Summary
Descrevemos um protocolo padrão para quantificação do reflexo optocinético. Combina estimulação virtual de tambor e vídeo-oculografia, permitindo assim uma avaliação precisa da seletividade característica do comportamento e sua plasticidade adaptativa.
Abstract
O reflexo optocinético (RPO) é um movimento ocular inato essencial que é desencadeado pelo movimento global do ambiente visual e serve para estabilizar as imagens retinianas. Devido à sua importância e robustez, o OKR tem sido utilizado para estudar a aprendizagem visomotora e avaliar as funções visuais de camundongos com diferentes origens genéticas, idades e tratamentos medicamentosos. Aqui, apresentamos um procedimento para avaliar respostas OKR de camundongos com cabeça fixada com alta precisão. A fixação da cabeça pode excluir a contribuição da estimulação vestibular sobre os movimentos oculares, tornando possível mensurar os movimentos oculares desencadeados apenas pelo movimento visual. O OKR é provocado por um sistema de tambor virtual, no qual uma grade vertical apresentada em três monitores de computador flutua horizontalmente de forma oscilatória ou unidirecional a uma velocidade constante. Com este sistema de realidade virtual, podemos alterar sistematicamente parâmetros visuais como frequência espacial, frequência temporal/oscilação, contraste, luminância e direção das grades, e quantificar curvas de sintonia da seletividade de características visuais. A video-oculografia infravermelha de alta velocidade garante a medição precisa da trajetória dos movimentos oculares. Os olhos de camundongos individuais são calibrados para fornecer oportunidades de comparar os OKRs entre animais de diferentes idades, gêneros e origens genéticas. O poder quantitativo dessa técnica permite detectar alterações no OKR quando esse comportamento se adapta plasticamente devido ao envelhecimento, experiência sensorial ou aprendizagem motora; Assim, torna esta técnica um valioso acréscimo ao repertório de ferramentas utilizadas para investigar a plasticidade dos comportamentos oculares.
Introduction
Em resposta aos estímulos visuais do ambiente, nossos olhos se movem para deslocar o olhar, estabilizar imagens retinianas, rastrear alvos em movimento ou alinhar as fóveas de dois olhos com alvos localizados a distâncias diferentes do observador, que são vitais para uma visão adequada 1,2. Comportamentos oculomotores têm sido amplamente utilizados como modelos atrativos de integração sensório-motora para a compreensão dos circuitos neurais na saúde e na doença, pelo menos em parte devido à simplicidadedo sistema oculomotor3. Controlado por três pares de músculos extraoculares, o olho gira no alvéolo primariamente em torno de três eixos correspondentes: elevação e depressão ao longo do eixo transverso, adução e abdução ao longo do eixo vertical e intorção e extorsão ao longo do eixo anteroposterior 1,2. Um sistema tão simples permite que os pesquisadores avaliem os comportamentos oculomotores de camundongos com facilidade e precisão em um ambiente de laboratório.
Um dos principais comportamentos oculomotores é o reflexo optocinético (RPO). Esse movimento ocular involuntário é desencadeado por lentas derivas ou deslizamentos de imagens na retina e serve para estabilizar as imagens retinianas à medida que a cabeça do animal ou seus arredores se movem 2,4. O OKR, como paradigma comportamental, é interessante para os pesquisadores por vários motivos. Primeiro, pode ser estimulada de forma confiável e quantificada com precisão 5,6. Em segundo lugar, os procedimentos de quantificação desse comportamento são relativamente simples e padronizados e podem ser aplicados para avaliar as funções visuais de uma grande coorte deanimais7. Terceiro, esse comportamento inato é altamente plástico 5,8,9. Sua amplitude pode ser potencializada quando deslizamentos repetitivos da retina ocorrem por longotempo5,8,9, ou quando o reflexo vestibular ocular (RVO), outro mecanismo de estabilização das imagens retinianas desencadeado pela entrada vestibular2, está comprometido5. Esses paradigmas experimentais de potenciação de OKR capacitam os pesquisadores a desvendar a base do circuito subjacente à aprendizagem oculomotora.
Dois métodos não invasivos têm sido primariamente utilizados para avaliar a RA em estudos anteriores: (1) video-oculografia combinada com um tambor físico 7,10,11,12,13 ou (2) determinação arbitrária de giros cefálicos combinada com um tambor virtual6,14,15,16. Embora suas aplicações tenham feito descobertas frutíferas na compreensão dos mecanismos moleculares e de circuito da plasticidade oculomotora, esses dois métodos têm algumas desvantagens que limitam seus poderes em examinar quantitativamente as propriedades do OKR. Em primeiro lugar, tambores físicos, com padrões impressos de listras ou pontos em preto e branco, não permitem mudanças fáceis e rápidas de padrões visuais, o que restringe em grande parte a medida da dependência do OKR de certas características visuais, como frequência espacial, direção e contraste de grades em movimento 8,17. Em vez disso, testes da seletividade do OKR a essas características visuais podem se beneficiar da estimulação visual computadorizada, na qual as características visuais podem ser convenientemente modificadas de tentativa para tentativa. Dessa forma, os pesquisadores podem examinar sistematicamente o comportamento do OKR no espaço de parâmetros visuais multidimensionais. Além disso, o segundo método do ensaio de OKR relata apenas os limiares dos parâmetros visuais que desencadeiam as OKRs discerníveis, mas não as amplitudes dos movimentos dos olhos ou da cabeça 6,14,15,16. A falta de poder quantitativo impede, portanto, analisar a forma das curvas de sintonia e as características visuais preferidas, ou detectar diferenças sutis entre camundongos individuais em condições normais e patológicas. Para superar as limitações acima, a video-oculografia e a estimulação visual virtual computadorizada foram combinadas para testar o comportamento do RA em estudos recentes 5,17,18,19,20. No entanto, esses estudos publicados anteriormente não forneceram detalhes técnicos suficientes ou instruções passo a passo e, consequentemente, ainda é um desafio para os pesquisadores estabelecer tal teste OKR para suas próprias pesquisas.
Aqui, apresentamos um protocolo para quantificar precisamente a seletividade de características visuais do comportamento de OKR sob condições fotópicas ou escotópicas com a combinação de vídeo-oculografia e estimulação visual virtual computadorizada. Os camundongos são fixados com a cabeça para evitar o movimento ocular evocado pela estimulação vestibular. Uma câmera de alta velocidade é usada para registrar os movimentos oculares de ratos vendo grades em movimento com parâmetros visuais alterados. O tamanho físico dos globos oculares de camundongos individuais é calibrado para garantir a precisão da derivação do ângulo dos movimentos oculares21. Este método quantitativo permite comparar o comportamento do OKR entre animais de diferentes idades ou origens genéticas, ou monitorar sua alteração causada por tratamentos farmacológicos ou aprendizagem visomotora.
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Protocol
Todos os procedimentos experimentais realizados neste estudo foram aprovados pelo Comitê Local de Cuidados com Animais de Ciências Biológicas, de acordo com as diretrizes estabelecidas pelo Comitê de Cuidados com Animais da Universidade de Toronto e pelo Conselho Canadense de Cuidados com Animais.
1. Implantação de uma barra de cabeça no topo do crânio
NOTA: Para evitar a contribuição do comportamento do RVO para os movimentos oculares, a cabeça do mouse é imobilizada durante o teste OKR. Portanto, uma barra de cabeça é implantada cirurgicamente no topo do crânio.
- Anestesiar camundongos (fêmeas e machos C57BL/6 de 2-5 meses de idade por meio de uma mistura de isoflurano a 4% (v/v) e O2 em câmara de gás. Transfira o mouse para uma plataforma de cirurgia personalizada e reduza a concentração de isoflurano para 1,5%-2%. Monitore a profundidade da anestesia verificando a resposta da pinça dos dedos dos pés e a taxa de respiração durante toda a cirurgia.
- Coloque uma almofada de aquecimento por baixo do corpo do animal para manter sua temperatura corporal. Aplique uma camada de pomada lubrificante para os olhos em ambos os olhos para protegê-los da secagem. Cubra os olhos com papel alumínio para protegê-los da iluminação da luz.
- Injetar carprofeno por via subcutânea na dose de 20 mg/kg para reduzir a dor. Depois de molhar o pelo com o limpador de pele gluconato de clorexidina, raspe o pelo no topo do crânio. Desinfetar o couro cabeludo exposto com álcool isopropílico a 70% e álcool clorexidina duas vezes.
- Injetar bupivacaína (8 mg/kg) por via subcutânea no local da incisão e, em seguida, remover o couro cabeludo (~1 cm2) com tesoura para expor a superfície dorsal do crânio, incluindo o osso frontal posterior, osso parietal e osso interparietal.
- Aplicar várias gotas de lidocaína a 1% e epinefrina 1:100.000 no crânio exposto para reduzir a dor local e o sangramento. Raspe o crânio com uma cureta Meyhoefer para remover a fáscia e limpe-a com solução salina tamponada com fosfato (PBS).
NOTA: O músculo temporal é separado do crânio para aumentar a área de superfície para uma barra de cabeça para fixar. - Seque o crânio soprando suavemente ar comprimido em direção à superfície do crânio até que a umidade desapareça e o osso fique esbranquiçado. Aplique uma fina camada de supercola na superfície exposta do crânio, incluindo a borda do couro cabeludo cortado, seguida por uma camada de resina acrílica.
NOTA: A superfície do crânio precisa estar livre de sangue ou água antes da aplicação de supercola. - Coloque uma barra de cabeça de aço inoxidável (ver Figura 1A) ao longo da linha média no topo do crânio. Aplique mais resina acrílica, começando pela borda da barra da cabeça até que a base da barra da cabeça esteja completamente embutida na resina acrílica. Aplique a resina acrílica duas ou três vezes para aumentar a espessura.
- Aguarde cerca de 15 min até que a resina acrílica endureça. Injetar por via subcutânea 1 mL de solução de ringer com lactato. Em seguida, devolva o rato a uma gaiola colocada numa almofada de aquecimento até que o animal esteja totalmente móvel.
- Permita que o rato recupere na gaiola de casa durante pelo menos 5 dias após a cirurgia. Quando o animal estiver em boa forma, fixe a cabeça com a barra da cabeça na configuração OKR por 15-30 min para familiarizá-lo com a fixação da cabeça e o ambiente experimental. Repita a familiarização uma vez ao dia por pelo menos 3 dias.
2. Configuração do tambor virtual e vídeo-oculografia
- Monte três monitores ortogonalmente um ao outro para formar um recinto quadrado que cobre ~270° do azimute e 63° da elevação no espaço visual (Figura 1B à esquerda).
- Com uma placa gráfica discreta, mescle os três monitores em uma tela simples para garantir a sincronização em todos os monitores.
- Calibre a luminância dos monitores conforme descrito abaixo.
- Ligue o computador ao qual os monitores estão conectados e aguarde 15 minutos. O aquecimento é essencial para ter luminância estável.
- Altere sistematicamente a configuração de brilho no monitor de 0 para 100 por etapas de 25.
- Para cada valor de brilho, meça a luminância dos monitores sob vários valores de pixel (0-255, passos de 15) com um medidor de luminância.
- Ajuste a relação entre luminância e brilho para o valor de pixel 255 com regressão linear e estime o valor de brilho que dá origem a 160 cd/m2.
- Para cada valor de pixel usado na medição de luminância (passo 2.3.3), estime a luminância para o valor de brilho derivado na etapa 2.3.4 com base na regressão linear. Use a função de potência lum = A * pixel γ para ajustar a relação entre o novo conjunto de valores de luminância (sob o valor de brilho derivado em 2.3.4) e seus valores de pixel correspondentes para derivar o fator gama γe o coeficiente A. Estes serão utilizados para gerar grades senoidais dos valores de luminância desejados.
- Defina o brilho de todos os três monitores para os valores derivados na etapa 2.3.4 para garantir que seus valores de luminância sejam os mesmos para o mesmo valor de pixel.
- Gere um tambor virtual, que é usado para estimular o comportamento OKR, com o kit de ferramentas de estimulação visual, conforme descrito abaixo.
- Apresentar uma grade senoidal vertical nos monitores e ajustar o período (espaçamento entre listras) ao longo do azimute para garantir que a projeção da grade no olho tenha frequência espacial constante (grade de tambor; Figura 1B meio e direita).
- Certifique-se de que a cabeça do animal esteja fixada no centro do recinto para que ele veja que a grade tem uma frequência espacial constante em toda a superfície do tambor virtual.
- Modificar os parâmetros da grade móvel, como a amplitude oscilatória, frequência espacial, frequência temporal/oscilação, direção, contraste, etc., nos códigos de estimulação visual. Use dois tipos de movimento visual: (1) a grade se desloca no sentido horário ou anti-horário de forma oscilatória seguindo uma função senoidal:
Aqui, Amp é a amplitude da trajetória do tambor, f é a frequência de oscilação, e t é o tempo (amplitude de oscilação: 5°; frequência espacial da grade: 0,04-0,45 cpd; frequência de oscilação: 0,1-0,8 Hz, correspondendo a um pico de velocidade do estímulo de 3,14-25,12°/s [velocidade do tambor = Amp x 2π x f x cos (2π x f x t); contraste: 80%-100%; luminância média: 35-45 cd/m2; 2) A grelha deriva unidirecionalmente a uma velocidade constante:
(Frequência espacial: 0,04-0,64 cpd; frequência temporal: 0,25-1 Hz; velocidade do tambor = frequência temporal/frequência espacial.)
- Configure a vídeo-oculografia conforme descrito abaixo.
- Para evitar o bloqueio do campo visual do animal, coloque um espelho infravermelho (IR) a 60° da linha média para formar uma imagem do olho direito.
- Coloque uma câmera IR no lado direito atrás do mouse (Figura 1C esquerda) para capturar uma imagem do olho direito.
- Monte a câmera IR de alta velocidade em um braço de câmera que permite que a câmera gire ± 10° em torno da imagem do olho direito (Figura 1C à direita).
- Use um fotodiodo acoplado a um dos monitores para fornecer um sinal elétrico para sincronizar o tempo de video-oculografia e estimulação visual.
- Coloque quatro diodos emissores de luz IR (LEDs) apoiados por braços de pescoço de ganso ao redor do olho direito para fornecer iluminação IR do olho.
- Coloque dois LEDs IR na câmera para fornecer referências de reflexão corneana (CR): um é fixado acima da câmera (X-CR), enquanto o outro está no lado esquerdo da câmera (Y-CR; Figura 1D).
- Meça a ampliação óptica do sistema de vídeo-oculografia com uma lâmina de calibração.
NOTA: Os CRs de referência são usados para cancelar os movimentos oculares translacionais quando o ângulo do olho é calculado com base nos movimentos rotacionais dos olhos.
- Fixe a cabeça do animal no centro do recinto formado pelos monitores, conforme descrito abaixo.
- Fixe a cabeça do animal com a placa da cabeça no centro da plataforma e faça-a virada para a frente. Ajustar a inclinação da cabeça de modo que os olhos esquerdo e direito sejam nivelados e os cantos nasal e temporal dos olhos estejam alinhados horizontalmente (Figura 1E).
- Movimentar a cabeça do animal horizontalmente por ajuste grosseiro proporcionado pelo aparelho de fixação da cabeça e ajuste fino fornecido por um estágio de translação 2D, e verticalmente através do aparelho de fixação da cabeça e de um par poste/suporte de poste, até que o olho direito do animal apareça no vídeo ao vivo da câmera. Antes da calibração e medição dos movimentos oculares, sobreponha a imagem do olho direito do animal refletida pelo espelho quente com o ponto de pivô do braço da câmera (veja detalhes na etapa 3.4 abaixo).
- Crie um gabinete personalizado ao redor da plataforma OKR para bloquear a luz ambiente (Figura 1F).
3. Calibração dos movimentos oculares
NOTA: Os movimentos oculares rotacionais são calculados com base nos movimentos da pupila e no raio da órbita dos movimentos pupilares (Rp, a distância do centro da pupila ao centro do globo ocular). Para cada camundongo individualmente, esse raio é medido experimentalmente21.
- Fixar a cabeça do animal no centro do recinto formado pelos três monitores, conforme descrito no passo 2.6.1.
- Ligue a câmera e ajuste os quatro LEDs ao redor do olho direito para obter uma iluminação IR uniforme.
- Sob orientação visual, ajuste a posição do olho direito até que ele apareça no centro do vídeo, conforme descrito na etapa 2.6.2.
- Alinhe a imagem virtual do olho direito com o ponto de pivô do braço da câmera, conforme descrito abaixo.
- Gire manualmente o braço da câmera para a extremidade esquerda (-10°). Mover manualmente a posição do olho direito do animal no plano horizontal perpendicular ao eixo óptico com ajuste fino do estágio de translação 2D (Figura 1C, seta verde), até que o X-CR esteja no centro horizontal da imagem.
- Gire manualmente o braço da câmera para a outra extremidade (+10°). Se o X-CR se afastar do centro da imagem, mova o olho direito ao longo do eixo óptico com ajuste fino até que o X-CR chegue ao centro (Figura 1C, seta azul).
- Repita as etapas 3.4.1-3.4.2 algumas vezes até que o X-CR permaneça no centro quando o braço da câmera oscilar para a esquerda e para a direita. Se o olho direito se mover no meio de uma repetição, reinicie o processo de ajuste.
- Meça a distância vertical entre o Y-CR e o X-CR após travar o braço da câmera na posição central. Ligue o LED Y-CR e grave sua posição no vídeo e, em seguida, alterne para o LED X-CR e grave sua posição.
OBS: A distância vertical entre o Y-CR e o X-CR será utilizada para derivar a posição do Y-CR durante a mensuração dos movimentos oculares em que apenas o LED X-CR está ligado. - Meça o raio de rotação da pupila Rp, conforme descrito abaixo.
- Gire o braço da câmera para a extremidade esquerda (-10°) e registre as posições da pupila (P,p1) e X-CR (P, CR1) no vídeo.
- Em seguida, gire o braço da câmera para a extremidade direita (+10°) e registre as posições da pupila (Pp2) e X-CR (PCR2) no vídeo. Repita esta etapa várias vezes.
NOTA: O olho direito do animal precisa permanecer parado durante cada repetição para que a quantidade de movimentos da pupila no filme reflita com precisão o grau de balanço do braço da câmera. - Com base nos valores registrados acima, calcule o raio de rotação pupilar Rp (Figura 2A) com a seguinte fórmula:
NOTA: A distância entre o reflexo da córnea e o centro da pupila no espaço físico é calculada com base na sua distância no filme:
PCR - Pp = número de pixels no filme x tamanho do pixel do chip da câmera x ampliação
- Desenvolver a relação entre Rp e diâmetro da pupila, conforme descrito abaixo. Rp muda quando a pupila dilata ou contrai; proximalmente, seu valor é inversamente proporcional ao tamanho da pupila (Figura 2B superior).
- Alterar sistematicamente a luminância dos monitores de 0 para 160 cd/m2 para regular o tamanho da pupila.
- Para cada valor de luminância, repita o passo 3,6 8-10 vezes e registre o diâmetro da pupila.
- Aplicar regressão linear à relação entre Rp e diâmetro da pupila com base nos valores medidos acima para derivar a inclinação e intercepto (Figura 2B abaixo).
NOTA: Os outliers causados por movimentos oculares ocasionais são removidos antes do ajuste linear. Para medições repetitivas em várias sessões, a calibração precisa ser feita apenas uma vez para um animal, a menos que seu olho cresça durante o experimento.
4. Registre os movimentos oculares do OKR
- Fixe um mouse na plataforma seguindo as etapas 3.1-3.4. Ignore esta etapa se a gravação ocorrer logo após a calibração ser feita. Bloqueie o braço da câmera na posição central.
- Configure os monitores e o animal para OKR escotópico conforme descrito abaixo. Pule esta etapa para OKR fotópico.
- Cubra a tela de cada monitor com um filtro personalizado, que é feito de cinco camadas de filme de densidade neutra (ND) de 1,2. Certifique-se de que nenhuma luz vaze pelo espaço entre o filtro e o monitor.
- Desligue a luz do ambiente. Os passos a seguir são feitos com o auxílio de um óculos IR.
- Aplicar uma gota de solução de pilocarpina (2% em soro fisiológico) no olho direito e aguardar 15 min. Certifique-se de que a gota permanece no olho e não é limpa pelo mouse. Se a solução for enxugada pelo animal, aplique outra gota de solução de pilocarpina. Isso encolhe a pupila para um tamanho adequado para rastreamento ocular sob a condição escotópica.
NOTA: Sob a condição escotópica, a pupila dilata substancialmente de modo que sua borda fica parcialmente escondida atrás da pálpebra. Isso afeta a precisão da estimativa do centro pupilar pela video-oculografia. O encolhimento farmacológico da pupila do olho direito diminui sua entrada visual e, assim, os estímulos visuais são apresentados ao olho esquerdo. - Lave o olho direito com soro fisiológico para lavar bem a solução de pilocarpina. Puxe a cortina para vedar completamente o recinto, o que evita que a luz perdida interfira na visão escotópica.
- Dê ao animal 5 min para se acomodar totalmente ao ambiente escotópico antes de iniciar o teste OKR.
- Execute o software de estimulação visual e o software de rastreamento ocular. Para a medição de OKR fotópico, certifique-se de que a grade do tambor oscile horizontalmente com uma trajetória senoidal; para a medição escotópica do OKR, certifique-se de que a grade do tambor se desloque a uma velocidade constante da esquerda para a direita, que é a direção têmporo-nasal em referência ao olho esquerdo.
NOTA: Quando a pupila do olho direito, mas não do olho esquerdo, é encolhida pela pilocarpina sob a condição escotópica, o OKR eliciado pela estimulação oscilatória do tambor é altamente assimétrico. Assim, para a medida escotópica do OKR, o olho esquerdo é estimulado enquanto o movimento do olho direito é monitorado. - O software de rastreamento ocular mede automaticamente o tamanho da pupila, a posição CR e a posição da pupila para cada quadro e calcula o ângulo de posição dos olhos com base na seguinte fórmula (Figura 2C):
Aqui, P CR é a posiçãoCR, P p é a posição da pupila e Rp é o raio de rotação da pupila. A distância entre a reflexão da córnea e o centro da pupila no espaço físico é calculada com base na distância deles no filme:
PCR - Pp = número de pixels no filme x tamanho do pixel do chip da câmera x ampliação
Rp do tamanho da pupila correspondente é derivado com base no modelo de regressão linear na etapa 3.7.3 (Figura 2B abaixo).
5. Análise dos movimentos oculares do OKR com o software de análise ocular
- Processe os traços oculares usando um filtro mediano (janela de filtro = 0,05 s) para remover o ruído de alta frequência (Figura 3A no meio).
- Remova os sacádicos ou nistagmos conforme descrito abaixo.
- Estimar a velocidade ocular calculando a derivada de primeira ordem dos movimentos oculares (Figura 3A abaixo). Identificar os sacádicos ou nistagmo aplicando um limiar de velocidade de 50°/s (Figura 3A abaixo).
- Substituir os sacádicos ou nistagmo extrapolando a posição dos olhos durante esses movimentos rápidos dos olhos a partir do segmento anterior aos sacádicos ou nistagmo com base na regressão linear (Figura 3B).
- Calcule a amplitude dos movimentos oculares do OKR por transformada rápida de Fourier (algoritmo de Goertzel) se a grade do tambor oscilar (Figura 3C), ou calcule a velocidade média dos movimentos oculares durante a estimulação visual se a grade do tambor se mover a uma velocidade constante em uma direção (Figura 3B inferior).
OBS: A amplitude dos movimentos oculares oscilatórios derivados da transformada de Fourier é semelhante à amplitude derivada do ajuste do trajeto ocular com função senoidal (Figura 3D). - Calcule o ganho OKR. Para o movimento oscilatório do tambor, o ganho de OKR é definido como a razão entre a amplitude dos movimentos oculares e a amplitude dos movimentos do tambor (Figura 3C à direita). Para o movimento unidirecional do tambor, o ganho de OKR é definido como a razão entre a velocidade do olho e a velocidade da grade do tambor (Figura 3B abaixo).
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Representative Results
Com o procedimento detalhado acima, avaliamos a dependência do OKR em diversas características visuais. Os rastreamentos de exemplo mostrados aqui foram derivados usando os códigos de análise fornecidos no Arquivo de Codificação Suplementar 1, e o arquivo bruto de rastreios de exemplo pode ser encontrado no Arquivo de Codificação Suplementar 2. Quando a grade do tambor flutuava em trajetória senoidal (0,4 Hz), o olho do animal acompanhava automaticamente o movimento da grade de forma oscilatória semelhante (painel superior da Figura 3B), característico do comportamento do OKR2,5,8. A amplitude dos movimentos oculares do OKR no eixo horizontal foi derivada com transformada rápida de Fourier (Figura 3C&D), e o ganho do OKR foi calculado como a razão entre a amplitude dos movimentos oculares e a amplitude do movimento da grade (Figura 3C). O ganho de OKR variou com os valores de frequência espacial, frequência de oscilação e direção da grade de movimento (Figura 4A). Primeiro, a curva de sintonia de frequência espacial do comportamento do OKR tinha forma de V invertido e atingiu um pico de frequência espacial intermediária de 0,16 cpd (Figura 4A à esquerda). Em segundo lugar, a curva de sintonia da frequência de oscilação diminuiu monotonicamente à medida que a frequência de oscilação da grade do tambor aumentou (Figura 4A no meio), indicando que o comportamento do OKR funciona melhor em resposta ao movimento visual de baixa velocidade4. Tanto a amplitude quanto a forma da curva de sintonia das frequências de oscilação variaram quando se apresentaram grades de diferentes frequênciasespaciais17. Terceiro, o OKR horizontal também poderia ser induzido por grades movendo-se em direções diferentes (Figura 4A à direita). O comportamento mais forte da OKR horizontal foi provocado pelo movimento têmporo-nasal (0°). O ganho de OKR caiu para ~80%, ou ~30% do máximo, quando a grade se moveu em ângulos oblíquos de 30° ou 60° desviados da direção têmporo-nasal (tanto para cima quanto para baixo), respectivamente, e o OKR horizontal desapareceu quando a grade se moveu verticalmente para cima ou para baixo (90° e 270°). Além disso, as formas das curvas de sintonia foram influenciadas pelo nível de luminância. Por exemplo, os animais realizaram bem o comportamento do OKR em resposta às frequências espaciais de 0,16 e 0,32 cpd na condição fotópica, mas a curva de sintonia da frequência espacial deslocou-se para a esquerda na condição escotópica (Figura 4B). Para analisar a forma das curvas de sintonia, nós as ajustamos com funções matemáticas apropriadas. Por exemplo, a função gaussiana foi usada para estimar o pico e a largura de banda da sintonia de frequência espacial (Figura 4C). Com essa análise, verificou-se que a curva de sintonia sob a condição escotópica apresentou menor valor na frequência espacial preferida em comparação à condição fotópica. O procedimento detalhado acima também pode ser usado para quantificar a plasticidade do comportamento do OKR. Após 45 min de estimulação contínua com OKR, a amplitude do comportamento do OKR foi significativamente potencializada (Figura 4D), consistente com relatos anteriores. Estes resultados demonstram as aplicações deste protocolo no exame dos comportamentos e potenciais oculomotores na compreensão dos circuitos cerebrais envolvidos nesses comportamentos.
Figura 1: Configuração do equipamento OKR . (A) Dimensões da barra de cabeçote. (B) Vista traseira (esquerda) e vista superior (meio) do sistema de bateria virtual. Três monitores são montados ortogonalmente um ao outro. A cabeça de um rato é colocada no centro do recinto quadrado e virada para a frente. O período de estimulação visual (espaço entre as listras) é variado com base no azimute ao olho do animal para garantir que a projeção da grade no olho tenha uma frequência espacial constante. Em outras palavras, a frequência espacial da grade é percebida como constante em todo o campo visual, como se a grade flutuasse ao longo da superfície de um tambor virtual (à direita). (C) Configuração da video-oculografia IR. Esquerda: a posição da câmera quando fixada no centro durante a gravação do OKR. Seta azul: ao longo do eixo óptico. Seta verde: perpendicular ao eixo óptico. Direita: a rotação da câmera durante a calibração dos olhos. (D) Posição dos LEDs X-CR e Y-CR fixados na câmera. (E) Os níveis dos olhos esquerdo e direito (esquerdo) e os cantos nasal e temporal dos olhos são alinhados horizontalmente (direita) girando a haste horizontal ou o adaptador da placa de cabeça, respectivamente (setas vermelhas). (F) Foto da estação OKR. Observe que o equipamento OKR é colocado dentro de um gabinete personalizado com uma cortina preta. Abreviações: IR = infravermelho; RC = reflexão corneana. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Calibração e mensuração das posições oculares em video-oculografia . (A) Esquema da calibração. O raio de rotação da pupila (Rp) é estimado girando-se a câmera para a posição mais à esquerda (-10°, painel esquerdo) e para a posição mais à direita (10°, painel direito). Pontos vermelhos indicam as posições de reflexão da córnea X-CR quando a câmera é colocada nas posições mais à esquerda e mais à direita. Pontos azuis indicam os centros das pupilas. Barras verdes indicam as distâncias entre a reflexão corneana e o centro da pupila visualizado no vídeo da câmera (PCR -P P). (B) Dependência de Rp do tamanho da pupila. Topo: esquemas de globos oculares com pupila pequena ou grande. Fundo: relação entre Rp e o diâmetro da pupila de um rato de exemplo. O tamanho da pupila é alterado variando-se a luminância (10 valores na faixa de 0-160 cd/m2) para o mouse. Pontos pretos: os dados que são usados para ajuste linear. Pontos azuis: outliers que são excluídos do ajuste linear. Curva vermelha: a linha de melhor ajuste na regressão linear. Note que o Rp é inversamente proporcional ao diâmetro da pupila. (C) Cálculo do ângulo de posição dos olhos quando o olho se moveu para os lados direito ou esquerdo do eixo óptico. Pontos vermelhos, pontos azuis e barras verdes têm os mesmos significados que em A. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Cálculo do ganho de OKR. (A) Topo: instantâneos das posições dos olhos nasais (N; esquerda) e temporais (T; direita) durante a estimulação com OKR. Elipses vermelhas: ajustando-se ao perfil da pupila. Cruz vermelha: centros de alunos. Setas brancas: reflexão corneana de um LED de referência. Meio: as trajetórias dos movimentos oculares com (preto) ou sem (vermelho) um filtro mediano (janela de filtro = 0,05 s) para remover ruídos de alta frequência. Fundo: estimativa da velocidade ocular através do cálculo da derivada de primeira ordem dos movimentos oculares. Os sacádicos (setas vermelhas) são detectados com um limiar de velocidade de 50 °/s. (B) O trajeto dos movimentos oculares lentos do OKR após a remoção das sacadas/nistagmo (preto) sobrepostos com o trajeto do tambor22. Superior: movimento oscilatório do tambor com amplitude de 5° e frequência de oscilação de 0,4 Hz. Inferior: movimento unidirecional (temporo-nasal) do tambor com velocidade constante de 6,25°/s. (C) Esquerda: o ciclo-média da trajetória do olho no topo B. Direita: a análise da frequência dos movimentos de grade do olho ou do tambor por transformada rápida de Fourier. Deve-se notar que a grade do tambor oscila a 0,4 Hz, e assim as amplitudes de movimento da grade do olho e do tambor atingem o pico em 0,4 Hz (marcas de estrelas). O ganho de OKR é a razão entre as amplitudes do movimento da grade do olho e do tambor a 0,4 Hz. (D) Topo: ajuste curvo da trajetória do olho no topo B com função senoidal. Fundo: relação da amplitude dos movimentos oculares derivada pelo método da transformada rápida de Fourier e derivada do ajuste da curva senoidal. Ponto amarelo: exemplo na parte superior. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Seletividade de características visuais e plasticidade dos comportamentos de OKR. (A) A seletividade de características visuais do ganho de OKR sob a condição fotópica. Esquerda: curva de sintonia de frequência espacial de um animal (frequência de oscilação: 0,4 Hz; trajetória: oscilando horizontalmente; luminância média: 40 cd/m2; n = 15). Média: curva de sintonia da frequência de oscilação de um animal (frequência espacial: 0,08 ou 0,16 cpd; trajetória: oscilando horizontalmente; luminância média: 40 cd/m2; n = 15). Direita: curva de sintonia de direção de um animal (frequência espacial: 0,16 cpd; frequência temporal: 1 Hz; luminância média: 45 cd/m2; n = 24). A seta vermelha e a barra indicam a direção têmporo-nasal. Para sintonia espacial e temporal/frequência de oscilação, uma grade vertical do tambor apresentada em três monitores move-se horizontalmente a uma velocidade constante ou de forma oscilatória. Para sintonia de direção, uma grade apresentada apenas no monitor direito se move em uma das 12 direções a uma velocidade constante. Espessura: erro padrão da média (EPM). (B) Curva de sintonia de frequência espacial do ganho de OKR de um animal sob a condição escotópica ou fotópica. Fotográfico: movimento oscilatório; frequência de oscilação: 0,2 Hz; luminância média: 40 cd/m2; n = 15. Escotópico: movimento linear com velocidade constante; frequência temporal: 0,25 Hz; luminância média: 8 x 10-5 cd/m2; n = 16. A condição escotópica é obtida cobrindo-se os monitores com cinco camadas de filtro Lee (299 1,2 ND). (C) Ajuste gaussiano de sintonia de frequência espacial do ganho de OKR sob condições fotópicas e escotópicas. Fotográfico: movimento oscilatório; frequência de oscilação: 0,2 Hz; luminância média: 40 cd/m2; n = 15. Escotópico: movimento linear com velocidade constante; frequência temporal: 0,25 Hz; luminância média: 8 x 10-5 cd/m2; n = 16. (D) Potencialização do OKR de um camundongo induzida por 45 min de estimulação contínua com OKR. Frequência espacial: 0,1 cpd; frequência de oscilação: 0,4 Hz; luminância média: 35 cd/m2; n = 40. Topo: trajetórias médias do ciclo OKR antes e depois da potencialização do OKR. Espessura: SEM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Arquivo de codificação suplementar 1: código de análise usado para gerar os rastreamentos de exemplo. Clique aqui para baixar este arquivo.
Arquivo de codificação suplementar 2: Exemplos de rastreamentos gerados com o software. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
O método do ensaio comportamental OKR aqui apresentado apresenta várias vantagens. Primeiro, a estimulação visual gerada por computador resolve os problemas intrínsecos dos tambores físicos. Lidando com a questão de que os tambores físicos não suportam o exame sistemático da sintonia espacial de frequência, direção ou contraste8, o tambor virtual permite que esses parâmetros visuais sejam alterados experimentalmente, facilitando uma análise sistemática e quantitativa da seletividade de características do comportamento do OKR (Figura 4A); Enquanto os tambores físicos sofrem uma iluminação não uniforme por uma fonte de luz externa23, o tambor virtual pode facilmente fornecer luminância homogênea em toda a sua superfície; com a ajuda de filtros ND e um medidor de luminância, a estimulação visual gerada por computador permite a medição do OKR em vários níveis de luminância bem controlados, desde escotópico até fotópico (Figura 4B), o que é difícil de ser feito com tambores físicos. Sem a limitação na aceleração de tambores físicos devido à sua massa inercial, a estimulação visual virtual pode alcançar trajetórias idealmente precisas, especialmente em alta aceleração e alta velocidade. Além disso, a estimulação visual gerada por computador permite o desenho criativo de outros tipos de estimulação visual, como pontos coerentemente em movimento, o que ajuda a investigar mecanismos de vários comportamentos oculomotores. Em segundo lugar, nosso procedimento é padronizado e, portanto, requer esforços mínimos para monitorar o progresso do registro comportamental, o que fornece uma oportunidade de examinar vários camundongos simultaneamente. Portanto, é adequado para estudos envolvendo uma grande coorte de animais (dezenas a centenas de animais). Terceiro, a alta precisão e o poder quantitativo permitem comparar medidas repetitivas de OKR de camundongos em estudos longitudinais24, sob diferentes tratamentos farmacológicos10 ou sob perturbações do circuito neural5. Por fim, a análise baseada na transformada de Fourier no domínio da frequência 5,7,9 fornece resultados equivalentes na amplitude dos movimentos oculares oscilatórios à análise baseada em ajustes no domínio temporal12,25,26 (Figura 3D abaixo), demonstrando que o método de análise aqui apresentado é acurado e preciso.
Nosso método também oferece uma oportunidade para estudar a plasticidade OKR, um paradigma muito usado para investigar os mecanismos de aprendizagem oculomotora. Ao apresentar estimulação contínua do RA em camundongo ou lesão cirúrgica de seu órgão vestibular, a amplitude do RA pode serpotencializada8,9. O ensaio OKR aqui apresentado é sensível o suficiente para captar pequenas mudanças nos movimentos oculares que ocorrem na potenciação do OKR (Figura 4D). O poder quantitativo desse método permite correlacionar as alterações comportamentais com a dinâmica dos circuitos neurais, o que é essencial para revelar os mecanismos subjacentes à aprendizagem oculomotora5,8,9,13.
Para garantir a precisão da medição OKR, existem algumas etapas críticas. Primeiro, durante a cirurgia, é necessário cuidado extra para evitar que a supercola e o acrílico dental toquem a pálpebra, o que pode danificar a córnea ou ocluir parcialmente a abertura ocular. Em segundo lugar, a força da OKR é afetada pelo estado comportamental de camundongos27,28. Assim, algumas rodadas de acomodação são recomendadas para minimizar o impacto do estresse na medição do OKR; Além disso, a perturbação causada por odorantes, ruído ou luz deve ser evitada durante a gravação. Finalmente, as cabeças dos ratos devem ser orientadas adequadamente para que a linha que liga os dois cantos dos olhos seja paralela ao eixo horizontal. Isso garante que a direção do movimento visual esteja alinhada com os movimentos oculares do eixo de adução e abdução. Em terceiro lugar, a iluminação uniforme do olho é fundamental para gerar uma imagem nítida da pupila e, por sua vez, garantir um rastreamento ocular de alta qualidade.
Vale ressaltar que existem algumas limitações dos métodos aqui apresentados. Primeiro, quando o olho de um animal pisca ou a descarga ocular opaca bloqueia a pupila, a video-oculografia perde o controle do olho momentaneamente ou permanentemente. Da mesma forma, não pode ser usado para monitorar os movimentos oculares quando as pálpebras são suturadas. Em segundo lugar, a resolução temporal da video-oculografia é limitada pela taxa de quadros das câmeras a um intervalo de 4-20 ms. Por fim, o preparo fixado na cabeça não permite monitorar o comportamento ocular de animais em movimento livre.
A vídeo-oculografia e o tambor virtual aqui apresentados foram aplicados com sucesso para caracterizar a seletividade de características visuais e a plasticidade do comportamento de OKR, e para entender os circuitos centrais e retinianos envolvidos na mediação e modulação adaptativa desse comportamento. Além disso, também podem beneficiar estudos em que outros comportamentos oculares sejam temas ou mesmo fatores de confusão dos fenômenos neurais. Por exemplo, a video-oculografia pode ser utilizada para monitorar a dilatação pupilar29 e movimentos oculares sacádicos 30,31, que são indicativos de estado de alerta e encefálico32,33,34,35. Além disso, os procedimentos de calibração e medição descritos aqui são universalmente aplicáveis para monitorar os movimentos oculares com uma câmera montada na cabeça em camundongos em movimento livre.
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Disclosures
Os autores declaram não haver interesses concorrentes.
Acknowledgments
Somos gratos a Yingtian He por compartilhar dados de ajuste de direção. Este trabalho foi apoiado por subsídios da Fundação Canadense de Inovação e Fundo de Pesquisa de Ontário (CFI/ORF projeto no. 37597), NSERC (RGPIN-2019-06479), CIHR (Project Grant 437007) e Connaught New Researcher Awards.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2D translational stage | Thorlabs | XYT1 | |
| Acrylic resin | Lang Dental | B1356 | For fixing headplate on skull and protecting skull |
| Bupivacaine | STERIMAX | ST-BX223 | Bupivacaine Injection BP 0.5%. Local anesthesia |
| Carprofen | RIMADYL | 8507-14-1 | Analgesia |
| Compressed air | Dust-Off | ||
| Eye ointment | Alcon | Systane | For maintaining moisture of eyes |
| Graphic card | NVIDIA | Geforce GTX 1650 or Quadro P620. | For generating single screen among three monitors |
| Heating pad | Kent Scientific | HTP-1500 | For maintaining body temperature |
| High-speed infrared (IR) camera | Teledyne Dalsa | G3-GM12-M0640 | For recording eye rotation |
| IR LED | Digikey | PDI-E803-ND | For CR reference and the illumination of the eye |
| IR mirror | Edmund optics | 64-471 | For reflecting image of eye |
| Isoflurane | FRESENIUS KABI | CP0406V2 | |
| Labview | National instruments | version 2014 | eye tracking |
| Lactated ringer | BAXTER | JB2324 | Water and energy supply |
| Lidocaine and epinephrine mix | Dentsply Sirona | 82215-1 | XYLOCAINE. Local anesthesia |
| Luminance Meter | Konica Minolta | LS-150 | for calibration of monitors |
| Matlab | MathWorks | version xxx | analysis of eye movements |
| Meyhoefer Curette | World Precision Instruments | 501773 | For scraping skull and removing fascia |
| Microscope calibration slide | Amscope | MR095 | to measure the magnification of video-oculography |
| Monitors | Acer | B247W | Visual stimulation |
| Neutral density filter | Lee filters | 299 | to generate scotopic visual stimulation |
| Nigh vision goggle | Alpha optics | AO-3277 | for scotopic OKR |
| Photodiode | Digikey | TSL254-R-LF-ND | to synchronize visual stimulation and video-oculography |
| Pilocarpine hydrochloride | Sigma-Aldrich | P6503 | |
| Post | Thorlabs | TR1.5 | |
| Post holder | Thorlabs | PH1 | |
| PsychoPy | open source software | version xxx | visual stimulation toolkit |
| Scissor | RWD | S12003-09 | For skin removal |
| Superglue | Krazy Glue | Type: All purpose. For adhering headplate on the skull |
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