率和瘘管成功率。在VO小鼠中，RV腔增大，游离壁增厚，术后2个月内每搏输出量增加约30%-40%。此后右心室收缩压升高，观察到相应的肺动脉瓣反流，并出现小肺动脉重塑。综上所述，改良动静脉瘘（AVF）手术在出生后小鼠中建立RV VO模型是可行的。考虑到瘘管闭合和肺动脉阻力升高的概率，在应用前必须进行腹部超声和超声心动图以确认模型状态。
Introduction
右心室 （RV） 容量超负荷 （VO） 在先天性心脏病 （CHD） 患儿中很常见，可导致病理性心肌重塑和长期预后不良 1,2,3。深入了解左心室重塑和相关的早期靶向干预对于冠心病患儿的良好预后至关重要。成人和儿童心脏的分子结构、生理功能和对刺激的反应存在一些差异1,4,5,6。例如，在压力超负荷的影响下，心肌细胞增殖是新生儿心脏的主要反应，而纤维化发生在成人心脏中5,6。此外，许多治疗成人心力衰竭的有效药物对儿童心力衰竭没有治疗作用，甚至可能造成进一步的损害7,8。因此，从成年动物中得出的结论不能直接应用于幼年动物。
几十年来，动静脉瘘 （AVF） 模型已被用于在不同物种的成年动物中诱导慢性心脏 VO 和相应的心功能障碍 9,10,11,12,13。然而，人们对出生后小鼠的模型知之甚少。在我们之前的研究中，通过创建腹部 AVF 成功生成了 VO 出生后小鼠模型。出生后心脏中RV发育轨迹的变化也被证明是14,15,16,17。
为了探索本模型的基本改良手术过程和特点，提出了详细的方案;在这项研究中，该模型进行了为期 3 个月的评估。
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Protocol
本文介绍的所有程序均符合《赫尔辛基宣言》中概述的原则，并得到了上海儿童医学中心动物福利与人类研究委员会（SCMC-LAWEC-2023-003）的批准。本研究使用C57BL / 6小鼠幼崽（P7，雄性，3-4g）。这些动物是从商业来源获得的（见 材料表）。将小鼠幼崽及其哺乳母亲（幼崽：单个笼子中的母亲= 6：1）保持在无特定病原体的实验室条件下，在22±2°C下进行12小时光暗循环，自由获得水和营养饮食。幼崽被随机分为两组：VO组和假手术组。
1.设备和手术工具准备
注意： 所有材料/设备的商业细节都列在 材料表中。
- 确保以下类型的设备准备就绪并正常运行：手术台（泡沫塑料面板）、吸入麻醉机、带垂直照明和内置摄像头的显微镜、带有 24 MHz 换能器的超声设备和恒温加热平台。
- 对手术器械（即微针架、细尖镊子和圆柄 Vannas 弹簧剪刀）进行消毒。
- 组装以下耗材：带线的 11-0 和 9-0 手术缝合针（锥点）、胶带条、5 mL 注射器针头、2-0 丝（手术固定）、无菌棉签和超声凝胶。
- 确保存在以下试剂：甜菜碱、70% 乙醇、生理盐水、异氟醚、对乙酰氨基酚、眼膏和脱毛膏。
2. 外科手术
注：瘘管手术程序根据前面描述的方法11进行了修改。 图 1 显示了出生后小鼠中 AVF 操作的示意图。
- 麻醉和约束
- 将小鼠幼崽放入提供有2%异氟烷/氧气的麻醉诱导盒中2分钟，流量设置为1L / min。使用结核注射器给予对乙酰氨基酚（0.1 ml PO of 80 mg / 2.5 ml）。
- 将幼崽仰卧在手术台上，以0.8L / min的流量鼻腔吸入1.5%异氟醚以维持麻醉。通过将腿绑在固定的注射器针头上来调整幼犬的位置。将眼药膏涂抹在幼崽的眼睛上，以防止角膜干燥。
- 捏住麻醉幼犬的尾巴以检查其疼痛反应;没有明显的身体运动表明麻醉充分。
- 瘘管手术
- 用三次交替的betadine和70%乙醇磨砂膏对皮肤进行消毒，然后覆盖手术部位。从下腹部切开腹壁和腹膜到剑突下，使腹膜腔完全暴露，注意不要伤害腹部器官。滴入普通无菌生理盐水以润湿外化器官。
- 使用棉签轻轻将胃肠道和膀胱从手术部位拉开，以观察腹膜后下方的垂直腹主动脉 （AA） 和下腔静脉 （IVC）。将手术台逆时针旋转90°，并调整显微镜放大倍率，以清晰地观察两个水平容器。
- 用 11-0 缝合针（直径 = 0.07 mm）将瘘管从 AA 沿肾动脉远端 1 cm 的斜方向穿刺到 IVC 中。根据 IVC 中静脉血和动脉血的肿胀和混合来验证瘘管是否成功创建。
- 接下来，用干棉签施加适当的力快速压缩出血点 15 秒。尽快置换腹腔内的胃、肠、膀胱，促进止血压迫。
- 使用 9-0 缝合线用毯子缝合腹壁和腹膜。停止麻醉并为幼崽提供100%氧气1分钟。
- 麻醉复苏
- 将幼崽放在38°C的加热平台上。在充满活力地完全苏醒后，将幼崽送回哺乳期的母亲身边。整个过程持续约15分钟。
注意：在本研究中，假手术组除了穿刺步骤外，经历相同的程序。
- 将幼崽放在38°C的加热平台上。在充满活力地完全苏醒后，将幼崽送回哺乳期的母亲身边。整个过程持续约15分钟。
3.瘘管的超声确认
注：超声设备的一般操作与以前的报告相同 18,19。
- 通过腹部超声确认瘘管
- 诱导麻醉后（步骤2.1.1），用胶带将小鼠固定在温暖平台上的仰卧位置。然后，用超声凝胶将小鼠连接到心电图（ECG）监测器。使用 1.5% 异氟醚以 0.8 L/min 的流量维持麻醉。
- 使用脱毛膏准备胸部和腹部皮肤。几秒钟后，用温水浸泡的棉签去除乳霜。将换能器（24 MHz）放在腹中线上，并将换能器标记旋转到小鼠头部。
- 将平台向下移动到小鼠的左侧或右侧，并使用B模式和彩色多普勒模式来可视化血管和血液信号的长轴视图18,19。通过脉冲波多普勒模式测量 AA、IVC 和瘘管的血流速度以确认 AVF 通畅。
注：在AA和IVC之间可见的湍流信号表明超声上成功的瘘管形成（图2C）。与AA中相对较低的收缩速度相比，AVF部位的多普勒血流速度显着升高（图2A，C）。此外，与IVC中的正常血流模式（图2B）相比，AVF近端IVC血流的脉动波形也证实了瘘管的成功形成（图2D）。
- 通过超声心动图确认 VO
- 向下移动平台的尾部，将换能器（24 MHz）放在胸部，并将换能器标记旋转到小鼠的右肩。使用 B 模式和彩色多普勒模式可视化肺动脉 （PA） 的改良胸骨旁长轴视图。
- 使用脉冲波多普勒模式，测量 PA 中的血流信号，包括速度时间积分 （PA-VTI）、PA 瓣膜直径 （PAD）、肺动脉加速时间 （PAT） 和 RV 射血时间 （RVET）（图 2E、F 和图 3A、B）。
- 根据三次连续测量的平均值测量超声参数。使用以下公式20 计算 RV 每搏输出量（RVSV，mL）和 RV 收缩压（RVSP，mmHg）：
RVSV [mL] =1/4 ×πD2 × VTIPA
RVSP [mmHg] = -83.7 × PAT/RVET - 指数 + 63.7
注：考虑到超声测量偏差，与假手术组小鼠相比，VO小鼠的RVSV或VTIPA增加>15%被认为是RV中的VO（图2E，F）。
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Representative Results
3个月内的生存率和AVF通畅率
VO组共有30只（75%）小鼠和假手术组19只（95%）小鼠在AVF手术中存活（图4A）。在VO组中，8只小鼠在手术后1天内因出血过多（n = 5）或自相残杀（n = 3）而死亡，而2只小鼠在1个月时因不明原因死亡。
在存活的VO小鼠（n = 30）中，超声证实术后21只小鼠成功建立了瘘管，这些小鼠在术后1周（P14）时被证明是未闭的，并维持到术后2周（P21）。然而，7只小鼠的瘘管在1个月时闭合，2只小鼠在2个月时闭合。在3个月的随访中，只有12只小鼠有持续的AVF。术后1周、2周、1个月和2个月的AVF通畅率分别为70%、70%、46.7%和40%（图4B）。
右心血流动力学改变
血流动力学参数随访3个月，结果显示，两个月内各组小鼠PAD和RVSV均随年龄增长而升高（两组均n=6;图3B，E，F）。与假手术小鼠相比，VO组在术后2周内PA-VTI显著升高（图3D），但此后下降，PA流型随着PAT的降低而改变（图3A）。VO组RVSV持续2个月高于假手术组，增幅约为30%-40%。术后2个月，RVSP显著增加，伴有肺动脉瓣反流（图3C，G）。
右心和小肺动脉的形态学变化
在显微镜下，与AVF后的假手术组相比，RV显着扩大（图5A）。组织学染色显示VO小鼠的无RV壁增厚和RV腔增大（图5B）。根据RV血流动力学变化，术后2个月RVSP升高。随机选择手术后3个月的两组小鼠的肺组织进行苏木精和伊红（HE）染色，结果显示VO组的一些小肺动脉中膜增厚，内皮增生和外周炎性细胞浸润（图5C）。
图1：出生后小鼠AVF手术示意图 。 （A）手术器械。（B） AVF手术的程序。缩写：AVF = 动静脉瘘;IVC = 下腔静脉;AA = 腹主动脉。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：通过超声确认 AVF 瘘管和 VO。 （A） AA中的正常脉动流量信号（峰值流速：400 mm/s）。（B） IVC的正常血流信号。（C）瘘管处流速增加（内部带有黄色和绿色色调的红色血流信号表示瘘管处有湍流信号;收缩期峰值流速：900 mm/s）。（D） 随着流速的增加，瘘管附近的静脉输液中心发生脉动流动。（E） 术后 1 周 VO 小鼠的 PA-VTI 升高。（F） 手术后 1 周假小鼠的 PA-VTI（蓝色血流信号表示 PA 的血流）。缩写：AVF = 动静脉瘘;IVC = 下腔静脉;AA = 腹主动脉;PA = 肺动脉;VTI = 速度-时间积分。在多普勒彩色模式向换能器的流量用红色编码，远离换能器的流量用蓝色编码。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3：通过超声心动图得出的右心血流动力学测量值。 （A）VO小鼠各时间点的多普勒血流模式逐渐降低。 （B）PA参数的二维测量。（C） 彩色多普勒超声心动图显示 PA 反流。（D-F）术后 VO 小鼠每个时间点 PA-VTI、PAD 和 RVSV 的变化。（G）VO（黑色）和假（灰色）小鼠RVSP直方图显示AVF手术后2个月和3个月RVSP增加（6只VO小鼠;6只假小鼠;学生的t检验;*代表统计学意义）。缩写：P14 = 出生后第 14 天;P21 = 出生后第 21 天;PVR = 肺动脉瓣反流;RVSP = 右心室收缩压;M = 月;W = 周。图F改编自Sun等人，经许可14。请点击这里查看此图的较大版本.
图4：AVF手术后小鼠的存活率和瘘管通畅率。 （A）术后小鼠存活率（VO组n=40;假手术组n=20）。（B） VO 小鼠的瘘管通畅率 （n = 30）。 请点击这里查看此图的较大版本.
图5：右心的形态学变化 。 （A） AVF 手术后每个时间点 VO 小鼠的心脏扩大。（B）术后不同时间点的心脏HE染色显示无左心室壁增厚，右心室腔增大。（C）AVF后小鼠肺小动脉的组织病理学改变显示小肺动脉增生和肥大，并伴有炎症细胞浸润。比例尺：（A） = 5 mm;（B） = 2000 微米;（C） = 50 μm。 缩写：W = 周;M = 月。 请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
以前，经典的 RV VO 模型是使用瓣膜反流21 创建的;然而，与AVF相比，心内直视瓣膜手术可能需要更复杂的技术，并且可能与显着更高的死亡率有关，特别是在出生后小鼠中。由于动物研究表明，AVF22 已达到与 VO 相同的效果，因此本研究使用了创伤较小的改良腹瘘手术。
在成功建立瘘管的过程中考虑了某些因素。首先，该程序是在未进行气管插管和辅助通气的出生后小鼠中进行的;因此，根据幼崽的动态状况及时调整其麻醉设置对于避免因呼吸衰竭而死亡至关重要。其次，幼犬的胃和膀胱在手术过程中经常处于饱满状态。因此，为了充分暴露腹膜后血管结构，需要进行温和、精细的手术，以避免对脆弱的腹部器官造成伤害。第三，在幼崽中很难进行AA结扎以防止严重的动脉出血;因此，需要在穿刺后立即使用棉签进行止血加压。此后，腹膜后和腹部器官有可能对出血部位产生进一步的压迫。此外，有人指出，过度压迫可能导致早期瘘管衰竭。
由于与成人 RV VO 模型相比，手术创伤较小，出生后 VO 小鼠在术后早期表现出相对较高的围手术期存活率，但瘘管成功率较低11,23。除了严重出血外，蚕食没有经验的母亲是手术后幼崽死亡的主要原因。舒适安静的繁殖环境、紧闭腹部伤口、快速体温恢复、麻醉后幼崽完全苏醒，可以降低自相残杀的风险。既往对成年AVF小鼠模型的研究发现，AVF的形成有三个阶段：术后第0-1天快速血栓形成期，3周瘘管成熟期，最后在3-6周内几只小鼠成功产生AVF并重新封堵瘘管23。在这项研究中，出生后小鼠的瘘管通畅曲线也显示出相同的轨迹（即瘘管闭合主要发生在术后1周内或4-8周内，其余瘘管在3个月时保持开放）。因此，通过腹部超声确认术后2个月内出生后AVF小鼠瘘的通畅性至关重要。
RVSV 升高是 RV VO 的另一个重要证据，但瘘管通畅除外。目前，心导管插入术很难在低体重的年轻小鼠中实施。得益于其无创、操作相对简单、对同一只小鼠的连续监测等优点，本研究采用高频换能器超声心动图评估血流动力学变化。通过肺血流量VTI估计RVSV，在出生后VO小鼠术后2个月内增加约30%-40%。这些结果进一步证明了该模型成功建立了AVF和RV VO。
慢性 VO 可能逐渐导致功能性肺阻力升高，最终导致 PA 小动脉血管重塑。这个过程在冠心病患儿中很常见，有左向右分流。先前对绵羊和仔猪的动物研究证明，AVF可导致肺血管系统的结构和功能变化13,24,25。术后2个月随访，VO小鼠PA多普勒血流形态异常，PAT降低，肺动脉瓣反流，RVSV呈下降趋势。如前所述，PAT可用作评估新生儿和儿童RV后负荷的补充参数。上述现象可能表明VO小鼠的肺血管阻力改变26,27,28。为了量化升高的 RV 后负荷或压力过载，使用 Thibault 在成年小鼠18 中验证的公式使用 PAT 和 RVET 的比率来估计 RVSP 的值，这表明在出生后模型中 AVF 手术后 2 个月 RVSP 显着增加。此外，VO小鼠数个肺叶炎症和PA重塑的组织病理学证据进一步证明了术后3个月的结构异常。因此，为了排除压力过载的影响，建议将这种出生后小鼠RV VO模型的应用限制在手术后2个月。
综上所述，改良AVF手术是建立出生后小鼠RV VO模型的可行技术。考虑到瘘管闭合和肺动脉阻力升高的概率，应用前应进行腹部超声和超声心动图检查，以确认模型状态。
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Disclosures
没有利益冲突需要声明。
Acknowledgments
这项工作得到了国家自然科学基金（第82200309项）和宁波市杰出医疗团队创新项目（第2022020405项）的支持
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70% Ethanol | Tiandz,Chia | ||
| ACETAMINOPHEN Oral Solution | VistaPharm, Inc. Largo, FL 33771, USA | NDC 66689-054-01 | |
| Anesthesia machine | RWD Life Science,China | R550IP | |
| Anesthesia mask | RWD Life Science,China | 68680 | |
| C57BL/6 mice | Xipu’er-bikai Experimental Animal Co., Ltd (Shanghai, China) | ||
| Hair removal cream | Veet, France | VT-200 | |
| Hematoxylin and eosin Kit | Beyotime biotech | C0105M | |
| Isoflurane | RWD Life Science,China | R510-22-10 | |
| Microscope | Yuyan Instruments, China | SM-301 | |
| Surgical suture needles | NINGBO MEDICAL NEEDLE CO.,LTD, China | ||
| Thermostatic heating platform | Qingdao Juchuang Environmental Protection Group Co., Ltd, China | ||
| Ultrasound device | FUJIFILM VisualSonics, Inc. | Vevo 2100 | Image modes includes B-Mode, Color Doppler Mode and Pulsed Wave Doppler Mode |
| Ultrasound gel | Parker Laboratories,United States | REF 01-08 | |
| Ultrasound transducer | FUJIFILM VisualSonics, Inc. | MS 400 |
References
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