Summary
Her beskriver vi en standardprotokol til kvantificering af den optokinetiske refleks. Det kombinerer virtuel tromlestimulering og video-okulografi og muliggør således præcis evaluering af funktionens selektivitet af adfærden og dens adaptive plasticitet.
Abstract
Den optokinetiske refleks (OKR) er en væsentlig medfødt øjenbevægelse, der udløses af den globale bevægelse af det visuelle miljø og tjener til at stabilisere retinale billeder. På grund af sin betydning og robusthed er OKR blevet brugt til at studere visuel-motorisk læring og til at evaluere de visuelle funktioner hos mus med forskellige genetiske baggrunde, aldre og lægemiddelbehandlinger. Her introducerer vi en procedure til evaluering af OKR-responser fra hovedfaste mus med høj nøjagtighed. Hovedfiksering kan udelukke bidraget fra vestibulær stimulering på øjenbevægelser, hvilket gør det muligt at måle øjenbevægelser, der kun udløses af visuel bevægelse. OKR fremkaldes af et virtuelt tromlesystem, hvor et lodret gitter præsenteret på tre computerskærme driver vandret på en oscillerende måde eller ensrettet med konstant hastighed. Med dette virtual reality-system kan vi systematisk ændre visuelle parametre som rumlig frekvens, tids-/svingningsfrekvens, kontrast, luminans og gitterretningen og kvantificere indstillingskurver for visuel funktionsselektivitet. Højhastigheds infrarød video-okulografi sikrer nøjagtig måling af øjenbevægelsernes bane. De enkelte mus' øjne er kalibreret for at give mulighed for at sammenligne OKR'erne mellem dyr i forskellige aldre, køn og genetiske baggrunde. Den kvantitative kraft af denne teknik gør det muligt at opdage ændringer i OKR, når denne adfærd plastisk tilpasser sig på grund af aldring, sensorisk oplevelse eller motorisk læring; Det gør således denne teknik til en værdifuld tilføjelse til repertoiret af værktøjer, der bruges til at undersøge plasticiteten af okulær adfærd.
Introduction
Som reaktion på visuelle stimuli i miljøet bevæger vores øjne sig for at flytte vores blik, stabilisere nethindebilleder, spore bevægelige mål eller justere foveae af to øjne med mål placeret i forskellige afstande fra observatøren, hvilket er afgørende for korrekt syn 1,2. Oculomotorisk adfærd er blevet brugt i vid udstrækning som attraktive modeller for sensorimotorisk integration for at forstå de neurale kredsløb i sundhed og sygdom, i det mindste delvis på grund af enkelheden i det oculomotoriske system3. Styret af tre par ekstraokulære muskler roterer øjet i soklen primært omkring tre tilsvarende akser: højde og fordybning langs tværaksen, adduktion og bortførelse langs den lodrette akse og intorsion og afpresning langs anteroposterioraksen 1,2. Et sådant simpelt system giver forskere mulighed for nemt og præcist at evaluere musens oculomotoriske adfærd i et laboratoriemiljø.
En primær oculomotorisk adfærd er den optokinetiske refleks (OKR). Denne ufrivillige øjenbevægelse udløses af langsomme drifter eller glidninger af billeder på nethinden og tjener til at stabilisere nethindebilleder, når et dyrs hoved eller dets omgivelser bevæger sig 2,4. OKR, som et adfærdsparadigme, er interessant for forskere af flere grunde. For det første kan den stimuleres pålideligt og kvantificeres nøjagtigt 5,6. For det andet er procedurerne for kvantificering af denne adfærd relativt enkle og standardiserede og kan anvendes til at evaluere de visuelle funktioner hos en stor kohorte af dyr7. For det tredje er denne medfødte adfærd meget plastisk 5,8,9. Dens amplitude kan forstærkes, når gentagne retinale glider forekommer i lang tid 5,8,9, eller når dens arbejdspartner vestibulær okulær refleks (VOR), en anden mekanisme til stabilisering af retinale billeder udløst af vestibulær input2, er svækket5. Disse eksperimentelle paradigmer for OKR-potensering giver forskere mulighed for at afsløre kredsløbsgrundlaget bag oculomotorisk læring.
To ikke-invasive metoder er primært blevet brugt til at evaluere OKR i tidligere undersøgelser: (1) videookulografi kombineret med en fysisk tromle 7,10,11,12,13 eller (2) vilkårlig bestemmelse af hoveddrejninger kombineret med en virtuel tromle6,14,15,16. Selvom deres anvendelser har gjort frugtbare opdagelser i forståelsen af molekylære og kredsløbsmekanismer for oculomotorisk plasticitet, har disse to metoder hver især nogle ulemper, der begrænser deres kræfter til kvantitativt at undersøge OKR's egenskaber. For det første tillader fysiske tromler med trykte mønstre af sorte og hvide striber eller prikker ikke lette og hurtige ændringer af visuelle mønstre, hvilket stort set begrænser målingen af OKR's afhængighed af visse visuelle træk, såsom rumlig frekvens, retning og kontrast af bevægelige riste 8,17. I stedet kan test af OKR's selektivitet over for disse visuelle funktioner drage fordel af computeriseret visuel stimulering, hvor visuelle funktioner bekvemt kan ændres fra forsøg til forsøg. På den måde kan forskerne systematisk undersøge OKR-adfærden i det multidimensionelle visuelle parameterrum. Desuden rapporterer den anden metode i OKR-analysen kun tærsklerne for visuelle parametre, der udløser mærkbare OKR'er, men ikke amplituderne af øjen- eller hovedbevægelser 6,14,15,16. Manglen på kvantitativ effekt forhindrer således analyse af formen på indstillingskurver og de foretrukne visuelle træk eller detektering af subtile forskelle mellem individuelle mus under normale og patologiske forhold. For at overvinde ovenstående begrænsninger var videookulografi og computeriseret virtuel visuel stimulering blevet kombineret for at analysere OKR-adfærden i nylige undersøgelser 5,17,18,19,20. Disse tidligere offentliggjorte undersøgelser gav imidlertid ikke nok tekniske detaljer eller trinvise instruktioner, og det er derfor stadig udfordrende for forskere at etablere en sådan OKR-test til deres egen forskning.
Her præsenterer vi en protokol til præcist at kvantificere den visuelle funktionsselektivitet af OKR-adfærd under fotopiske eller scotopiske forhold med kombinationen af videookulografi og computeriseret virtuel visuel stimulering. Mus er hovedfikseret for at undgå øjenbevægelser fremkaldt af vestibulær stimulering. Et højhastighedskamera bruges til at optage okulære bevægelser fra mus, der ser bevægelige riste med skiftende visuelle parametre. Den fysiske størrelse af øjenæblerne på individuelle mus kalibreres for at sikre nøjagtigheden af at udlede øjenvinklen21. Denne kvantitative metode gør det muligt at sammenligne OKR-adfærd mellem dyr i forskellige aldre eller genetiske baggrunde eller overvåge dens ændring forårsaget af farmakologiske behandlinger eller visuel-motorisk læring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentelle procedurer udført i denne undersøgelse blev godkendt af Biological Sciences Local Animal Care Committee i overensstemmelse med retningslinjer fastlagt af University of Toronto Animal Care Committee og Canadian Council on Animal Care.
1. Implantation af en hovedstang oven på kraniet
BEMÆRK: For at undgå bidrag fra VOR-adfærd til øjenbevægelserne immobiliseres musens hoved under OKR-testen. Derfor implanteres en hovedstang kirurgisk oven på kraniet.
- Bedøv en mus (2-5 måneder gammel hun og han C57BL/6) med en blanding af 4% isofluran (v/v) ogO2 i et gaskammer. Overfør musen til en tilpasset kirurgisk platform og reducer koncentrationen af isofluran til 1,5% -2%. Overvåg dybden af anæstesi ved at kontrollere tå-klemme respons og respirationshastigheden gennem hele operationen.
- Placer en varmepude under dyrets krop for at opretholde dets kropstemperatur. Påfør et lag smøremiddel øjensalve på begge øjne for at beskytte dem mod tørring. Dæk øjnene med aluminiumsfolie for at beskytte dem mod lysbelysning.
- Subkutan injicere carprofen i en dosis på 20 mg/kg for at reducere smerter. Efter befugtning af pelsen med chlorhexidingluconathudrens barberes pelsen oven på kraniet. Desinficer den udsatte hovedbund med 70% isopropylalkohol og chlorhexidinalkohol to gange.
- Injicer bupivacain (8 mg/kg) subkutant på snitstedet, og fjern derefter hovedbunden (~1 cm2) med en saks for at eksponere kraniets dorsale overflade, herunder den bageste frontknogle, parietalknoglen og den interparietale knogle.
- Påfør flere dråber 1% lidokain og 1:100.000 adrenalin på den udsatte kraniet for at reducere lokal smerte og blødning. Skrab kraniet med en Meyhoefer-curette for at fjerne fascia og rengør det med fosfatbufret saltvand (PBS).
BEMÆRK: Den temporalis-muskel er adskilt fra kraniet for at øge overfladearealet for en hovedstang at fastgøre. - Tør kraniet ved forsigtigt at blæse trykluft mod kraniets overflade, indtil fugtigheden er væk, og knoglen bliver hvidlig. Påfør et tyndt lag superlim på den udsatte overflade af kraniet, inklusive kanten af den skårne hovedbund, efterfulgt af et lag akrylharpiks.
BEMÆRK: Overfladen af kraniet skal være fri for blod eller vand før påføring af superlim. - Placer en hovedstang i rustfrit stål (se figur 1A) langs midterlinjen oven på kraniet. Påfør mere akrylharpiks, startende fra kanten af hovedstangen, indtil bunden af hovedstangen er helt indlejret i akrylharpiksen. Påfør akrylharpiks to eller tre gange for at opbygge tykkelsen.
- Vent i ca. 15 minutter, indtil akrylharpiksen hærder. Subkutant injiceres 1 ml lakteret ringeropløsning. Derefter returneres musen til et bur placeret på en varmepude, indtil dyret er fuldt mobilt.
- Lad musen komme sig i hjemmeburet i mindst 5 dage efter operationen. Når dyret er i god form, skal du fastgøre hovedet med hovedstangen i OKR-opsætningen i 15-30 minutter for at gøre det bekendt med hovedfikseringen og forsøgsmiljøet. Gentag fortroligheden en gang om dagen i mindst 3 dage.
2. Opsætning af den virtuelle tromme og video-oculografi
- Monter tre skærme ortogonalt til hinanden for at danne et firkantet kabinet, der dækker ~ 270 ° af azimut og 63 ° af højden i det visuelle rum (figur 1B til venstre).
- Med et diskret grafikkort kan du flette de tre skærme til et simpelt display for at sikre synkronisering på tværs af alle skærme.
- Kalibrer skærmenes luminans som beskrevet nedenfor.
- Tænd for computeren, som skærmene er tilsluttet, og vent i 15 minutter. Opvarmningen er afgørende for at have stabil luminans.
- Skift systematisk lysstyrkeindstillingen på skærmen fra 0 til 100 med trin på 25.
- For hver lysstyrkeværdi måles skærmens luminans under forskellige pixelværdier (0-255, trin på 15) med en luminansmåler.
- Tilpas forholdet mellem luminans og lysstyrke for pixelværdi 255 med lineær regression, og estimer lysstyrkeværdien, der giver anledning til 160 cd/m2.
- For hver pixelværdi, der anvendes til luminansmåling (trin 2.3.3), skal du estimere luminansen for lysstyrkeværdien afledt i trin 2.3.4 baseret på lineær regression. Brug effektfunktionen lum = A * pixel γ til at tilpasse forholdet mellem det nye sæt luminansværdier (under lysstyrkeværdien afledt af 2.3.4) og deres tilsvarende pixelværdier til at udlede gammafaktoren γog koefficienten A. Disse vil blive brugt til at generere sinusformede riste med ønskede luminansværdier.
- Indstil lysstyrken på alle tre skærme til de værdier, der er afledt i trin 2.3.4, for at sikre, at deres luminansværdier er de samme for den samme pixelværdi.
- Generer en virtuel tromle, som bruges til at stimulere OKR-adfærd, med det visuelle stimuleringsværktøjssæt, som beskrevet nedenfor.
- Præsenter et lodret sinusformet gitter på skærmene, og juster perioden (afstand mellem striber) langs azimutten for at sikre, at projektionen af gitteret på øjet har konstant rumlig frekvens (tromlegitter; Figur 1B midt og højre).
- Sørg for, at dyrets hoved er fastgjort i midten af anlægget, så det ser, at risten har en konstant rumlig frekvens over overfladen af den virtuelle tromle.
- Rediger parametrene for bevægeligt gitter, såsom oscillerende amplitude, rumlig frekvens, tidsmæssig / svingningsfrekvens, retning, kontrast osv. I de visuelle stimuleringskoder. Brug to typer visuel bevægelse: (1) gitteret driver med eller mod uret på en oscillerende måde efter en sinusformet funktion:
Her er Amp amplituden af tromlebanen, f er svingningsfrekvensen, og t er tiden (svingningsamplitude: 5°; gitterrumlig frekvens: 0,04-0,45 cpd; svingningsfrekvens: 0,1-0,8 Hz, svarende til en tophastighed for stimulus på 3,14-25,12 °/s [tromlehastighed = Amp x 2π x f x cos (2π x f x t); kontrast: 80%-100%; gennemsnitlig luminans: 35-45 cd/m2; (2) risten kører ensrettet med konstant hastighed:
(Rumlig frekvens: 0,04-0,64 cpd; tidsfrekvens: 0,25-1 Hz; tromlehastighed = tidsfrekvens/rumlig frekvens.)
- Konfigurer video-okulografien som beskrevet nedenfor.
- For at undgå blokering af dyrets synsfelt skal du placere et infrarødt spejl (IR) 60° fra midterlinjen for at danne et billede af højre øje.
- Placer et IR-kamera på højre side bag musen (figur 1C venstre) for at tage et billede af højre øje.
- Monter højhastigheds-IR-kameraet på en kameraarm, der gør det muligt for kameraet at rotere ± 10° rundt om billedet af højre øje (figur 1C til højre).
- Brug en fotodiode, der er fastgjort til en af skærmene, til at give et elektrisk signal til at synkronisere timingen af videookulografi og visuel stimulering.
- Placer fire IR-lysdioder (LED'er) understøttet af svanehalsarme omkring højre øje for at give IR-belysning af øjet.
- Placer to IR-LED'er på kameraet for at give hornhinderefleksion (CR) referencer: den ene er fastgjort over kameraet (X-CR), mens den anden er på venstre side af kameraet (Y-CR; Figur 1D).
- Mål den optiske forstørrelse af video-okulografisystemet med et kalibreringsobjektglas.
BEMÆRK: Reference-CR'erne bruges til at annullere de translationelle øjenbevægelser, når øjenvinklen beregnes ud fra de roterende øjenbevægelser.
- Fastgør dyrets hoved i midten af kabinettet dannet af skærmene, som beskrevet nedenfor.
- Fastgør dyrets hoved med hovedpladen til midten af riggen og få den til at vende fremad. Juster hovedets hældning, så venstre og højre øje udjævnes, og øjnens nasale og tidsmæssige hjørner justeres vandret (figur 1E).
- Bevæg dyrets hoved vandret ved grov justering fra hovedfikseringsapparatet og finjustering tilvejebragt af et 2D-translationstrin og lodret gennem hovedfikseringsapparatet og et stolpe-/stolpeholderpar, indtil dyrets højre øje vises i kameraets livevideo. Før kalibrering og måling af øjenbevægelser overlejres billedet af dyrets højre øje, der reflekteres af det varme spejl, med kameraarmens drejepunkt (se nærmere oplysninger i trin 3.4 nedenfor).
- Byg et tilpasset kabinet omkring OKR-riggen for at blokere rumlyset (figur 1F).
3. Kalibrering af øjenbevægelser
BEMÆRK: Roterende øjenbevægelser beregnes ud fra elevens bevægelser og radius af pupilbevægelsernes bane (Rp, afstanden fra midten af pupillen til midten af øjeæblet). For hver enkelt mus måles denne radius eksperimentelt21.
- Fastgør dyrets hoved i midten af det anlæg, der dannes af de tre monitorer, som beskrevet i trin 2.6.1.
- Tænd kameraet, og juster de fire lysdioder omkring højre øje for at opnå ensartet IR-belysning.
- Under visuel vejledning skal du justere placeringen af højre øje, indtil det vises i midten af videoen, som beskrevet i trin 2.6.2.
- Juster det virtuelle billede af højre øje med kameraarmens omdrejningspunkt som beskrevet nedenfor.
- Drej kameraarmen manuelt til venstre yderste ende (-10°). Flyt manuelt dyrets højre øjenposition på det vandrette plan vinkelret på den optiske akse med finjustering af 2D-translationstrinnet (figur 1C, grøn pil), indtil X-CR er i billedets vandrette centrum.
- Drej kameraarmen manuelt til den anden ende (+10°). Hvis X-CR løber væk fra midten af billedet, skal du flytte højre øje langs den optiske akse med finjustering, indtil X-CR kommer til midten (figur 1C, blå pil).
- Gentag trin 3.4.1-3.4.2 et par gange, indtil X-CR forbliver i midten, når kameraarmen svinger til venstre og højre. Hvis højre øje bevæger sig midt i en gentagelse, skal du genstarte justeringsprocessen.
- Mål den lodrette afstand mellem Y-CR og X-CR efter låsning af kameraarmen i den centrale position. Tænd for Y-CR LED, og optag dens position på videoen, og skift derefter til X-CR LED, og optag dens position.
BEMÆRK: Den lodrette afstand mellem Y-CR og X-CR vil blive brugt til at udlede Y-CR'ens position under måling af øjenbevægelser, hvor kun X-CR LED'en er tændt. - Elevrotationsradius Rp måles som beskrevet nedenfor.
- Drej kameraarmen til venstre ende (-10°), og optag pupillens (PP1) og X-CR (PCR1) positioner på videoen.
- Drej derefter kameraarmen til højre ende (+10°), og optag pupillens (Pp2) og X-CR (PCR2) positioner på videoen. Gentag dette trin flere gange.
BEMÆRK: Dyrets højre øje skal forblive stationært under hver gentagelse, så mængden af pupilbevægelser i filmen nøjagtigt afspejler graden af svingning af kameraarmen. - Baseret på de ovenfor registrerede værdier beregnes pupilrotationsradius Rp (figur 2A) med følgende formel:
BEMÆRK: Afstanden mellem hornhinderefleksionen og pupilcentret i det fysiske rum beregnes ud fra deres afstand i filmen:
PCR - Pp = antal pixels i filmen x pixelstørrelse på kamerachip x forstørrelse
- Udvikle forholdet mellem Rp og pupildiameter, som beskrevet nedenfor. Rp ændres, når eleven udvider eller indsnævres; umiddelbart er dens værdi omvendt proportional med pupilstørrelsen (figur 2B øverst).
- Skift skærmenes luminans systematisk fra 0 til 160 cd/m2 for at regulere pupilstørrelsen.
- Gentag trin 3.6 8-10 gange for hver luminansværdi, og registrer pupillens diameter.
- Anvend lineær regression på forholdet mellem Rp og pupildiameter baseret på værdierne målt ovenfor for at udlede hældningen og skæringspunktet (figur 2B nederst).
BEMÆRK: Afvigende værdier forårsaget af lejlighedsvise øjenbevægelser fjernes før den lineære tilpasning. Ved gentagne målinger i flere sessioner skal kalibreringen kun udføres én gang for ét dyr, medmindre øjet bliver større under forsøget.
4. Optag øjenbevægelser af OKR
- Hovedfiksering af en mus i riggen ved at følge trin 3.1-3.4. Spring dette trin over, hvis optagelsen finder sted lige efter, at kalibreringen er udført. Lås kameraarmen i den centrale position.
- Indstil monitorerne og dyret til scotopic OKR som beskrevet nedenfor. Spring dette trin over for fotopisk OKR.
- Dæk skærmen på hver skærm med et tilpasset filter, der er lavet af fem lag 1.2 neutral densitet (ND) film. Sørg for, at der ikke lækker lys ud gennem mellemrummet mellem filteret og skærmen.
- Sluk lyset i rummet. Følgende trin udføres ved hjælp af en IR-brille.
- Påfør en dråbe pilocarpinopløsning (2% i saltvand) på højre øje og vent 15 min. Sørg for, at dråben forbliver på øjet og ikke tørres væk af musen. Hvis opløsningen tørres væk af dyret, skal du anvende en anden dråbe pilocarpinopløsning. Dette krymper pupillen til en passende størrelse til øjensporing under skotopisk tilstand.
BEMÆRK: Under skotopisk tilstand udvider pupillen sig væsentligt, så kanten er delvist skjult bag øjenlåget. Dette påvirker præcisionen af estimering af elevcentret ved video-okulografi. Farmakologisk krympning af pupillen på højre øje mindsker dens visuelle input, og dermed præsenteres de visuelle stimuli for venstre øje. - Skyl højre øje med saltvand for at vaske pilocarpinopløsningen grundigt væk. Træk gardinet ned for at forsegle kabinettet helt, hvilket forhindrer omstrejfende lys i at forstyrre det skotopiske syn.
- Giv dyret 5 minutter til fuldt ud at tilpasse sig det skotopiske miljø, før OKR-testen påbegyndes.
- Kør den visuelle stimuleringssoftware og øjensporingssoftwaren. Ved fotopisk OKR-måling skal du sikre, at tromlegitteret svinger vandret med en sinusformet bane; til scotopisk OKR-måling skal du sikre, at tromlegitteret driver med en konstant hastighed fra venstre mod højre, hvilket er den temporo-nasale retning i forhold til venstre øje.
BEMÆRK: Når pupillen på højre øje, men ikke på venstre øje, krympes af pilocarpin under skotopisk tilstand, er OKR fremkaldt af oscillerende tromlestimulering meget asymmetrisk. Ved scotopisk OKR-måling stimuleres det venstre øje således, mens bevægelsen af højre øje overvåges. - Øjesporingssoftwaren måler automatisk pupilstørrelsen, CR-positionen og pupilpositionen for hvert billede og beregner øjenvinklen baseret på følgende formel (figur 2C):
Her er PCR CR-positionen, P p er elevpositionen, og Rp er elevrotationsradiusen. Afstanden mellem hornhinderefleksion og pupilcenter i det fysiske rum beregnes ud fra deres afstand i filmen:
PCR - Pp = antal pixels i filmen x pixelstørrelse på kamerachip x forstørrelse
Rp af den tilsvarende pupilstørrelse udledes på grundlag af den lineære regressionsmodel i trin 3.7.3 (figur 2B nederst).
5. Analyse af øjenbevægelser af OKR med øjenanalysesoftwaren
- Behandl øjesporene ved hjælp af et medianfilter (filtervindue = 0,05 s) for at fjerne højfrekvent støj (figur 3A i midten).
- Fjern saccades eller nystagmus som beskrevet nedenfor.
- Anslå øjenhastigheden ved at beregne den første ordens derivat af øjenbevægelser (figur 3A nederst). Identificer saccades eller nystagmus ved at anvende en hastighedstærskel på 50 ° / s (figur 3A nederst).
- Udskift saccades eller nystagmus ved at ekstrapolere øjenpositionerne under disse hurtige øjenbevægelser fra segmentet før saccades eller nystagmus baseret på lineær regression (figur 3B).
- Beregn amplituden af OKR-øjenbevægelser ved hurtig Fourier-transformation (Goertzel-algoritme), hvis tromlegitteret svinger (figur 3C), eller beregn gennemsnitshastigheden af øjenbevægelser under den visuelle stimulering, hvis tromlegitteret bevæger sig med konstant hastighed i en retning (figur 3B nederst).
BEMÆRK: Amplituden af oscillerende øjenbevægelser afledt af Fourier-transformation svarer til amplituden afledt af tilpasningen af øjenbanen med en sinusformet funktion (figur 3D). - Beregn OKR-gevinsten. For oscillerende tromlebevægelse defineres OKR-forstærkning som forholdet mellem amplituden af øjenbevægelser og amplituden af tromlebevægelser (figur 3C til højre). For ensrettet tromlebevægelse defineres OKR-forstærkning som forholdet mellem øjenhastighed og tromlegitterhastighed (figur 3B nederst).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med proceduren beskrevet ovenfor evaluerede vi OKR's afhængighed af flere visuelle funktioner. De eksempelspor, der vises her, blev afledt ved hjælp af analysekoderne i Supplementary Coding File 1, og eksempelsporene raw-fil kan findes i Supplementary Coding File 2. Når tromlegitteret drev i en sinusformet bane (0,4 Hz), fulgte dyrets øje automatisk ristens bevægelse på en lignende oscillerende måde (figur 3B toppanel), hvilket er karakteristisk for OKR-adfærden 2,5,8. Amplituden af OKR-øjenbevægelser i den vandrette akse blev afledt med hurtig Fourier-transformation (figur 3C&D), og OKR-forstærkningen blev beregnet som forholdet mellem amplituden af øjenbevægelser og amplituden af gitterbevægelse (figur 3C). OKR-forstærkningen varierede med værdierne for rumlig frekvens, svingningsfrekvens og bevægelsesretningsgitteret (figur 4A). For det første havde den rumlige frekvensindstillingskurve for OKR-adfærden en omvendt V-form og toppede ved en mellemliggende rumlig frekvens på 0,16 cpd (figur 4A til venstre). For det andet faldt svingningsfrekvensindstillingskurven monotont, da tromlegitterets svingningsfrekvens steg (figur 4A i midten), hvilket indikerer, at OKR-adfærden fungerer bedst som reaktion på den visuelle bevægelse ved lav hastighed4. Både amplituden og formen af svingningsfrekvensindstillingskurven varierede, når der blev præsenteret riste med forskellige rumlige frekvenser17. For det tredje kan den vandrette OKR også fremkaldes af riste, der bevæger sig i forskellige retninger (figur 4A til højre). Den stærkeste horisontale OKR-adfærd blev fremkaldt af den temporo-nasale bevægelse (0°). OKR-forstærkningen faldt til ~80% eller ~30% af maksimum, når gitteret bevægede sig i skrå vinkler 30° eller 60° afveg fra henholdsvis den temporo-nasale retning (både opad og nedad), og den vandrette OKR forsvandt, når risten bevægede sig lodret opad eller nedad (90° og 270°). Desuden blev formen på tuningkurverne påvirket af luminansniveauet. For eksempel udførte dyr OKR-adfærden godt som reaktion på rumlige frekvenser på 0,16 og 0,32 cpd under den fotopiske tilstand, men den rumlige frekvensindstillingskurve skiftede til venstre under den skotopiske tilstand (figur 4B). For at analysere formen på tuningkurver passer vi dem med passende matematiske funktioner. For eksempel blev den gaussiske funktion brugt til at estimere toppen og båndbredden af rumlig frekvensindstilling (figur 4C). Med denne analyse fandt vi, at tuningkurven under den skotopiske tilstand havde en lavere værdi i den foretrukne rumlige frekvens sammenlignet med den fotopiske tilstand. Proceduren beskrevet ovenfor kan også bruges til at kvantificere plasticiteten af OKR-adfærd. Efter 45 minutters kontinuerlig OKR-stimulering blev amplituden af OKR-adfærden signifikant forstærket (figur 4D), i overensstemmelse med tidligere rapporter. Disse resultater demonstrerer anvendelserne af denne protokol til at undersøge den oculomotoriske adfærd og potentialer i forståelsen af hjernens kredsløb involveret i denne adfærd.
Figur 1: Opsætning af OKR-riggen . (A) Hovedstangens dimensioner. (B) Set bagfra (venstre) og set ovenfra (midten) af det virtuelle trommesystem. Tre skærme er monteret ortogonalt på hinanden. Musens hoved er placeret i midten af det firkantede kabinet og vender fremad. Perioden med visuel stimulering (mellemrum mellem striber) varieres baseret på azimut til dyrets øje for at sikre, at projektionen af gitteret på øjet har en konstant rumlig frekvens. Med andre ord opfattes gitterets rumlige frekvens som konstant i hele synsfeltet, som om gitteret driver langs overfladen af en virtuel tromle (højre). (C) Opsætning af IR-videookulografi. Venstre: Kameraets position, når det er fastgjort i midten under OKR-optagelse. Blå pil: langs den optiske akse. Grøn pil: vinkelret på den optiske akse. Til højre: kameraets rotation under øjenkalibrering. (D) Placeringen af X-CR- og Y-CR-LED'erne, der er fastgjort på kameraet. (E) Niveauer af venstre og højre øje (venstre) og næse- og temporale hjørner af øjnene justeres vandret (højre) ved at dreje henholdsvis den vandrette stang eller hovedpladeadapteren (røde pile). (F) Foto af OKR-stationen. Bemærk, at OKR-riggen er placeret inde i et tilpasset kabinet med et sort gardin. Forkortelser: IR = infrarød; CR = hornhinderefleksion. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Kalibrering og måling af øjenpositioner i videookulografi . (A) Skematisk oversigt over kalibreringen. Pupilrotationsradius (Rp) estimeres ved at dreje kameraet til positionen længst til venstre (-10°, venstre panel) og til positionen længst til højre (10°, højre panel). Røde prikker angiver positionerne for hornhinderefleksion X-CR, når kameraet er placeret længst til venstre og yderst til højre. Blå prikker angiver elevernes centre. Grønne bjælker angiver afstandene mellem hornhinderefleksionen og pupilcenteret, der ses i kameravideoen (P, CR - P, P). (B) Afhængighed af Rp af elevstørrelse. Top: skemaer af øjenkugler med en lille eller stor elev. Nederst: forholdet mellem Rp og diameteren af pupillen på en eksempelmus. Pupilstørrelsen ændres ved at variere luminansen (10 værdier i området 0-160 cd/m2) til musen. Sorte prikker: de data, der bruges til lineær tilpasning. Blå prikker: afvigende værdier, der er udelukket fra lineær tilpasning. Rød kurve: den bedst egnede linje i lineær regression. Bemærk, at Rp er omvendt proportional med pupildiameteren. (C) Beregning af øjenpositionsvinklen, når øjet har bevæget sig til højre eller venstre side af synsaksen. Røde prikker, blå prikker og grønne søjler har samme betydning som i A. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Beregning af OKR-gevinst. (A) Top: snapshots af nasale (N; venstre) og tidsmæssige (T; højre) øjenpositioner taget under OKR-stimulering. Røde ellipser: passer til elevprofilen. Røde kors: elevcentre. Hvide pile: hornhinderefleksion af en reference-LED. Midt: banerne for øjenbevægelser med (sort) eller uden (rød) et medianfilter (filtervindue = 0,05 s) for at fjerne højfrekvent støj. Nederst: estimering af øjenhastigheden ved at beregne den første ordens derivat af øjenbevægelser. Saccades (røde pile) detekteres med en hastighedstærskel på 50 ° / s. (B) Banen for langsomme øjenbevægelser af OKR efter fjernelse af saccades / nystagmus (sort) overlejret med tromlebane22. Top: oscillerende tromlebevægelse med en amplitude på 5° og en svingningsfrekvens på 0,4 Hz. Nederst: ensrettet (temporo-nasal) tromlebevægelse med en konstant hastighed på 6,25 °/s. (C) Venstre: cyklusgennemsnittet af øjets bane i B-toppen. Til højre: frekvensanalyse af øjets eller trommegitterets bevægelser ved hurtig Fourier-transformation. Det skal bemærkes, at tromlegitteret svinger ved 0,4 Hz, og dermed topper amplituderne af øje- og trommegitterbevægelse ved 0,4 Hz (stjernemærker). OKR-forstærkning er forholdet mellem amplituderne af øjen- og trommegitterbevægelse ved 0,4 Hz. (D) Top: kurvetilpasning af øjets bane i B-top med sinusformet funktion. Nederst: forholdet mellem amplituden af øjenbevægelser afledt af den hurtige Fourier-transformationsmetode og afledt af sinusformet kurvetilpasning. Gul prik: eksempel øverst. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Den visuelle funktionsselektivitet og plasticitet af OKR-adfærd. (A) Den visuelle funktionsselektivitet af OKR-forstærkning under den fotopiske tilstand. Til venstre: rumlig frekvensindstillingskurve fra et dyr (svingningsfrekvens: 0,4 Hz; bane: oscillerende vandret; gennemsnitlig luminans: 40 cd/m2; n = 15). Midten: svingningsfrekvensindstillingskurve fra et dyr (rumlig frekvens: 0,08 eller 0,16 cpd; bane: oscillerende vandret; gennemsnitlig luminans: 40 cd/m2; n = 15). Til højre: retningsindstillingskurve fra et dyr (rumlig frekvens: 0,16 cpd; tidsfrekvens: 1 Hz; gennemsnitlig luminans: 45 cd/m2; n = 24). Den røde pil og bjælke angiver den temporo-nasale retning. Til rumlig og tidsmæssig/svingningsfrekvensindstilling bevæger et lodret tromlegitter præsenteret på tre skærme vandret med konstant hastighed eller på en oscillerende måde. Til retningsindstilling bevæger et gitter, der kun præsenteres på den rigtige skærm, sig i en af 12 retninger med konstant hastighed. Tykkelse: standardfejl for gennemsnittet (SEM). (B) Rumlig frekvensindstillingskurve for OKR-forstærkning fra et dyr under skotopisk eller fotopisk tilstand. Fotopic: oscillerende bevægelse; svingningsfrekvens: 0,2 Hz; gennemsnitlig luminans: 40 cd/m2; n = 15. Skotopisk: lineær bevægelse med konstant hastighed; tidsmæssig frekvens: 0,25 Hz; gennemsnitlig luminans: 8 x 10-5 cd/m2; n = 16. Den skotopiske tilstand opnås ved at dække skærmene med fem lag Lee-filter (299 1,2 ND). Tykkelse: SEM. (C) Gaussisk tilpasning af rumlig frekvensindstilling af OKR-forstærkning under fotopiske og skotopiske forhold. Fotopic: oscillerende bevægelse; svingningsfrekvens: 0,2 Hz; gennemsnitlig luminans: 40 cd/m2; n = 15. Skotopisk: lineær bevægelse med konstant hastighed; tidsmæssig frekvens: 0,25 Hz; gennemsnitlig luminans: 8 x 10-5 cd/m2; n = 16. (D) OKR-potensering af én mus induceret af 45 minutters kontinuerlig OKR-stimulering. Rumlig frekvens: 0,1 cpd; svingningsfrekvens: 0,4 Hz; gennemsnitlig luminans: 35 cd/m2 n = 40. Top: cyklus gennemsnitlige OKR-baner før og efter OKR-potensering. Tykkelse: SEM. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende kodningsfil 1: Analysekode, der bruges til at generere eksempelsporingerne. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende kodningsfil 2: Eksempler på spor, der genereres med softwaren. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden til OKR-adfærdsanalysen, der præsenteres her, giver flere fordele. For det første løser computergenereret visuel stimulering de iboende problemer med fysiske trommer. Ved at håndtere problemet med, at fysiske trommer ikke understøtter den systematiske undersøgelse af rumlig frekvens, retning eller kontrastindstilling8, tillader den virtuelle tromle, at disse visuelle parametre ændres på forsøgsbasis, hvilket letter en systematisk og kvantitativ analyse af funktionsselektiviteten af OKR-adfærden (figur 4A); Mens fysiske tromler lider under en uensartet belysning af en ekstern lyskilde23, kan den virtuelle tromle let levere homogen luminans over overfladen; ved hjælp af ND-filtre og en luminansmåler muliggør den computergenererede visuelle stimulering OKR-måling ved forskellige velkontrollerede luminansniveauer fra skotopisk til fotopisk (figur 4B), hvilket er vanskeligt at udføre med fysiske tromler. Uden begrænsningen i accelerationen af fysiske tromler på grund af deres inertimasse kan den virtuelle visuelle stimulering opnå ideelt nøjagtige baner, især ved høj acceleration og høj hastighed. Desuden tillader computergenereret visuel stimulering kreativt design af andre former for visuel stimulering, såsom sammenhængende bevægelige prikker, hvilket hjælper med at undersøge mekanismer for forskellige oculomotoriske adfærd. For det andet er vores procedure standardiseret og kræver derfor minimal indsats for at overvåge udviklingen af adfærdsregistrering, hvilket giver mulighed for at undersøge flere mus samtidigt. Derfor er den velegnet til undersøgelser, der involverer en stor kohorte af dyr (titusinder til hundreder af dyr). For det tredje gør den høje præcision og kvantitative effekt det muligt at sammenligne gentagne OKR-målinger af de samme mus i longitudinelle undersøgelser24, under forskellige farmakologiske behandlinger10 eller under neurale kredsløbsforstyrrelser5. Endelig giver den Fourier-transformationsbaserede analyse i frekvensdomænet 5,7,9 ækvivalente resultater i amplituden af oscillerende øjenbevægelser med den tilpasningsbaserede analyse i det tidsmæssige domæne 12,25,26 (figur 3D nederst), hvilket viser, at analysemetoden, der præsenteres her, er både nøjagtig og præcis.
Vores metode giver også mulighed for at studere OKR-plasticitet, et vildt anvendt paradigme til at undersøge mekanismerne for oculomotorisk læring. Ved kontinuerlig OKR-stimulering af en mus eller kirurgisk læsion af dens vestibulære organ, kan amplituden af OKR forstærkes 8,9. OKR-analysen, der præsenteres her, er følsom nok til at fange små ændringer i øjenbevægelser, der sker i OKR-potensering (figur 4D). Den kvantitative effekt af denne metode gør det muligt at korrelere adfærdsændringer med neurale kredsløbsdynamikker, hvilket er vigtigt for at afsløre mekanismerne bag oculomotorisk læring 5,8,9,13.
For at sikre nøjagtigheden af OKR-måling er der et par kritiske trin. For det første er der under operationen behov for ekstra omhu for at undgå, at superlim og dental akryl berører øjenlåget, hvilket kan beskadige hornhinden eller delvist blokere øjenåbningen. For det andet påvirkes styrken af OKR af adfærdstilstanden hos mus27,28. Derfor anbefales et par runder indkvartering for at minimere virkningen af stress på OKR-måling; Forstyrrelser forårsaget af lugtstoffer, støj eller lys bør også forhindres under optagelsen. Endelig skal musenes hoveder orienteres korrekt, så linjen, der forbinder de to øjenhjørner, er parallel med den vandrette akse. Dette garanterer, at retningen af visuel bevægelse er justeret med aksen for adduktion og bortførelse øjenbevægelser. For det tredje er den ensartede belysning af øjet nøglen til at generere et skarpt billede af pupillen og dermed sikre øjensporing af høj kvalitet.
Det er værd at bemærke, at der er nogle få begrænsninger af de metoder, der præsenteres her. For det første, når et dyrs øje blinker eller uigennemsigtig øjenudladning blokerer eleven, mister video-okulografien sporet af øjet et øjeblik eller permanent. På samme måde kan det ikke bruges til at overvåge øjenbevægelser, når øjenlågene sutureres. For det andet er videookulografiens tidsmæssige opløsning begrænset af kameraernes billedhastighed til en rækkevidde på 4-20 ms. Endelig tillader det hovedfaste præparat ikke overvågning af dyrs okulære adfærd.
Video-okulografien og den virtuelle tromme, der præsenteres her, var med succes blevet anvendt til at karakterisere den visuelle funktionsselektivitet og plasticiteten af OKR-adfærd og til at forstå de retinale og centrale kredsløb, der er involveret i formidling og adaptivt modulering af denne adfærd. Derudover kan de også gavne undersøgelser, hvor andre okulære adfærd enten er emnerne eller endda forvirrende faktorer for de neurale fænomener. For eksempel kan video-okulografien bruges til at overvåge pupiludvidelse29 og saccadelignende øjenbevægelser 30,31, som er tegn på årvågenhed og hjernetilstand32,33,34,35. Desuden er de kalibrerings- og måleprocedurer, der er skitseret her, universelt anvendelige til overvågning af øjenbevægelser med et hovedmonteret kamera i frit bevægelige mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Vi er taknemmelige for Yingtian He for at dele data om retningsindstilling. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Canadian Foundation of Innovation and Ontario Research Fund (CFI/ORF projekt nr. 37597), NSERC (RGPIN-2019-06479), CIHR (Project Grant 437007) og Connaught New Researcher Awards.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2D translational stage | Thorlabs | XYT1 | |
| Acrylic resin | Lang Dental | B1356 | For fixing headplate on skull and protecting skull |
| Bupivacaine | STERIMAX | ST-BX223 | Bupivacaine Injection BP 0.5%. Local anesthesia |
| Carprofen | RIMADYL | 8507-14-1 | Analgesia |
| Compressed air | Dust-Off | ||
| Eye ointment | Alcon | Systane | For maintaining moisture of eyes |
| Graphic card | NVIDIA | Geforce GTX 1650 or Quadro P620. | For generating single screen among three monitors |
| Heating pad | Kent Scientific | HTP-1500 | For maintaining body temperature |
| High-speed infrared (IR) camera | Teledyne Dalsa | G3-GM12-M0640 | For recording eye rotation |
| IR LED | Digikey | PDI-E803-ND | For CR reference and the illumination of the eye |
| IR mirror | Edmund optics | 64-471 | For reflecting image of eye |
| Isoflurane | FRESENIUS KABI | CP0406V2 | |
| Labview | National instruments | version 2014 | eye tracking |
| Lactated ringer | BAXTER | JB2324 | Water and energy supply |
| Lidocaine and epinephrine mix | Dentsply Sirona | 82215-1 | XYLOCAINE. Local anesthesia |
| Luminance Meter | Konica Minolta | LS-150 | for calibration of monitors |
| Matlab | MathWorks | version xxx | analysis of eye movements |
| Meyhoefer Curette | World Precision Instruments | 501773 | For scraping skull and removing fascia |
| Microscope calibration slide | Amscope | MR095 | to measure the magnification of video-oculography |
| Monitors | Acer | B247W | Visual stimulation |
| Neutral density filter | Lee filters | 299 | to generate scotopic visual stimulation |
| Nigh vision goggle | Alpha optics | AO-3277 | for scotopic OKR |
| Photodiode | Digikey | TSL254-R-LF-ND | to synchronize visual stimulation and video-oculography |
| Pilocarpine hydrochloride | Sigma-Aldrich | P6503 | |
| Post | Thorlabs | TR1.5 | |
| Post holder | Thorlabs | PH1 | |
| PsychoPy | open source software | version xxx | visual stimulation toolkit |
| Scissor | RWD | S12003-09 | For skin removal |
| Superglue | Krazy Glue | Type: All purpose. For adhering headplate on the skull |
References
- Gerhard, D.
- Distler, C., Hoffmann, K. P. The Oxford Handbook of Eye Movement. , Oxford University Press. 65-83 (2011).
- Sereno, A. B., Bolding, M. S. Executive Functions: Eye Movements and Human Neurological Disorders. , Elsevier. (2017).
- Giolli, R. A., Blanks, R. H. I., Lui, F. The accessory optic system: basic organization with an update on connectivity, neurochemistry, and function. Progress in Brain Research. 151, 407-440 (2006).
- Liu, B. H., Huberman, A. D., Scanziani, M. Cortico-fugal output from visual cortex promotes plasticity of innate motor behaviour. Nature. 538 (7625), 383-387 (2016).
- Prusky, G. T., Alam, N. M., Beekman, S., Douglas, R. M. Rapid quantification of adult and developing mouse spatial vision using a virtual optomotor system. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (12), 4611-4616 (2004).
- Stahl, J. S., van Alphen, A. M., De Zeeuw, C. I. A comparison of video and magnetic search coil recordings of mouse eye movements. Journal of Neuroscience Methods. 99 (1-2), 101-110 (2000).
- Faulstich, B. M., Onori, K. A., du Lac, S. Comparison of plasticity and development of mouse optokinetic and vestibulo-ocular reflexes suggests differential gain control mechanisms. Vision Research. 44 (28), 3419-3427 (2004).
- Katoh, A., Kitazawa, H., Itohara, S., Nagao, S. Dynamic characteristics and adaptability of mouse vestibulo-ocular and optokinetic response eye movements and the role of the flocculo-olivary system revealed by chemical lesions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (13), 7705-7710 (1998).
- Cahill, H., Nathans, J. The optokinetic reflex as a tool for quantitative analyses of nervous system function in mice: application to genetic and drug-induced variation. PLoS One. 3 (4), 2055 (2008).
- Cameron, D. J., et al. The optokinetic response as a quantitative measure of visual acuity in zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (80), 50832 (2013).
- de Jeu, M., De Zeeuw, C. I.
- Kodama, T., du Lac, S. Adaptive acceleration of visually evoked smooth eye movements in mice. The Journal of Neuroscience. 36 (25), 6836-6849 (2016).
- Doering, C. J., et al. Modified Ca(v)1.4 expression in the Cacna1f(nob2) mouse due to alternative splicing of an ETn inserted in exon 2. PLoS One. 3 (7), e2538 (2008).
- Shi, C., et al. Optimization of optomotor response-based visual function assessment in mice. Scientific Reports. 8 (1), 9708 (2018).
- Waldner, D. M., et al. Transgenic expression of Cacna1f rescues vision and retinal morphology in a mouse model of congenital stationary night blindness 2A (CSNB2A). Translational Vision Science & Technology. 9 (11), 19 (2020).
- Tabata, H., Shimizu, N., Wada, Y., Miura, K., Kawano, K. Initiation of the optokinetic response (OKR) in mice. Journal of Vision. 10 (1), 1-17 (2010).
- Al-Khindi, T., et al. The transcription factor Tbx5 regulates direction-selective retinal ganglion cell development and image stabilization. Current Biology. 32 (19), 4286-4298 (2022).
- Harris, S. C., Dunn, F. A. Asymmetric retinal direction tuning predicts optokinetic eye movements across stimulus conditions. eLife. 12, e81780 (2023).
- van Alphen, B., Winkelman, B. H., Frens, M. A. Three-dimensional optokinetic eye movements in the C57BL/6J mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (1), 623-630 (2010).
- Stahl, J. S. Calcium channelopathy mutants and their role in ocular motor research. Annals of the New York Academy of Sciences. 956, 64-74 (2002).
- Endo, S., et al. Dual involvement of G-substrate in motor learning revealed by gene deletion. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (9), 3525-3530 (2009).
- Thomas, B. B., Seiler, M. J., Sadda, S. R., Coffey, P. J., Aramant, R. B. Optokinetic test to evaluate visual acuity of each eye independently. Journal of Neuroscience Methods. 138 (1-2), 7-13 (2004).
- Burroughs, S. L., Kaja, S., Koulen, P. Quantification of deficits in spatial visual function of mouse models for glaucoma. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (6), 3654-3659 (2011).
- Wakita, R., et al. Differential regulations of vestibulo-ocular reflex and optokinetic response by β- and α2-adrenergic receptors in the cerebellar flocculus. Scientific Reports. 7 (1), 3944 (2017).
- Dehmelt, F. A., et al. Spherical arena reveals optokinetic response tuning to stimulus location, size, and frequency across entire visual field of larval zebrafish. eLife. 10, e63355 (2021).
- Magnusson, M., Pyykko, I., Jantti, V. Effect of alertness and visual attention on optokinetic nystagmus in humans. American Journal of Otolaryngology. 6 (6), 419-425 (1985).
- Collins, W. E., Schroeder, D. J., Elam, G. W. Effects of D-amphetamine and of secobarbital on optokinetic and rotation-induced nystagmus. Aviation, Space, and Environmental Medicine. 46 (4), 357-364 (1975).
- Reimer, J., et al. Pupil fluctuations track fast switching of cortical states during quiet wakefulness. Neuron. 84 (2), 355-362 (2014).
- Sakatani, T., Isa, T. PC-based high-speed video-oculography for measuring rapid eye movements in mice. Neuroscience Research. 49 (1), 123-131 (2004).
- Sakatani, T., Isa, T. Quantitative analysis of spontaneous saccade-like rapid eye movements in C57BL/6 mice. Neuroscience Research. 58 (3), 324-331 (2007).
- Vinck, M., Batista-Brito, R., Knoblich, U., Cardin, J. A. Arousal and locomotion make distinct contributions to cortical activity patterns and visual encoding. Neuron. 86 (3), 740-754 (2015).
- Bradley, M. M., Miccoli, L., Escrig, M. A., Lang, P. J. The pupil as a measure of emotional arousal and autonomic activation. Psychophysiology. 45 (4), 602-607 (2008).
- Hess, E. H., Polt, J. M. Pupil size as related to interest value of visual stimuli. Science. 132 (3423), 349-350 (1960).
- Di Stasi, L. L., Catena, A., Canas, J. J., Macknik, S. L., Martinez-Conde, S. Saccadic velocity as an arousal index in naturalistic tasks. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 37 (5), 968-975 (2013).
