Summary
ここでは、視運動性反射を定量化するための標準プロトコルについて説明します。仮想ドラム刺激とビデオ眼球撮影を組み合わせることで、行動の特徴選択性とその適応可塑性を正確に評価することができます。
Abstract
視運動性反射(OKR)は、視覚環境の全体的な動きによって引き起こされ、網膜画像を安定させるのに役立つ重要な先天的な眼球運動です。OKRは、その重要性と堅牢性から、視覚運動学習の研究や、遺伝的背景、年齢、薬物治療の異なるマウスの視覚機能の評価に使用されてきました。ここでは、頭部固定マウスのOKR応答を高精度に評価するための手順を紹介します。頭部固定は、前庭刺激が眼球運動に寄与することを除外することができ、視覚運動のみによって引き起こされる眼球運動を測定することが可能になります。OKRは、3台のコンピュータモニターに表示される垂直グレーティングが、水平方向に振動的に、または一方向に等速でドリフトする仮想ドラムシステムによって引き出されます。このバーチャルリアリティシステムにより、空間周波数、時間/振動周波数、コントラスト、輝度、回折格子の方向などの視覚パラメータを体系的に変更し、視覚特徴選択性のチューニング曲線を定量化することができます。高速赤外線ビデオ眼球撮影により、眼球運動の軌跡を正確に測定できます。個々のマウスの目は、年齢、性別、遺伝的背景の異なる動物間でOKRを比較する機会を提供するように調整されています。この手法の定量的な力により、この行動が加齢、感覚経験、または運動学習によって可塑的に適応するときの OKR の変化を検出できます。したがって、この手法は、眼の行動の可塑性を調査するために使用されるツールのレパートリーに貴重な追加になります。
Introduction
環境内の視覚刺激に反応して、私たちの目は、視線を移動したり、網膜画像を安定させたり、移動するターゲットを追跡したり、観察者から異なる距離にあるターゲットに2つの目の中心窩を合わせたりするために動きます1,2。動眼行動は、少なくとも部分的には眼球運動系が単純であることから、健康と疾患の神経回路を理解するための感覚運動統合の魅力的なモデルとして広く用いられてきた3。眼球は3対の外眼筋によって制御され、眼窩内で主に3つの対応する軸を中心に回転します:横軸に沿った挙上と下降、垂直軸に沿った内転と外転、前後軸に沿ったねじれと外転1,2。このようなシンプルなシステムにより、研究者は実験室環境でマウスの動眼行動を簡単かつ正確に評価することができます。
主な動眼運動行動の1つは、視運動性反射(OKR)です。この不随意眼球運動は、網膜上の画像のゆっくりとしたドリフトまたはスリップによって引き起こされ、動物の頭部またはその周囲が動くときに網膜画像を安定させるのに役立ちます2,4。行動パラダイムとしてのOKRは、いくつかの理由で研究者にとって興味深いものです。第一に、確実に刺激し、正確に定量することができる5,6。第二に、この行動を定量化する手順は比較的単純で標準化されており、動物の大規模なコホートの視覚機能を評価するために適用することができます7。第三に、この生得的な振る舞いは高度に可塑的である5,8,9。その振幅は、反復的な網膜スリップが長時間発生する場合5,8,9、または前庭入力2によって引き起こされる網膜画像を安定化する別のメカニズムである作業パートナーの前庭眼反射(VOR)が損なわれる場合に増強され得る5。OKR増強のこれらの実験パラダイムは、研究者が眼球運動学習の根底にある回路基盤を明らかにする力を与えます。
以前の研究では、主に 2 つの非侵襲的な方法が OKR の評価に使用されてきました: (1) ビデオ眼球撮影と物理ドラムの組み合わせ 7,10,11,12,13 または (2) 仮想ドラムと組み合わせたヘッドターンの任意の決定 6,14,15,16 .これらのアプリケーションは、眼球運動可塑性の分子および回路メカニズムを理解する上で実りある発見をもたらしましたが、これら2つの方法にはそれぞれいくつかの欠点があり、OKRの特性を定量的に調べる能力が制限されています。第一に、黒と白の縞模様やドットのパターンが印刷された物理的なドラムは、視覚パターンを簡単かつ迅速に変更することができず、空間周波数、方向、移動格子のコントラストなどの特定の視覚的特徴に対するOKRの依存性の測定を大きく制限します8,17。代わりに、これらの視覚的特徴に対する OKR の選択性のテストは、視覚的特徴を試行ごとに便利に変更できるコンピューター化された視覚刺激の恩恵を受けることができます。このようにして、研究者は多次元の視覚パラメータ空間でOKRの挙動を体系的に調べることができます。さらに、OKRアッセイの2番目の方法は、識別可能なOKRをトリガーする視覚パラメータの閾値のみを報告し、目または頭の動きの振幅は報告しません6,14,15,16。したがって、定量的検出力の欠如は、同調曲線の形状と好ましい視覚的特徴の分析、または正常状態と病理学的状態における個々のマウス間の微妙な違いの検出を妨げます。上記の制限を克服するために、ビデオ眼画像とコンピューター化された仮想視覚刺激を組み合わせて、最近の研究でOKRの行動をアッセイしました5,17,18,19,20。しかし、これらの以前に発表された研究は、十分な技術的詳細やステップバイステップの指示を提供しておらず、その結果、研究者が自分の研究のためにそのようなOKRテストを確立することは依然として困難です。
ここでは、ビデオ眼球撮影とコンピュータ化された仮想視覚刺激の組み合わせにより、明所視またはスコトープ条件下でのOKR行動の視覚特徴選択性を正確に定量化するプロトコルを提示します。マウスは、前庭刺激によって引き起こされる眼球運動を避けるために頭を固定します。高速度カメラを使用して、視覚パラメータを変化させた移動する格子を見ているマウスの眼球の動きを記録します。個々のマウスの眼球の物理的大きさは、眼球運動の角度を導出する精度を確保するために較正される21。この定量的手法により、年齢や遺伝的背景の異なる動物間でOKRの行動を比較したり、薬理学的治療や視覚運動学習によって引き起こされる変化をモニタリングしたりすることができます。
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Protocol
この研究で実施されたすべての実験手順は、トロント大学動物管理委員会およびカナダ動物管理評議会によって確立されたガイドラインに従って、生物科学地域動物管理委員会によって承認されました。
1.頭蓋骨の上にヘッドバーを埋め込む
注: VOR の動作が眼球運動に寄与するのを避けるため、OKR テスト中はマウスの頭部が固定されます。そのため、頭蓋骨の上にヘッドバーを外科的に埋め込みます。
- マウス(生後2〜5ヶ月の雌雄C57BL/6)をガス室で4%イソフルラン(v/v)とO2 の混合物で麻酔する。マウスをカスタマイズされた手術プラットフォームに移し、イソフルランの濃度を1.5%〜2%に下げます。手術中のつま先つまみ反応と呼吸数をチェックして、麻酔の深さを監視します。
- 動物の体温を維持するために、動物の下に温熱パッドを置きます。両眼に潤滑剤の眼軟膏を塗って、乾燥から保護します。目をアルミホイルで覆い、光の照射から保護します。
- 痛みを軽減するために、20 mg / kgの用量でカルプロフェンを皮下注射します。.グルコン酸クロルヘキシジンスキンクリーナーで毛皮を濡らした後、頭蓋骨の上の毛皮を剃ります。露出した頭皮を70%イソプロピルアルコールとクロルヘキシジンアルコールで2回消毒します。
- 切開部位にブピバカイン(8mg/kg)を皮下注射し、ハサミで頭皮(~1cm2)を切除し、後頭前頭骨、頭頂骨、頭頂間骨を含む頭蓋骨の背側表面を露出させます。
- 露出した頭蓋骨に1%リドカインと1:100,000エピネフリンを数滴塗布して、局所的な痛みと出血を軽減します。Meyhoeferキュレットで頭蓋骨をこすり落として筋膜を取り除き、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄します。
注:側頭筋は頭蓋骨から分離されており、ヘッドバーを取り付けるための表面積を増やします。 - 水分がなくなり、骨が白っぽくなるまで、頭蓋骨の表面に向かって圧縮空気をそっと吹き付けて、頭蓋骨を乾かします。カットした頭皮の端を含む頭蓋骨の露出した表面に瞬間接着剤の薄い層を塗布し、続いてアクリル樹脂の層を塗布します。
注意: 瞬間接着剤を塗布する前に、頭蓋骨の表面に血液や水が付着していない必要があります。 - 頭蓋骨の上の正中線に沿ってステンレス鋼のヘッドバー( 図1Aを参照)を配置します。ヘッドバーの端から始めて、ヘッドバーのベースがアクリル樹脂に完全に埋め込まれるまで、さらにアクリル樹脂を塗布します。アクリル樹脂を2〜3回塗布して厚みを増します。
- アクリル樹脂が固まるまで15分ほど待ちます。1 mLの授乳リンガー溶液を皮下に注射します。.次に、動物が完全に動くようになるまで、マウスを加熱パッドの上に置かれたケージに戻します。
- 手術後少なくとも5日間はホームケージでマウスを回復させます。動物の体調が良いら、OKRセットアップでヘッドバーで頭を15〜30分間固定して、頭の固定と実験環境に慣れさせます。習熟を1日1回、少なくとも3日間繰り返します。
2. バーチャルドラムとビデオオキュログラフィーのセットアップ
- 3台のモニターを互いに直交して取り付け、視認空間の方位角~270°、仰角63°をカバーする正方形の筐体を形成します(図1B左)。
- ディスクリートグラフィックカードを使用して、3台のモニターをシンプルなディスプレイに統合し、すべてのモニター間で同期を確保します。
- 以下で説明するように、モニターの輝度を調整します。
- モニターが接続されているコンピューターの電源を入れ、15分間待ちます。ウォームアップは、安定した輝度を得るために不可欠です。
- モニターの明るさ設定を0から100まで25段階で体系的に変更します。
- 輝度値ごとに、輝度計を使用して、さまざまなピクセル値(0〜255、15ステップ)でモニターの輝度を測定します。
- ピクセル値 255 の輝度と明るさの関係を線形回帰で当てはめ、160 cd/m2 になる明るさの値を推定します。
- 輝度測定(ステップ2.3.3)で用いた画素値ごとに、ステップ2.3.4で導出した輝度値の輝度を線形回帰に基づいて推定します。べき関数 lum = A * pixel γ を使用して、新しい輝度値のセット (2.3.4 で導出された輝度値の下) とそれに対応するピクセル値との関係を当てはめ、ガンマ係数 γと係数 A を導出します。これらは、所望の輝度値の正弦波格子を生成するために使用されます。
- 3 台すべてのモニターの明るさを手順 2.3.4 で取得した値に設定して、同じピクセル値に対して輝度値が同じになるようにします。
- 以下で説明するように、視覚刺激ツールキットを使用して、OKR の動作を刺激するために使用される仮想ドラムを生成します。
- モニターに垂直正弦波格子を提示し、方位角に沿って周期(ストライプ間の間隔)を調整して、目への格子の投影が一定の空間周波数を持つようにします(ドラムグレーチング;図1B中と右)。
- 動物の頭がエンクロージャーの中央に固定されていることを確認して、格子が仮想ドラムの表面全体で一定の空間周波数を持っていることを確認します。
- 振動振幅、空間周波数、時間/振動周波数、方向、コントラストなど、移動回折格子のパラメータを視覚刺激コードで変更します。2種類の視覚的動きを使用する:(1)回折格子は、正弦波関数に従って振動的に時計回りまたは反時計回りにドリフトします。
ここで、Ampはドラム軌道の振幅、fは発振周波数、tは時間(発振振幅:5°、グレーティング空間周波数:0.04-0.45cpd、発振周波数:0.1-0.8Hz、刺激のピーク速度3.14-25.12°/sに相当[ドラム速度=Amp x 2π x f x cos(2π x f x t);コントラスト: 80%-100%;平均輝度:35-45 cd / m2;(2)グレーティングは等速で一方向にドリフトします。
(空間周波数:0.04-0.64 cpd、時間周波数:0.25-1 Hz、ドラム速度=時間周波数/空間周波数)
- 以下の説明に従ってビデオ眼球撮影を設定します。
- 動物の視野の閉塞を避けるために、正中線から60°のところに赤外線(IR)ミラーを配置して、右目の画像を形成します。
- マウスの後ろの右側にIRカメラを配置し(図1C左)、右目の画像をキャプチャします。
- カメラアームに高速IRカメラを取り付けて、右目の画像を中心にカメラを±10°回転させます(図1C右)。
- モニターの1つに取り付けられたフォトダイオードを使用して、ビデオオキュログラフィーと視覚刺激のタイミングを同期させるための電気信号を提供します。
- グースネックアームで支えられた4つのIR発光ダイオード(LED)を右目の周りに配置して、目のIR照明を提供します。
- 角膜反射(CR)基準を提供するために、カメラに2つのIR LEDを配置します:1つはカメラの上に固定され(X-CR)、もう1つはカメラの左側(Y-CR; 図1D)。
- ビデオ眼球撮影システムの光学倍率をキャリブレーションスライドで測定します。
注: 参照 CR は、回転する眼球運動に基づいて眼角が計算されるときに、並進眼球運動を打ち消すために使用されます。
- 以下に説明するように、モニターによって形成された囲いの中央に動物の頭を固定します。
- 動物の頭をヘッドプレートでリグの中央に固定し、前を向くようにします。左右の目が水平になり、鼻と側頭が水平になるように頭の傾きを調整します(図1E)。
- 動物の右目がカメラのライブビデオに現れるまで、頭部固定装置による粗調整と2D並進ステージによる微調整によって動物の頭を水平に動かし、頭部固定装置と支柱/支柱ホルダーのペアを介して垂直に動かします。眼球運動のキャリブレーションと測定の前に、ホットミラーで反射された動物の右目の画像をカメラアームのピボットポイントに重ね合わせます(以下の手順3.4の詳細を参照)。
- OKRリグの周囲にカスタマイズされたエンクロージャーを構築して、部屋の光を遮断します(図1F)。
3.眼球運動のキャリブレーション
注:回転眼球運動は、瞳孔の動きと瞳孔運動の軌道半径(Rp、瞳孔の中心から眼球の中心までの距離)に基づいて計算されます。個々のマウスごとに、この半径は実験的に測定される21。
- ステップ2.6.1の説明に従って、3つのモニターで形成された囲いの中央に動物の頭を固定します。
- カメラの電源を入れ、右目を取り囲む4つのLEDを調整して、均一なIR照明を実現します。
- 視覚的なガイダンスの下で、手順2.6.2の説明に従って、右目の位置をビデオの中央に表示されるまで調整します。
- 以下で説明するように、右目の虚像をカメラアームのピボットポイントに合わせます。
- カメラアームを手動で左端(-10°)に回転させます。X-CRが画像の水平中央に来るまで、2D並進段階(図1C、緑色の矢印)を微調整しながら、水平面上の動物の右目の位置を光軸に垂直に手動で移動します。
- カメラアームを手動でもう一方の端(+ 10°)に回転させます。X-CRが画像の中心から離れる場合は、X-CRが中央に来るまで微調整しながら右目を動かします(図1C、青い矢印)。
- 手順3.4.1〜3.4.2を数回繰り返して、カメラアームが左右に振ったときにX-CRが中央にとどまるようにします。1回の繰り返しの途中で右目が動いた場合は、調整プロセスを再開します。
- カメラアームを中央位置にロックした後、Y-CRとX-CRの間の垂直距離を測定します。Y-CR LEDをオンにしてその位置をビデオに記録してから、X-CR LEDに切り替えてその位置を記録します。
注意: Y-CRとX-CRの間の垂直距離は、X-CR LEDのみが点灯している眼球運動の測定中にY-CRの位置を導き出すために使用されます。 - 以下で説明するように、瞳孔回転半径Rpを測定します。
- カメラアームを左端(-10°)に回転させ、瞳孔(Pp1)とX-CR(PCR1)の位置をビデオに記録します。
- 次に、カメラアームを右端(+ 10°)に回転させ、瞳孔(Pp2)とX-CR(PCR2)の位置をビデオに記録します。この手順を複数回繰り返します。
注:映画の瞳孔の動きの量がカメラアームの揺れの程度を正確に反映するように、動物の右目は各繰り返しの間静止したままにする必要があります。 - 上記で記録した値に基づいて、次の式で瞳孔回転半径Rp (図2A)を計算します。
注:物理空間における角膜反射と瞳孔中心の間の距離は、ムービー内の距離に基づいて計算されます。
PCR - Pp = 動画の画素数 x カメラチップの画素サイズ x 倍率
- 以下に説明するように、Rpと瞳孔径の関係を作成します。Rpは、瞳孔が拡張または収縮すると変化します。その値は瞳孔の大きさに反比例します(図2B上)。
- モニターの輝度を0から160cd / m2 まで体系的に変更して、瞳孔サイズを調整します。
- 輝度値ごとに、手順3.6を8〜10回繰り返し、瞳孔の直径を記録します。
- 上記で測定した値に基づいて、Rpと瞳孔径の関係に線形回帰を適用し、傾きと切片を導き出します(図2B下)。
注: 時折の眼球運動によって引き起こされる外れ値は、線形フィッティングの前に除去されます。複数のセッションで繰り返し測定する場合、実験中に目が大きくならない限り、1匹の動物に対して1回だけキャリブレーションを行う必要があります。
4. OKRの眼球運動を記録する
- 手順3.1〜3.4に従って、リグにマウスをヘッド固定します。キャリブレーションが完了した直後に記録が行われる場合は、この手順をスキップしてください。カメラアームを中央の位置にロックします。
- 以下で説明するように、スコトピック OKR のモニターと動物を設定します。明所視 OKR については、この手順をスキップします。
- 各モニターの画面を、5層の1.2減光(ND)フィルムで作られたカスタマイズされたフィルターで覆います。フィルターとモニターの隙間から光が漏れないようにしてください。
- 部屋の明かりを消します。次の手順は、IRゴーグルを使用して実行されます。
- ピロカルピン溶液(生理食塩水2%)を右目に1滴塗布し、15分間待ちます。滴が目にとどまり、マウスで拭き取られないようにします。溶液が動物によって拭き取られた場合は、ピロカルピン溶液をもう一滴塗布します。.これにより、瞳孔がスコトープ条件下でのアイトラッキングに適したサイズに縮小されます。
注:スコトープ条件下では、瞳孔は大幅に拡張し、その端がまぶたの後ろに部分的に隠れます。これは、ビデオ眼球撮影による瞳孔中心の推定の精度に影響を与えます。右眼の瞳孔を薬理学的に縮小すると、その視覚入力が減少するため、視覚刺激が左眼に提示されます。 - 右目を生理食塩水で洗い流し、ピロカルピン溶液を完全に洗い流します。カーテンを引き下げて筐体を完全に密閉し、迷光がスコトープ視力に干渉するのを防ぎます。
- OKRテストを開始する前に、動物がスコトープ環境に完全に適応するために5分間与えます。
- 視覚刺激ソフトウェアと視線追跡ソフトウェアを実行します。明所視OKR測定では、ドラムグレーティングが正弦波軌道で水平に振動することを確認します。スコトープOKR測定では、ドラムグレーチングが左目から右(左目に対する側頭鼻方向)に一定の速度でドリフトすることを確認します。
注:スコトープ条件下でピロカルピンによって、左眼ではなく右眼の瞳孔が縮小した場合、振動ドラム刺激によって誘発されるOKRは非常に非対称です。このように、スコトピックOKR測定では、右目の動きをモニターしながら、左眼を刺激します。 - アイトラッキングソフトウェアは、各フレームの瞳孔サイズ、CR位置、瞳孔位置を自動的に測定し、次の式に基づいて眼位置の角度を計算します(図2C)。
ここで、PCRはCR 位置、Ppは 瞳位置、Rpは 瞳孔回転半径である。物理空間における角膜反射と瞳孔中心の間の距離は、ムービー内の距離に基づいて計算されます。
PCR - Pp = 動画の画素数 x カメラチップの画素サイズ x 倍率
対応する瞳孔サイズのRpは、ステップ3.7.3の線形回帰モデルに基づいて導き出されます(図2B下)。
5. 視線解析ソフトによるOKRの眼球運動の解析
- メディアンフィルタ(フィルタウィンドウ = 0.05秒)を使用してアイトレースを処理し、高周波ノイズを除去します(図3A中央)。
- 以下に説明するように、サッカードまたは眼振を取り除きます。
- 眼球運動の1次導関数を計算して、眼球速度を推定します(図3A下)。50°/sの速度閾値を適用して、サッカードまたは眼振を特定します(図3A下)。
- 線形回帰に基づいて、サッカードまたは眼振の前のセグメントからこれらの高速眼球運動中の眼球位置を外挿することにより、サッカードまたは眼振を置き換えます(図3B)。
- ドラムグレーティングが振動する場合(図3C)、またはドラムグレーティングが一方向に等速で移動する場合(図3B下)は、視覚刺激中の眼球運動の平均速度を計算します。
注:フーリエ変換から得られる振動眼球運動の振幅は、正弦波関数による眼球軌道のフィッティングから得られる振幅に似ています(図3D)。 - OKR ゲインを計算します。振動ドラムの動きの場合、OKRゲインは、ドラムの動きの振幅に対する目の動きの振幅の比率として定義されます(図3C右)。ドラムの単方向動作の場合、OKRゲインは、ドラムのグレーティング速度に対するアイ速度の比として定義されます(図3B下)。
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Representative Results
上記の手順で、いくつかの視覚的特徴に対する OKR の依存関係を評価しました。ここに示すトレース例は、補足コーディング・ファイル1で提供されている分析コードを使用して導出されたもので、トレースのrawファイルの例は、補足コーディング・ファイル2にあります。ドラムグレーティングが正弦波軌道(0.4Hz)で漂流すると、動物の目は自動的に同様の振動方法でグレーティングの動きに追従し(図3B上パネル)、これはOKR挙動の特徴である2,5,8。横軸のOKR眼球運動の振幅は高速フーリエ変換で導出され(図3C&D)、OKR利得は眼球運動の振幅と格子運動の振幅の比として計算されました(図3C)。OKRゲインは、空間周波数、発振周波数、および移動格子の方向の値によって変化しました(図4A)。まず、OKR動作の空間周波数調整曲線は逆V字型で、0.16cpdの中間空間周波数でピークに達しました(図4A左)。第2に、ドラムグレーティングの発振周波数が増加するにつれて発振周波数の同調曲線が単調に低下し(図4A中)、OKRの挙動が低速の視覚運動に応答して最もよく働くことが示された4。発振周波数同調曲線の振幅と形状は、異なる空間周波数の格子を提示すると変化した17。第3に、水平方向のOKRは、異なる方向に移動するグレーティングによっても誘導される可能性があります(図4A右)。最も強い水平方向のOKR行動は、側頭鼻腔運動(0°)によって誘発されました。格子が側頭鼻方向からそれぞれ30°または60°斜めの角度(上向きと下向きの両方)にずれると、OKRゲインは最大値の~80%または~30%に低下し、格子が垂直に上向きまたは下向き(90°と270°)に移動すると水平方向のOKRが消えました。さらに、チューニングカーブの形状は輝度レベルの影響を受けました。例えば、動物は明所視条件下では0.16および0.32 cpdの空間周波数に応答してOKR行動を良好に実行しましたが、空間周波数調整曲線はスコトープ条件下で左にシフトしました(図4B)。チューニング曲線の形状を解析するために、適切な数学関数でそれらを適合させます。たとえば、ガウス関数を使用して、空間周波数チューニングのピークと帯域幅を推定しました(図4C)。この分析により、スコトープ条件下での同調曲線は、明所視条件と比較して、好ましい空間周波数の値が小さいことがわかりました。上記で詳述した手順は、OKR 行動の可塑性を定量化するためにも使用できます。45分間の連続OKR刺激後、OKR行動の振幅は有意に増強され(図4D)、以前の報告と一致しました。これらの結果は、動眼行動とこれらの行動に関与する脳回路を理解するための可能性を調べる上でのこのプロトコルの応用を示しています。
図1:OKRリグのセットアップ 。 (A)ヘッドバーの寸法。(B)バーチャルドラムシステムの背面図(左)と上面図(中央)。3台のモニターが直交して取り付けられています。マウスの頭は正方形の囲いの中央に配置され、前を向いています。視覚刺激の周期(縞模様の間の空間)は、動物の目への方位角に基づいて変化し、目への格子の投影が一定の空間周波数を持つようにします。言い換えれば、回折格子の空間周波数は、あたかも回折格子が仮想ドラムの表面に沿って漂流しているかのように、視野全体で一定に知覚されます(右)。(C)IRビデオオキュログラフィーのセットアップ。左:OKR録画中に中央に固定したときのカメラの位置。青い矢印:光軸に沿って。緑の矢印:光軸に垂直。右:視線キャリブレーション中のカメラの回転。(D)カメラに固定されているX-CRおよびY-CRLEDの位置。(E)水平ロッドまたはヘッドプレートアダプターをそれぞれ回転させることで、左右の目(左)と目尻と側頭角を水平(右)に揃えます(赤い矢印)。(F)OKRステーションの写真。OKR リグは、黒いカーテンで囲まれたカスタマイズされた筐体内に配置されることに注意してください。略語:IR =赤外線;CR = 角膜反射。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:ビデオ眼球撮影における眼球位置のキャリブレーションと測定。 (A)キャリブレーションの概略図。瞳孔の回転半径(R、p)は、カメラを左端の位置(-10°、左パネル)と右端の位置(10°、右パネル)に回転させることによって推定されます。赤い点は、カメラを左端と右端に配置したときの角膜反射X-CRの位置を示します。青い点は瞳孔の中心を示します。緑色のバーは、カメラビデオで表示される角膜反射と瞳孔中心の間の距離を示します(PCR - PP)。(B)瞳孔の大きさに対するRpの依存性。上:瞳孔が小さいまたは大きい眼球の概略図。下:例示マウスのRpと瞳孔径の関係。瞳孔の大きさは、マウスの輝度(0〜160cd /m2の範囲の10の値)を変化させることによって変化します。黒い点:線形フィッティングに使用されるデータ。青い点:線形フィッティングから除外される外れ値。赤い曲線:線形回帰の最適直線。なお、Rpは瞳孔径に反比例する。(C)眼が視軸の右側または左側に移動したときの眼位置の角度の計算。赤い点、青い点、緑のバーは、A と同じ意味を持ちます。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:OKRゲインの計算。 (A)上:OKR刺激中に撮影された鼻(N;左)と側頭(T;右)の目の位置のスナップショット。赤い楕円:瞳孔のプロファイルにフィットします。赤十字:瞳孔の中心。白い矢印:基準LEDの角膜反射。中央:高周波ノイズを除去するためのメディアンフィルター(フィルターウィンドウ=0.05秒)を使用した(黒)または使用しなかった(赤)眼球運動の軌跡。下:眼球運動の1次導関数の計算による眼球速度の推定。サッカード(赤い矢印)は、50°/sの速度閾値で検出されます。 (B)ドラム軌道22でオーバーレイされたサッカード/眼振(黒)を除去した後のOKRのゆっくりとした眼球運動の軌跡。上:振幅5°、発振周波数0.4Hzの振動ドラム運動。 下:6.25°/s等速の単方向(側頭鼻)ドラム運動。 (C)左:Bの眼軌跡のサイクル平均。 上 。右:高速フーリエ変換によるアイまたはドラムグレーティングの動きの周波数解析。ドラムグレーティングは0.4Hzで振動するため、アイとドラムグレーティングの動きの振幅は0.4Hz(スターマーク)でピークに達することに注意してください。OKRゲインは、0.4Hzにおけるアイとドラムグレーティングの動きの振幅の比です。 (D)上:正弦波関数を持つ B上面 の眼軌跡のカーブフィッティング。下:高速フーリエ変換法と正弦波曲線フィッティングから導出された眼球運動の振幅の関係。黄色の点:上部の例。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図4:OKR行動の視覚的特徴選択性と可塑 性。 (A)明所視条件下でのOKRゲインの視覚的特徴選択性。左:1匹の動物の空間周波数同調曲線(発振周波数:0.4Hz、軌跡:水平振動、平均輝度:40cd/m2、n=15)。中央:1匹の動物の発振周波数同調曲線(空間周波数:0.08または0.16cpd、軌跡:水平振動、平均輝度:40cd/m2、n = 15)。右:1匹の動物の方向同調曲線(空間周波数:0.16 cpd、時間周波数:1 Hz、平均輝度:45 cd/m2、n = 24)。赤い矢印とバーは側頭鼻の方向を示しています。空間的および時間的/振動周波数のチューニングでは、3つのモニターに表示される垂直ドラムグレーティングが、等速または振動的に水平に移動します。方向調整では、右側のモニターのみに表示されるグレーティングが、12 方向のいずれかに一定の速度で移動します。厚さ:平均の標準誤差(SEM)。(B)スコトープまたは明所視条件下での1匹の動物のOKRゲインの空間周波数調整曲線。明視:振動運動;発振周波数:0.2 Hz;平均輝度:40 cd / m2;n = 15 です。スコトピック:等速の直線運動。時間周波数:0.25 Hz;平均輝度:8 x 10-5 cd / m2;n = 16 です。スコトープ条件は、モニターを5層のLeeフィルター(299 1.2 ND)で覆うことによって達成されます。厚さ:SEM。 (C)明所視および暗所視条件下でのOKRゲインの空間周波数チューニングのガウスフィッティング。明視:振動運動;発振周波数:0.2 Hz;平均輝度:40 cd / m2;n = 15 です。スコトピック:等速の直線運動。時間周波数:0.25 Hz;平均輝度:8 x 10-5 cd / m2;n = 16 です。(D)45分間の連続OKR刺激によって誘発された1匹のマウスのOKR増強。空間周波数:0.1 cpd;発振周波数:0.4 Hz;平均輝度:35 cd / m2;n = 40 です。上:OKR増強前後のサイクル平均OKR軌跡。厚さ:SEM。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
補足コーディングファイル1:サンプルトレースの生成に使用した解析コード。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足コーディングファイル2:ソフトウェアで生成されたトレースの例。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ここで紹介するOKR行動アッセイの方法には、いくつかの利点があります。第一に、コンピュータで生成された視覚刺激は、物理的なドラムの本質的な問題を解決します。物理的なドラムが空間周波数、方向、またはコントラストチューニングの体系的な検査をサポートしていないという問題に対処するために8、仮想ドラムはこれらの視覚的パラメータを試行的に変更することを可能にし、OKR動作の特徴選択性の体系的かつ定量的な分析を容易にします(図4A)。物理的なドラムは、外部光源23による不均一な照明に悩まされるが、仮想ドラムは、その表面を横切って均質な輝度を容易に提供することができる。NDフィルターと輝度計の助けを借りて、コンピュータで生成された視覚刺激により、スコトープから明所視まで、適切に制御されたさまざまな輝度レベルでのOKR測定が可能になります(図4B)。慣性質量による物理的なドラムの加速度に制限がなく、仮想視覚刺激は、特に高加速度と高速で、理想的に正確な軌道を達成することができます。さらに、コンピュータで生成された視覚刺激は、コヒーレントに動くドットなど、他のタイプの視覚刺激の創造的な設計を可能にし、さまざまな動眼行動のメカニズムを調べるのに役立ちます。第二に、私たちの手順は標準化されているため、行動記録の進行状況を監視するための労力が最小限で済み、複数のマウスを同時に調べる機会を提供します。したがって、大規模な動物コホート(数十〜数百匹)を含む研究に適しています。第三に、高精度かつ定量的な検出力により、縦断的研究24、異なる薬理学的処理10、または神経回路の摂動5下で、同じマウスの反復的なOKR測定を比較することが可能になる。最後に、周波数領域5,7,9のフーリエ変換による解析では、時間領域12,25,26のフィッティングによる解析と同等の結果が得られており(図3D下)、ここで紹介した解析手法が正確かつ精密であることを示しています。
また、この手法は、動眼学習のメカニズムを調査するために広く使用されているパラダイムであるOKR可塑性を研究する機会を提供します。マウスに継続的なOKR刺激を与えたり、前庭器官を外科的に病変させたりすると、OKRの振幅を増強することができます8,9。ここで紹介するOKRアッセイは、OKR増強で発生する眼球運動の小さな変化を捉えるのに十分な感度を持っています(図4D)。この手法の定量的な力は、行動の変化と神経回路のダイナミクスを相関させることを可能にし、動眼学習の根底にあるメカニズムを明らかにするために不可欠です5,8,9,13。
OKR 測定の精度を確保するには、いくつかの重要な手順があります。まず、手術中は、瞬間接着剤や歯科用アクリルがまぶたに触れないように特別な注意が必要であり、角膜を傷つけたり、目の開口部を部分的に塞いだりする可能性があります。第二に、OKRの強さは、マウスの行動状態によって影響を受ける27,28。したがって、OKR測定に対するストレスの影響を最小限に抑えるために、数回の調整が推奨されます。また、録音中は、臭気物質、騒音、または光によって引き起こされる妨害を防ぐ必要があります。最後に、マウスの頭は、目の2つの角を結ぶ線が水平軸と平行になるように適切に向ける必要があります。これにより、視覚運動の方向が内転および外転の眼球運動の軸と整列することが保証されます。第三に、瞳孔の鮮明な画像を生成し、高品質のアイトラッキングを保証するには、目の均一な照明が重要です。
ここで紹介する方法にはいくつかの制限があることに注意してください。まず、動物の目がまばたきをしたり、不透明な眼液が瞳孔を塞いだりすると、ビデオ眼球撮影は瞬間的または永久に眼球を見失います。同様に、まぶたを縫合するときの眼球運動のモニタリングにも使用できません。第二に、ビデオ眼球撮影の時間分解能は、カメラのフレームレートによって4〜20ミリ秒の範囲に制限されます。最後に、頭部固定式調製では、自由に動く動物の眼球行動を監視することはできません。
ここで紹介したビデオ眼球撮影とバーチャルドラムは、OKR行動の視覚的特徴選択性と可塑性を特徴付け、この行動の媒介と適応調節に関与する網膜回路と中枢回路を理解するためにうまく適用されました。さらに、他の眼の行動が神経現象のトピックまたは交絡因子である研究にも役立ちます。例えば、ビデオ−眼球撮影は、覚醒および脳状態32、33、34、35を示す瞳孔散大29およびサッカード様眼球運動30,31を監視するために用いることができる。さらに、ここで概説するキャリブレーションと測定の手順は、自由に動くマウスのヘッドマウントカメラで眼球運動を監視するために普遍的に適用できます。
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Disclosures
著者らは、競合する利害関係がないことを宣言します。
Acknowledgments
方向調整のデータを共有してくれたYingtian Heに感謝します。この研究は、Canadian Foundation of Innovation and Ontario Research Fund (CFI/ORF project no. 37597)、NSERC (RGPIN-2019-06479)、CIHR (Project Grant 437007)、Connaught New Researcher Awardsからの助成金によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2D translational stage | Thorlabs | XYT1 | |
| Acrylic resin | Lang Dental | B1356 | For fixing headplate on skull and protecting skull |
| Bupivacaine | STERIMAX | ST-BX223 | Bupivacaine Injection BP 0.5%. Local anesthesia |
| Carprofen | RIMADYL | 8507-14-1 | Analgesia |
| Compressed air | Dust-Off | ||
| Eye ointment | Alcon | Systane | For maintaining moisture of eyes |
| Graphic card | NVIDIA | Geforce GTX 1650 or Quadro P620. | For generating single screen among three monitors |
| Heating pad | Kent Scientific | HTP-1500 | For maintaining body temperature |
| High-speed infrared (IR) camera | Teledyne Dalsa | G3-GM12-M0640 | For recording eye rotation |
| IR LED | Digikey | PDI-E803-ND | For CR reference and the illumination of the eye |
| IR mirror | Edmund optics | 64-471 | For reflecting image of eye |
| Isoflurane | FRESENIUS KABI | CP0406V2 | |
| Labview | National instruments | version 2014 | eye tracking |
| Lactated ringer | BAXTER | JB2324 | Water and energy supply |
| Lidocaine and epinephrine mix | Dentsply Sirona | 82215-1 | XYLOCAINE. Local anesthesia |
| Luminance Meter | Konica Minolta | LS-150 | for calibration of monitors |
| Matlab | MathWorks | version xxx | analysis of eye movements |
| Meyhoefer Curette | World Precision Instruments | 501773 | For scraping skull and removing fascia |
| Microscope calibration slide | Amscope | MR095 | to measure the magnification of video-oculography |
| Monitors | Acer | B247W | Visual stimulation |
| Neutral density filter | Lee filters | 299 | to generate scotopic visual stimulation |
| Nigh vision goggle | Alpha optics | AO-3277 | for scotopic OKR |
| Photodiode | Digikey | TSL254-R-LF-ND | to synchronize visual stimulation and video-oculography |
| Pilocarpine hydrochloride | Sigma-Aldrich | P6503 | |
| Post | Thorlabs | TR1.5 | |
| Post holder | Thorlabs | PH1 | |
| PsychoPy | open source software | version xxx | visual stimulation toolkit |
| Scissor | RWD | S12003-09 | For skin removal |
| Superglue | Krazy Glue | Type: All purpose. For adhering headplate on the skull |
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