Summary
여기에서는 광동태 반사를 정량화하기 위한 표준 프로토콜을 설명합니다. 가상 드럼 자극과 비디오 안구 촬영을 결합하여 동작의 특징 선택성과 적응 가소성을 정확하게 평가할 수 있습니다.
Abstract
광동태 반사(OKR)는 시각 환경의 전체적인 움직임에 의해 유발되고 망막 이미지를 안정화하는 역할을 하는 필수적인 타고난 안구 운동입니다. OKR의 중요성과 견고성으로 인해 OKR은 시각 운동 학습을 연구하고 다양한 유전적 배경, 연령 및 약물 치료를 가진 마우스의 시각 기능을 평가하는 데 사용되었습니다. 여기에서는 머리 고정 마우스의 OKR 응답을 높은 정확도로 평가하는 절차를 소개합니다. 머리 고정은 전정 자극이 안구 운동에 미치는 영향을 배제할 수 있으므로 시각적 움직임에 의해서만 유발되는 안구 운동을 측정할 수 있습니다. OKR은 가상 드럼 시스템에 의해 유도되며, 3개의 컴퓨터 모니터에 표시되는 수직 격자가 진동 방식으로 수평으로 또는 일정한 속도로 단방향으로 드리프트됩니다. 이 가상 현실 시스템을 통해 공간 주파수, 시간/진동 주파수, 대비, 휘도 및 격자 방향과 같은 시각적 매개변수를 체계적으로 변경하고 시각적 특징 선택성의 튜닝 곡선을 정량화할 수 있습니다. 고속 적외선 비디오 안과 조영술은 안구 운동의 궤적을 정확하게 측정합니다. 개별 쥐의 눈은 다양한 연령, 성별 및 유전적 배경을 가진 동물 간의 OKR을 비교할 수 있는 기회를 제공하도록 보정됩니다. 이 기술의 정량적 능력을 통해 이 행동이 노화, 감각 경험 또는 운동 학습으로 인해 소성적으로 적응할 때 OKR의 변화를 감지할 수 있습니다. 따라서 이 기술은 안구 행동의 가소성을 조사하는 데 사용되는 도구 레퍼토리에 귀중한 추가 기능을 제공합니다.
Introduction
환경의 시각적 자극에 반응하여 우리의 눈은 시선을 이동하거나, 망막 이미지를 안정화하거나, 움직이는 표적을 추적하거나, 두 눈의 중심와를 관찰자로부터 서로 다른 거리에 있는 표적과 정렬하기 위해 움직이며, 이는 적절한 시력에 매우 중요합니다 1,2. 안구 운동 행동은 건강과 질병의 신경 회로를 이해하기 위한 감각 운동 통합의 매력적인 모델로 널리 사용되어 왔는데, 이는 적어도 부분적으로는 안구 운동 시스템의 단순성때문이다 3. 세 쌍의 외안근에 의해 조절되는 눈은 주로 횡축을 따라 상승 및 하강, 수직 축을 따라 내전과 외전, 전후 축을 따라 내전과 외전, 1,2. 이러한 간단한 시스템을 통해 연구자들은 실험실 환경에서 쥐의 안구 운동 행동을 쉽고 정확하게 평가할 수 있습니다.
주요 안구 운동 행동 중 하나는 광동태 반사(OKR)입니다. 이 비자발적 안구 운동은 망막의 느린 표류 또는 이미지의 미끄러짐에 의해 유발되며 동물의 머리 또는 그 주변이 움직일 때 망막 이미지를 안정화하는 역할을합니다 2,4. 행동 패러다임으로서의 OKR은 여러 가지 이유로 연구자들에게 흥미롭습니다. 첫째, 안정적으로 자극되고 정확하게 정량화할 수 있습니다 5,6. 둘째, 이러한 행동을 정량화하는 절차는 비교적 간단하고 표준화되어 있으며, 대규모 동물 집단의 시각 기능을 평가하는 데 적용할 수 있다7. 셋째, 이 타고난 행동은 매우 가소적이다 5,8,9. 그 진폭은 반복적인 망막 미끄러짐이 장시간 발생할 때 강화될 수 있다 5,8,9 또는 전정 입력2에 의해 유발되는 망막 이미지를 안정화시키는 또 다른 메커니즘인 작업 파트너인 전정 안구 반사(VOR)가 손상되었을 때 5. OKR 강화에 대한 이러한 실험적 패러다임은 연구자들이 안구 운동 학습의 기초가 되는 회로 기반을 밝힐 수 있도록 합니다.
이전 연구에서 OKR을 평가하기 위해 주로 두 가지 비침습적 방법이 사용되었습니다: (1) 물리적 드럼과 결합된 비디오 안구 조영술(7,10,11,12,13) 또는 (2) 가상 드럼(6,14,15,16)과 결합된 머리 회전의 임의 결정. 그들의 응용 프로그램은 안구 운동 가소성의 분자 및 회로 메커니즘을 이해하는 데 유익한 발견을 했지만 이 두 가지 방법은 각각 OKR의 특성을 정량적으로 검사하는 능력을 제한하는 몇 가지 단점이 있습니다. 첫째, 흑백 줄무늬 또는 점의 인쇄 패턴이 있는 물리적 드럼은 시각적 패턴의 쉽고 빠른 변경을 허용하지 않으며, 이는 움직이는 격자의 공간 주파수, 방향 및 대비와 같은 특정 시각적 특징에 대한 OKR의 의존성 측정을 크게 제한합니다 8,17. 대신, 이러한 시각적 특징에 대한 OKR의 선택성 테스트는 시각적 특징을 시도마다 편리하게 수정할 수 있는 컴퓨터화된 시각적 자극의 이점을 얻을 수 있습니다. 이러한 방식으로 연구원은 다차원 시각적 매개 변수 공간에서 OKR 동작을 체계적으로 검사할 수 있습니다. 더욱이, OKR 분석의 두 번째 방법은 식별 가능한 OKR을 유발하는 시각적 매개변수의 임계값만 보고하지만 눈 또는 머리 움직임의 진폭은 보고하지 않습니다 6,14,15,16. 따라서 정량적 검정력이 부족하기 때문에 튜닝 곡선의 모양과 선호하는 시각적 특징을 분석하거나 정상 상태와 병리학적 조건에서 개별 마우스 간의 미묘한 차이를 감지할 수 없습니다. 위와 같은 한계를 극복하기 위해 비디오 안구 조영술과 컴퓨터 가상 시각 자극을 결합하여 최근 연구 5,17,18,19,20에서 OKR 행동을 분석했습니다. 그러나 이전에 발표된 이러한 연구는 충분한 기술적 세부 사항이나 단계별 지침을 제공하지 않았기 때문에 연구자가 자신의 연구를 위해 이러한 OKR 테스트를 설정하는 것은 여전히 어렵습니다.
여기에서는 비디오 안구 조영술과 컴퓨터화된 가상 시각 자극의 조합을 통해 포토픽 또는 스코토픽 조건에서 OKR 행동의 시각적 특징 선택성을 정확하게 정량화하는 프로토콜을 제시합니다. 쥐는 전정 자극에 의해 유발되는 안구 운동을 피하기 위해 머리를 고정합니다. 고속 카메라는 시각적 매개변수가 변경되는 움직이는 격자를 보는 마우스의 안구 움직임을 기록하는 데 사용됩니다. 개별 마우스의 안구의 물리적 크기는 안구 운동의 각도를 유도하는 정확성을 보장하기 위해 보정된다21. 이 정량적 방법을 사용하면 서로 다른 연령 또는 유전적 배경을 가진 동물 간의 OKR 행동을 비교하거나 약리학적 치료 또는 시각 운동 학습으로 인한 변화를 모니터링할 수 있습니다.
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Protocol
이 연구에서 수행된 모든 실험 절차는 토론토 대학 동물 관리 위원회와 캐나다 동물 관리 위원회가 수립한 지침에 따라 생물 과학 지역 동물 관리 위원회의 승인을 받았습니다.
1. 두개골 위에 헤드 바 이식
참고: VOR 동작이 눈의 움직임에 기여하지 않도록 하기 위해 OKR 테스트 중에 마우스 머리가 고정됩니다. 따라서 두개골 위에 외과적으로 헤드 바를 이식합니다.
- 생쥐(2-5개월 암컷 및 수컷 C57BL/6)를 가스실에서 4% 이소플루란(v/v)과O2 의 혼합물로 마취합니다. 마우스를 맞춤형 수술 플랫폼으로 옮기고 이소플루란의 농도를 1.5%-2%로 줄입니다. 수술 중 발가락 꼬집기 반응과 호흡수를 확인하여 마취 깊이를 모니터링합니다.
- 동물의 체온을 유지하기 위해 동물의 몸 아래에 가열 패드를 놓습니다. 양쪽 눈이 건조해지지 않도록 양쪽 눈에 윤활제 안연고를 바릅니다. 알루미늄 호일로 눈을 가려 빛으로부터 눈을 보호하십시오.
- 통증을 줄이기 위해 20mg/kg의 용량으로 카프로펜을 피하 주사합니다. 클로르헥시딘 글루코네이트 스킨 클리너로 털을 적신 후 두개골 위의 털을 면도합니다. 노출된 두피를 70% 이소프로필 알코올과 클로르헥시딘 알코올로 두 번 소독합니다.
- bupivacaine (8 mg / kg)을 절개 부위에 피하 주사 한 후 가위로 두피 (~1cm2)를 제거하여 후전두골, 두정골, 두정골 및 두정골 간 뼈를 포함한 두개골의 등쪽 표면을 노출시킵니다.
- 노출된 두개골에 1% 리도카인과 1:100,000 에피네프린을 몇 방울 떨어뜨려 국소 통증과 출혈을 줄입니다. Meyhoefer 큐렛으로 두개골을 긁어 근막을 제거하고 인산염 완충 식염수(PBS)로 청소합니다.
알림: 측두근은 두개골에서 분리되어 헤드 바가 부착할 표면적을 늘립니다. - 수분이 사라지고 뼈가 희끄무레해질 때까지 두개골 표면을 향해 압축 공기를 부드럽게 불어넣어 두개골을 건조시킵니다. 잘린 두피의 가장자리를 포함하여 두개골의 노출된 표면에 초강력 접착제를 얇게 바른 다음 아크릴 수지 층을 바릅니다.
알림: 초강력 접착제를 바르기 전에 두개골 표면에 혈액이나 물이 없어야 합니다. - 두개골 상단의 정중선을 따라 스테인리스 스틸 헤드 바( 그림 1A 참조)를 놓습니다. 헤드 바의 바닥이 아크릴 레진에 완전히 묻힐 때까지 헤드 바의 가장자리에서 시작하여 더 많은 아크릴 레진을 바릅니다. 아크릴 수지를 두세 번 도포하여 두께를 늘립니다.
- 아크릴 수지가 굳을 때까지 약 15분 동안 기다립니다. 젖산 링거 용액 1mL를 피하 주사합니다. 그런 다음 동물이 완전히 움직일 때까지 가열 패드에 놓인 케이지에 쥐를 되돌립니다.
- 수술 후 최소 5일 동안 쥐가 홈 케이지에서 회복되도록 하십시오. 동물의 상태가 양호해지면 OKR 설정에서 헤드 막대로 머리를 15-30분 동안 고정하여 머리 고정 및 실험 환경에 익숙해지도록 합니다. 최소 3일 동안 하루에 한 번 익숙이를 반복합니다.
2. 가상 드럼 및 비디오 오큘로그래피 설정
- 3개의 모니터를 서로 직각으로 장착하여 시각적 공간에서 방위각의 ~270°와 고도의 63°를 포함하는 정사각형 인클로저를 형성합니다(그림 1B 왼쪽).
- 개별 그래픽 카드를 사용하면 3개의 모니터를 하나의 디스플레이로 병합하여 모든 모니터에서 동기화를 보장할 수 있습니다.
- 아래 설명된 대로 모니터의 휘도를 보정합니다.
- 모니터가 연결된 컴퓨터를 켜고 15분 동안 기다립니다. 안정적인 휘도를 위해서는 워밍업이 필수적입니다.
- 모니터의 밝기 설정을 0에서 100까지 25단계씩 체계적으로 변경합니다.
- 각 밝기 값에 대해 휘도 측정기를 사용하여 다양한 픽셀 값(0-255, 15단계)에서 모니터의 휘도를 측정합니다.
- 선형 회귀를 사용하여 픽셀 값 255에 대한 광도와 밝기 간의 관계를 피팅하고 160cd/m2를 발생시키는 밝기 값을 추정합니다.
- 휘도 측정(2.3.3단계)에 사용된 각 픽셀 값에 대해 선형 회귀를 기반으로 2.3.4단계에서 파생된 밝기 값의 휘도를 추정합니다. 거듭제곱 함수 lum = A * pixel γ를 사용하여 새로운 광도 값 집합(2.3.4에서 파생된 밝기 값 아래)과 해당 픽셀 값 간의 관계를 피팅하여 감마 계수 γ와 계수 A를 도출합니다. 이들은 원하는 휘도 값의 정현파 격자를 생성하는 데 사용됩니다.
- 세 모니터의 밝기를 2.3.4단계에서 파생된 값으로 설정하여 광도 값이 동일한 픽셀 값에 대해 동일한지 확인합니다.
- 아래 설명된 대로 시각적 자극 툴킷을 사용하여 OKR 동작을 자극하는 데 사용되는 가상 드럼을 생성합니다.
- 모니터에 수직 정현파 격자를 제시하고 방위각을 따라 주기(줄무늬 사이의 간격)를 조정하여 눈에 격자의 투영이 일정한 공간 주파수(드럼 격자)를 갖도록 합니다. 그림 1B 가운데 및 오른쪽).
- 격자가 가상 드럼 표면에서 일정한 공간 주파수를 갖는다는 것을 알 수 있도록 동물의 머리가 인클로저 중앙에 고정되어 있는지 확인합니다.
- 시각적 자극 코드에서 진동 진폭, 공간 주파수, 시간/진동 주파수, 방향, 대비 등과 같은 움직이는 격자의 매개변수를 수정합니다. 두 가지 유형의 시각적 동작을 사용합니다 : (1) 격자는 정현파 함수를 따라 진동 방식으로 시계 방향 또는 시계 반대 방향으로 표류합니다.
여기서 Amp는 드럼 궤적의 진폭, f는 진동 주파수, t는 시간(진동 진폭: 5°; 격자 공간 주파수: 0.04-0.45 cpd; 진동 주파수: 0.1-0.8Hz, 3.14-25.12°/s 자극의 피크 속도에 해당[드럼 속도 = Amp x 2π x f x cos (2π x f x t); 대비: 80%-100%; 평균 휘도: 35-45cd/m2; (2) 격자는 일정한 속도로 단방향으로 표류합니다.
(공간 주파수: 0.04-0.64 cpd, 시간 주파수: 0.25-1 Hz, 드럼 속도 = 시간 주파수/공간 주파수)
- 아래 설명된 대로 비디오 오큘로그래피를 설정합니다.
- 동물의 시야가 막히는 것을 방지하려면 적외선(IR) 거울을 정중선에서 60° 떨어진 곳에 배치하여 오른쪽 눈의 이미지를 형성합니다.
- 마우스 뒤의 오른쪽에 IR 카메라를 놓고(그림 1C 왼쪽) 오른쪽 눈의 이미지를 캡처합니다.
- 카메라가 오른쪽 눈 이미지를 중심으로 ± 10° 회전할 수 있는 카메라 암에 고속 IR 카메라를 장착합니다(그림 1C 오른쪽).
- 모니터 중 하나에 부착된 광 다이오드를 사용하여 비디오 안구 촬영 타이밍과 시각적 자극을 동기화하는 전기 신호를 제공합니다.
- 오른쪽 눈 주위에 구즈넥 암으로 지지되는 4개의 IR 발광 다이오드(LED)를 배치하여 눈의 IR 조명을 제공합니다.
- 각막 반사(CR) 기준을 제공하기 위해 카메라에 두 개의 IR LED를 배치합니다: 하나는 카메라 위(X-CR)에 고정되고 다른 하나는 카메라 왼쪽(Y-CR; 그림 1D).
- 보정 슬라이드를 사용하여 비디오 안구 조영 시스템의 광학 배율을 측정합니다.
참고: 참조 CR은 회전 안구 움직임을 기반으로 눈 각도를 계산할 때 병진 안구 움직임을 상쇄하는 데 사용됩니다.
- 아래 설명과 같이 모니터에 의해 형성된 인클로저의 중앙에 동물의 머리를 고정합니다.
- 헤드 플레이트가 있는 동물의 머리를 리그 중앙에 고정하고 앞쪽을 향하도록 합니다. 왼쪽 눈과 오른쪽 눈이 수평이 되고 눈의 콧구멍과 측두골이 수평으로 정렬되도록 머리의 기울기를 조정합니다(그림 1E).
- 머리 고정 장치에 의해 제공되는 거친 조정과 2D 병진 단계에 의해 제공되는 미세 조정에 의해 동물의 머리를 수평으로 움직이고, 카메라의 라이브 비디오에 동물의 오른쪽 눈이 나타날 때까지 머리 고정 장치와 포스트/포스트 홀더 쌍을 통해 수직으로 움직입니다. 안구 움직임을 보정 및 측정하기 전에 핫 미러에 반사된 동물의 오른쪽 눈 이미지를 카메라 암의 피벗 포인트와 오버레이합니다(아래 3.4단계의 세부 정보 참조).
- 실내 조명을 차단하기 위해 OKR 장비 주위에 맞춤형 인클로저를 구축합니다(그림 1F).
3. 안구 운동 보정
참고: 회전 안구 운동은 동공의 움직임과 동공 움직임의 궤도 반경(Rp, 동공 중심에서 안구 중심까지의 거리)을 기준으로 계산됩니다. 각각의 개별 마우스에 대해, 이 반경은 실험적으로측정된다(21).
- 2.6.1단계에서 설명한 대로 세 개의 모니터로 형성된 인클로저 중앙에 동물의 머리를 고정합니다.
- 카메라를 켜고 오른쪽 눈을 둘러싼 4개의 LED를 조정하여 균일한 IR 조명을 얻습니다.
- 시각적 안내에 따라 2.6.2단계에서 설명한 대로 오른쪽 눈이 비디오 중앙에 나타날 때까지 오른쪽 눈의 위치를 조정합니다.
- 아래 설명과 같이 오른쪽 눈의 가상 이미지를 카메라 암의 피벗 포인트에 맞춥니다.
- 카메라 암을 왼쪽 끝(-10°)으로 수동으로 회전합니다. X-CR이 이미지의 수평 중심에 올 때까지 2D 병진 단계(그림 1C, 녹색 화살표)를 미세 조정하여 광축에 수직인 수평면에서 동물의 오른쪽 눈 위치를 수동으로 이동합니다.
- 카메라 암을 다른 쪽 끝(+10°)으로 수동으로 회전합니다. X-CR이 이미지 중심에서 멀어지면 X-CR이 중앙에 올 때까지 미세 조정하여 광축을 따라 오른쪽 눈을 움직입니다(그림 1C, 파란색 화살표).
- 카메라 암이 왼쪽과 오른쪽으로 흔들릴 때 X-CR이 중앙에 머물 때까지 3.4.1-3.4.2단계를 몇 번 반복합니다. 한 번 반복하는 도중에 오른쪽 눈이 움직이면 조정 과정을 다시 시작하십시오.
- 카메라 암을 중앙 위치에 고정한 후 Y-CR과 X-CR 사이의 수직 거리를 측정합니다. Y-CR LED를 켜고 비디오에 위치를 기록한 다음 X-CR LED로 전환하여 위치를 기록합니다.
알림: Y-CR과 X-CR 사이의 수직 거리는 X-CR LED만 켜져 있는 안구 움직임을 측정하는 동안 Y-CR의 위치를 도출하는 데 사용됩니다. - 아래 설명과 같이 동공회전 반경 RP를 측정합니다.
- 카메라 암을 왼쪽 끝(-10°)으로 돌리고 영상에 동공(Pp1) 및 X-CR(PCR1)의 위치를 기록합니다.
- 그런 다음 카메라 암을 오른쪽 끝(+10°)으로 돌리고 비디오에서 동공(Pp2) 및 X-CR(PCR2)의 위치를 녹화합니다. 이 단계를 여러 번 반복합니다.
참고: 동물의 오른쪽 눈은 동영상에서 동공 움직임의 양이 카메라 팔을 휘두르는 정도를 정확하게 반영할 수 있도록 각 반복 중에 정지 상태를 유지해야 합니다. - 위에 기록된 값을 기반으로 다음 공식을 사용하여 동공회전 Rp(그림 2A)의 반경을 계산합니다.
참고: 물리적 공간에서 각막 반사와 동공 중심 사이의 거리는 동영상에서의 거리를 기준으로 계산됩니다.
PCR - Pp = 동영상의 픽셀 수 x 카메라 칩의 픽셀 크기 x 배율
- 아래에 설명된 대로Rp 와 동공 직경 사이의 관계를 개발합니다. Rp는 동공이 확장되거나 수축할 때 변합니다. 근위적으로, 그 값은 동공 크기에 반비례합니다(그림 2B 상단).
- 모니터의 휘도를 0에서 160cd/m2 까지 체계적으로 변경하여 동공 크기를 조절합니다.
- 각 휘도 값에 대해 3.6 단계를 8-10회 반복하고 동공의 직경을 기록합니다.
- 위에서 측정한 값을기반으로 Rp와 동공 지름 사이의 관계에 선형 회귀를 적용하여 기울기와 절편을 도출합니다(그림 2B 하단).
NOTE: 간헐적인 안구 움직임으로 인한 이상치는 선형 피팅 전에 제거됩니다. 여러 세션에서 반복적인 측정의 경우, 실험 중에 눈이 더 커지지 않는 한 한 동물에 대해 보정을 한 번만 수행하면 됩니다.
4. OKR의 안구 움직임 기록
- 3.1-3.4단계에 따라 리그에서 마우스를 헤드로 고정합니다. 보정이 완료된 직후에 기록이 발생하는 경우 이 단계를 건너뜁니다. 카메라 암을 중앙 위치에 고정합니다.
- 아래 설명된 대로 스코토픽 OKR에 대한 모니터와 동물을 설정합니다. 포토픽 OKR의 경우 이 단계를 건너뜁니다.
- 각 모니터의 화면을 1.2 ND(Neutral Density) 필름의 5개 레이어로 구성된 맞춤형 필터로 덮습니다. 필터와 모니터 사이의 틈을 통해 빛이 새지 않도록 하십시오.
- 방 불을 끕니다. 다음 단계는 IR 고글을 사용하여 수행됩니다.
- 필로카르핀 용액(식염수 2%)을 오른쪽 눈에 한 방울 떨어뜨리고 15분 동안 기다립니다. 방울이 눈에 남아 있고 마우스로 닦이지 않는지 확인하십시오. 용액이 동물에 의해 닦아지면 필로카르핀 용액을 한 방울 더 바르십시오. 이렇게 하면 동공이 스코토픽 조건에서 시선 추적에 적합한 크기로 축소됩니다.
참고: 스코토픽 상태에서는 동공이 크게 확장되어 가장자리가 눈꺼풀 뒤에 부분적으로 숨겨집니다. 이것은 비디오 안구 촬영으로 동공 중심을 추정하는 정밀도에 영향을 미칩니다. 약리학적으로 오른쪽 눈의 동공을 축소하면 시각적 입력이 감소하여 시각적 자극이 왼쪽 눈에 전달됩니다. - 오른쪽 눈을 식염수로 헹구어 필로카르핀 용액을 완전히 씻어냅니다. 커튼을 아래로 당겨 인클로저를 완전히 밀봉하면 미광이 스코토픽 시야를 방해하는 것을 방지할 수 있습니다.
- OKR 테스트를 시작하기 전에 동물이 스코토픽 환경에 완전히 적응할 수 있도록 5분 동안 기다리십시오.
- 시각 자극 소프트웨어와 시선 추적 소프트웨어를 실행합니다. 포토픽 OKR 측정의 경우 드럼 격자가 정현파 궤적으로 수평으로 진동하는지 확인하십시오. 스코토픽 OKR 측정의 경우 드럼 격자가 왼쪽 눈을 기준으로 측두-코 방향인 왼쪽에서 오른쪽으로 일정한 속도로 드리프트되는지 확인합니다.
참고: 왼쪽 눈이 아닌 오른쪽 눈의 동공이 스코토픽 조건에서 필로카르핀에 의해 축소되면 진동 드럼 자극에 의해 유도된 OKR은 매우 비대칭적입니다. 따라서 스코토픽 OKR 측정의 경우 오른쪽 눈의 움직임을 모니터링하면서 왼쪽 눈을 자극합니다. - 시선 추적 소프트웨어는 각 프레임의 동공 크기, CR 위치 및 동공 위치를 자동으로 측정하고 다음 공식에 따라 눈 위치의 각도를 계산합니다(그림 2C).
여기서, PCR 은 CR 위치,Pp 는 동공 위치,Rp 는 동공 회전 반경이다. 물리적 공간에서 각막 반사와 동공 중심 사이의 거리는 동영상에서의 거리를 기준으로 계산됩니다.
PCR - Pp = 동영상의 픽셀 수 x 카메라 칩의 픽셀 크기 x 배율
해당 동공크기의 Rp는 3.7.3단계의 선형 회귀 모델을 기반으로 도출됩니다(그림 2B 하단).
5. 눈 분석 소프트웨어를 이용한 OKR의 안구 움직임 분석
- 중앙값 필터(필터 창 = 0.05초)를 사용하여 아이 트레이스를 처리하여 고주파 노이즈를 제거합니다(그림 3A 중간).
- 아래 설명된 대로 안진 또는 안진을 제거합니다.
- 안구 움직임의 1차 도함수를 계산하여 눈 속도를 추정합니다(그림 3A 하단). 50°/s의 속도 임계값을 적용하여 안진 또는 안진을 식별합니다(그림 3A 하단).
- 선형 회귀를 기반으로 안진 또는 안진 앞 세그먼트에서 이러한 빠른 안구 운동 중 안구 위치를 외삽하여 안구 또는 안진을 대체합니다(그림 3B).
- 드럼 격자가 진동하는 경우 고속 푸리에 변환(Goertzel 알고리즘)으로 OKR 안구 움직임의 진폭을 계산하거나(그림 3C), 드럼 격자가 한 방향으로 일정한 속도로 움직이는 경우 시각적 자극 중 안구 움직임의 평균 속도를 계산합니다(그림 3B 하단).
참고: 푸리에 변환에서 파생된 진동 안구 운동의 진폭은 정현파 함수로 안구 궤적을 맞출 때 도출된 진폭과 유사합니다(그림 3D). - OKR 게인을 계산합니다. 진동 드럼 동작의 경우 OKR 게인은 드럼 움직임의 진폭에 대한 눈 움직임의 진폭의 비율로 정의됩니다(그림 3C 오른쪽). 단방향 드럼 동작의 경우 OKR 게인은 드럼 격자 속도에 대한 눈 속도의 비율로 정의됩니다(그림 3B 하단).
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Representative Results
위에서 자세히 설명한 절차를 통해 여러 시각적 기능에 대한 OKR의 종속성을 평가했습니다. 여기에 표시된 예제 추적은 보충 코딩 파일 1에 제공된 분석 코드를 사용하여 파생되었으며, 예제 추적 원시 파일은 보충 코딩 파일 2에서 찾을 수 있습니다. 드럼 격자가 정현파 궤적(0.4Hz)으로 표류할 때 동물의 눈은 유사한 진동 방식으로 격자의 움직임을 자동으로 따라갔으며(그림 3B 상단 패널), 이는 OKR 동작 2,5,8의 특징입니다. 수평축에서 OKR 안구 움직임의 진폭은 고속 푸리에 변환(그림 3C&D)으로 유도되었으며, OKR 이득은 격자 운동의 진폭에 대한 안구 운동의 진폭의 비율로 계산되었습니다(그림 3C). OKR 이득은 공간 주파수, 진동 주파수 및 이동 격자 방향의 값에 따라 달라집니다(그림 4A). 첫째, OKR 동작의 공간 주파수 조정 곡선은 역 V자형을 가지며 0.16cpd의 중간 공간 주파수에서 피크를 기록했습니다(그림 4A 왼쪽). 둘째, 드럼 격자의 진동 주파수가 증가함에 따라 진동 주파수 튜닝 곡선이 단조롭게 감소했으며(그림 4A 중간), 이는 OKR 동작이 저속시각 동작4에 가장 잘 반응하여 작동함을 나타냅니다. 진동 주파수 튜닝 곡선의 진폭과 모양은 서로 다른 공간 주파수(17)의 격자를 나타낼 때 다양했다. 셋째, 수평 OKR은 다른 방향으로 움직이는 격자에 의해서도 유도될 수 있습니다(그림 4A 오른쪽). 가장 강한 수평 OKR 동작은 측두-비강 운동(0°)에 의해 유도되었습니다. 격자가 측두-비강 방향(위쪽 및 아래쪽 모두)에서 각각 벗어난 비스듬한 각도로 30° 또는 60° 이동했을 때 OKR 이득은 ~80% 또는 최대값의 ~30%로 떨어졌고 격자가 수직으로 위 또는 아래(90° 및 270°)로 이동할 때 수평 OKR이 사라졌습니다. 또한 튜닝 곡선의 모양은 휘도 수준의 영향을 받았습니다. 예를 들어, 동물은 포토픽 조건에서 0.16 및 0.32 cpd의 공간 주파수에 반응하여 OKR 행동을 잘 수행했지만, 스코토픽 조건에서는 공간 주파수 조정 곡선이 왼쪽으로 이동했습니다(그림 4B). 튜닝 곡선의 모양을 분석하기 위해 적절한 수학 함수로 맞춥니다. 예를 들어, Gaussian 함수는 공간 주파수 튜닝의 피크와 대역폭을 추정하는 데 사용되었습니다(그림 4C). 이 분석을 통해 스코토픽 조건에서의 튜닝 곡선이 포토픽 조건에 비해 선호하는 공간 주파수에서 더 낮은 값을 갖는다는 것을 발견했습니다. 위에서 자세히 설명한 절차를 사용하여 OKR 동작의 가소성을 정량화할 수도 있습니다. 45분 동안 지속적인 OKR 자극을 가한 후 OKR 행동의 진폭이 크게 강화되었으며(그림 4D), 이전 보고와 일치했습니다. 이러한 결과는 이러한 행동과 관련된 뇌 회로를 이해하는 데 있어 안구 운동 행동과 잠재력을 조사하는 데 이 프로토콜의 적용을 보여줍니다.
그림 1: OKR 장비 설정. (A) 헤드 바의 치수. (B) 가상 드럼 시스템의 후면 view(왼쪽)와 상단 view(가운데). 3개의 모니터가 서로 직각으로 장착됩니다. 마우스의 머리는 정사각형 인클로저의 중앙에 배치되고 앞쪽을 향합니다. 시각적 자극 기간(줄무늬 사이의 공간)은 동물의 눈 방위각에 따라 달라지며 눈에 격자가 투영되어 일정한 공간 주파수를 갖도록 합니다. 즉, 격자의 공간 주파수는 격자가 가상 드럼의 표면을 따라 표류하는 것처럼 시야 전체에 걸쳐 일정하게 인식됩니다(오른쪽). (C) IR 비디오 안구 촬영 설정. 왼쪽: OKR 녹화 중 중앙에 고정했을 때의 카메라 위치. 파란색 화살표: 광축을 따라. 녹색 화살표: 광축에 수직입니다. 오른쪽: 눈 보정 중 카메라의 회전. (D) 카메라에 고정된 X-CR 및 Y-CR LED의 위치입니다. (E) 왼쪽 눈과 오른쪽 눈의 높이(왼쪽)와 눈의 콧방울과 측두각은 각각 수평 막대 또는 헤드플레이트 어댑터를 회전하여 수평(오른쪽)으로 정렬됩니다(빨간색 화살표). (F) OKR 역 사진. OKR 장비는 검은색 커튼이 있는 사용자 지정 인클로저 내부에 배치됩니다. 약어: IR = 적외선; CR = 각막 반사. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 비디오 안구 조영술에서 눈 위치의 보정 및 측정 . (A) 교정 개략도. 동공 회전 반경(RP)은 카메라를 가장 왼쪽 위치(-10°, 왼쪽 패널)와 가장 오른쪽 위치(10°, 오른쪽 패널)로 회전하여 추정합니다. 빨간색 점은 카메라를 가장 왼쪽과 가장 오른쪽 위치에 놓았을 때 각막 반사 X-CR의 위치를 나타냅니다. 파란색 점은 동공의 중심을 나타냅니다. 녹색 막대는 카메라 비디오에서 본 각막 반사와 동공 중심 사이의 거리를 나타냅니다(PCR - PP). (B) 동공크기에 대한 Rp의 의존성. 위: 작거나 큰 동공이 있는 안구의 개략도. 아래:Rp 와 예제 쥐의 동공 지름 사이의 관계. 동공 크기는 마우스의 광도(0-160cd/m2 범위의 10개 값)를 변경하여 변경됩니다. 검은색 점: 선형 피팅에 사용되는 데이터입니다. 파란색 점: 선형 피팅에서 제외되는 이상값입니다. 빨간색 곡선: 선형 회귀에서 가장 적합한 선입니다. Rp는 동공 직경에 반비례합니다. (C) 눈이 시축의 오른쪽 또는 왼쪽으로 이동했을 때의 눈 위치 각도 계산. 빨간색 점, 파란색 점, 녹색 막대는 A에서와 동일한 의미를 갖습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: OKR 게인 계산. (A) 위: OKR 자극 중에 촬영한 비강(N, 왼쪽) 및 측두(T, 오른쪽) 눈 위치의 스냅샷. 빨간색 타원: 동공 프로파일에 맞춥니다. 적십자: 학생 센터. 흰색 화살표: 기준 LED의 각막 반사. 중간: 고주파 노이즈를 제거하기 위한 중앙값 필터(필터 창 = 0.05초)가 있는 경우(검은색) 또는 없는 경우(빨간색) 안구 움직임의 궤적. 아래: 안구 움직임의 1차 도함수를 계산하여 안구 속도를 추정합니다. Saccades(빨간색 화살표)는 50°/s의 속도 임계값으로 감지됩니다. (B) 드럼 궤적22와 겹쳐진 saccades/nystagmus(검은색)를 제거한 후 OKR의 느린 안구 운동 궤적. 상단: 진폭이 5°이고 진동 주파수가 0.4Hz인 진동 드럼 동작. 하단: 6.25°/s의 일정한 속도의 단방향(시간-비강) 드럼 동작. (C) 왼쪽: B 상단에서 눈 궤적의 주기 평균. 오른쪽: 고속 푸리에 변환에 의한 아이 또는 드럼 격자 움직임의 주파수 분석. 드럼 격자는 0.4Hz에서 진동하므로 눈과 드럼 격자 움직임의 진폭은 0.4Hz(별 표시)에서 최고조에 달합니다. OKR 게인은 0.4Hz에서 눈의 진폭과 드럼 격자 이동의 비율입니다. (D) 상단: 정현파 기능이 있는 B 상단 의 눈 궤적의 곡선 피팅. 아래: 고속 푸리에 변환 방법으로 파생되고 정현파 곡선 피팅에서 파생된 안구 움직임의 진폭 관계. 노란색 점: 상단의 예. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: OKR 동작의 시각적 특징 선택성 및 가소성. (A) 포토픽 조건에서 OKR 이득의 시각적 특징 선택성. 왼쪽: 한 동물의 공간 주파수 튜닝 곡선(진동 주파수: 0.4Hz, 궤적: 수평 진동, 평균 휘도: 40cd/m2, n = 15). 중간: 한 동물의 진동 주파수 조정 곡선(공간 주파수: 0.08 또는 0.16 cpd, 궤적: 수평 진동, 평균 휘도: 40cd/m2, n = 15). 오른쪽: 한 동물의 방향 조정 곡선(공간 주파수: 0.16cpd, 시간 주파수: 1Hz, 평균 휘도: 45cd/m2, n = 24). 빨간색 화살표와 막대는 측두-코 방향을 나타냅니다. 공간 및 시간/진동 주파수 튜닝의 경우 3개의 모니터에 표시되는 수직 드럼 격자가 일정한 속도 또는 진동 방식으로 수평으로 움직입니다. 방향 조정의 경우 오른쪽 모니터에만 표시되는 격자가 일정한 속도로 12개 방향 중 하나로 움직입니다. 두께: 평균(SEM)의 표준 오차. (B) 스코토픽 또는 포토픽 조건에서 한 동물의 OKR 이득의 공간 주파수 조정 곡선. 사진: 진동 운동; 진동 주파수: 0.2Hz; 평균 휘도: 40cd/m2; n = 15입니다. Scotopic : 일정한 속도의 직선 운동; 시간 주파수: 0.25Hz; 평균 휘도: 8 x 10-5cd/m2; n = 16입니다. 스코토픽 조건은 5개의 Lee 필터(299 1.2 ND)로 모니터를 덮음으로써 달성됩니다. 두께: SEM. (C) 포토픽 및 스코토픽 조건에서 OKR 이득의 공간 주파수 튜닝에 대한 가우스 피팅. 사진: 진동 운동; 진동 주파수: 0.2Hz; 평균 휘도: 40cd/m2; n = 15입니다. Scotopic : 일정한 속도의 직선 운동; 시간 주파수: 0.25Hz; 평균 휘도: 8 x 10-5cd/m2; n = 16입니다. (D) 45분의 지속적인 OKR 자극에 의해 유도된 한 마우스의 OKR 강화. 공간 주파수: 0.1cpd; 발진 주파수: 0.4Hz; 평균 휘도: 35cd/m2; n = 40입니다. 상단: OKR 강화 전후의 주기 평균 OKR 궤적. 두께: SEM. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 코딩 파일 1: 예제 추적을 생성하는 데 사용되는 분석 코드입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 코딩 파일 2: Examp소프트웨어로 생성된 트레이스. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에 제시된 OKR 행동 분석 방법은 몇 가지 이점을 제공합니다. 첫째, 컴퓨터로 생성된 시각적 자극은 물리적 드럼의 본질적인 문제를 해결합니다. 물리적 드럼이 공간 주파수, 방향 또는 대비 튜닝8의 체계적인 검사를 지원하지 않는다는 문제를 해결하기 위해 가상 드럼을 사용하면 이러한 시각적 매개변수를 시험별로 변경할 수 있으므로 OKR 동작의 특징 선택성에 대한 체계적이고 정량적인 분석을 용이하게 할 수 있습니다(그림 4A). 물리적 드럼은 외부 광원(23)에 의한 불균일한 조명으로 인해 어려움을 겪는 반면, 가상 드럼은 그 표면 전체에 걸쳐 균질한 휘도를 쉽게 제공할 수 있다; ND 필터와 휘도계의 도움으로 컴퓨터로 생성된 시각적 자극을 통해 스코토픽에서 포토픽까지 잘 제어된 다양한 휘도 수준에서 OKR 측정이 가능하며(그림 4B), 이는 물리적 드럼으로는 수행하기 어렵습니다. 관성 질량으로 인한 물리적 드럼의 가속도에 제한이 없는 가상 시각적 자극은 특히 높은 가속도 및 고속에서 이상적으로 정확한 궤적을 달성할 수 있습니다. 또한 컴퓨터로 생성된 시각적 자극을 통해 점의 일관성 있게 움직이는 것과 같은 다른 유형의 시각적 자극을 창의적으로 설계할 수 있어 다양한 안구 운동 행동의 메커니즘을 조사하는 데 도움이 됩니다. 둘째, 우리의 절차는 표준화되어 있으므로 행동 기록의 진행 상황을 모니터링하는 데 최소한의 노력이 필요하며, 이는 여러 마우스를 동시에 검사할 수 있는 기회를 제공합니다. 따라서 대규모 동물 코호트(수십에서 수백 마리의 동물)를 포함하는 연구에 적합합니다. 셋째, 높은 정밀도와 정량적 능력은 종단 연구24, 상이한 약리학적 치료10 또는 신경회로 섭동5 하에서 동일한 마우스의 반복적인 OKR 측정을 비교할 수 있게 한다. 마지막으로, 주파수 영역 5,7,9에서의 푸리에 변환 기반 분석은 시간 영역12,25,26(그림 3D 하단)에서의 피팅 기반 분석과 진동 안구 운동의 진폭에서 동일한 결과를 제공하며, 여기에 제시된 분석 방법이 정확하고 정밀하다는 것을 보여줍니다.
우리의 방법은 또한 안구 운동 학습의 메커니즘을 조사하기 위해 널리 사용되는 패러다임인 OKR 가소성을 연구할 수 있는 기회를 제공합니다. 마우스에 지속적인 OKR 자극을 주거나 전정 기관을 외과적으로 병변시킬 때 OKR의 진폭은 강화될 수 있습니다 8,9. 여기에 제시된 OKR 분석은 OKR 강화에서 발생하는 안구 움직임의 작은 변화를 포착할 수 있을 만큼 민감합니다(그림 4D). 이 방법의 정량적 능력은 행동 변화를 신경 회로 역학과 연관시키는 것을 가능하게 하며, 이는 안구 운동 학습의 기초가 되는 메커니즘을 밝히는 데 필수적입니다 5,8,9,13.
OKR 측정의 정확성을 보장하기 위해서는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫째, 수술 중에는 초강력 접착제와 치과용 아크릴이 눈꺼풀에 닿아 각막이 손상되거나 눈 개구부를 부분적으로 막을 수 없도록 각별한 주의가 필요합니다. 둘째, OKR의 강도는 마우스의 행동 상태에 의해 영향을 받는다27,28. 따라서 OKR 측정에 대한 스트레스의 영향을 최소화하기 위해 몇 차례의 조정이 권장됩니다. 또한 녹음 중에는 냄새, 소음 또는 빛으로 인한 방해를 방지해야 합니다. 마지막으로 눈의 두 모서리를 연결하는 선이 수평축과 평행하도록 쥐의 머리를 올바르게 향해야 합니다. 이것은 시각적 움직임의 방향이 내전 및 외전 안구 운동의 축과 정렬되도록 보장합니다. 셋째, 눈의 균일한 조명은 동공의 선명한 이미지를 생성하고 고품질 시선 추적을 보장하는 데 중요합니다.
여기에 제시된 방법에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 첫째, 동물의 눈이 깜빡이거나 불투명한 눈 분비물이 동공을 막으면 비디오 안구 조영술이 순간적으로 또는 영구적으로 눈을 추적하지 못하게 됩니다. 마찬가지로 눈꺼풀을 봉합할 때 눈의 움직임을 모니터링하는 데 사용할 수 없습니다. 둘째, 비디오 안구 촬영의 시간적 해상도는 카메라의 프레임 속도에 의해 4-20ms 범위로 제한됩니다. 마지막으로, 머리 고정 준비는 자유롭게 움직이는 동물의 안구 행동을 모니터링 할 수 없습니다.
여기에 제시된 비디오 안구 및 가상 드럼은 OKR 행동의 시각적 특징 선택성과 가소성을 특성화하고 이 행동을 중재하고 적응적으로 조절하는 데 관련된 망막 및 중심 회로를 이해하는 데 성공적으로 적용되었습니다. 또한 다른 안구 행동이 신경 현상의 주제 또는 교란 요인인 연구에도 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 비디오-안구 조영술은 동공 확장(29) 및 안구 운동(saccade-like eye movement)30,31을 모니터링하는데 사용될 수 있는데, 이는 각성 및 뇌 상태(32,33,34,35)를 나타낸다. 또한, 여기에 설명된 보정 및 측정 절차는 자유롭게 움직이는 마우스에서 헤드 마운트 카메라로 안구 움직임을 모니터링하는 데 보편적으로 적용할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 상충되는 이해관계가 없음을 선언합니다.
Acknowledgments
방향 조정 데이터를 공유해 주신 Yingtian He에게 감사드립니다. 이 연구는 Canadian Foundation of Innovation 및 Ontario Research Fund(CFI/ORF 프로젝트 번호 37597), NSERC(RGPIN-2019-06479), CIHR(Project Grant 437007) 및 Connaught New Researcher Awards의 보조금으로 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2D translational stage | Thorlabs | XYT1 | |
| Acrylic resin | Lang Dental | B1356 | For fixing headplate on skull and protecting skull |
| Bupivacaine | STERIMAX | ST-BX223 | Bupivacaine Injection BP 0.5%. Local anesthesia |
| Carprofen | RIMADYL | 8507-14-1 | Analgesia |
| Compressed air | Dust-Off | ||
| Eye ointment | Alcon | Systane | For maintaining moisture of eyes |
| Graphic card | NVIDIA | Geforce GTX 1650 or Quadro P620. | For generating single screen among three monitors |
| Heating pad | Kent Scientific | HTP-1500 | For maintaining body temperature |
| High-speed infrared (IR) camera | Teledyne Dalsa | G3-GM12-M0640 | For recording eye rotation |
| IR LED | Digikey | PDI-E803-ND | For CR reference and the illumination of the eye |
| IR mirror | Edmund optics | 64-471 | For reflecting image of eye |
| Isoflurane | FRESENIUS KABI | CP0406V2 | |
| Labview | National instruments | version 2014 | eye tracking |
| Lactated ringer | BAXTER | JB2324 | Water and energy supply |
| Lidocaine and epinephrine mix | Dentsply Sirona | 82215-1 | XYLOCAINE. Local anesthesia |
| Luminance Meter | Konica Minolta | LS-150 | for calibration of monitors |
| Matlab | MathWorks | version xxx | analysis of eye movements |
| Meyhoefer Curette | World Precision Instruments | 501773 | For scraping skull and removing fascia |
| Microscope calibration slide | Amscope | MR095 | to measure the magnification of video-oculography |
| Monitors | Acer | B247W | Visual stimulation |
| Neutral density filter | Lee filters | 299 | to generate scotopic visual stimulation |
| Nigh vision goggle | Alpha optics | AO-3277 | for scotopic OKR |
| Photodiode | Digikey | TSL254-R-LF-ND | to synchronize visual stimulation and video-oculography |
| Pilocarpine hydrochloride | Sigma-Aldrich | P6503 | |
| Post | Thorlabs | TR1.5 | |
| Post holder | Thorlabs | PH1 | |
| PsychoPy | open source software | version xxx | visual stimulation toolkit |
| Scissor | RWD | S12003-09 | For skin removal |
| Superglue | Krazy Glue | Type: All purpose. For adhering headplate on the skull |
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