Summary
Nous décrivons ici un protocole standard pour quantifier le réflexe optocinétique. Il combine la stimulation virtuelle du tambour et la vidéo-oculographie, et permet ainsi une évaluation précise de la sélectivité caractéristique du comportement et de sa plasticité adaptative.
Abstract
Le réflexe optocinétique (OKR) est un mouvement oculaire inné essentiel qui est déclenché par le mouvement global de l’environnement visuel et sert à stabiliser les images rétiniennes. En raison de son importance et de sa robustesse, l’OKR a été utilisé pour étudier l’apprentissage visuo-moteur et pour évaluer les fonctions visuelles de souris ayant des antécédents génétiques, des âges et des traitements médicamenteux différents. Nous présentons ici une procédure permettant d’évaluer avec une grande précision les réponses OKR des souris à tête fixe. La fixation de la tête permet d’exclure l’apport de la stimulation vestibulaire sur les mouvements oculaires, ce qui permet de mesurer les mouvements oculaires déclenchés uniquement par le mouvement visuel. L’OKR est obtenu par un système de batterie virtuelle, dans lequel un réseau vertical présenté sur trois écrans d’ordinateur dérive horizontalement de manière oscillatoire ou unidirectionnelle à une vitesse constante. Avec ce système de réalité virtuelle, nous pouvons modifier systématiquement les paramètres visuels tels que la fréquence spatiale, la fréquence temporelle/d’oscillation, le contraste, la luminance et la direction des réseaux, et quantifier les courbes de réglage de la sélectivité des caractéristiques visuelles. La vidéo-oculographie infrarouge à haute vitesse assure une mesure précise de la trajectoire des mouvements oculaires. Les yeux de chaque souris sont calibrés pour permettre de comparer les OKR entre des animaux d’âges, de sexes et de milieux génétiques différents. La puissance quantitative de cette technique lui permet de détecter les changements dans l’OKR lorsque ce comportement s’adapte plastiquement en raison du vieillissement, de l’expérience sensorielle ou de l’apprentissage moteur ; Ainsi, elle fait de cette technique un ajout précieux au répertoire d’outils utilisés pour étudier la plasticité des comportements oculaires.
Introduction
En réponse à des stimuli visuels dans l’environnement, nos yeux bougent pour déplacer notre regard, stabiliser les images rétiniennes, suivre les cibles en mouvement ou aligner les fovéae de deux yeux avec des cibles situées à différentes distances de l’observateur, ce qui est vital pour une bonne vision 1,2. Les comportements oculomoteurs ont été largement utilisés comme modèles attrayants d’intégration sensorimotrice pour comprendre les circuits neuronaux dans la santé et la maladie, au moins en partie en raison de la simplicité du système oculomoteur3. Contrôlé par trois paires de muscles extraoculaires, l’œil tourne dans l’orbite principalement autour de trois axes correspondants : l’élévation et la dépression le long de l’axe transversal, l’adduction et l’abduction le long de l’axe vertical, et l’intorsion et l’extorsion le long de l’axe antéropostérieur 1,2. Un système aussi simple permet aux chercheurs d’évaluer les comportements oculomoteurs des souris facilement et avec précision dans un environnement de laboratoire.
L’un des principaux comportements oculomoteurs est le réflexe optocinétique (OKR). Ce mouvement oculaire involontaire est déclenché par de lentes dérives ou glissements d’images sur la rétine et sert à stabiliser les images rétiniennes lorsque la tête d’un animal ou son environnement bougent 2,4. L’OKR, en tant que paradigme comportemental, intéresse les chercheurs pour plusieurs raisons. Tout d’abord, il peut être stimulé de manière fiable et quantifié avec précision 5,6. Deuxièmement, les procédures de quantification de ce comportement sont relativement simples et standardisées et peuvent être appliquées pour évaluer les fonctions visuelles d’une grande cohorte d’animaux7. Troisièmement, ce comportement inné est hautement plastique 5,8,9. Son amplitude peut être potentialisée lorsque des glissements rétiniens répétitifs se produisent pendant une longue période 5,8,9, ou lorsque son partenaire de travail, le réflexe oculaire vestibulaire (VOR), un autre mécanisme de stabilisation des images rétiniennes déclenché par l’entrée vestibulaire2, est altéré5. Ces paradigmes expérimentaux de potentialisation OKR permettent aux chercheurs de dévoiler la base du circuit sous-jacent à l’apprentissage oculomoteur.
Deux méthodes non invasives ont été principalement utilisées pour évaluer l’OKR dans des études antérieures : (1) vidéo-oculographie combinée à un tambour physique 7,10,11,12,13 ou (2) détermination arbitraire des tours de tête combinée à un tambour virtuel6,14,15,16. Bien que leurs applications aient permis de faire des découvertes fructueuses dans la compréhension des mécanismes moléculaires et des circuits de la plasticité oculomotrice, ces deux méthodes présentent chacune des inconvénients qui limitent leurs pouvoirs dans l’examen quantitatif des propriétés de l’OKR. Tout d’abord, les tambours physiques, avec des motifs imprimés de rayures ou de points noirs et blancs, ne permettent pas de changer facilement et rapidement les motifs visuels, ce qui limite considérablement la mesure de la dépendance de l’OKR à certaines caractéristiques visuelles, telles que la fréquence spatiale, la direction et le contraste des réseaux mobiles 8,17. Au lieu de cela, les tests de sélectivité de l’OKR à ces caractéristiques visuelles peuvent bénéficier d’une stimulation visuelle informatisée, dans laquelle les caractéristiques visuelles peuvent être facilement modifiées d’un essai à l’autre. De cette façon, les chercheurs peuvent examiner systématiquement le comportement des OKR dans l’espace des paramètres visuels multidimensionnels. De plus, la deuxième méthode du test OKR ne rapporte que les seuils des paramètres visuels qui déclenchent des OKR discernables, mais pas les amplitudes des mouvements des yeux ou de la tête 6,14,15,16. Le manque de puissance quantitative empêche donc d’analyser la forme des courbes d’accord et les caractéristiques visuelles préférées, ou de détecter des différences subtiles entre les souris individuelles dans des conditions normales et pathologiques. Pour surmonter les limitations ci-dessus, la vidéo-oculographie et la stimulation visuelle virtuelle informatisée ont été combinées pour tester le comportement OKR dans des études récentes 5,17,18,19,20. Cependant, ces études publiées précédemment n’ont pas fourni suffisamment de détails techniques ou d’instructions étape par étape, et par conséquent, il est toujours difficile pour les chercheurs d’établir un tel test OKR pour leurs propres recherches.
Nous présentons ici un protocole permettant de quantifier précisément la sélectivité des caractéristiques visuelles du comportement OKR dans des conditions photopiques ou scotopiques avec la combinaison de la vidéo-oculographie et de la stimulation visuelle virtuelle informatisée. Les souris ont la tête fixe pour éviter les mouvements oculaires provoqués par la stimulation vestibulaire. Une caméra à haute vitesse est utilisée pour enregistrer les mouvements oculaires des souris qui observent des réseaux mobiles avec des paramètres visuels changeants. La taille physique des globes oculaires de chaque souris est calibrée pour assurer la précision de la dérivation de l’angle des mouvements oculaires21. Cette méthode quantitative permet de comparer le comportement des OKR entre des animaux d’âges ou de génétiques différents, ou de suivre son évolution causée par des traitements pharmacologiques ou l’apprentissage visuo-moteur.
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Protocol
Toutes les procédures expérimentales effectuées dans le cadre de cette étude ont été approuvées par le Comité local de protection des animaux de la Division des sciences biologiques, conformément aux lignes directrices établies par le Comité de protection des animaux de l’Université de Toronto et le Conseil canadien de protection des animaux.
1. Implantation d’une barre de tête sur le dessus du crâne
REMARQUE : Pour éviter la contribution du comportement VOR aux mouvements oculaires, la tête de la souris est immobilisée pendant le test OKR. Par conséquent, une barre de tête est implantée chirurgicalement sur le dessus du crâne.
- Anesthésier une souris (femelle et mâle C57BL/6 âgés de 2 à 5 mois) par un mélange de 4% d’isoflurane (v/v) et d’O2 dans une chambre à gaz. Transférez la souris sur une plate-forme chirurgicale personnalisée et réduisez la concentration d’isoflurane à 1,5 % à 2 %. Surveillez la profondeur de l’anesthésie en vérifiant la réponse au pincement des orteils et la fréquence respiratoire tout au long de la chirurgie.
- Placez un coussin chauffant sous le corps de l’animal pour maintenir sa température corporelle. Appliquez une couche de pommade lubrifiante pour les yeux sur les deux yeux pour les protéger du dessèchement. Couvrez les yeux avec du papier d’aluminium pour les protéger de la lumière lumineuse.
- Injecter par voie sous-cutanée du carprofène à une dose de 20 mg/kg pour réduire la douleur. Après avoir mouillé la fourrure avec un nettoyant pour peau au gluconate de chlorhexidine, rasez la fourrure sur le dessus du crâne. Désinfectez le cuir chevelu exposé avec de l’alcool isopropylique à 70 % et de l’alcool chlorhexidine deux fois.
- Injecter de la bupivacaïne (8 mg/kg) par voie sous-cutanée au site de l’incision, puis retirer le cuir chevelu (~1 cm2) avec des ciseaux pour exposer la surface dorsale du crâne, y compris l’os frontal postérieur, l’os pariétal et l’os interpariétal.
- Appliquez plusieurs gouttes de lidocaïne à 1 % et d’épinéphrine à 1 :100 000 sur le crâne exposé pour réduire la douleur et les saignements locaux. Grattez le crâne avec une curette Meyhoefer pour retirer le fascia et nettoyez-le avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
REMARQUE : Le muscle temporal est séparé du crâne pour augmenter la surface d’attache d’une barre de tête. - Séchez le crâne en soufflant doucement de l’air comprimé vers la surface du crâne jusqu’à ce que l’humidité ait disparu et que l’os devienne blanchâtre. Appliquez une fine couche de superglue sur la surface exposée du crâne, y compris le bord du cuir chevelu coupé, suivie d’une couche de résine acrylique.
REMARQUE : La surface du crâne doit être exempte de sang ou d’eau avant l’application de la superglue. - Placez une barre de tête en acier inoxydable (voir Figure 1A) le long de la ligne médiane sur le dessus du crâne. Appliquez plus de résine acrylique, en commençant par le bord de la barre de tête jusqu’à ce que la base de la barre de tête soit complètement noyée dans la résine acrylique. Appliquez de la résine acrylique deux ou trois fois pour augmenter l’épaisseur.
- Attendez environ 15 min jusqu’à ce que la résine acrylique durcisse. Injecter par voie sous-cutanée 1 mL de solution de sonnerie lactée. Ensuite, remettez la souris dans une cage placée sur un coussin chauffant jusqu’à ce que l’animal soit complètement mobile.
- Laissez la souris récupérer dans la cage d’accueil pendant au moins 5 jours après la chirurgie. Une fois que l’animal est en bonne forme, fixez sa tête avec la barre de tête dans la configuration OKR pendant 15 à 30 minutes pour le familiariser avec la fixation de la tête et l’environnement expérimental. Répétez la familiarisation une fois par jour pendant au moins 3 jours.
2. Mise en place du tambour virtuel et de la vidéo-oculographie
- Montez trois moniteurs orthogonalement l’un à l’autre pour former une enceinte carrée qui couvre ~270° de l’azimut et 63° de l’élévation dans l’espace visuel (Figure 1B à gauche).
- À l’aide d’une carte graphique séparée, fusionnez les trois moniteurs en un seul écran simple pour assurer la synchronisation entre tous les moniteurs.
- Calibrez la luminance des moniteurs comme décrit ci-dessous.
- Allumez l’ordinateur auquel les moniteurs sont connectés et attendez 15 minutes. L’échauffement est essentiel pour avoir une luminance stable.
- Modifiez systématiquement le réglage de la luminosité sur l’écran de 0 à 100 par pas de 25.
- Pour chaque valeur de luminosité, mesurez la luminance des moniteurs sous différentes valeurs de pixels (0-255, pas de 15) à l’aide d’un luminomètre.
- Ajustez la relation entre la luminance et la luminosité pour la valeur de pixel 255 avec une régression linéaire et estimez la valeur de luminosité qui donne lieu à 160 cd/m2.
- Pour chaque valeur de pixel utilisée dans la mesure de la luminance (étape 2.3.3), estimez la luminance de la valeur de luminosité dérivée de l’étape 2.3.4 sur la base d’une régression linéaire. Utilisez la fonction de puissance lum = A * pixel γ pour ajuster la relation entre le nouvel ensemble de valeurs de luminance (sous la valeur de luminosité dérivée en 2.3.4) et leurs valeurs de pixels correspondantes afin de dériver le facteur gamma γet le coefficient A. Ceux-ci seront utilisés pour générer des réseaux sinusoïdaux des valeurs de luminance souhaitées.
- Réglez la luminosité des trois moniteurs sur les valeurs dérivées de l’étape 2.3.4 pour vous assurer que leurs valeurs de luminance sont les mêmes pour la même valeur de pixel.
- Générez un tambour virtuel, qui est utilisé pour stimuler le comportement OKR, avec la boîte à outils de stimulation visuelle, comme décrit ci-dessous.
- Présentez un réseau sinusoïdal vertical sur les moniteurs et ajustez la période (espacement entre les bandes) le long de l’azimut pour assurer que la projection du réseau sur l’œil a une fréquence spatiale constante (réseau à tambour ; Figure 1B, au milieu et à droite).
- Assurez-vous que la tête de l’animal est fixée au centre de l’enclos afin qu’il voie que le réseau a une fréquence spatiale constante sur toute la surface du tambour virtuel.
- Modifiez les paramètres du réseau mobile, tels que l’amplitude oscillatoire, la fréquence spatiale, la fréquence temporelle/d’oscillation, la direction, le contraste, etc., dans les codes de stimulation visuelle. Utilisez deux types de mouvement visuel : (1) le réseau dérive dans le sens des aiguilles d’une montre ou dans le sens inverse des aiguilles d’une montre de manière oscillatoire suivant une fonction sinusoïdale :
Ici, Amp est l’amplitude de la trajectoire du tambour, f est la fréquence d’oscillation, et t est le temps (amplitude d’oscillation : 5° ; fréquence spatiale réseau : 0,04-0,45 cpd ; fréquence d’oscillation : 0,1-0,8 Hz, correspondant à une vitesse de crête du stimulus de 3,14-25,12 °/s [vitesse du tambour = Amp x 2π x f x cos (2π x f x t) ; contraste : 80%-100%; luminance moyenne : 35-45 cd/m2 ; (2) le réseau dérive unidirectionnellement à une vitesse constante :
(Fréquence spatiale : 0,04-0,64 cpd ; fréquence temporelle : 0,25-1 Hz ; vitesse du tambour = fréquence temporelle/fréquence spatiale.)
- Configurez la vidéo-oculographie comme décrit ci-dessous.
- Pour éviter le blocage du champ visuel de l’animal, placez un miroir infrarouge (IR) à 60° de la ligne médiane pour former une image de l’œil droit.
- Placez une caméra infrarouge sur le côté droit derrière la souris (Figure 1C à gauche) pour capturer une image de l’œil droit.
- Montez la caméra infrarouge haute vitesse sur un bras de caméra qui permet à la caméra de pivoter d'± 10° autour de l’image de l’œil droit (Figure 1C à droite).
- Utilisez une photodiode fixée à l’un des moniteurs pour fournir un signal électrique afin de synchroniser le moment de la vidéo-oculographie et de la stimulation visuelle.
- Placez quatre diodes électroluminescentes (DEL) IR soutenues par des bras en col de cygne autour de l’œil droit pour fournir un éclairage IR de l’œil.
- Placez deux LED IR sur la caméra pour fournir des références de réflexion cornéenne (CR) : l’une est fixée au-dessus de la caméra (X-CR), tandis que l’autre se trouve sur le côté gauche de la caméra (Y-CR ; Graphique 1D).
- Mesurez le grossissement optique du système de vidéo-oculographie à l’aide d’une lame d’étalonnage.
REMARQUE : Les CR de référence sont utilisés pour annuler les mouvements de translation de l’œil lorsque l’angle de l’œil est calculé en fonction des mouvements de rotation de l’œil.
- Fixez la tête de l’animal au centre de l’enclos formé par les moniteurs, comme décrit ci-dessous.
- Fixez la tête de l’animal avec la plaque de tête au centre du montage et faites-le face vers l’avant. Ajustez l’inclinaison de la tête de manière à ce que les yeux gauche et droit soient de niveau et que les coins nasal et temporal des yeux soient alignés horizontalement (Figure 1E).
- Déplacez la tête de l’animal horizontalement par un réglage grossier fourni par l’appareil de fixation de la tête et un réglage fin fourni par une platine de translation 2D, et verticalement à travers l’appareil de fixation de la tête et une paire poteau/support de poteau, jusqu’à ce que l’œil droit de l’animal apparaisse dans la vidéo en direct de la caméra. Avant l’étalonnage et la mesure des mouvements oculaires, superposez l’image de l’œil droit de l’animal réfléchie par le miroir chaud avec le point de pivot du bras de la caméra (voir les détails à l’étape 3.4 ci-dessous).
- Construisez un boîtier personnalisé autour de la plate-forme OKR pour bloquer la lumière de la pièce (Figure 1F).
3. Calibrage des mouvements oculaires
REMARQUE : Les mouvements oculaires de rotation sont calculés sur la base des mouvements de la pupille et du rayon de l’orbite des mouvements pupillaires (Rp, la distance entre le centre de la pupille et le centre du globe oculaire). Pour chaque souris, ce rayon est mesuré expérimentalement21.
- Fixez la tête de l’animal au centre de l’enclos formé par les trois moniteurs, comme décrit à l’étape 2.6.1.
- Allumez l’appareil photo et ajustez les quatre LED entourant l’œil droit pour obtenir un éclairage IR uniforme.
- Sous guidage visuel, ajustez la position de l’œil droit jusqu’à ce qu’il apparaisse au centre de la vidéo, comme décrit à l’étape 2.6.2.
- Alignez l’image virtuelle de l’œil droit avec le point de pivot du bras de la caméra, comme décrit ci-dessous.
- Faites pivoter manuellement le bras de la caméra vers l’extrémité gauche (-10°). Déplacez manuellement la position de l’œil droit de l’animal sur le plan horizontal perpendiculaire à l’axe optique avec un réglage fin de la platine de translation 2D (Figure 1C, flèche verte), jusqu’à ce que le X-CR soit au centre horizontal de l’image.
- Faites pivoter manuellement le bras de la caméra vers l’autre extrémité (+10°). Si le X-CR s’éloigne du centre de l’image, déplacez l’œil droit le long de l’axe optique avec un réglage fin jusqu’à ce que le X-CR arrive au centre (Figure 1C, flèche bleue).
- Répétez les étapes 3.4.1 à 3.4.2 plusieurs fois jusqu’à ce que le X-CR reste au centre lorsque le bras de la caméra pivote vers la gauche et vers la droite. Si l’œil droit bouge au milieu d’une répétition, recommencez le processus d’ajustement.
- Mesurez la distance verticale entre le Y-CR et le X-CR après avoir verrouillé le bras de la caméra en position centrale. Allumez la LED Y-CR et enregistrez sa position sur la vidéo, puis passez à la LED X-CR et enregistrez sa position.
REMARQUE : La distance verticale entre le Y-CR et le X-CR sera utilisée pour dériver la position du Y-CR pendant la mesure des mouvements oculaires dans laquelle seule la LED X-CR est allumée. - Mesurez le rayon de rotation de la pupille Rp, comme décrit ci-dessous.
- Faites pivoter le bras de la caméra vers l’extrémité gauche (-10°) et enregistrez les positions de la pupille (Pp1) et X-CR (PCR1) sur la vidéo.
- Ensuite, faites pivoter le bras de la caméra vers l’extrémité droite (+10°) et enregistrez les positions de la pupille (Pp2) et X-CR (PCR2) sur la vidéo. Répétez cette étape plusieurs fois.
REMARQUE : L’œil droit de l’animal doit rester immobile pendant chaque répétition afin que la quantité de mouvements de la pupille dans le film reflète avec précision le degré de balancement du bras de la caméra. - Sur la base des valeurs enregistrées ci-dessus, calculez le rayon de rotation de la pupille Rp (Figure 2A) à l’aide de la formule suivante :
REMARQUE : La distance entre la réflexion cornéenne et le centre de la pupille dans l’espace physique est calculée en fonction de leur distance dans le film :
PCR - Pp = nombre de pixels dans le film x taille de pixel de la puce de l’appareil photo x grossissement
- Développer la relation entre Rp et le diamètre de la pupille, comme décrit ci-dessous. Rp change lorsque la pupille se dilate ou se contracte ; sa valeur est inversement proportionnelle à la taille de la pupille (figure 2B en haut).
- Modifiez systématiquement la luminance des moniteurs de 0 à 160 cd/m2 pour réguler la taille de la pupille.
- Pour chaque valeur de luminance, répétez l’étape 3.6 8 à 10 fois et notez le diamètre de la pupille.
- Appliquer une régression linéaire à la relation entre Rp et le diamètre de la pupille en fonction des valeurs mesurées ci-dessus pour dériver la pente et l’ordonnée à l’origine (figure 2B en bas).
REMARQUE : Les valeurs aberrantes causées par des mouvements oculaires occasionnels sont éliminées avant l’ajustement linéaire. Pour les mesures répétitives en plusieurs sessions, l’étalonnage ne doit être effectué qu’une seule fois pour un animal, à moins que son œil ne grossisse pendant l’expérience.
4. Enregistrez les mouvements oculaires de l’OKR
- Fixez une souris dans la plate-forme en suivant les étapes 3.1 à 3.4. Ignorez cette étape si l’enregistrement a lieu juste après l’étalonnage. Verrouillez le bras de l’appareil photo en position centrale.
- Configurez les moniteurs et l’animal pour les OKR scotopiques comme décrit ci-dessous. Ignorez cette étape pour les OKR photopiques.
- Couvrez l’écran de chaque moniteur avec un filtre personnalisé, composé de cinq couches de film 1,2 densité neutre (ND). Assurez-vous qu’aucune lumière ne s’échappe par l’espace entre le filtre et le moniteur.
- Éteignez la lumière de la pièce. Les étapes suivantes se font à l’aide d’un masque IR.
- Appliquez une goutte de solution de pilocarpine (2% dans le sérum physiologique) sur l’œil droit et attendez 15 min. Assurez-vous que la goutte reste sur l’œil et n’est pas essuyée par la souris. Si la solution est essuyée par l’animal, appliquez une autre goutte de solution de pilocarpine. Cela réduit la pupille à une taille appropriée pour le suivi oculaire dans la condition scotopique.
REMARQUE : Dans la condition scotopique, la pupille se dilate considérablement de sorte que son bord est partiellement caché derrière la paupière. Cela affecte la précision de l’estimation du centre pupillaire par vidéo-oculographie. Le rétrécissement pharmacologique de la pupille de l’œil droit diminue son entrée visuelle, et donc les stimuli visuels sont présentés à l’œil gauche. - Rincez l’œil droit avec une solution saline pour éliminer soigneusement la solution de pilocarpine. Tirez le rideau vers le bas pour sceller complètement l’enceinte, ce qui empêche la lumière parasite d’interférer avec la vision scotopique.
- Donnez à l’animal 5 minutes pour s’adapter complètement à l’environnement scotopique avant de commencer le test OKR.
- Exécutez le logiciel de stimulation visuelle et le logiciel de suivi oculaire. Pour la mesure des OKR photopiques, assurez-vous que le réseau du tambour oscille horizontalement avec une trajectoire sinusoïdale ; pour la mesure des OKR scotopiques, assurez-vous que le réseau du tambour dérive à une vitesse constante de gauche à droite, qui est la direction temporo-nasale par rapport à l’œil gauche.
REMARQUE : Lorsque la pupille de l’œil droit, mais pas de l’œil gauche, est rétrécie par la pilocarpine dans la condition scotopique, l’OKR induit par la stimulation du tambour oscillatoire est très asymétrique. Ainsi, pour la mesure des OKR scotopiques, l’œil gauche est stimulé tandis que le mouvement de l’œil droit est surveillé. - Le logiciel de suivi oculaire mesure automatiquement la taille de la pupille, la position CR et la position de la pupille pour chaque image, et calcule l’angle de position de l’œil en fonction de la formule suivante (Figure 2C) :
Ici, PCR est la position CR, P p est la position de la pupille et Rp est le rayon de rotation de la pupille. La distance entre la réflexion cornéenne et le centre de la pupille dans l’espace physique est calculée en fonction de leur distance dans le film :
PCR - Pp = nombre de pixels dans le film x taille de pixel de la puce de l’appareil photo x grossissement
Rp de la taille de la pupille correspondante est calculé sur la base du modèle de régression linéaire de l’étape 3.7.3 (figure 2B du bas).
5. Analyse des mouvements oculaires de l’OKR avec le logiciel d’analyse oculaire
- Traitez les traces oculaires à l’aide d’un filtre médian (fenêtre de filtre = 0,05 s) pour éliminer le bruit à haute fréquence (figure 3A au milieu).
- Retirez les saccades ou le nystagmus comme décrit ci-dessous.
- Estimez la vitesse de l’œil en calculant la dérivée du premier ordre des mouvements oculaires (figure 3A en bas). Identifier les saccades ou nystagmus en appliquant un seuil de vitesse de 50 °/s (Figure 3A en bas).
- Remplacez les saccades ou nystagmus en extrapolant les positions oculaires pendant ces mouvements oculaires rapides à partir du segment précédant les saccades ou le nystagmus sur la base d’une régression linéaire (Figure 3B).
- Calculez l’amplitude des mouvements oculaires OKR par transformée de Fourier rapide (algorithme de Goertzel) si le réseau de tambour oscille (Figure 3C), ou calculez la vitesse moyenne des mouvements oculaires pendant la stimulation visuelle si le réseau de tambour se déplace à une vitesse constante dans une direction (Figure 3B en bas).
NOTE : L’amplitude des mouvements oculaires oscillatoires dérivés de la transformée de Fourier est similaire à l’amplitude dérivée de l’ajustement de la trajectoire de l’œil avec une fonction sinusoïdale (Figure 3D). - Calculez le gain OKR. Pour le mouvement oscillatoire du tambour, le gain OKR est défini comme le rapport entre l’amplitude des mouvements oculaires et l’amplitude des mouvements du tambour (Figure 3C à droite). Pour le mouvement unidirectionnel du tambour, le gain OKR est défini comme le rapport entre la vitesse de l’œil et la vitesse du réseau du tambour (Figure 3B en bas).
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Representative Results
Avec la procédure détaillée ci-dessus, nous avons évalué la dépendance de l’OKR sur plusieurs caractéristiques visuelles. Les exemples de traces présentés ici ont été dérivés à l’aide des codes d’analyse fournis dans le fichier de codage supplémentaire 1, et l’exemple de fichier brut de traces se trouve dans le fichier de codage supplémentaire 2. Lorsque le réseau du tambour dérivait sur une trajectoire sinusoïdale (0,4 Hz), l’œil de l’animal suivait automatiquement le mouvement du réseau d’une manière oscillatoire similaire (panneau supérieur de la figure 3B), ce qui est caractéristique du comportement OKR2,5,8. L’amplitude des mouvements oculaires des OKR sur l’axe horizontal a été calculée à l’aide de la transformée de Fourier rapide (Figure 3C&D), et le gain des OKR a été calculé comme le rapport entre l’amplitude des mouvements oculaires et l’amplitude du mouvement du réseau (Figure 3C). Le gain OKR variait en fonction des valeurs de la fréquence spatiale, de la fréquence d’oscillation et du réseau de direction du mouvement (Figure 4A). Tout d’abord, la courbe de réglage de la fréquence spatiale du comportement OKR avait une forme en V inversée et culminait à une fréquence spatiale intermédiaire de 0,16 cpd (Figure 4A à gauche). Deuxièmement, la courbe d’accord de la fréquence d’oscillation a diminué de manière monotone à mesure que la fréquence d’oscillation du réseau du tambour augmentait (Figure 4A au milieu), ce qui indique que le comportement OKR fonctionne mieux en réponse au mouvement visuel à basse vitesse4. L’amplitude et la forme de la courbe d’accord de la fréquence d’oscillation variaient lors de la présentation de réseaux de différentes fréquences spatiales17. Troisièmement, l’OKR horizontal pourrait également être induit par des réseaux se déplaçant dans des directions différentes (Figure 4A à droite). Le comportement OKR horizontal le plus fort a été provoqué par le mouvement temporo-nasal (0°). Le gain d’OKR est tombé à ~80 %, soit ~30 % du maximum, lorsque le réseau s’est déplacé dans des angles obliques de 30° ou 60° a dévié de la direction temporo-nasale (à la fois vers le haut et vers le bas), respectivement, et l’OKR horizontal a disparu lorsque le réseau s’est déplacé verticalement vers le haut ou vers le bas (90° et 270°). De plus, les formes des courbes d’accord ont été influencées par le niveau de luminance. Par exemple, les animaux ont bien exécuté le comportement OKR en réponse à des fréquences spatiales de 0,16 et 0,32 cpd dans la condition photopique, mais la courbe d’accord de la fréquence spatiale s’est déplacée vers la gauche dans la condition scotopique (Figure 4B). Pour analyser la forme des courbes d’accordage, nous les ajustons avec des fonctions mathématiques appropriées. Par exemple, la fonction gaussienne a été utilisée pour estimer le pic et la largeur de bande de l’accord spatial des fréquences (Figure 4C). Avec cette analyse, nous avons constaté que la courbe d’accord dans la condition scotopique avait une valeur plus faible dans la fréquence spatiale préférée par rapport à la condition photopique. La procédure détaillée ci-dessus peut également être utilisée pour quantifier la plasticité du comportement des OKR. Après 45 minutes de stimulation continue des OKR, l’amplitude du comportement des OKR a été significativement potentialisée (Figure 4D), ce qui est cohérent avec les rapports précédents. Ces résultats démontrent les applications de ce protocole dans l’examen des comportements oculomoteurs et des potentiels dans la compréhension des circuits cérébraux impliqués dans ces comportements.
Figure 1 : Configuration de l’installation OKR. (A) Dimensions de la barre de tête. (B) Vue arrière (à gauche) et vue de dessus (au milieu) du système de batterie virtuelle. Trois moniteurs sont montés orthogonalement l’un à l’autre. La tête d’une souris est placée au centre de l’enceinte carrée et tournée vers l’avant. La période de stimulation visuelle (espace entre les bandes) varie en fonction de l’azimut de l’œil de l’animal afin d’assurer une fréquence spatiale constante de projection du réseau sur l’œil. En d’autres termes, la fréquence spatiale du réseau est perçue comme constante dans tout le champ visuel, comme si le réseau dérivait le long de la surface d’un tambour virtuel (à droite). (C) Mise en place d’une vidéo-oculographie IR. À gauche : la position de la caméra lorsqu’elle est fixée au centre pendant l’enregistrement OKR. Flèche bleue : le long de l’axe optique. Flèche verte : perpendiculaire à l’axe optique. À droite : la rotation de l’appareil photo lors de l’étalonnage de l’œil. (D) Position des LED X-CR et Y-CR fixées sur la caméra. (E) Les niveaux des yeux gauche et droit (à gauche), ainsi que les coins nasal et temporal des yeux sont alignés horizontalement (à droite) en faisant tourner la tige horizontale ou l’adaptateur de plaque frontale, respectivement (flèches rouges). (F) Photo de la station OKR. Notez que la plate-forme OKR est placée à l’intérieur d’un boîtier personnalisé avec un rideau noir. Abréviations : IR = infrarouge ; CR = réflexion cornéenne. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Étalonnage et mesure de la position des yeux en vidéo-oculography. (A) Schéma de l’étalonnage. Le rayon de rotation de la pupille (Rp) est estimé en faisant pivoter la caméra vers la position la plus à gauche (-10°, panneau de gauche) et vers la position la plus à droite (10°, panneau de droite). Les points rouges indiquent les positions de réflexion cornéenne X-CR lorsque la caméra est placée dans les positions les plus à gauche et les plus à droite. Les points bleus indiquent les centres des pupilles. Les barres vertes indiquent les distances entre la réflexion cornéenne et le centre de la pupille visualisées dans la vidéo de la caméra (PCR - PP). (B) Dépendance de Rp à la taille de la pupille. En haut : schémas des globes oculaires avec une pupille petite ou grande. En bas : relation entre Rp et le diamètre de la pupille d’une souris d’exemple. La taille de la pupille est modifiée en faisant varier la luminance (10 valeurs dans la plage de 0 à 160 cd/m2) par rapport à la souris. Points noirs : les données utilisées pour l’ajustement linéaire. Points bleus : valeurs aberrantes exclues de l’ajustement linéaire. Courbe rouge : la droite la mieux ajustée en régression linéaire. Notez que le Rp est inversement proportionnel au diamètre de la pupille. (C) Calcul de l’angle de position de l’œil lorsque l’œil s’est déplacé vers le côté droit ou gauche de l’axe optique. Les points rouges, les points bleus et les barres vertes ont les mêmes significations que dans A. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Calcul du gain OKR. (A) En haut : instantanés de la position nasale (N ; gauche) et temporale (T ; droite) de l’œil prise lors de la stimulation OKR. Ellipses rouges : s’adaptent au profil de la pupille. Croix-rouge : centres d’élèves. Flèches blanches : réflexion cornéenne d’une LED de référence. Milieu : les trajectoires des mouvements oculaires avec (noir) ou sans (rouge) filtre médian (fenêtre de filtre = 0,05 s) pour supprimer les bruits à haute fréquence. En bas : estimation de la vitesse de l’œil en calculant la dérivée du premier ordre des mouvements oculaires. Les saccades (flèches rouges) sont détectées avec un seuil de vitesse de 50 °/s. (B) La trajectoire des mouvements oculaires lents de l’OKR après suppression des saccades/nystagmus (noirs) superposée à la trajectoire du tambour22. En haut : mouvement oscillatoire du tambour d’une amplitude de 5° et d’une fréquence d’oscillation de 0,4 Hz. En bas : mouvement unidirectionnel (temporo-nasal) du tambour avec une vitesse constante de 6,25 °/s. (C) À gauche : la moyenne cyclique de la trajectoire de l’œil en B en haut. A droite : l’analyse fréquentielle des mouvements de l’œil ou du réseau de tambour par transformée de Fourier rapide. Il convient de noter que le réseau du tambour oscille à 0,4 Hz, et donc les amplitudes du mouvement de l’œil et du tambour culminent à 0,4 Hz (marques d’étoiles). Le gain OKR est le rapport entre les amplitudes du mouvement de l’œil et du tambour à 0,4 Hz. (D) En haut : ajustement de la courbe de la trajectoire de l’œil en B en haut avec fonction sinusoïdale. En bas : relation de l’amplitude des mouvements oculaires dérivée de la méthode de la transformée de Fourier rapide et dérivée de l’ajustement de courbe sinusoïdale. Point jaune : exemple en haut. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : La sélectivité et la plasticité des comportements OKR des caractéristiques visuelles. (A) La sélectivité visuelle du gain OKR dans la condition photopique. À gauche : courbe d’accord de fréquence spatiale d’un animal (fréquence d’oscillation : 0,4 Hz ; trajectoire : oscillant horizontalement ; luminance moyenne : 40 cd/m2 ; n = 15). Milieu : courbe d’accord de la fréquence d’oscillation d’un animal (fréquence spatiale : 0,08 ou 0,16 cpd ; trajectoire : oscillant horizontalement ; luminance moyenne : 40 cd/m2 ; n = 15). À droite : courbe d’accord de direction d’un animal (fréquence spatiale : 0,16 cpd ; fréquence temporelle : 1 Hz ; luminance moyenne : 45 cd/m2 ; n = 24). La flèche et la barre rouges indiquent la direction temporo-nasale. Pour l’accord de fréquence spatiale et temporelle/oscillation, un réseau de tambour vertical présenté sur trois moniteurs se déplace horizontalement à une vitesse constante ou de manière oscillatoire. Pour le réglage de la direction, un réseau présenté uniquement sur le moniteur de droite se déplace dans l’une des 12 directions à une vitesse constante. Epaisseur : erreur type de la moyenne (MEB). (B) Courbe d’accord de fréquence spatiale du gain OKR d’un animal dans la condition scotopique ou photopique. Photopic : mouvement oscillatoire ; fréquence d’oscillation : 0,2 Hz ; luminance moyenne : 40 cd/m2 ; n = 15. Scotopique : mouvement linéaire à vitesse constante ; fréquence temporelle : 0,25 Hz ; luminance moyenne : 8 x 10-5 cd/m2 ; n = 16. L’état scotopique est obtenu en recouvrant les moniteurs de cinq couches de filtre de Lee (299 1.2 ND). Epaisseur : MEB. (C) Ajustement gaussien de l’ajustement spatial de la fréquence du gain OKR dans des conditions photopiques et scotopiques. Photopic : mouvement oscillatoire ; fréquence d’oscillation : 0,2 Hz ; luminance moyenne : 40 cd/m2 ; n = 15. Scotopique : mouvement linéaire à vitesse constante ; fréquence temporelle : 0,25 Hz ; luminance moyenne : 8 x 10-5 cd/m2 ; n = 16. (D) Potentialisation OKR d’une souris induite par 45 min de stimulation OKR continue. Fréquence spatiale : 0,1 cpd ; fréquence d’oscillation : 0,4 Hz ; luminance moyenne : 35 cd/m2 ; n = 40. En haut : trajectoires moyennes des OKR du cycle avant et après la potentialisation des OKR. Epaisseur : MEB. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Fichier de codage supplémentaire 1 : code d’analyse utilisé pour générer les exemples de traces. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Fichier de codage supplémentaire 2 : Exemples de traces générées avec le logiciel. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
La méthode du test comportemental OKR présentée ici offre plusieurs avantages. Tout d’abord, la stimulation visuelle générée par ordinateur résout les problèmes intrinsèques de la batterie physique. Traitant du problème que les tambours physiques ne prennent pas en charge l’examen systématique de la fréquence spatiale, de la direction ou de l’accord de contraste8, le tambour virtuel permet de modifier ces paramètres visuels essai par essai, facilitant ainsi une analyse systématique et quantitative de la sélectivité des caractéristiques du comportement OKR (Figure 4A) ; Alors que les tambours physiques souffrent d’un éclairage non uniforme par une source de lumière externe23, le tambour virtuel peut facilement fournir une luminance homogène sur toute sa surface ; à l’aide de filtres ND et d’un appareil de mesure de la luminance, la stimulation visuelle générée par ordinateur permet la mesure des OKR à différents niveaux de luminance bien contrôlés, du scotopique au photopique (Figure 4B), ce qui est difficile à réaliser avec des tambours physiques. Sans la limitation de l’accélération des tambours physiques due à leur masse inertielle, la stimulation visuelle virtuelle peut atteindre des trajectoires parfaitement précises, en particulier à forte accélération et à grande vitesse. De plus, la stimulation visuelle générée par ordinateur permet la conception créative d’autres types de stimulation visuelle, tels que des points en mouvement cohérent, ce qui permet d’étudier les mécanismes de divers comportements oculomoteurs. Deuxièmement, notre procédure est standardisée et nécessite donc un minimum d’efforts pour surveiller la progression de l’enregistrement comportemental, ce qui permet d’examiner plusieurs souris simultanément. Par conséquent, il convient aux études impliquant une grande cohorte d’animaux (des dizaines à des centaines d’animaux). Troisièmement, la haute précision et la puissance quantitative permettent de comparer des mesures répétitives d’OKR sur les mêmes souris dans des études longitudinales24, sous différents traitements pharmacologiques10, ou sous des perturbations du circuit neuronal5. Enfin, l’analyse basée sur la transformée de Fourier dans le domaine fréquentiel 5,7,9 donne des résultats équivalents dans l’amplitude des mouvements oscillatoires oculaires à l’analyse basée sur l’ajustement dans le domaine temporel12,25,26 (Figure 3D du bas), démontrant que la méthode d’analyse présentée ici est à la fois exacte et précise.
Notre méthode offre également l’opportunité d’étudier la plasticité des OKR, un paradigme très utilisé pour étudier les mécanismes de l’apprentissage oculomoteur. Lors de la présentation d’une stimulation OKR continue à une souris ou d’une lésion chirurgicale de son organe vestibulaire, l’amplitude de l’OKR peut être potentialisée 8,9. Le test OKR présenté ici est suffisamment sensible pour capturer de petits changements dans les mouvements oculaires qui se produisent lors de la potentialisation OKR (Figure 4D). La puissance quantitative de cette méthode permet de corréler les changements de comportement avec la dynamique des circuits neuronaux, ce qui est essentiel pour révéler les mécanismes sous-jacents à l’apprentissage oculomoteur 5,8,9,13.
Pour garantir la précision de la mesure des OKR, il y a quelques étapes critiques. Tout d’abord, pendant la chirurgie, des précautions supplémentaires sont nécessaires pour éviter que la superglue et l’acrylique dentaire ne touchent la paupière, ce qui pourrait endommager la cornée ou obstruer partiellement l’ouverture de l’œil. Deuxièmement, la force de l’OKR est affectée par l’état comportemental des souris27,28. Ainsi, quelques séries d’accommodements sont recommandées pour minimiser l’impact du stress sur la mesure des OKR ; De plus, les perturbations causées par les odorants, le bruit ou la lumière doivent être évitées pendant l’enregistrement. Enfin, la tête des souris doit être correctement orientée de manière à ce que la ligne reliant les deux coins des yeux soit parallèle à l’axe horizontal. Cela garantit que la direction du mouvement visuel est alignée avec l’axe d’adduction et les mouvements oculaires d’abduction. Troisièmement, l’éclairage uniforme de l’œil est essentiel pour générer une image nette de la pupille et assurer à son tour un suivi oculaire de haute qualité.
Il convient de noter qu’il existe quelques limites aux méthodes présentées ici. Tout d’abord, lorsque l’œil d’un animal cligne ou qu’un écoulement oculaire opaque bloque la pupille, la vidéo-oculographie perd la trace de l’œil momentanément ou définitivement. De même, il ne peut pas être utilisé pour surveiller les mouvements oculaires lorsque les paupières sont suturées. Deuxièmement, la résolution temporelle de la vidéo-oculographie est limitée par la fréquence d’images des caméras à une plage de 4 à 20 ms. Enfin, la préparation à tête fixe ne permet pas de surveiller les comportements oculaires des animaux se déplaçant librement.
La vidéo-oculographie et le tambour virtuel présentés ici ont été appliqués avec succès pour caractériser la sélectivité des caractéristiques visuelles et la plasticité du comportement des OKR, et pour comprendre les circuits rétiniens et centraux impliqués dans la médiation et la modulation adaptative de ce comportement. En outre, ils peuvent également bénéficier à des études dans lesquelles d’autres comportements oculaires sont soit les sujets, soit même des facteurs de confusion des phénomènes neuronaux. Par exemple, la vidéo-oculographie peut être utilisée pour surveiller la dilatation de la pupille29 et les mouvements oculaires en forme de saccade 30,31, qui sont indicatifs de la vigilance et de l’état du cerveau32,33,34,35. De plus, les procédures d’étalonnage et de mesure décrites ici sont universellement applicables pour surveiller les mouvements oculaires à l’aide d’une caméra montée sur la tête chez les souris se déplaçant librement.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent pas d’intérêts concurrents.
Acknowledgments
Nous sommes reconnaissants à Yingtian He d’avoir partagé les données de réglage de la direction. Ces travaux ont été financés par des subventions de la Fondation canadienne pour l’innovation et du Fonds pour la recherche en Ontario (projet no 37597 de la FCI/FCO), du CRSNG (RGPIN-2019-06479), des IRSC (subvention Projet 437007) et des bourses Connaught pour nouveaux chercheurs.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2D translational stage | Thorlabs | XYT1 | |
| Acrylic resin | Lang Dental | B1356 | For fixing headplate on skull and protecting skull |
| Bupivacaine | STERIMAX | ST-BX223 | Bupivacaine Injection BP 0.5%. Local anesthesia |
| Carprofen | RIMADYL | 8507-14-1 | Analgesia |
| Compressed air | Dust-Off | ||
| Eye ointment | Alcon | Systane | For maintaining moisture of eyes |
| Graphic card | NVIDIA | Geforce GTX 1650 or Quadro P620. | For generating single screen among three monitors |
| Heating pad | Kent Scientific | HTP-1500 | For maintaining body temperature |
| High-speed infrared (IR) camera | Teledyne Dalsa | G3-GM12-M0640 | For recording eye rotation |
| IR LED | Digikey | PDI-E803-ND | For CR reference and the illumination of the eye |
| IR mirror | Edmund optics | 64-471 | For reflecting image of eye |
| Isoflurane | FRESENIUS KABI | CP0406V2 | |
| Labview | National instruments | version 2014 | eye tracking |
| Lactated ringer | BAXTER | JB2324 | Water and energy supply |
| Lidocaine and epinephrine mix | Dentsply Sirona | 82215-1 | XYLOCAINE. Local anesthesia |
| Luminance Meter | Konica Minolta | LS-150 | for calibration of monitors |
| Matlab | MathWorks | version xxx | analysis of eye movements |
| Meyhoefer Curette | World Precision Instruments | 501773 | For scraping skull and removing fascia |
| Microscope calibration slide | Amscope | MR095 | to measure the magnification of video-oculography |
| Monitors | Acer | B247W | Visual stimulation |
| Neutral density filter | Lee filters | 299 | to generate scotopic visual stimulation |
| Nigh vision goggle | Alpha optics | AO-3277 | for scotopic OKR |
| Photodiode | Digikey | TSL254-R-LF-ND | to synchronize visual stimulation and video-oculography |
| Pilocarpine hydrochloride | Sigma-Aldrich | P6503 | |
| Post | Thorlabs | TR1.5 | |
| Post holder | Thorlabs | PH1 | |
| PsychoPy | open source software | version xxx | visual stimulation toolkit |
| Scissor | RWD | S12003-09 | For skin removal |
| Superglue | Krazy Glue | Type: All purpose. For adhering headplate on the skull |
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