Summary
Här beskriver vi ett standardprotokoll för att kvantifiera den optokinetiska reflexen. Den kombinerar virtuell trumstimulering och videookukulografi och möjliggör därmed en exakt utvärdering av beteendets funktionsselektivitet och dess adaptiva plasticitet.
Abstract
Den optokinetiska reflexen (OKR) är en essentiell medfödd ögonrörelse som utlöses av den visuella miljöns globala rörelse och tjänar till att stabilisera näthinnebilder. På grund av dess betydelse och robusthet har OKR använts för att studera visuell-motorisk inlärning och för att utvärdera de visuella funktionerna hos möss med olika genetisk bakgrund, ålder och läkemedelsbehandling. Här introducerar vi en procedur för att utvärdera OKR-svar från huvudfixerade möss med hög noggrannhet. Huvudfixering kan utesluta bidraget av vestibulär stimulering på ögonrörelser, vilket gör det möjligt att mäta ögonrörelser som endast utlöses av visuell rörelse. OKR framkallas av ett virtuellt trumsystem, där ett vertikalt gitter som presenteras på tre datorskärmar driver horisontellt på ett oscillerande sätt eller enkelriktat med en konstant hastighet. Med detta virtual reality-system kan vi systematiskt ändra visuella parametrar som rumslig frekvens, tids-/svängningsfrekvens, kontrast, luminans och gitterriktning, och kvantifiera inställningskurvor för visuell funktionsselektivitet. Höghastighets infraröd videookuskopografi säkerställer noggrann mätning av ögonrörelsernas bana. Ögonen på enskilda möss kalibreras för att ge möjlighet att jämföra OKR mellan djur i olika åldrar, kön och genetisk bakgrund. Den kvantitativa kraften i denna teknik gör det möjligt att upptäcka förändringar i OKR när detta beteende anpassas plastiskt på grund av åldrande, sensorisk upplevelse eller motorisk inlärning; Således gör det denna teknik till ett värdefullt tillskott till repertoaren av verktyg som används för att undersöka plasticiteten hos okulära beteenden.
Introduction
Som svar på visuella stimuli i omgivningen rör sig våra ögon för att flytta blicken, stabilisera näthinnebilder, spåra rörliga mål eller rikta in foveae på två ögon med mål som ligger på olika avstånd från observatören, vilket är avgörande för korrekt syn 1,2. Okulomotoriska beteenden har använts i stor utsträckning som attraktiva modeller för sensomotorisk integration för att förstå de neurala kretsarna i hälsa och sjukdom, åtminstone delvis på grund av enkelheten i det okulomotoriska systemet3. Ögat styrs av tre par extraokulära muskler och roterar i ögonhålan huvudsakligen runt tre motsvarande axlar: höjd och nedsänkning längs den tvärgående axeln, adduktion och abduktion längs den vertikala axeln samt intorsion och utpressning längs den anteroposteriora axeln 1,2. Ett sådant enkelt system gör det möjligt för forskare att utvärdera mössens okulomotoriska beteenden enkelt och exakt i en labbmiljö.
Ett primärt okulomotoriskt beteende är den optokinetiska reflexen (OKR). Denna ofrivilliga ögonrörelse utlöses av långsamma glidningar eller glidningar av bilder på näthinnan och tjänar till att stabilisera näthinnebilder när ett djurs huvud eller dess omgivning rör sig 2,4. OKR, som beteendeparadigm, är intressant för forskare av flera skäl. För det första kan den stimuleras på ett tillförlitligt sätt och kvantifieras exakt 5,6. För det andra är procedurerna för att kvantifiera detta beteende relativt enkla och standardiserade och kan tillämpas för att utvärdera de visuella funktionerna hos en stor kohort av djur7. För det tredje är detta medfödda beteende mycket plastiskt 5,8,9. Dess amplitud kan förstärkas när repetitiva näthinneglidningar förekommer under lång tid 5,8,9, eller när dess arbetspartner vestibulära okulära reflex (VOR), en annan mekanism för att stabilisera näthinnebilder som utlöses av vestibulär ingång2, är nedsatt5. Dessa experimentella paradigm för OKR-potentiering gör det möjligt för forskare att avslöja kretsbasen bakom okulomotorisk inlärning.
Två icke-invasiva metoder har främst använts för att utvärdera OKR i tidigare studier: (1) video-okugrafi kombinerat med en fysisk trumma 7,10,11,12,13 eller (2) godtycklig bestämning av huvudvridningar i kombination med en virtuell trumma6,14,15,16. Även om deras tillämpningar har gjort fruktbara upptäckter för att förstå de molekylära och kretsmekanismerna för okulomotorisk plasticitet, har dessa två metoder var och en vissa nackdelar som begränsar deras förmåga att kvantitativt undersöka OKR:s egenskaper. För det första tillåter fysiska trummor, med tryckta mönster av svarta och vita ränder eller prickar, inte enkla och snabba ändringar av visuella mönster, vilket till stor del begränsar mätningen av OKR:s beroende av vissa visuella egenskaper, såsom rumslig frekvens, riktning och kontrast för rörliga galler 8,17. Istället kan tester av OKR:s selektivitet till dessa visuella egenskaper dra nytta av datoriserad visuell stimulering, där visuella egenskaper bekvämt kan modifieras från försök till försök. På så sätt kan forskare systematiskt undersöka OKR-beteendet i det flerdimensionella visuella parameterrummet. Dessutom rapporterar den andra metoden för OKR-analysen endast tröskelvärdena för visuella parametrar som utlöser urskiljbara OKR, men inte amplituderna för ögon- eller huvudrörelser 6,14,15,16. Bristen på kvantitativ kraft förhindrar således att man analyserar formen på inställningskurvor och de föredragna visuella egenskaperna, eller upptäcker subtila skillnader mellan enskilda möss under normala och patologiska förhållanden. För att övervinna ovanstående begränsningar hade videookugrafi och datoriserad virtuell visuell stimulering kombinerats för att analysera OKR-beteendet i nyligen genomförda studier 5,17,18,19,20. Dessa tidigare publicerade studier gav dock inte tillräckligt med tekniska detaljer eller steg-för-steg-instruktioner, och följaktligen är det fortfarande utmanande för forskare att etablera ett sådant OKR-test för sin egen forskning.
Här presenterar vi ett protokoll för att exakt kvantifiera den visuella egenskapsselektiviteten hos OKR-beteende under fotopiska eller skotopiska förhållanden med kombinationen av video-okugrafi och datoriserad virtuell visuell stimulering. Möss är huvudfixerade för att undvika ögonrörelser som framkallas av vestibulär stimulering. En höghastighetskamera används för att spela in ögonrörelserna från möss som tittar på rörliga galler med förändrade visuella parametrar. Den fysiska storleken på ögongloberna hos enskilda möss kalibreras för att säkerställa noggrannheten i härledningen av ögonrörelsernas vinkel21. Denna kvantitativa metod gör det möjligt att jämföra OKR-beteende mellan djur i olika åldrar eller genetisk bakgrund, eller övervaka dess förändring orsakad av farmakologiska behandlingar eller visuell-motorisk inlärning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experimentella procedurer som utfördes i denna studie godkändes av Biological Sciences Local Animal Care Committee, i enlighet med riktlinjer som fastställts av University of Toronto Animal Care Committee och Canadian Council on Animal Care.
1. Implantation av en huvudstång ovanpå skallen
OBS: För att undvika att VOR-beteendet bidrar till ögonrörelserna immobiliseras mushuvudet under OKR-testet. Därför implanteras en huvudstång kirurgiskt ovanpå skallen.
- Bedöva en mus (2-5 månader gammal hona och hane C57BL/6) med en blandning av 4% isofluran (v/v) ochO2 i en gaskammare. Överför musen till en anpassad operationsplattform och minska koncentrationen av isofluran till 1,5%-2%. Övervaka anestesidjupet genom att kontrollera tåklämningsresponsen och andningsfrekvensen under hela operationen.
- Placera en värmedyna under djurets kropp för att bibehålla kroppstemperaturen. Applicera ett lager glidande ögonsalva på båda ögonen för att skydda dem från att torka ut. Täck ögonen med aluminiumfolie för att skydda dem från ljusbelysning.
- Subkutant injicera karprofen i en dos på 20 mg/kg för att minska smärtan. Efter att ha blött pälsen med klorhexidinglukonat hudrengöringsmedel, raka pälsen ovanpå skallen. Desinficera den exponerade hårbotten med 70 % isopropylalkohol och klorhexidinalkohol två gånger.
- Injicera bupivakain (8 mg/kg) subkutant på snittstället och ta sedan bort hårbotten (~1 cm2) med en sax för att exponera skallens dorsala yta, inklusive det bakre pannbenet, parietalbenet och interparietalbenet.
- Applicera flera droppar av 1 % lidokain och 1:100 000 adrenalin på den exponerade skallen för att minska lokal smärta och blödning. Skrapa skallen med en Meyhoefer-kyrett för att ta bort fascian och rengör den med fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS).
OBS: Temporalismuskeln är separerad från skallen för att öka ytan för en huvudstång att fästa. - Torka skallen genom att försiktigt blåsa tryckluft mot skallens yta tills fukten är borta och benet blir vitaktigt. Applicera ett tunt lager superlim på den exponerade ytan av skallen, inklusive kanten på den skurna hårbotten, följt av ett lager akrylharts.
OBS: Skallens yta måste vara fri från blod eller vatten innan superlim appliceras. - Placera en huvudstång i rostfritt stål (se figur 1A) längs mittlinjen ovanpå skallen. Applicera mer akrylharts, med början från kanten av huvudstången tills basen av huvudstången är helt inbäddad i akrylhartset. Applicera akrylharts två eller tre gånger för att bygga upp tjockleken.
- Vänta i ca 15 minuter tills akrylhartset härdar. Injicera subkutant 1 ml lakterad ringerlösning. Sätt sedan tillbaka musen i en bur placerad på en värmedyna tills djuret är helt rörligt.
- Låt musen återhämta sig i hemburen i minst 5 dagar efter operationen. När djuret är i god form, fixera huvudet med huvudstången i OKR-inställningen i 15-30 minuter för att bekanta det med huvudfixeringen och experimentmiljön. Upprepa förtrogenheten en gång om dagen i minst 3 dagar.
2. Inställning av den virtuella trumman och videookugrafin
- Montera tre bildskärmar ortogonalt mot varandra för att bilda ett kvadratiskt hölje som täcker ~270° av azimuten och 63° av höjden i det visuella utrymmet (figur 1B till vänster).
- Med ett diskret grafikkort kan du slå samman de tre bildskärmarna till en enkel skärm för att säkerställa synkronisering över alla bildskärmar.
- Kalibrera bildskärmarnas luminans enligt beskrivningen nedan.
- Slå på datorn som bildskärmarna är anslutna till och vänta i 15 minuter. Uppvärmningen är viktig för att få stabil luminans.
- Ändra systematiskt inställningen för ljusstyrka på monitorn från 0 till 100 i steg om 25.
- För varje ljusstyrka mäter du bildskärmarnas luminans under olika pixelvärden (0-255, steg om 15) med en luminansmätare.
- Anpassa förhållandet mellan luminans och ljusstyrka för pixelvärde 255 med linjär regression och uppskatta ljusstyrkan som ger upphov till 160 cd/m2.
- För varje pixelvärde som används i luminansmätningen (steg 2.3.3) beräknas luminansen för ljusstyrkan som härleddes i steg 2.3.4 baserat på linjär regression. Använd effektfunktionen lum = A * pixel γ för att anpassa förhållandet mellan den nya uppsättningen luminansvärden (under det ljusstyrkevärde som härletts i punkt 2.3.4) och deras motsvarande pixelvärden för att härleda gammafaktorn γoch koefficienten A. Dessa kommer att användas för att generera sinusformade gitter med önskade luminansvärden.
- Ställ in ljusstyrkan för alla tre bildskärmarna på de värden som härleddes i steg 2.3.4 för att säkerställa att deras luminansvärden är desamma för samma pixelvärde.
- Generera en virtuell trumma, som används för att stimulera OKR-beteende, med den visuella stimuleringsverktygslådan, enligt beskrivningen nedan.
- Presentera ett vertikalt sinusformat gitter på monitorerna och justera perioden (avståndet mellan ränderna) längs azimuten för att säkerställa att projektionen av gittret på ögat har konstant rumslig frekvens (trumgitter; Figur 1B i mitten och höger).
- Se till att djuret är fixerat i mitten av inhägnaden så att det ser att gallret har en konstant rumslig frekvens över ytan på den virtuella trumman.
- Ändra parametrarna för rörligt gitter, såsom oscillerande amplitud, rumslig frekvens, tids-/svängningsfrekvens, riktning, kontrast, etc., i de visuella stimuleringskoderna. Använd två typer av visuell rörelse: (1) gallret driver medurs eller moturs på ett oscillerande sätt efter en sinusformad funktion:
Här är Amp amplituden för trumbanan, f är svängningsfrekvensen och t är tiden (svängningsamplitud: 5°; gitterrumslig frekvens: 0,04-0,45 cpd; svängningsfrekvens: 0,1-0,8 Hz, motsvarande en topphastighet för stimulus på 3,14-25,12 °/s [trumhastighet = Amp x 2π x f x cos (2π x f x t); kontrast: 80%-100%; Genomsnittlig luminans: 35–45 cd/m2. (2) Gallret driver i en riktning med konstant hastighet:
(Rumslig frekvens: 0,04-0,64 cpd; tidsfrekvens: 0,25-1 Hz; trumhastighet = tidsfrekvens/rumsfrekvens.)
- Ställ in videookuliografin enligt beskrivningen nedan.
- För att undvika blockering av djurets synfält, placera en infraröd (IR) spegel 60° från mittlinjen för att bilda en bild av höger öga.
- Placera en IR-kamera på höger sida bakom musen (Figur 1C till vänster) för att ta en bild av höger öga.
- Montera höghastighets-IR-kameran på en kameraarm som gör att kameran kan rotera ± 10° runt bilden av höger öga (Figur 1C höger).
- Använd en fotodiod som är ansluten till en av monitorerna för att ge en elektrisk signal för att synkronisera tidpunkten för videookugrafi och visuell stimulering.
- Placera fyra IR-lysdioder (LED) som stöds av svanhalsarmar runt det högra ögat för att ge IR-belysning av ögat.
- Placera två IR-lysdioder på kameran för att ge referenser till hornhinnereflektion (CR): den ena är fixerad ovanför kameran (X-CR), medan den andra är på vänster sida av kameran (Y-CR; Figur 1D).
- Mät den optiska förstoringen av videookulografisystemet med en kalibreringsglas.
OBS: Referens-CR används för att ta bort de translationella ögonrörelserna när ögonvinkeln beräknas baserat på de roterande ögonrörelserna.
- Fäst djurets huvud i mitten av det hölje som bildas av monitorerna, enligt beskrivningen nedan.
- Fäst djurets huvud med huvudplattan i mitten av riggen och gör det vänt framåt. Justera huvudets lutning så att vänster och höger öga är i nivå och ögonens näs- och tinninghörn är inriktade horisontellt (Figur 1E).
- Flytta djurets huvud horisontellt genom grovjustering som tillhandahålls av huvudfixeringsapparaten och finjustering som tillhandahålls av ett 2D-translationssteg, och vertikalt genom huvudfixeringsapparaten och ett par stolpar/stolphållare, tills djurets högra öga syns i kamerans livevideo. Innan kalibrering och mätning av ögonrörelser, överlägg bilden av djurets högra öga som reflekteras av den heta spegeln med kameraarmens vridpunkt (se detaljer i steg 3.4 nedan).
- Bygg en anpassad kapsling runt OKR-riggen för att blockera rumsbelysning (Figur 1F).
3. Kalibrering av ögonrörelser
OBS: Roterande ögonrörelser beräknas baserat på pupillens rörelser och radien för pupillrörelsernas omloppsbana (Rp, avståndet från pupillens centrum till ögonglobens centrum). För varje enskild mus mäts denna radie experimentellt21.
- Fäst djurets huvud i mitten av det utrymme som bildas av de tre monitorerna, enligt beskrivningen i steg 2.6.1.
- Slå på kameran och justera de fyra lysdioderna som omger det högra ögat för att uppnå enhetlig IR-belysning.
- Under visuell vägledning justerar du positionen för det högra ögat tills det visas i mitten av videon, enligt beskrivningen i steg 2.6.2.
- Rikta in den virtuella bilden av det högra ögat med vridpunkten på kameraarmen, enligt beskrivningen nedan.
- Vrid kameraarmen manuellt till den vänstra yttersta änden (-10°). Flytta djurets högra ögonposition manuellt på horisontalplanet vinkelrätt mot den optiska axeln med finjustering av 2D-translationssteget (Figur 1C, grön pil), tills X-CR är i bildens horisontella mitt.
- Vrid kameraarmen manuellt till den andra änden (+10°). Om X-CR försvinner från mitten av bilden, flytta höger öga längs den optiska axeln med finjustering tills X-CR kommer till mitten (Bild 1C, blå pil).
- Upprepa steg 3.4.1-3.4.2 några gånger tills X-CR stannar i mitten när kameraarmen svänger åt vänster och höger. Om det högra ögat rör sig mitt i en repetition, starta om justeringsprocessen.
- Mät det vertikala avståndet mellan Y-CR och X-CR efter att ha låst kameraarmen i mittläget. Slå på Y-CR-LAMPAN och spela in dess position på videon och växla sedan till X-CR-LAMPAN och spela in dess position.
OBS: Det vertikala avståndet mellan Y-CR och X-CR kommer att användas för att härleda Y-CR:s position under mätning av ögonrörelser där endast X-CR LED är påslagen. - Mät pupillrotationsradien Rp, enligt beskrivningen nedan.
- Vrid kameraarmen till vänster ände (-10°) och spela in positionerna för pupillen (Pp1) och X-CR (PCR1) på videon.
- Vrid sedan kameraarmen till höger ände (+10°) och spela in positionerna för pupillen (Pp2) och X-CR (PCR2) på videon. Upprepa detta steg flera gånger.
OBS: Djurets högra öga måste förbli stillastående under varje repetition så att mängden pupillrörelser i filmen exakt återspeglar graden av svängning av kameraarmen. - Beräkna pupillrotationsradien Rp (figur 2A) med hjälp av de värden som registrerats ovan med följande formel:
OBS: Avståndet mellan hornhinnans reflektion och pupillens centrum i det fysiska rummet beräknas baserat på deras avstånd i filmen:
PCR - Pp = antal pixlar i filmen x pixelstorlek på kamerachip x förstoring
- Utveckla sambandetmellan Rp och pupilldiameter, enligt beskrivningen nedan. Rp förändras när pupillen vidgas eller drar ihop sig; Värdet är omvänt proportionellt mot pupillstorleken (figur 2B överst).
- Ändra bildskärmarnas luminans systematiskt från 0 till 160 cd/m2 för att reglera pupillstorleken.
- För varje luminansvärde, upprepa steg 3.6 8-10 gånger och registrera pupillens diameter.
- Tillämpa linjär regression på förhållandet mellan Rp och pupilldiameter baserat på de värden som uppmätts ovan för att härleda lutningen och skärningspunkten (figur 2B nederst).
OBS: Extremvärdena som orsakas av tillfälliga ögonrörelser tas bort före den linjära anpassningen. För upprepade mätningar i flera sessioner behöver kalibreringen bara göras en gång för ett djur, såvida inte ögat blir större under försöket.
4. Spela in ögonrörelser för OKR
- Head-fixa en mus i riggen genom att följa steg 3.1-3.4. Hoppa över det här steget om inspelningen sker direkt efter att kalibreringen är klar. Lås kameraarmen i mittläget.
- Ställ in monitorerna och djuret för skotopisk OKR enligt beskrivningen nedan. Hoppa över det här steget för fotopisk OKR.
- Täck skärmen på varje bildskärm med ett anpassat filter, som är tillverkat av fem lager av 1,2 film med neutral densitet (ND). Se till att inget ljus läcker ut genom springan mellan filtret och monitorn.
- Stäng av rumslampan. Följande steg görs med hjälp av en IR-glasögon.
- Applicera en droppe pilokarpinlösning (2 % koksaltlösning) på höger öga och vänta 15 minuter. Se till att droppen stannar på ögat och inte torkas bort av musen. Om lösningen torkas bort av djuret, applicera ytterligare en droppe pilokarpinlösning. Detta krymper pupillen till en lämplig storlek för ögonspårning under det skotopiska tillståndet.
OBS: Under det skotopiska tillståndet vidgas pupillen avsevärt så att dess kant delvis döljs bakom ögonlocket. Detta påverkar precisionen i uppskattningen av pupillcentrum med hjälp av videookukulografi. Farmakologiskt krympande pupill på höger öga minskar dess synintryck, och därmed presenteras de visuella stimuli för vänster öga. - Skölj höger öga med koksaltlösning för att skölja bort pilokarpinlösningen noggrant. Dra ner gardinen för att helt täta höljet, vilket förhindrar ströljus från att störa den skotopiska synen.
- Ge djuret 5 minuter för att helt anpassa sig till den skotopiska miljön innan OKR-testet påbörjas.
- Kör programvaran för visuell stimulering och programvaran för ögonspårning. För fotopisk OKR-mätning, se till att trumgittret svänger horisontellt med en sinusformad bana; för skotopisk OKR-mätning, se till att trumgittret driver med en konstant hastighet från vänster till höger, vilket är den temporo-nasala riktningen i förhållande till vänster öga.
OBS: När pupillen på höger öga, men inte på vänster öga, krymps av pilokarpin under det skotopiska tillståndet, är OKR som framkallas av oscillerande trumstimulering mycket asymmetrisk. Således, för skotopisk OKR-mätning, stimuleras vänster öga medan rörelsen av höger öga övervakas. - Eyetracking-programmet mäter automatiskt pupillstorleken, CR-positionen och pupillpositionen för varje bildruta och beräknar ögonvinkeln baserat på följande formel (Figur 2C):
Här är PCR CR-positionen, P p är pupillpositionen och Rp är pupillrotationsradien. Avståndet mellan hornhinnans reflektion och pupillens centrum i det fysiska rummet beräknas utifrån deras avstånd i filmen:
PCR - Pp = antal pixlar i filmen x pixelstorlek på kamerachip x förstoring
Rp för motsvarande pupillstorlek härleds baserat på den linjära regressionsmodellen i steg 3.7.3 (figur 2B nederst).
5. Analys av ögonrörelser i OKR med programvaran för ögonanalys
- Bearbeta ögonspåren med hjälp av ett medianfilter (filterfönster = 0.05 s) för att ta bort högfrekvent brus (Figur 3A mitten).
- Ta bort sackaderna eller nystagmus enligt beskrivningen nedan.
- Uppskatta ögonhastigheten genom att beräkna första ordningens derivata av ögonrörelser (figur 3A nederst). Identifiera sackaderna eller nystagmusen genom att tillämpa en hastighetströskel på 50 °/s (figur 3A nederst).
- Ersätt sackaderna eller nystagmusen genom att extrapolera ögonpositionerna under dessa snabba ögonrörelser från segmentet före sackaderna eller nystagmus baserat på linjär regression (figur 3B).
- Beräkna amplituden för OKR-ögonrörelser med snabb Fouriertransform (Goertzel-algoritmen) om trumgittret oscillerar (figur 3C), eller beräkna medelhastigheten för ögonrörelser under den visuella stimuleringen om trumgittret rör sig med konstant hastighet i en riktning (figur 3B nederst).
OBS: Amplituden för oscillerande ögonrörelser härledda från Fouriertransformen liknar amplituden som härleds från anpassningen av ögonbanan med en sinusformad funktion (Figur 3D). - Beräkna OKR-förstärkningen. För oscillerande trumrörelse definieras OKR-förstärkning som förhållandet mellan amplituden för ögonrörelser och amplituden för trumrörelser (figur 3C till höger). För enkelriktad trumrörelse definieras OKR-förstärkningen som förhållandet mellan ögats hastighet och trumgittens hastighet (figur 3B nederst).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med den procedur som beskrivs ovan utvärderade vi OKR:s beroende av flera visuella funktioner. Exempelspåren som visas här härleddes med hjälp av analyskoderna i Kompletterande kodningsfil 1, och exempelspårfilen finns i Kompletterande kodningsfil 2. När trumgittret drev i en sinusformad bana (0,4 Hz) följde djurets öga automatiskt gitterets rörelse på ett liknande oscillerande sätt (figur 3B topppanel), vilket är karakteristiskt för OKR-beteendet 2,5,8. Amplituden för OKR-ögonrörelser i den horisontella axeln härleddes med snabb Fouriertransform (figur 3C&D), och OKR-förstärkningen beräknades som förhållandet mellan amplituden för ögonrörelser och amplituden för gitterrörelse (figur 3C). OKR-förstärkningen varierade med värdena för rumslig frekvens, svängningsfrekvens och rörelseriktningsgitter (figur 4A). För det första hade den rumsliga frekvensjusteringskurvan för OKR-beteendet en inverterad V-form och nådde en topp vid en mellanliggande rumslig frekvens på 0,16 cpd (figur 4A till vänster). För det andra minskade svängningsfrekvensens avstämningskurva monotont när svängningsfrekvensen för trumgittret ökade (figur 4A i mitten), vilket indikerar att OKR-beteendet fungerar bäst som svar på den visuella rörelsen4 med låg hastighet. Både amplituden och formen på svängningsfrekvensjusteringskurvan varierade vid presentation av gitter med olika rumsfrekvenser17. För det tredje kan den horisontella OKR också induceras av gallerdurk som rör sig i olika riktningar (figur 4A till höger). Det starkaste horisontella OKR-beteendet framkallades av den temporo-nasala rörelsen (0°). OKR-förstärkningen sjönk till ~80 %, eller ~30 % av maximum, när gittret rörde sig i sneda vinklar 30° eller 60° avvek från den temporo-nasala riktningen (både uppåt respektive nedåt), och den horisontella OKR försvann när gittret rörde sig vertikalt uppåt eller nedåt (90° och 270°). Dessutom påverkades formen på inställningskurvorna av luminansnivån. Till exempel utförde djuren OKR-beteendet väl som svar på rumsfrekvenser på 0,16 och 0,32 cpd under det fotopiska tillståndet, men den rumsliga frekvensjusteringskurvan försköts åt vänster under det skotopiska tillståndet (Figur 4B). För att analysera formen på avstämningskurvor utrustar vi dem med lämpliga matematiska funktioner. Till exempel användes den gaussiska funktionen för att uppskatta toppen och bandbredden för rumslig frekvensjustering (figur 4C). Med denna analys fann vi att avstämningskurvan under det skotopiska tillståndet hade ett lägre värde i den föredragna rumsfrekvensen jämfört med det fotopiska tillståndet. Proceduren som beskrivs ovan kan också användas för att kvantifiera plasticiteten i OKR-beteendet. Efter 45 minuters kontinuerlig OKR-stimulering var amplituden för OKR-beteendet signifikant potentierad (Figur 4D), i linje med tidigare rapporter. Dessa resultat visar tillämpningarna av detta protokoll för att undersöka de okulomotoriska beteendena och potentialerna för att förstå de hjärnkretsar som är involverade i dessa beteenden.
Figur 1: Inställning av OKR-riggen . (A) Mått på huvudstången. (B) Baksida view (vänster) och toppen view (mitten) av det virtuella trumsystemet. Tre bildskärmar är monterade ortogonalt mot varandra. Mushuvudet placeras i mitten av det fyrkantiga höljet och är vänt framåt. Perioden för visuell stimulering (avstånd mellan ränderna) varieras baserat på azimut till djurets öga för att säkerställa att projektionen av gittret på ögat har en konstant rumslig frekvens. Med andra ord uppfattas gitterdurkens rumsliga frekvens som konstant i hela synfältet, som om gittret driver längs ytan på en virtuell trumma (höger). (C) Inställning av IR-videookugrafi. Vänster: kamerans position när den är fixerad i mitten under OKR-inspelning. Blå pil: längs den optiska axeln. Grön pil: vinkelrät mot den optiska axeln. Höger: kamerans rotation under ögonkalibrering. (D) Placering av X-CR- och Y-CR-lysdioderna fixerade på kameran. (E) Nivåerna i vänster och höger öga (vänster) och ögonvrån i näsan och tinninghörnen är inriktade horisontellt (höger) genom att vrida den horisontella stången respektive huvudplattans adapter (röda pilar). (F) Foto av OKR-stationen. Observera att OKR-riggen är placerad i en anpassad kapsling med ett svart draperi. Förkortningar: IR = infraröd; CR = reflektion av hornhinnan. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Kalibrering och mätning av ögonpositioner i videookukulografi . A) Schematisk bild av kalibreringen. Pupillrotationsradien (Rp) beräknas genom att vrida kameran till läget längst till vänster (-10°, vänster panel) och till läget längst till höger (10°, höger panel). Röda prickar indikerar positionerna för hornhinnans reflektion X-CR när kameran placeras längst till vänster och längst till höger. Blå prickar anger pupillernas centrum. Gröna staplar anger avstånden mellan hornhinnans reflektion och pupillens centrum som visas i kameravideon (PCR - PP). (B) Rp :s beroende av pupillstorlek. Överst: scheman av ögonglober med en liten eller stor pupill. Nederst: förhållandet mellan Rp och pupilldiametern på en exempelmus. Pupillstorleken ändras genom att luminansen (10 värden i intervallet 0-160 cd/m2) ändras till musen. Svarta prickar: de data som används för linjär montering. Blå prickar: extremvärden som är undantagna från linjär anpassning. Röd kurva: den linje som passar bäst i linjär regression. Observeraatt Rp är omvänt proportionellt mot pupilldiametern. C) Beräkning av ögonvinkelns position när ögat har rört sig till höger eller vänster sida av den optiska axeln. Röda prickar, blå prickar och gröna staplar har samma betydelser som i A. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Beräkning av OKR-vinst. (A) Överst: ögonblicksbilder av nasala (N; vänster) och temporala (T; höger) ögonpositioner tagna under OKR-stimulering. Röda ellipser: passar till pupillprofilen. Röda kors: elevcentra. Vita pilar: hornhinnereflektion av en referenslysdiod. Mitten: banorna för ögonrörelser med (svart) eller utan (rött) medianfilter (filterfönster = 0,05 s) för att ta bort högfrekvent brus. Nederst: uppskattning av ögats hastighet genom att beräkna första ordningens derivata av ögonrörelser. Sackader (röda pilar) detekteras med en hastighetströskel på 50 °/s. (B) Banan för OKR:s långsamma ögonrörelser efter avlägsnande av sackaderna/nystagmusen (svart) överlagrad med trumbana22. Överst: oscillerande trumrörelse med en amplitud på 5° och en svängningsfrekvens på 0,4 Hz. Nederst: enkelriktad (temporo-nasal) trumrörelse med en konstant hastighet på 6,25 °/s. (C) Vänster: cykelmedelvärdet för ögonbanan i B-toppen. Höger: frekvensanalys av ögats eller trumgittens rörelser med snabb Fouriertransform. Det bör noteras att trumgittret oscillerar vid 0,4 Hz, och därmed toppas amplituderna för ögats och trumgittens rörelse vid 0,4 Hz (stjärnmärken). OKR-förstärkning är förhållandet mellan amplituderna för ögats och trumgitterets rörelse vid 0,4 Hz. (D) Topp: kurvanpassning av ögonbanan i B-toppen med sinusformad funktion. Nederst: förhållandet mellan amplituden av ögonrörelser härledd med den snabba Fouriertransformmetoden och härledd från sinusformad kurvanpassning. Gul prick: exempel högst upp. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Den visuella egenskapsselektiviteten och plasticiteten hos OKR-beteenden. (A) Den visuella egenskapsselektiviteten för OKR-förstärkning under det fotopiska tillståndet. Vänster: kurva för rumslig frekvensavstämning från ett djur (svängningsfrekvens: 0,4 Hz; förlopp: oscillerande horisontellt; medelluminans: 40 cd/m2; n = 15). Mitten: svängningsfrekvenskurva från ett djur (rumslig frekvens: 0,08 eller 0,16 cpd; trajektory: oscillerande horisontellt; genomsnittlig luminans: 40 cd/m2; n = 15). Höger: riktningskurva från ett djur (rumslig frekvens: 0,16 cpd; tidsfrekvens: 1 Hz; medelluminans: 45 cd/m2; n = 24). Den röda pilen och stapeln anger den temporo-nasala riktningen. För rumslig och tidsmässig/oscillerande frekvensinställning rör sig ett vertikalt trumgaller som presenteras på tre monitorer horisontellt med konstant hastighet eller på ett oscillerande sätt. För riktningsinställning rör sig ett gitter som endast visas på den högra bildskärmen i en av 12 riktningar med konstant hastighet. Tjocklek: medelvärdets standardfel (SEM). (B) Rumslig frekvensavstämningskurva för OKR-förstärkning från ett djur under skotopiskt eller fotopiskt tillstånd. Fotopic: oscillerande rörelse; svängningsfrekvens: 0,2 Hz; Genomsnittlig luminans: 40 cd/m2. n = 15. Skotopisk: linjär rörelse med konstant hastighet; tidsfrekvens: 0,25 Hz; Genomsnittlig luminans: 8 x 10–5 cd/m2. n = 16. Det skotopiska tillståndet uppnås genom att täcka monitorerna med fem lager Lee-filter (299 1.2 ND). Tjocklek: SEM. (C) Gaussisk anpassning av rumslig frekvensinställning av OKR-förstärkning under fotopiska och skotopiska förhållanden. Fotopic: oscillerande rörelse; svängningsfrekvens: 0,2 Hz; Genomsnittlig luminans: 40 cd/m2. n = 15. Skotopisk: linjär rörelse med konstant hastighet; tidsfrekvens: 0,25 Hz; Genomsnittlig luminans: 8 x 10–5 cd/m2. n = 16. (D) OKR-potentiering av en mus inducerad av 45 minuters kontinuerlig OKR-stimulering. Rumslig frekvens: 0,1 cpd; svängningsfrekvens: 0,4 Hz; Genomsnittlig luminans: 35 cd/m2. n = 40. Överst: cykelns genomsnittliga OKR-banor före och efter OKR-potentiering. Tjocklek: SEM. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Kompletterande kodningsfil 1: Analyskod som används för att generera exempelspårningarna. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande kodningsfil 2: Exempel på spår som genererats med programvaran. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden för OKR-beteendeanalysen som presenteras här ger flera fördelar. För det första löser datorgenererad visuell stimulering de inneboende problemen med fysiska trummor. För att hantera problemet att fysiska trummor inte stöder systematisk undersökning av rumslig frekvens, riktning eller kontrastinställning8, tillåter den virtuella trumman att dessa visuella parametrar ändras på försöksbasis, vilket underlättar en systematisk och kvantitativ analys av egenskapsselektiviteten i OKR-beteendet (figur 4A); Medan fysiska trummor lider av en ojämn belysning av en extern ljuskälla23, kan den virtuella trumman lätt ge homogen luminans över sin yta; Med hjälp av ND-filter och en luminansmätare möjliggör den datorgenererade visuella stimuleringen OKR-mätning vid olika välkontrollerade luminansnivåer från skotopisk till fotopisk (Figur 4B), vilket är svårt att göra med fysiska trummor. Utan begränsningen i accelerationen av fysiska trummor på grund av deras tröghetsmassa kan den virtuella visuella stimuleringen uppnå idealiskt exakta banor, särskilt vid hög acceleration och hög hastighet. Dessutom möjliggör datorgenererad visuell stimulering kreativ design av andra typer av visuell stimulering, såsom koherent rörliga prickar, vilket hjälper till att undersöka mekanismerna för olika okulomotoriska beteenden. För det andra är vår procedur standardiserad och kräver därför minimala ansträngningar för att övervaka framstegen med beteenderegistrering, vilket ger en möjlighet att undersöka flera möss samtidigt. Därför är den lämplig för studier som involverar en stor kohort av djur (tiotals till hundratals djur). För det tredje gör den höga precisionen och den kvantitativa kraften det möjligt att jämföra repetitiva OKR-mätningar av samma möss i longitudinella studier24, under olika farmakologiska behandlingar10 eller under störningar i neurala kretsar5. Slutligen ger den Fouriertransformbaserade analysen i frekvensdomänen 5,7,9 ekvivalenta resultat i amplituden av oscillerande ögonrörelser med den anpassningsbaserade analysen i tidsdomänen 12,25,26 (Figur 3D nederst), vilket visar att analysmetoden som presenteras här är både noggrann och exakt.
Vår metod ger också en möjlighet att studera OKR-plasticitet, ett vilt använt paradigm för att undersöka mekanismerna för okulomotorisk inlärning. Vid kontinuerlig OKR-stimulering till en mus eller kirurgiskt lesionerande av dess vestibulära organ, kan OKR:s amplitud potentieras 8,9. OKR-analysen som presenteras här är tillräckligt känslig för att fånga små förändringar i ögonrörelser som sker vid OKR-potentiering (figur 4D). Den kvantitativa kraften i denna metod gör det möjligt att korrelera beteendeförändringar med neural kretsdynamik, vilket är viktigt för att avslöja mekanismerna bakom okulomotorisk inlärning 5,8,9,13.
För att säkerställa noggrannheten i OKR-mätningen finns det några kritiska steg. För det första, under operationen, krävs extra försiktighet för att undvika att superlim och tandakryl vidrör ögonlocket, vilket kan skada hornhinnan eller delvis täppa till ögonöppningen. För det andra påverkas styrkan hos OKR av beteendetillståndet hos möss27,28. Därför rekommenderas några omgångar av ackommodation för att minimera stressens inverkan på OKR-mätningen; Störningar som orsakas av luktämnen, buller eller ljus bör också förhindras under inspelningen. Slutligen ska mössens huvuden orienteras korrekt så att linjen som förbinder de två ögonvrån är parallell med den horisontella axeln. Detta garanterar att riktningen för den visuella rörelsen är i linje med ögonrörelserna för adduktion och abduktion. För det tredje är den enhetliga belysningen av ögat nyckeln till att generera en skarp bild av pupillen och i sin tur säkerställa högkvalitativ ögonspårning.
Det är värt att notera att det finns några begränsningar för de metoder som presenteras här. För det första, när ett djurs öga blinkar eller ogenomskinlig ögonsekret blockerar pupillen, förlorar videookuliografin ögat tillfälligt eller permanent. På samma sätt kan den inte användas för att övervaka ögonrörelser när ögonlocken är suturerade. För det andra begränsas den tidsmässiga upplösningen för videooculografin av kamerornas bildhastighet till ett intervall på 4-20 ms. Slutligen tillåter inte det huvudfixerade preparatet övervakning av det okulära beteendet hos djur som rör sig fritt.
Video-okuliografin och den virtuella trumman som presenteras här har framgångsrikt tillämpats för att karakterisera den visuella egenskapsselektiviteten och plasticiteten hos OKR-beteendet, och för att förstå de retinala och centrala kretsar som är involverade i att förmedla och adaptivt modulera detta beteende. Dessutom kan de också gynna studier där andra okulära beteenden antingen är ämnena eller till och med förväxlingsfaktorer för de neurala fenomenen. Till exempel kan videookuliografen användas för att övervaka pupillvidgning29 och sackadeliknande ögonrörelser 30,31, vilket tyder på vakenhet och hjärntillstånd32,33,34,35. Dessutom är de kalibrerings- och mätprocedurer som beskrivs här universellt tillämpliga för övervakning av ögonrörelser med en huvudmonterad kamera i fritt rörliga möss.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna redovisar inga motstridiga intressen.
Acknowledgments
Vi är tacksamma mot Yingtian He för att han delar med sig av data om riktningsinställning. Detta arbete stöddes av anslag från Canadian Foundation of Innovation och Ontario Research Fund (CFI/ORF project no. 37597), NSERC (RGPIN-2019-06479), CIHR (Project Grant 437007) och Connaught New Researcher Awards.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2D translational stage | Thorlabs | XYT1 | |
| Acrylic resin | Lang Dental | B1356 | For fixing headplate on skull and protecting skull |
| Bupivacaine | STERIMAX | ST-BX223 | Bupivacaine Injection BP 0.5%. Local anesthesia |
| Carprofen | RIMADYL | 8507-14-1 | Analgesia |
| Compressed air | Dust-Off | ||
| Eye ointment | Alcon | Systane | For maintaining moisture of eyes |
| Graphic card | NVIDIA | Geforce GTX 1650 or Quadro P620. | For generating single screen among three monitors |
| Heating pad | Kent Scientific | HTP-1500 | For maintaining body temperature |
| High-speed infrared (IR) camera | Teledyne Dalsa | G3-GM12-M0640 | For recording eye rotation |
| IR LED | Digikey | PDI-E803-ND | For CR reference and the illumination of the eye |
| IR mirror | Edmund optics | 64-471 | For reflecting image of eye |
| Isoflurane | FRESENIUS KABI | CP0406V2 | |
| Labview | National instruments | version 2014 | eye tracking |
| Lactated ringer | BAXTER | JB2324 | Water and energy supply |
| Lidocaine and epinephrine mix | Dentsply Sirona | 82215-1 | XYLOCAINE. Local anesthesia |
| Luminance Meter | Konica Minolta | LS-150 | for calibration of monitors |
| Matlab | MathWorks | version xxx | analysis of eye movements |
| Meyhoefer Curette | World Precision Instruments | 501773 | For scraping skull and removing fascia |
| Microscope calibration slide | Amscope | MR095 | to measure the magnification of video-oculography |
| Monitors | Acer | B247W | Visual stimulation |
| Neutral density filter | Lee filters | 299 | to generate scotopic visual stimulation |
| Nigh vision goggle | Alpha optics | AO-3277 | for scotopic OKR |
| Photodiode | Digikey | TSL254-R-LF-ND | to synchronize visual stimulation and video-oculography |
| Pilocarpine hydrochloride | Sigma-Aldrich | P6503 | |
| Post | Thorlabs | TR1.5 | |
| Post holder | Thorlabs | PH1 | |
| PsychoPy | open source software | version xxx | visual stimulation toolkit |
| Scissor | RWD | S12003-09 | For skin removal |
| Superglue | Krazy Glue | Type: All purpose. For adhering headplate on the skull |
References
- Gerhard, D.
- Distler, C., Hoffmann, K. P. The Oxford Handbook of Eye Movement. , Oxford University Press. 65-83 (2011).
- Sereno, A. B., Bolding, M. S. Executive Functions: Eye Movements and Human Neurological Disorders. , Elsevier. (2017).
- Giolli, R. A., Blanks, R. H. I., Lui, F. The accessory optic system: basic organization with an update on connectivity, neurochemistry, and function. Progress in Brain Research. 151, 407-440 (2006).
- Liu, B. H., Huberman, A. D., Scanziani, M. Cortico-fugal output from visual cortex promotes plasticity of innate motor behaviour. Nature. 538 (7625), 383-387 (2016).
- Prusky, G. T., Alam, N. M., Beekman, S., Douglas, R. M. Rapid quantification of adult and developing mouse spatial vision using a virtual optomotor system. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (12), 4611-4616 (2004).
- Stahl, J. S., van Alphen, A. M., De Zeeuw, C. I. A comparison of video and magnetic search coil recordings of mouse eye movements. Journal of Neuroscience Methods. 99 (1-2), 101-110 (2000).
- Faulstich, B. M., Onori, K. A., du Lac, S. Comparison of plasticity and development of mouse optokinetic and vestibulo-ocular reflexes suggests differential gain control mechanisms. Vision Research. 44 (28), 3419-3427 (2004).
- Katoh, A., Kitazawa, H., Itohara, S., Nagao, S. Dynamic characteristics and adaptability of mouse vestibulo-ocular and optokinetic response eye movements and the role of the flocculo-olivary system revealed by chemical lesions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (13), 7705-7710 (1998).
- Cahill, H., Nathans, J. The optokinetic reflex as a tool for quantitative analyses of nervous system function in mice: application to genetic and drug-induced variation. PLoS One. 3 (4), 2055 (2008).
- Cameron, D. J., et al. The optokinetic response as a quantitative measure of visual acuity in zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (80), 50832 (2013).
- de Jeu, M., De Zeeuw, C. I.
- Kodama, T., du Lac, S. Adaptive acceleration of visually evoked smooth eye movements in mice. The Journal of Neuroscience. 36 (25), 6836-6849 (2016).
- Doering, C. J., et al. Modified Ca(v)1.4 expression in the Cacna1f(nob2) mouse due to alternative splicing of an ETn inserted in exon 2. PLoS One. 3 (7), e2538 (2008).
- Shi, C., et al. Optimization of optomotor response-based visual function assessment in mice. Scientific Reports. 8 (1), 9708 (2018).
- Waldner, D. M., et al. Transgenic expression of Cacna1f rescues vision and retinal morphology in a mouse model of congenital stationary night blindness 2A (CSNB2A). Translational Vision Science & Technology. 9 (11), 19 (2020).
- Tabata, H., Shimizu, N., Wada, Y., Miura, K., Kawano, K. Initiation of the optokinetic response (OKR) in mice. Journal of Vision. 10 (1), 1-17 (2010).
- Al-Khindi, T., et al. The transcription factor Tbx5 regulates direction-selective retinal ganglion cell development and image stabilization. Current Biology. 32 (19), 4286-4298 (2022).
- Harris, S. C., Dunn, F. A. Asymmetric retinal direction tuning predicts optokinetic eye movements across stimulus conditions. eLife. 12, e81780 (2023).
- van Alphen, B., Winkelman, B. H., Frens, M. A. Three-dimensional optokinetic eye movements in the C57BL/6J mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (1), 623-630 (2010).
- Stahl, J. S. Calcium channelopathy mutants and their role in ocular motor research. Annals of the New York Academy of Sciences. 956, 64-74 (2002).
- Endo, S., et al. Dual involvement of G-substrate in motor learning revealed by gene deletion. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (9), 3525-3530 (2009).
- Thomas, B. B., Seiler, M. J., Sadda, S. R., Coffey, P. J., Aramant, R. B. Optokinetic test to evaluate visual acuity of each eye independently. Journal of Neuroscience Methods. 138 (1-2), 7-13 (2004).
- Burroughs, S. L., Kaja, S., Koulen, P. Quantification of deficits in spatial visual function of mouse models for glaucoma. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (6), 3654-3659 (2011).
- Wakita, R., et al. Differential regulations of vestibulo-ocular reflex and optokinetic response by β- and α2-adrenergic receptors in the cerebellar flocculus. Scientific Reports. 7 (1), 3944 (2017).
- Dehmelt, F. A., et al. Spherical arena reveals optokinetic response tuning to stimulus location, size, and frequency across entire visual field of larval zebrafish. eLife. 10, e63355 (2021).
- Magnusson, M., Pyykko, I., Jantti, V. Effect of alertness and visual attention on optokinetic nystagmus in humans. American Journal of Otolaryngology. 6 (6), 419-425 (1985).
- Collins, W. E., Schroeder, D. J., Elam, G. W. Effects of D-amphetamine and of secobarbital on optokinetic and rotation-induced nystagmus. Aviation, Space, and Environmental Medicine. 46 (4), 357-364 (1975).
- Reimer, J., et al. Pupil fluctuations track fast switching of cortical states during quiet wakefulness. Neuron. 84 (2), 355-362 (2014).
- Sakatani, T., Isa, T. PC-based high-speed video-oculography for measuring rapid eye movements in mice. Neuroscience Research. 49 (1), 123-131 (2004).
- Sakatani, T., Isa, T. Quantitative analysis of spontaneous saccade-like rapid eye movements in C57BL/6 mice. Neuroscience Research. 58 (3), 324-331 (2007).
- Vinck, M., Batista-Brito, R., Knoblich, U., Cardin, J. A. Arousal and locomotion make distinct contributions to cortical activity patterns and visual encoding. Neuron. 86 (3), 740-754 (2015).
- Bradley, M. M., Miccoli, L., Escrig, M. A., Lang, P. J. The pupil as a measure of emotional arousal and autonomic activation. Psychophysiology. 45 (4), 602-607 (2008).
- Hess, E. H., Polt, J. M. Pupil size as related to interest value of visual stimuli. Science. 132 (3423), 349-350 (1960).
- Di Stasi, L. L., Catena, A., Canas, J. J., Macknik, S. L., Martinez-Conde, S. Saccadic velocity as an arousal index in naturalistic tasks. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 37 (5), 968-975 (2013).
