Summary
Este protocolo apresenta o estabelecimento e a confirmação de um modelo de sobrecarga de volume (VO) do ventrículo direito pós-natal em camundongos com fístula arteriovenosa (FAV) abdominal, que pode ser aplicado para investigar como a VO contribui para o desenvolvimento cardíaco pós-natal.
Abstract
A sobrecarga de volume (VO) do ventrículo direito (VD) é comum em crianças com cardiopatia congênita. Tendo em vista os distintos estágios de desenvolvimento, o miocárdio do VD pode responder diferentemente à VO em crianças em comparação com adultos. O presente estudo tem como objetivo estabelecer um modelo de VO do VD pós-natal em camundongos utilizando uma fístula arteriovenosa abdominal modificada. Para confirmar a confecção da VO e as seguintes alterações morfológicas e hemodinâmicas do VD, foram realizadas ultrassonografia abdominal, ecocardiograma e coloração histoquímica durante 3 meses. Como resultado, o procedimento em camundongos pós-natais mostrou uma taxa aceitável de sobrevivência e sucesso da fístula. Em camundongos VO, a cavidade do VD foi aumentada com uma parede livre espessada, e o volume sistólico foi aumentado em cerca de 30%-40% dentro de 2 meses após a cirurgia. A partir daí, a pressão sistólica do VD aumentou, observou-se regurgitação valvar pulmonar correspondente e surgiu pequeno remodelamento da artéria pulmonar. Em conclusão, a cirurgia de fístula arteriovenosa (FAV) modificada é viável para estabelecer o modelo de VO do VD em camundongos pós-natais. Considerando a probabilidade de fechamento da fístula e elevação da resistência da artéria pulmonar, a ultrassonografia abdominal e o ecocardiograma devem ser realizados para confirmar o status do modelo antes da aplicação.
Introduction
A sobrecarga de volume (VO) do ventrículo direito (VD) é comum em crianças com cardiopatia congênita (CC), o que leva a remodelamento miocárdico patológico e mau prognóstico em longo prazo 1,2,3. Uma compreensão profunda do remodelamento do VR e das intervenções direcionadas precoces relacionadas é essencial para um bom desfecho em crianças com CC. Existem várias diferenças nas estruturas moleculares, funções fisiológicas e respostas a estímulos no coração de adultos e crianças 1,4,5,6. Por exemplo, sob a influência da sobrecarga pressórica, a proliferação de cardiomiócitos é a principal resposta em corações neonatais, enquanto a fibrose ocorre em corações adultos 5,6. Além disso, muitas drogas eficazes no tratamento da insuficiência cardíaca em adultos não têm efeito terapêutico sobre a insuficiência cardíaca em crianças, podendo até causar danos adicionais 7,8. Por conseguinte, as conclusões retiradas de animais adultos não podem ser aplicadas directamente a animais jovens.
O modelo de fístula arteriovenosa (FAV) tem sido utilizado para induzir VO cardíaco crônico e disfunção cardíaca correspondente há décadas em animais adultos de diferentes espécies9,10,11,12,13. No entanto, pouco se sabe sobre o modelo em camundongos pós-natais. Em nossos estudos anteriores, um modelo de VO pós-natal em camundongos foi gerado com sucesso pela criação de uma FAV abdominal. A alteração do trajeto do desenvolvimento do VD no coração pós-natal também foi demonstrada14,15,16,17.
Para explorar o processo cirúrgico modificado subjacente e as características do presente modelo, um protocolo detalhado é apresentado; O modelo é avaliado por 3 meses neste estudo.
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Protocol
Todos os procedimentos aqui apresentados estavam em conformidade com os princípios descritos na Declaração de Helsinque e foram aprovados pelo Comitê de Bem-Estar Animal e Estudos Humanos do Shanghai Children's Medical Center (SCMC-LAWEC-2023-003). Filhotes de camundongos C57BL/6 (P7, machos, 3-4 g) foram utilizados para o presente estudo. Os animais foram obtidos de fonte comercial (ver Tabela de Materiais). Os filhotes de camundongos e suas nutrizes (filhotes:mães = 6:1 em uma única gaiola) foram mantidos em condições laboratoriais livres de patógenos específicos sob um ciclo claro e escuro de 12 h a 22 ± 2 °C com livre acesso à água e dieta nutricional. Os filhotes foram randomizados em dois grupos: um grupo VO e um grupo sham-operado (sham).
1. Preparação de equipamentos e ferramentas cirúrgicas
NOTA: Os detalhes comerciais de todos os materiais/equipamentos estão listados na Tabela de Materiais.
- Certifique-se de que os seguintes tipos de equipamentos estejam prontos e funcionando corretamente: mesa cirúrgica (painel plástico de espuma), máquina de anestesia inalatória, microscópio com iluminação vertical e câmera embutida, aparelho de ultrassom com transdutor de 24 MHz e plataforma de aquecimento termostático.
- Esterilize os instrumentos cirúrgicos (ou seja, um suporte de microagulha, pinça de ponta fina e tesoura de mola Vannas de cabo redondo).
- Montar os seguintes consumíveis: agulhas de sutura cirúrgica 11-0 e 9-0 (ponto cone) com fio, fitas adesivas, agulhas de seringa de 5 mL, seda 2-0 (fixação cirúrgica), cotonetes estéreis e gel de ultrassom.
- Certifique-se de que os seguintes reagentes estejam presentes: Betadine, etanol 70%, soro fisiológico estéril, isoflurano, paracetamol, pomada oftálmica e creme para depilação.
2. Procedimento cirúrgico
OBS: O procedimento cirúrgico da fístula foi modificado de acordo com o método descritoanteriormente11. A Figura 1 mostra um diagrama esquemático da operação da FAV em camundongos pós-natais.
- Anestesia e contenção
- Coloque os filhotes de camundongos em uma caixa de indução anestésica fornecida com isoflurano a 2%, oxigênio a 2% por 2 minutos com o fluxo ajustado para 1 L/min. Administrar paracetamol (0,1 ml via oral de 80 mg/2,5 ml) utilizando uma seringa para TB.
- Colocar os filhotes em decúbito dorsal na mesa cirúrgica com inalação nasal de isoflurano a 1,5% com fluxo de 0,8 L/min para manutenção da anestesia. Ajuste a posição do filhote amarrando as pernas às agulhas fixas da seringa. Aplique pomada oftálmica nos olhos dos filhotes para evitar a dessecação da córnea.
- Aperte a cauda do filhote anestesiado para verificar sua responsividade à dor; nenhum movimento corporal óbvio indica anestesia adequada.
- Cirurgia de fístula
- Desinfetar a pele com três esfoliantes alternados de betadina e etanol 70% e, em seguida, borrar o local cirúrgico. Corte a parede abdominal e o peritônio do abdome inferior ao subxifóide para expor totalmente a cavidade peritoneal, tomando cuidado para não lesionar os órgãos abdominais. Gotejamento de soro fisiológico estéril normal para umedecer órgãos exteriorizados.
- Puxe suavemente o trato gastrointestinal e a bexiga para longe do local cirúrgico usando cotonetes para visualizar a aorta abdominal vertical (AA) e a veia cava inferior (VCI) sob o retroperitônio. Gire a mesa cirúrgica 90° no sentido anti-horário e ajuste a ampliação do microscópio para visualizar claramente os dois vasos horizontais.
- Punção da fístula do AA para a VCI em sentido oblíquo 1 cm distal à artéria renal com agulha de sutura 11-0 (diâmetro = 0,07 mm). Verificar o sucesso da criação de fístula com base no inchaço e mistura de sangue venoso e arterial na VCI.
- Em seguida, comprimir rapidamente o ponto de sangramento usando uma força apropriada aplicada com cotonetes secos por 15 s. Substitua o estômago, intestinos e bexiga na cavidade abdominal o mais rápido possível para promover a compressão hemostática.
- Sutura da parede abdominal e peritônio com um ponto de manta com fio de sutura 9-0. Interrompa a anestesia e forneça oxigênio a 100% dos filhotes por 1 min.
- Reanimação anestésica
- Coloque os filhotes em uma plataforma de aquecimento de 38 °C. Após um despertar completo com vitalidade, devolva os filhotes à mãe que amamenta. Todo o procedimento dura aproximadamente 15 min.
OBS: No presente estudo, o grupo simulado é submetido ao mesmo procedimento, exceto pela etapa de punção.
- Coloque os filhotes em uma plataforma de aquecimento de 38 °C. Após um despertar completo com vitalidade, devolva os filhotes à mãe que amamenta. Todo o procedimento dura aproximadamente 15 min.
3. Confirmação ultrassonográfica da fístula
LEGENDA: O funcionamento geral do aparelho de ultrassom foi idêntico a relatos anteriores18,19.
- Confirmação de fístula por ultrassonografia abdominal
- Após a indução anestésica (passo 2.1.1), fixar os ratos com fitas adesivas na posição supina sobre a plataforma aquecida. Em seguida, conecte os camundongos a um monitor de eletrocardiograma (ECG) com gel de ultrassom. Manter a anestesia com isoflurano a 1,5% com fluxo de 0,8 L/min.
- Prepare a pele do peito e do abdômen usando creme de depilação. Após alguns segundos, retire o creme com uma ponta de algodão morna embebida em água. Coloque o transdutor (24 MHz) na linha abdominal média e gire o marcador do transdutor para a cabeça dos camundongos.
- Mover a plataforma para o lado esquerdo ou direito dos camundongos e usar o modo B e o modo Doppler colorido para visualizar a visão de eixo longo dos vasos e sinais sanguíneos18,19. Medir a velocidade do fluxo sanguíneo dos AA, VCI e fístula para confirmar a patência da FAV através do modo Doppler pulsado.
OBS: O sucesso da formação de fístula no ultrassom foi indicado por um sinal de fluxo turbulento visível entre o AA e a VCI (Figura 2C). A velocidade do fluxo sanguíneo com Doppler no local da FAV foi significativamente elevada em comparação com uma velocidade sistólica relativamente menor no AA (Figura 2A,C). Além disso, em contraste com os padrões normais de fluxo na VCI (Figura 2B), a onda pulsátil do fluxo sanguíneo da VCI proximal à FAV também confirmou o sucesso da criação da fístula (Figura 2D).
- Confirmação da VO pela ecocardiografia
- Mova a parte final da plataforma para baixo, coloque o transdutor (24 MHz) no peito e gire o marcador do transdutor para o ombro direito dos ratos. Visualize a visão paraesternal modificada de eixo longo da artéria pulmonar (AP) usando modo B e modo Doppler colorido.
- Usando o modo Doppler pulsado, meça os sinais de fluxo sanguíneo na AP, incluindo a integral de velocidade de tempo (PA-VTI), diâmetro da válvula PA (DAP), tempo de aceleração arterial pulmonar (PAT) e tempo de ejeção do VD (RVED) (Figura 2E,F e Figura 3A,B).
- Medir os parâmetros ultrassonográficos a partir da média de três medidas consecutivas. Calcular o volume sistólico do VD (VSVD, mL) e a pressão sistólica do VD (PSVD, mmHg) utilizando as seguintes fórmulas20:
VSVD [mL] =1/4 × πD2 × ITVPA
PSVD [mmHg] = -83,7 × PAT/TVR - índice + 63,7
OBS: Considerando o viés de mensuração ultrassonográfica, um aumento de >15% no VSVD ou VTIPA em camundongos VO em comparação com camundongos no grupo sham foi considerado VO no VR (Figura 2E,F).
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Representative Results
Taxa de sobrevida e perviedade da FAV em 3 meses
Um total de 30 (75%) camundongos no grupo VO e 19 (95%) no grupo sham sobreviveram à cirurgia de FAV (Figura 4A). No grupo VO, oito camundongos morreram dentro de 1 dia após a cirurgia devido a sangramento excessivo (n = 5) ou canibalização (n = 3), enquanto dois camundongos morreram de causas desconhecidas em 1 mês.
Dos camundongos VO sobreviventes (n = 30), a ultrassonografia confirmou o estabelecimento bem sucedido de fístulas em 21 camundongos no pós-operatório, que se mostraram pérvias com 1 semana de pós-operatório (P14) e mantidas até 2 semanas de pós-operatório (P21). No entanto, a fístula fechou com 1 mês em sete camundongos e aos 2 meses em dois camundongos. Apenas 12 camundongos apresentaram FAV persistente no seguimento de 3 meses. As taxas de perviedade da FAV foram de 70, 70, 46,7 e 40% com 1 semana, 2 semanas, 1 mês e 2 meses de pós-operatório, respectivamente (Figura 4B).
Alterações hemodinâmicas no coração direito
O seguimento de 3 meses dos parâmetros hemodinâmicos mostrou que tanto a DAP quanto o VSVD dos camundongos de cada grupo aumentaram com a idade dentro de dois meses (n = 6 em ambos os grupos; Figura 3B,E,F). Em comparação com os camundongos sham-operados, o IAV-AP foi significativamente maior no grupo VO dentro de 2 semanas de pós-operatório (Figura 3D), mas diminuiu depois disso, e os padrões de fluxo de AP mudaram com a diminuição do PAT (Figura 3A). O VSVD no grupo VO foi consistentemente maior do que no grupo sham por 2 meses, com um aumento de aproximadamente 30%-40%. A PSVD aumentou significativamente com a regurgitação pulmonar 2 meses após a cirurgia (Figura 3C,G).
Alterações morfológicas no coração direito e pequenas artérias pulmonares
Ao microscópio, o VD foi significativamente aumentado em relação ao grupo sham após a FAV (Figura 5A). A coloração histológica mostrou parede livre de VD espessada e cavidade de VD aumentada nos camundongos VO (Figura 5B). De acordo com as alterações hemodinâmicas do VD, a PSVD estava elevada 2 meses após a cirurgia. Tecidos pulmonares de dois grupos de camundongos 3 meses após a cirurgia foram selecionados aleatoriamente para coloração de hematoxilina e eosina (HE), que mostrou espessamento da túnica média, hiperplasia endotelial e infiltrado de células inflamatórias periféricas em algumas das pequenas artérias pulmonares do grupo VO (Figura 5C).
Figura 1: Diagrama esquemático da operação de FAV em camundongos pós-natais . (A) Instrumentos cirúrgicos. (B) O procedimento cirúrgico da FAV. Abreviações: FAV = fístula arteriovenosa; VCI = veia cava inferior; AA = aorta abdominal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Confirmação de fístula de FAV e VO por ultrassonografia. (A) Sinal de fluxo pulsátil normal no AA (pico de velocidade de fluxo: 400 mm/s). (B) Sinal de fluxo sanguíneo normal da VCI. (C) Aumento da velocidade de fluxo na fístula (o sinal de fluxo sanguíneo vermelho com tonalidade amarela e verde em seu interior indicava um sinal de fluxo turbulento na fístula; pico de velocidade de fluxo sistólico: 900 mm/s). (D) Fluxo pulsátil na VCI próximo à fístula com o aumento da velocidade do fluxo. (E) Aumento do VTI da AP em camundongos VO 1 semana após a cirurgia. (F) VTI AP em camundongos sham 1 semana após a cirurgia (o sinal de fluxo sanguíneo azul indicou o fluxo sanguíneo do AP). Abreviações: FAV = fístula arteriovenosa; VCI = veia cava inferior; AA = aorta abdominal; PA = artéria pulmonar; VTI = integral velocidade-tempo. No modo Doppler colorido, o fluxo em direção ao transdutor foi codificado em vermelho e longe do transdutor foi codificado em azul. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Medidas hemodinâmicas do coração direito derivadas da ecocardiografia. (A) Os padrões de fluxo Doppler em cada momento dos camundongos VO mostraram diminuição gradual do PAT. (B) Medidas bidimensionais dos parâmetros da AF. (C) Regurgitação PA ao ecodopplercardiograma colorido. (D-F) Alterações no TIV-AP, PAD e RVSV em cada momento em camundongos VO pós-operatórios. (G) O histograma da RVSP em camundongos VO (preto) e sham (Gray) mostrou um aumento da RVSP em 2 meses e 3 meses após a cirurgia de FAV (seis camundongos VO; seis camundongos sham; Teste t de Student; *representa significância estatística). Abreviações: P14 = 14º dia pós-natal; P21 = 21º dia pós-natal; RVP = regurgitação valvar pulmonar; PSVD = pressão sistólica do ventrículo direito; M = meses; W = semanas. A figura F é adaptada de Sun et al., com permissão14. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Taxa de sobrevida e patência da fístula de camundongos após cirurgia de FAV. (A) A taxa de sobrevivência de camundongos pós-natais após a cirurgia (n = 40 no grupo VO; n = 20 no grupo sham). (B) Taxa de perviedade da fístula em camundongos VO (n = 30). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Alterações morfológicas no coração direito . (A) Coração aumentado em camundongos VO em cada momento após a cirurgia de FAV. (B) A coloração cardíaca de HE em diferentes momentos após a cirurgia mostrou parede livre de VR espessada e cavidade de VD aumentada. (C) As alterações histopatológicas das arteríolas pulmonares em camundongos após FAV mostraram hiperplasia e hipertrofia de pequenas artérias pulmonares com infiltração de células inflamatórias. Barras de escala: (A) = 5 mm; (B) = 2000 μm; (C) = 50 μm. Abreviaturas: W = semanas; M = meses. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Anteriormente, o modelo clássico VO do VD foi criado utilizando regurgitação valvar21; no entanto, em comparação com a FAV, a cirurgia valvar cardíaca aberta pode exigir técnicas mais sofisticadas e pode estar associada a mortalidade significativamente maior, particularmente em camundongos pós-parto. Como estudos em animais demonstraram que o mesmo efeito da VO foi alcançado pela FAV22, a cirurgia de fístula abdominal modificada com menos trauma foi utilizada neste estudo.
Alguns fatores foram considerados durante o procedimento para estabelecer a fístula com sucesso. Primeiro, o procedimento foi realizado em camundongos pós-natais sem intubação endotraqueal e ventilação auxiliar; Portanto, o ajuste imediato das configurações anestésicas dos filhotes de acordo com sua condição dinâmica foi essencial para evitar a morte por insuficiência respiratória. Em segundo lugar, o estômago e a bexiga do filhote estavam frequentemente em um estado completo durante a cirurgia. Portanto, para expor adequadamente as estruturas vasculares retroperitoneais, foi necessária uma operação delicada e delicada para evitar lesão dos frágeis órgãos abdominais. Terceiro, a ligadura do AA para evitar sangramento arterial grave foi difícil de realizar nos filhotes; portanto, foi necessária compressão hemostática com swab de algodão imediatamente após a punção. A partir daí, foi possível que os órgãos retroperitônio e abdominais produzissem compressão adicional no local do sangramento. Além disso, observou-se que a compressão excessiva pode contribuir para a falência precoce da fístula.
Devido ao procedimento menos traumático em comparação com os modelos VO de RV adultos, os camundongos VO pós-natais mostraram sobrevida perioperatória relativamente maior, mas menores taxas de sucesso da fístula no pós-operatório precoce11,23. Além da hemorragia grave, a canibalização da mãe inexperiente foi a principal causa de morte nos filhotes após a cirurgia. Um ambiente de reprodução confortável e silencioso, fechamento apertado de feridas abdominais, rápida recuperação da temperatura corporal e despertar completo dos filhotes após a anestesia podem reduzir o risco de canibalização. Estudos prévios em modelos adultos de camundongos com FAV descobriram que a formação de FAV tem três estágios: rápido período de trombose no pós-operatório 0-1, período de maturidade da fístula por 3 semanas e, finalmente, criação bem-sucedida de FAV com refechamento da fístula em alguns camundongos em 3-6 semanas23. Neste estudo, a curva de patência da fístula dos camundongos pós-natais também mostrou a mesma trajetória (ou seja, o fechamento da fístula ocorreu principalmente dentro de 1 semana ou durante 4-8 semanas após a cirurgia, e as fístulas restantes permaneceram abertas em 3 meses). Portanto, é fundamental confirmar a patência da fístula nos camundongos pós-natais com FAV dentro de 2 meses após a cirurgia por ultrassonografia abdominal.
O aumento do VSVD é outra evidência essencial para o VO do VD, exceto para a patência da fístula. Atualmente, o cateterismo cardíaco é difícil de implementar em camundongos jovens de baixo peso. Beneficiando-se das vantagens de sua não invasividade, manipulação relativamente simples e monitorização contínua do mesmo camundongo, a ecocardiografia com transdutores de alta frequência foi aplicada para avaliar as alterações hemodinâmicas neste estudo. O VSVD foi estimado pelo fluxo sanguíneo pulmonar VTI, e aumentou em cerca de 30%-40% dentro de 2 meses após a cirurgia nos camundongos VO pós-natais. Esses resultados comprovaram ainda mais o sucesso no estabelecimento da FAV e VO do VD nesse modelo.
A DV crônica pode gradualmente levar à elevação funcional da resistência pulmonar e, finalmente, ao remodelamento vascular das arteríolas da AP. Esse processo é comum em crianças com CC com shunt da esquerda para a direita. Estudos prévios em animais em ovinos e leitões comprovaram que a FAV poderia levar a alterações estruturais e funcionais do sistema vascular pulmonar 13,24,25. Durante o seguimento subsequente 2 meses após a cirurgia, padrões morfológicos anormais do fluxo Doppler AP com diminuição do PAT, regurgitação valvar pulmonar e tendência de queda do VSVD em camundongos VO foram observados. Como relatado anteriormente, o TAP pode ser utilizado como parâmetro complementar para avaliar a pós-carga do VD em neonatos e crianças. Os fenômenos citados acima podem sugerir uma resistência vascular pulmonar alterada em camundongos VO26,27,28. Para quantificar a pós-carga elevada do VD ou a sobrecarga pressórica, a razão entre o TAP e o TEVR foi utilizada para estimar o valor da PSVD utilizando a fórmula verificada por Thibault em camundongosadultos18, que demonstrou que a PSVD estava significativamente aumentada 2 meses após a cirurgia de FAV no modelo pós-natal. Além disso, evidências histopatológicas de inflamação e remodelamento da AP em vários lobos pulmonares de camundongos VO comprovaram ainda mais as anormalidades estruturais 3 meses após a cirurgia. Portanto, para excluir o efeito da sobrecarga pressórica, sugeriu-se que a aplicação deste modelo VO RV de camundongos pós-natal fosse limitada a 2 meses após a cirurgia.
Em resumo, a cirurgia de FAV modificada é uma técnica viável para estabelecer o modelo de VO do VD em camundongos pós-natais. Considerando a probabilidade de fechamento da fístula e elevação da resistência da artéria pulmonar, a ultrassonografia abdominal e o ecocardiograma devem ser realizados para confirmar o status do modelo antes da aplicação.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse a declarar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciência da China (nº 82200309) e pelo Projeto de Inovação da Distinguished Medical Team em Ningbo (nº 2022020405)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70% Ethanol | Tiandz,Chia | ||
| ACETAMINOPHEN Oral Solution | VistaPharm, Inc. Largo, FL 33771, USA | NDC 66689-054-01 | |
| Anesthesia machine | RWD Life Science,China | R550IP | |
| Anesthesia mask | RWD Life Science,China | 68680 | |
| C57BL/6 mice | Xipu’er-bikai Experimental Animal Co., Ltd (Shanghai, China) | ||
| Hair removal cream | Veet, France | VT-200 | |
| Hematoxylin and eosin Kit | Beyotime biotech | C0105M | |
| Isoflurane | RWD Life Science,China | R510-22-10 | |
| Microscope | Yuyan Instruments, China | SM-301 | |
| Surgical suture needles | NINGBO MEDICAL NEEDLE CO.,LTD, China | ||
| Thermostatic heating platform | Qingdao Juchuang Environmental Protection Group Co., Ltd, China | ||
| Ultrasound device | FUJIFILM VisualSonics, Inc. | Vevo 2100 | Image modes includes B-Mode, Color Doppler Mode and Pulsed Wave Doppler Mode |
| Ultrasound gel | Parker Laboratories,United States | REF 01-08 | |
| Ultrasound transducer | FUJIFILM VisualSonics, Inc. | MS 400 |
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