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Biochemistry

Purification de la chromatine du locus génique en copie unique chez Saccharomyces cerevisiae

Published: November 17, 2023 doi: 10.3791/65460
Automatic Translation
1, 1
1Institute of Epigenetics and Stem Cells, Helmholtz Zentrum München

Summary

Ce protocole présente une méthode d’isolement de la chromatine spécifique au locus basée sur la recombinaison spécifique au site pour purifier un locus de gène d’intérêt en une seule copie dans son contexte chromatin natif à partir d’une levure bourgeonnante, Saccharomyces cerevisiae.

Abstract

L’unité organisationnelle de base de la chromatine eucaryote est la particule centrale du nucléosome (NCP), qui comprend l’ADN enroulé ~ 1,7 fois autour d’un octamère d’histone. La chromatine est définie comme l’entité des NCP et de nombreux autres complexes protéiques, y compris les facteurs de transcription, le remodelage de la chromatine et les enzymes modificatrices. On ne sait toujours pas comment ces interactions protéine-ADN sont orchestrées au niveau de loci génomiques spécifiques au cours des différentes étapes du cycle cellulaire. Cela est principalement dû aux limitations techniques actuelles, qui rendent difficile l’obtention de mesures précises de telles interactions dynamiques. Nous décrivons ici une méthode améliorée combinant une recombinaison spécifique au site avec un protocole efficace de purification par affinité en une seule étape pour isoler un locus de gène d’intérêt en une seule copie dans son état natif de chromatine. La méthode permet l’enrichissement robuste du locus cible sur la chromatine génomique, ce qui fait de cette technique une stratégie efficace pour identifier et quantifier les interactions protéiques de manière non biaisée et systématique, par exemple par spectrométrie de masse. À la suite de ces analyses de composition, la chromatine native purifiée par cette méthode reflète probablement la situation in vivo concernant le positionnement des nucléosomes et les modifications des histones et se prête donc à d’autres analyses structurales et biochimiques de la chromatine dérivée de pratiquement n’importe quel locus génomique chez la levure.

Introduction

L’organisation dynamique des génomes eucaryotes en chromatine compacte l’ADN pour qu’il s’adapte aux limites du noyau tout en assurant une dynamique suffisante pour l’expression des gènes et l’accessibilité pour les facteurs régulateurs. En partie, cette polyvalence est médiée par le nucléosome, l’unité de base de la chromatine, qui comprend une particule centrale avec 147 pb d’ADN enroulé ~ 1,7 fois autour de l’octamère de l’histone1. Le nucléosome est une structure très dynamique en ce qui concerne sa composition, avec de nombreuses variantes d’histones et des modifications post-traductionnelles (PTM) sur les queues d’histones N- et C-terminales. De plus, la chromatine eucaryote interagit avec une multitude d’autres composants essentiels, tels que les facteurs de transcription, les mécanismes de traitement de l’ADN et de l’ARN, les protéines architecturales, les enzymes impliquées dans le remodelage et la modification de la chromatine et les molécules d’ARN associées à la chromatine. Ces mécanismes cruciaux impliqués dans la transcription, la réplication et la réparation nécessitent tous un accès à la chromatine, qui sert de substrat naturel à ces processus. Par conséquent, la compréhension des mécanismes moléculaires sous-jacents à ces transactions d’ADN nécessite une définition précise des altérations collectives de la structure de la chromatine dans les régions génomiques spécifiques où ces mécanismes convergent et facilitent les réactions biologiques.

Malgré l’identification de nombreux facteurs de la chromatine par le biais d’études génétiques et d’études d’interaction protéine-protéine, la réalisation d’analyses directes, impartiales et complètes des interactions de la chromatine sur des sites génomiques particuliers est restée un obstacle important 2,3. Dans un premier temps, seules des régions très abondantes du génome (c’est-à-dire des loci répétitifs) ou des plasmides multi-copies ont pu être isolés en quantités et en pureté suffisantes pour permettre l’identification par spectrométrie de masse des protéines associées 4,5,6,7. Une série de nouvelles approches basées sur l’hybridation directe de sondes de capture à l’ADN chromatinisé, la biotinylation de proximité à l’aide du système CRISPR-dCas9 ou la liaison de protéines adaptatrices spécifiques à la séquence au locus d’intérêt ont commencé à démêler le protéome des loci à copie unique à partir de génomes de levures et de mammifères 8,9,10. Cependant, toutes ces méthodes nécessitent la réticulation du formaldéhyde pour stabiliser les interactions protéine-ADN et la sonication pour solubiliser la chromatine en vue d’une purification ultérieure. Ensemble, les deux manipulations excluent la possibilité d’études structurelles et fonctionnelles ultérieures de la chromatine purifiée.

Pour surmonter ces limitations, nous avons précédemment conçu une méthodologie qui utilise la recombinaison spécifique au site pour extraire les domaines chromosomiques ciblés de la levure11,12. Essentiellement, la région génomique d’intérêt est entourée de sites de reconnaissance (RS) pour la R-recombinase spécifique du site de Zygosaccharomyces rouxi tout en incorporant simultanément un groupe de trois sites de liaison à l’ADN pour la protéine répressive transcriptionnelle procaryote LexA (LexA) dans la même région. Les cellules de levure contiennent une cassette d’expression pour l’expression simultanée de la R-recombinase et une protéine LexA fusionnée à un marqueur de purification par affinité en tandem (TAP). Après l’induction de la R-recombinase, l’enzyme excise efficacement la région ciblée du chromosome sous la forme d’un domaine de chromatine circulaire. Ce domaine peut être purifié via la protéine adaptatrice LexA-TAP, qui se lie aux sites de liaison à l’ADN LexA, ainsi qu’à un support d’affinité. Cette méthode a été récemment utilisée pour isoler des domaines distincts de la chromatine contenant des origines de réplication sélectionnées du chromosome III13 de la levure.

L’un des avantages majeurs de cette approche ex vivo est qu’elle permet des analyses fonctionnelles du matériau isolé. Par exemple, les domaines d’origine de réplication purifiés avec cette méthode peuvent être soumis à des tests de réplication in vitro pour évaluer l’efficacité de la cuisson d’origine dans un tube à essai à partir de matrices de chromatine assemblées in vivo natives. À terme, la caractérisation biochimique et fonctionnelle du matériel isolé pourrait permettre la reconstitution des processus nucléaires à l’aide de protéines purifiées et de la matrice de chromatine native. En résumé, cette méthodologie ouvre une voie passionnante dans la recherche sur la chromatine, car il sera possible de suivre les changements collectifs de composition et de structure de la chromatine d’une région génomique spécifique subissant une certaine transaction chromosomique.

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Protocol

Voir le tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux et instruments utilisés dans ce protocole. Reportez-vous au tableau 1 pour obtenir la liste des solutions, des tampons et des supports utilisés.

1. Construction de souches de levure recombinantes

  1. Pour construire une souche de levure compétente en recombinaison, transformer le plasmide K238 digéré par SbfI en une souche de levure avec des sites de liaison LexA intégrés et des sites de recombinaison RS au locus d’intérêt13,14.
    NOTE : Le fragment de restriction SbfI transformé contient la cassette d’expression requise pour l’expression constitutive de la protéine de fusion LexA-TAP et de la R-recombinase ainsi que des séquences homologues du chromosome I de levure pour l’intégration génomique de la cassette d’expression par recombinaison homologue (Figure 1).
  2. Pour construire une souche témoin, prenez une souche de levure isogénique dépourvue de sites de liaison RS et LexA intégrés, et transformez-la avec le plasmide K238 digéré par SbfI dans les mêmes conditions que celles utilisées pour la souche compétente pour la recombinaison.
  3. Sélectionner les cellules de levure compétentes en fonction du marqueur de sélection LEU2 sur les plaques de gélose SCD-LEU14.

2. Couplage d’anticorps IgG à des billes magnétiques activées par l’époxy

REMARQUE : Couplez les anticorps IgG aux billes magnétiques activées par l’époxy selon le protocole publié suivant11.

  1. Suspendre 300 mg de billes activées par l’époxy dans 10 mL d’acétone à 50 % (300 mg correspond à ~5,1 ×10 10 billes) dans un tube conique de 50 mL. Agiter vigoureusement sur un mélangeur vortex.
  2. Centrifuger le tube contenant les billes à 820 × g et 4 °C pendant 2 min. Retirez le surnageant.
  3. Lavez les billes 3 fois avec 20 mL de tampon phosphate de sodium 0,1 M (pH 7,4). Éliminer le surnageant après chaque étape de lavage par centrifugation comme décrit à l’étape 2.2.
  4. Suspendre les billes dans 16 mL de tampon de phosphate de sodium à 0,1 M (pH 7,4) et les faire tourner doucement dans une étuve d’hybridation pendant 5 min à température ambiante.
  5. Dissoudre les IgG de lapin (100 mg) dans 7 mL de dH2O (concentration finale : 14 mg/mL).
  6. Centrifuger la suspension d’IgG à 13 000 × g et 4 °C pendant 10 min pour clarifier la suspension.
  7. Transvaser 3,5 mL du surnageant (correspondant à 50 mg d’IgG de lapin) dans un nouveau tube conique de 50 mL.
  8. Diluer la solution d’IgG avec 9,85 mL de tampon de phosphate de sodium 0,1 M (pH 7,4), suivi de l’ajout goutte à goutte de 6,65 mL de sulfate d’ammonium 3 M dans du phosphate de sodium 0,1 M (pH 7,4) sous mélange doux.
    REMARQUE : Évitez d’ajouter rapidement du sulfate d’ammonium à la solution car une concentration locale élevée du sel provoquera la précipitation des IgG de lapin.
  9. Centrifuger la solution d’IgG à 820 × g et 4 °C pendant 3 min, puis ajouter le surnageant obtenu à la suspension à billes magnétiques.
  10. Incuber le tube pendant une nuit ou au moins pendant 18 h à 30 °C avec une rotation douce dans une étuve d’hybridation.
  11. Retirez le surnageant comme décrit à l’étape 2.2.
  12. Lavez les billes avec 20 mL de glycine-HCl à 100 mM (pH 2,5). Retirez rapidement la solution comme décrit à l’étape 2.2 pour éviter la dénaturation des polypeptides IgG.
  13. Lavez les billes une fois avec 20 mL de 10 mM de Tris-HCl (pH 8,8). Aspirer le surnageant comme décrit à l’étape 2.2.
  14. Ajouter 20 mL de solution de triéthylamine à 0,1 M pendant 5 à 10 minutes en rotation douce pour inactiver les groupes époxy réactifs résiduels. Retirez le surnageant comme décrit à l’étape 2.2.
  15. Lavez les billes 4 fois avec 20 mL de PBS (pH 7,4) pendant 5 min en les faisant pivoter doucement. Retirez le surnageant comme décrit à l’étape 2.2 après chaque étape de lavage.
  16. Laver les billes 2 fois avec 20 mL de PBS (pH 7,4) avec 0,5 % de Triton X-100 (p/v) pendant 5 min et 15 min chacune en rotation douce dans un four d’hybridation. Retirez le surnageant comme décrit à l’étape 2.2.
  17. Suspendre les billes dans un volume final de 16 mL de PBS (pH 7,4) avec 0,02 % d’azoture de sodium (p/v). Conserver sous forme d’aliquotes de 1 mL à 4 °C jusqu’à utilisation.

3. Culture et récolte de cellules de levure

  1. Inoculer des souches de levure compétentes de contrôle et de recombinaison à partir de plaques YPD dans 5 mL de milieu YPR et incuber pendant la nuit à 30 °C et 200 tr/min.
  2. Inoculer 2 mL de cette culture dans 100 mL de milieu YPR et incuber pendant la nuit à 30 °C et 200 tr/min.
  3. Pour chaque souche, verser 1 800 mL de milieu YP autoclavé et 200 mL de solution de raffinose autoclavée (20 % p/v) dans chacun des deux erlenmeyers de 5 L (4 L de milieu de culture au total pour chaque souche, répartis dans deux flacons).
  4. Inoculer les cellules de levure en croissance à OD600 0,2 dans leur milieu respectif et incuber comme décrit à l’étape 3.1 pendant environ 6 h ou jusqu’à ce que les cellules atteignent le OD600 souhaité de 1,0. Pour assurer une croissance normale des cellules, exemptes de toute contamination, vérifier la DO à 2 h d’intervalle.
  5. Ajouter 200 mL de galactose (20 % p/v) pour induire une recombinaison spécifique au site.
  6. Ajouter 110 μL (50 ng/mL) d’YMFA (en même temps que le galactose, étape 3.5) pour arrêter les cellules en phase G1, et incuber pendant 2 h.
    NOTE : L’ajout d’YMFA aux cellules dépend des conditions expérimentales et de la question biologique à aborder. Précisément, pour cette expérience, les cellules sont arrêtées en phase G1 afin d’obtenir une population cellulaire homogène avec des origines de réplication sous licence ; dans ce processus, le complexe pré-réplicatif se lie aux origines de la phase G1 avant l’initiation de la réplication de l’ADN dans la phase S.
  7. Transférer la suspension cellulaire dans des seaux à centrifuger de 1 L et centrifuger à 6 000 × g et 4 °C pendant 10 min. Jeter le surnageant et remettre en suspension les pastilles cellulaires dans un volume total de 10 à 15 mL de dH2O.
  8. Scellez une seringue de 25 ml à l’aide d’un bouchon Luer et placez-la dans un tube conique de 50 ml rempli d’eau. Transférez la suspension cellulaire dans la seringue et centrifugez à 2 397 × g pendant 10 minutes à température ambiante. Jeter le surnageant.
  9. Retirez le bouchon Luer de la seringue et extrudez les cellules dans de l’azote liquide pour former des « spaghettis » cellulaires.
    REMARQUE : L’utilisation de 4 L de milieu de culture permet d’obtenir un poids humide de granulés cellulaires finaux de 7 à 10 g.
  10. Transférer les spaghettis congelés dans un tube conique de 50 ml et les conserver à −80 °C jusqu’à nouvel usage.

4. Purification du locus de la chromatine

REMARQUE : Voir la figure 2 pour un aperçu schématique des étapes impliquées dans ce protocole de purification de la chromatine spécifique au locus.

  1. Refroidissez un moulin à café commercial en broyant 30 à 50 g de glace carbonique en secouant vigoureusement le moulin à café 2 fois pendant 30 s à chaque fois. Une fois refroidi, jetez la poudre de glace carbonique.
  2. Mélangez 3 g de spaghettis de cellules de levure congelées avec ~30-50 g de glace carbonique dans le moulin à café prérefroidi.
  3. Scellez la jonction entre le bouchon et le broyeur avec du parafilm pour éviter la perte de poudre de cellules de levure pendant le broyage.
  4. Broyez le mélange de cellules de levure et de glace carbonique 10x pendant 30 s à chaque fois, avec des intervalles de 30 s entre chaque tour (estimation de temps total : ~10 min). Pour éviter que la glace carbonique et la poudre cellulaire ne collent aux parois du moulin à café, tapotez continuellement les côtés du moulin à café pendant le broyage.
  5. Transférez la poudre de glace carbonique obtenue dans un bécher en plastique à l’aide d’une spatule propre et sèche.
  6. Conservez les béchers à température ambiante pour évaporer la glace carbonique.
  7. Une fois la glace carbonique évaporée, ajoutez 2,25 mL de tampon MB avec 1x inhibiteurs de protéase et de phosphatase (750 μL/g de cellules de levure) à la poudre de cellules de levure.
  8. Pipeter vigoureusement le mélange cellule-tampon pour assurer la suspension complète des cellules avec le tampon, et transférer dans un tube conique de 15 mL.
  9. Prélever des échantillons pour l’analyse de l’ADN (0,1 %) et des protéines (0,05 %) de la suspension cellulaire résultante (extraits de cellules brutes [CCE]). Conserver à −20 °C jusqu’à la suite du traitement (décrit à la rubrique 7).
  10. Transférer la suspension cellulaire dans des tubes de réaction de 2 mL à faible liaison et centrifuger à 21 130 × g pendant 30 min à 4 °C pour séparer les débris cellulaires du lysat cellulaire brut.
  11. Regrouper les surnageants de tous les tubes dans un tube conique de 15 ml.
  12. Prélever des échantillons du surnageant (entrée [IN]) pour l’analyse de l’ADN (0,1 %) et des protéines (0,05 %). Conserver à −20 °C jusqu’à la suite du traitement (décrit à la rubrique 7).
  13. Équilibrer 500 μL de boue à billes magnétiques couplées aux IgG (pour chaque souche de levure) en lavant 2 fois avec 500 μL de tampon MB froid avec 1 inhibiteur de protéase et de phosphatase pendant 5 min chacun à 4 °C en rotation à 20 tr/min. Éliminez le surnageant des billes à l’aide d’une grille magnétique après chaque étape de lavage.
  14. Incuber les billes magnétiques couplées aux IgG dans 500 μL de tampon MB froid avec 1x inhibiteurs de protéase et de phosphatase pendant 1 h à 4 °C en rotation à 20 tr/min. Éliminez le surnageant des billes à l’aide d’une grille magnétique.
  15. Mélanger la boue de billes magnétiques équilibrée avec le lysat cellulaire et incuber avec rotation à 20 tr/min pendant 2 h à 4 °C.
  16. Transférez l’ensemble de la suspension de lysat de cellules à billes magnétiques dans des tubes de réaction à faible liaison.
  17. Séparez les billes magnétiques, qui portent maintenant les anneaux de chromatine d’intérêt, du lysat cellulaire à l’aide d’une grille magnétique.
  18. Transférez le reste de l’écoulement (FT) de chaque tube dans un nouveau tube conique de 15 mL et prélevez des échantillons pour l’analyse de l’ADN (0,1 %) et des protéines (0,05 %). Conserver à −20 °C jusqu’à la suite du traitement (décrit à la rubrique 7).
  19. Suspendez les billes magnétiques de chaque tube dans 300 μL de tampon MB froid et regroupez les billes dans un tube de réaction. Laver 5 fois pendant 10 min chacun avec 750 μL de tampon MB froid avec 1 inhibiteur de protéase et de phosphatase à 4 °C en rotation à 20 tr/min. Effectuer le lavage final avec 750 μL de tampon MB froid sans inhibiteurs de protéase et de phosphatase.
  20. Suspendre les billes dans 40 μL de tampon MB froid sans inhibiteurs de protéase et de phosphatase.
    REMARQUE : Le volume final d’éluat peut être ajusté en fonction de son application prévue en aval. L’élution TEV fonctionne généralement efficacement dans la plage de 100 à 300 μL.

5. Élution médiée par la protéase TEV

  1. Pour libérer les complexes de cycle chromatin LexA-CBP des billes, incuber les billes avec 2 μL de protéase TEV recombinante marquée 6x His pendant une nuit à 4 °C et 450 tr/min dans un thermomélangeur.
  2. Séparez les billes de l’éluat final à l’aide d’une crémaillère magnétique. Transférez l’éluat, contenant des cycles de chromatine clivés, dans un nouveau tube de réaction de 1,5 mL.
  3. Conservez à nouveau les tubes sur une grille magnétique pour séparer les billes résiduelles de l’éluat final.
  4. Remettre les billes (TB) en suspension dans 750 μL de tampon AC froid et prélever des échantillons pour l’analyse de l’ADN (0,1 %) et des protéines (0,05 %). Conserver à −20 °C jusqu’à la suite du traitement (décrit à la rubrique 7).
  5. À partir de l’éluat final (TE), prélever des échantillons pour l’analyse de l’ADN (0,5 %) et des protéines (0,25 %). Conserver à −20 °C jusqu’à la suite du traitement (décrit à la rubrique 7).
    NOTE : En raison du faible volume de l’éluat final, le pourcentage des échantillons prélevés pour l’analyse de l’ADN et des protéines est augmenté afin d’obtenir une meilleure représentation de leur teneur en protéines et en ADN lors de l’analyse.

6. Élution de dénaturation

  1. Laver les billes 2x dans 750 μL de tampon AC froid pendant 20 min à chaque fois à 4 °C en rotation à 20 tr/min.
  2. Pour extraire les complexes LexA-chromatine liés, effectuer l’élution de dénaturation en ajoutant 500 μL de 0,5M NH4OH aux billes, et incuber pendant 30 min à température ambiante.
  3. Séparez les billes de la suspension à l’aide d’une crémaillère magnétique et transférez l’éluat dans un tube de réaction à faible liaison.
  4. Incuber à nouveau les billes comme à l’étape 6.2 pour récupérer le maximum de loci de chromatine dans l’éluat.
  5. Séparez les billes de la suspension à l’aide d’une crémaillère magnétique et mettez en commun l’éluat obtenu dans le même tube contenant l’éluat de l’étape 6.3.
  6. Remettre les billes (DB) en suspension dans 750 μL de dH2O et prélever des échantillons pour l’analyse de l’ADN (0,1 %) et des protéines (0,05 %).
  7. À partir de l’éluat final (DE), prélever des échantillons pour l’analyse de l’ADN (0,5 %) et des protéines (0,25 %).

7. Analyse de l’ADN et des protéines

  1. Analyse de l’ADN
    1. Préparation de l’échantillon
      1. Aux échantillons d’ADN, ajoutez 100 μL de tampon IRN et augmentez le volume avec dH2O jusqu’à un volume final de 200 μL.
      2. Ajouter 1 ng d’ADN plasmidique de pointe K071.
      3. Ajouter 1 μL d’ARNase A (10 mg/mL) et incuber à 37 °C pendant 1 h.
      4. Ajouter 5 μL de protéinase K (10 mg/mL) et 10 μL de SDS (20 %) et incuber pendant 1 h à 56 °C.
      5. Ajouter 200 μL de phénol/chloroforme/alcool isopropylique (25 :24 :1) et faire tourbillonner 2 fois pendant 10 s à chaque fois.
      6. Centrifuger les échantillons à 21 130 × g pendant 7 min pour séparer les phases organique et aqueuse.
      7. Transférez le surnageant dans de nouveaux tubes de 1,5 mL contenant 1,5 μL de glycogène (5 mg/mL) et 2,5 x 100 % d’éthanol.
      8. Incuber les tubes à −20 °C pendant au moins 2 h et au maximum toute la nuit pour précipiter l’ADN.
      9. Centrifugeuse à 21 130 × g, 4 °C pendant 45 min. Jeter le surnageant.
      10. Ajouter 150 μL d’éthanol à 70 % sans remettre la pastille d’ADN en suspension, puis centrifuger à nouveau à 21 130 × g à 4 °C pendant 10 min.
      11. Séchez les pastilles d’ADN à température ambiante pendant 10 à 15 minutes et remettez-les en suspension dans 40 μL de dH2O.
      12. Effectuer une digestion enzymatique de restriction pour linéariser l’ADN isolé à l’étape 7.1.1.11 avec l’endonucléase de restriction HpaI. Pour un mélange réactionnel de 50 μL, incuber 40 μL d’ADN isolé + 2 μL d’enzyme HpaI + 5 μL de tampon enzymatique de restriction + 3 μL de dH2O pendant une nuit à 37 °C.
    2. Analyse qPCR
      1. Diluer l’ADN digéré par restriction dans un rapport de 1 :5 (10 μL de l’ADN digéré par restriction obtenu à l’étape 7.1.1.12 dans 40 μL de dH2O).
      2. Utilisez des paires d’amorces conçues pour la région ARS316, PDC1 et l’ADN plasmidique à pointe.
      3. Exécutez la qPCR à l’aide du programme indiqué dans le tableau 2.
      4. Analysez les résultats de la qPCR par quantification relative en utilisant la région ARS316 et l’ADN plasmidique de pointe comme cibles et PDC1 (ou tout autre gène ou région génomique) comme locus de référence.
      5. Évaluer le pourcentage de récupération du locus ARS316 sur PDC1 en normalisant les valeurs de quantification relative de l’amorce ARS316 et PDC1 par le pourcentage du volume de fraction prélevé pour chaque échantillon. Par exemple, multipliez 0,1 % pour l’écoulement par un facteur de 1 000 et 0,5 % pour l’éluat de TEV par un facteur de 200.
      6. Normalisez les pourcentages de récupération d’ARS316 et de PDC1 avec les valeurs de quantification relative de l’ADN plasmidique de pointe.
      7. Évaluer l’enrichissement du locus ARS316 sur la chromatine totale en évaluant les valeurs cibles/de référence de quantification relative obtenues à l’aide de l’équation (1).
        Equation 1(1)
    3. Analyse par transfert de Southern
      1. À 20 μL d’échantillon d’ADN digéré par des enzymes de restriction, ajouter 5 μL de colorant de charge en gel.
      2. Faire passer les échantillons dans un gel d’agarose à 1 % à 110 V pendant ~3 h.
      3. Transférez le gel dans un plateau et faites-le tremper dans une solution de dépurination en agitant doucement pendant 20 min.
      4. Rincez le gel avec dH2O, et faites-le tremper dans une solution de dénaturation pendant 15 min en agitant. Jeter la solution de dénaturation.
      5. Trempez le gel dans une solution de dénaturation pendant 15 min en agitant doucement.
      6. Rincez le gel avec dH2O, et lavez-le 2x pendant 15 min à chaque fois avec le tampon de transfert en agitant doucement.
      7. Remplissez un plateau avec 1 à 1,5 L de tampon de transfert et placez-le sur une plate-forme stable.
      8. Découpez un long morceau de papier Whatman et placez-le sur la plate-forme de manière à ce que les deux extrémités du papier soient trempées dans le tampon de transfert.
      9. Coupez une bande de membrane de nylon positive et quatre bandes de papier Whatman égales à la taille du gel.
      10. Placez deux morceaux de papier Whatman imbibés dans le tampon de transfert sur la plate-forme.
      11. Placez le gel face vers le bas sur les morceaux de papier Whatman.
      12. Sur le gel, placez la membrane en nylon positif, puis les deux autres morceaux de papier Whatman imbibés de tampon de transfert. Assurez-vous de garder la pile humide avec le tampon de transfert.
      13. Retirez les bulles d’air emprisonnées en les faisant rouler à l’aide d’une tige de verre.
      14. Placez une pile d’essuie-tout sur le dessus de la pile assemblée, suivie d’un objet de 0,5 kg (par exemple, une bouteille en verre).
      15. Laisser l’assemblage pour une nuit de transfert à température ambiante.
      16. Après transfert, réticuler la membrane par UV avec une puissance totale de 1 200 J/cm2.
      17. Pour la détection du locus ARS316, effectuer l’hybridation par transfert de Southern à l’aide de sondes radioactives synthétisées à l’aide du système de marquage de l’ADN référencé.
        REMARQUE : Effectuez toutes les étapes ci-dessous sur la glace jusqu’à mention contraire.
      18. Dans un tube de réaction à faible liaison, diluer 25 à 40 ng de fragment de PCR (sonde) dans 19 μL de dH2O et incuber à 95 °C pendant 5 min. Laisser refroidir immédiatement sur de la glace.
      19. Ajoutez 1 μL de 500 μM dCTP, 500 μM dGTP et 500 μM dTTP dans le tube.
      20. Ajouter 20 μL du tampon contenant les hexamères nucléotidiques aléatoires fournis avec le kit.
      21. Ajouter 5 μL de dATP nucléotidique [α-32P] marqué radioactivement dans le tube. Effectuer toutes les étapes impliquant des matières marquées radioactivement dans un environnement de protection approuvé pour la radioactivité.
      22. Ajouter 1 μL de fragment de Klenow et incuber à 37 °C sur un thermomélangeur pendant 15 min pour la synthèse d’ADN simple brin.
      23. Ajouter 5 μL de tampon d’arrêt pour arrêter la réaction.
      24. Centrifuger une colonne d’exclusion de taille pendant 2 min à 1 500 × g pour éliminer le tampon de stockage. Jetez l’écoulement et placez la colonne dans un tube frais.
      25. Passez le mélange de sondes à travers la colonne pour éliminer les nucléotides radioactifs non incorporés. Centrifuger pendant 30 s à 1 500 × g pour recueillir la sonde.
      26. Ajouter 150 μL d’ADN de spermatozoïde de saumon (1 :100) pour bloquer la liaison non spécifique de la sonde à la membrane.
      27. Incuber le mélange de sondes à 95 °C pendant 5 min pour dénaturer l’ADN double brin.
      28. Congeler sur de la glace pendant quelques secondes et centrifuger pendant quelques secondes à 500 × g pour faire descendre les gouttelettes d’eau condensées sur le couvercle.
      29. Lavez brièvement la membrane de transfert sud avec le tampon d’hybridation pendant 5 à 10 minutes en rotation.
      30. Pré-hybrider la membrane avec le tampon d’hybridation pendant 1 h à 55 °C avec rotation. Éliminez le tampon d’hybridation.
      31. Ajouter 15 mL de tampon d’hybridation frais (préchauffé à 55 °C) à la membrane avec la sonde préparée. Incuber la membrane pendant une nuit à 55 °C avec rotation.
      32. Effectuer des lavages post-hybridation 2 fois pendant 15 min chacun avec 0,3 SSC, 0,1 % SDS à 55 °C avec rotation.
      33. Effectuer des lavages post-hybridation 2 fois pendant 15 min chacun avec 0,1 SSC, 0,1 % SDS à 55 °C avec rotation.
      34. Effectuer des lavages post-hybridation 2 fois pendant 15 min chacun avec 0,1 SSC, 1,5 % SDS à 55 °C avec rotation.
      35. Retirez la membrane du tube d’hybridation et exposez la membrane à un écran phosphorimageur pendant 3 jours maximum pour obtenir les empreintes radioactives sur le film.
      36. Acquérir des images du film à l’aide d’un système de balayage laser au phosphore.
  2. Analyse des protéines
    1. Préparation de l’échantillon
      1. Ajustez tous les échantillons de protéines à leur volume final (200 μL, 100 μL, 100 μL, 20 μL et 20 μL pour les échantillons d’extrait de cellule brute, d’entrée, d’écoulement, de billes et d’éluat, respectivement) en ajoutant 1 μL de β-mercaptoéthanol, de tampon d’échantillon PAGE LDS (1x) et dedH 2O.
      2. Dénaturer les échantillons à 95 °C pendant 5 min.
    2. Analyse par transfert Western
      REMARQUE : Effectuez le SDS-PAGE et le Western Blot à l’aide des protocoles standard15,16.
      1. Charger 15 μL de chaque échantillon dans chaque puits d’un gel SDS-PAGE de 1,5 mm.
      2. Effectuer l’immunomarquage du transfert à l’aide d’anticorps PAP (1 :2 000) et LexA (1 :1 000) avec incubation nocturne à 4 °C. Diluer dans une solution de lait en poudre à 5 % ou de PBST.
        REMARQUE : Après l’analyse PAP, le transfert peut être retiré à l’aide d’un protocole de stripping doux17 avant l’immunomarquage avec le deuxième anticorps LexA.

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Representative Results

La purification du domaine chromatin ARS316 de ~1,4 kb a été médiée par la protéine adaptatrice LexA-TAP exprimée de manière constitutive. Pour servir de contrôle négatif, nous avons effectué des purifications à l’aide d’une souche isogénique qui exprime LexA-TAP mais ne contient pas de sites intégrés de liaison RS et LexA. La figure 3 illustre le résultat de l’analyse de l’ADN d’une expérience de purification standard réalisée à la fois sur la souche témoin et sur une souche compétente en recombinaison ciblant le locus ARS316. Après l’isolement de l’ADN et la digestion enzymatique de restriction pour linéariser les molécules d’ADN circulaires, une analyse qPCR a été effectuée pour évaluer l’efficacité de purification du locus cible ARS316 sur le locus témoin génomique PDC1 non apparenté.

De plus, l’enrichissement du locus ARS316 sur la chromatine totale a été quantifié (Figure 3A,B). La souche témoin négative n’a montré aucune récupération des loci ARS316 ou PDC1 dans aucune des fractions, à l’exception de l’extrait, de l’entrée et de l’écoulement de la cellule brute, ce qui suggère qu’aucun enrichissement spécifique n’a pu être observé dans les élutions TEV et dénaturantes. En revanche, le locus ARS316 a été quantitativement appauvri dans l’écoulement continu de la souche de recombinaison et a pu être récupéré sur les billes après l’élution TEV et dans l’élution dénaturante. Après l’élution du TEV, les billes ont montré un pourcentage de récupération plus élevé du locus ARS316 car l’efficacité de clivage du TEV n’était pas de 100%. Il en résultait qu’une fraction des anneaux de chromatine restait liée aux billes. L’efficacité du clivage de la protéase TEV peut être améliorée en augmentant le volume d’élution au-dessus de 100 μL. En revanche, l’élution dénaturante a montré une récupération de 80 à 90 % du locus ARS316 dans la souche de recombinaison (Figure 3A), ce qui correspond à l’enrichissement élevé des molécules ARS316 en tenant compte de la taille du génome de la levure (Figure 3B).

Le transfert de Southern a également été effectué pour valider les résultats de la qPCR. En raison de sa grande sensibilité, il peut détecter des concentrations relativement faibles d’ADN cible, permettant ainsi une analyse quantitative des échantillons. Les résultats obtenus à partir de l’analyse par transfert de sud à l’aide d’une sonde marquée radioactivement ont confirmé l’enrichissement spécifique du locus ARS316 dans les fractions prélevées à partir de la souche de recombinaison, mais pas dans les fractions de la souche témoin (Figure 3C). Dans la souche de recombinaison, un enrichissement plus élevé du locus ARS316 a été observé sur la base de l’intensité du signal dans les billes TEV et les échantillons d’élution de dénaturation, concordant avec les résultats de la qPCR. De même, les signaux faibles observés dans les échantillons de billes d’élution et de dénaturation du TEV concordent avec le faible enrichissement observé du locus ARS316 dans ces fractions (Figure 3C).

L’efficacité du clivage et de la traction de LexA-TAP a également été évaluée par Western blot. La protéine LexA-TAP a un poids moléculaire de ~80 kDa (Figure 4A). Dans les souches de recombinaison et de contrôle, l’analyse par transfert Western a été effectuée à l’aide de l’anticorps PAP, qui cible la fraction protéine A de LexA-TAP dans les échantillons de purification. Comme prévu, les résultats ont démontré un épuisement presque total de LexA-TAP dans l’écoulement, avec une récupération observée dans les fractions finales de billes et d’élution (Figure 4B[i]). L’anticorps PAP détecte également le petit fragment de protéine A de ~15 kDa qui reste sur les billes après l’élution du TEV. Le même western blot a été prélevé et immunocoloré avec un anticorps contre la fraction LexA de LexA-TAP (Figure 4B[ii]), montrant des résultats complémentaires (Figure 4B[ii]). La bande forte à ~50 kDa dans les deux taches indique la chaîne lourde IgG couplée aux billes magnétiques, qui s’hybride avec les conjugués d’anticorps primaires/secondaires (Figure 4B[ii]).

Figure 1
Figure 1 : Schémas de la construction de la souche de levure. Une souche de levure modifiée avec des sites de LexA et de recombinaison intégrés sur le chromosome III est transformée avec un plasmide (K238) avec des cassettes d’expression pour l’expression constitutive de la protéine de fusion LexA-TAP à l’aide du promoteur TEF2 et la cassette d’expression inductible par le galactose pour l’expression de la R recombinase (RecR) à l’aide d’un promoteur GAL10. Le plasmide est linéarisé par digestion de restriction SbfI, créant ainsi des bras de recombinaison homologues pour l’intégration de la cassette d’expression dans un emplacement intergénique sur le chromosome I. Les cellules compétentes sont sélectionnées en fonction du marqueur de sélection LEU2 sur le milieu de culture dépourvu de leucine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Purification du locus de la chromatine ARS316 à partir de la levure Saccharomyces cerevisiae. Le locus ARS316 est excisé sous forme de cycles chromatiniens de son emplacement génomique dans les cellules de levure par recombinaison spécifique au site induite par le galactose. Ces cycles de chromatine sont isolés de l’extrait de cellule brute à l’aide de l’étiquette d’affinité LexA-TAP liée à des billes magnétiques couplées aux IgG. Les cycles de chromatine peuvent être libérés des billes par deux méthodes : i) clivage médié par protéase TEV, ou ii) élution de dénaturation à l’aide d’une solution d’ammonium. La flèche pointillée représente la possibilité d’effectuer une élution de dénaturation après l’élution médiée par la protéase TEV pour libérer les cycles de chromatine liés aux billes restants, car l’efficacité de clivage de la protéase TEV n’est pas de 100%. Les encadrés représentent les échantillons obtenus à différentes étapes de la purification pour les analyses de protéines et d’ADN. Abréviation : RS = sites de recombinaison. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Analyse de l’ADN pour évaluer la purification du locus ARS316. (A) Graphique à barres montrant la purification du locus ARS316 et d’une région non apparentée, PDC1, dans une série d’échantillons d’ADN prélevés lors de la purification du locus de la chromatine ARS316 à partir de la souche de levure recombinée. (B) Graphique à barres montrant l’enrichissement du locus ARS316 par rapport à la chromatine totale dans une série d’échantillons d’ADN prélevés lors de la purification du locus de la chromatine ARS316 à partir de souches de levure témoins et de recombinaison. (C) Image par transfert de Southern montrant l’enrichissement du locus ARS316 dans une série d’échantillons d’ADN prélevés lors de la purification du locus de la chromatine ARS316 à partir de souches de levure témoins et de recombinaison. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Analyse des protéines pour évaluer l’efficacité du pull-down et du clivage de LexA-TAP. (A) Dessin représentant les différents domaines protéiques de la protéine de fusion LexA-TAP, ainsi que la taille de chaque domaine. (B) Images par Western blot montrant l’immunomarquage contre (i) PAP et (ii) LexA dans une série d’échantillons de protéines prélevés lors de la purification du locus de la chromatine ARS316 à partir de souches de levure témoins et de recombinaison. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Diagramme de flux mettant en évidence les applications potentielles en aval des domaines de chromatine purifiés à l’aide de la purification d’affinité LexA-TAP. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Liste des solutions et des milieux utilisés dans ce protocole. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 2 : Programme de PCR quantitatif. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

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Discussion

L’identification des facteurs et du paysage chromatin d’une région génomique cible spécifique continue de poser un défi majeur dans la recherche sur la chromatine18. Ce protocole décrit un système efficace pour exciser et purifier spécifiquement les domaines distincts de la chromatine des chromosomes de levure. À notre connaissance, la pureté et le rendement de cette purification en une seule étape permettent de surmonter de nombreuses limitations des méthodes de purification de la chromatine spécifiques aux locus, permettant ainsi d’obtenir un enrichissement très élevé des loci ciblés par rapport à d’autres régions génomiques non apparentées.

En raison de l’étape d’excision supplémentaire à l’aide de la R-recombinase spécifique au site, un autre avantage est que l’on peut déterminer avec précision quelle région génomique est purifiée en fonction de l’emplacement précis des sites de recombinaison dans le génome. En revanche, d’autres méthodes reposent sur le cisaillement de l’ADN par sonication, ce qui se traduit par des longueurs de molécules hétérogènes ; Cette hétérogénéité rend ces méthodes moins précises en termes de purification d’un locus cible bien défini.

Enfin, cette stratégie de purification utilise des conditions natives sans l’inclusion de réticulants chimiques comme le formaldéhyde. Ainsi, le matériau isolé obtenu par cette approche se prête à des analyses structurales et fonctionnelles. Une étape critique du protocole de purification est l’efficacité de l’élution TEV, qui dépend fortement de plusieurs paramètres, notamment l’activité de la protéase TEV, les conditions de réaction et les volumes de réaction. Pour l’expérience présentée, le volume d’élution a été réglé au minimum, ce qui a affecté l’efficacité de l’élution. Cependant, l’augmentation du volume et de la quantité de protéase TEV pourrait améliorer considérablement l’efficacité de l’élution. Malgré sa faible efficacité, l’élution TEV permet un clivage et une récupération très spécifiques des domaines de chromatine souhaités. En comparaison, l’élution de dénaturation a une efficacité d’élution de plus de 90 %, mais peut éluer certaines molécules d’ADN ou de protéines non spécifiques des billes. Par conséquent, la méthode choisie dépend de l’application en aval souhaitée du matériau isolé. Par exemple, il a été démontré que l’élution dénaturante permet l’identification par spectrométrie de masse des facteurs de chromatine associés, tandis que l’élution TEV native est préférée pour les tests fonctionnels en aval tels que les tests de transcription ou de réplication in vitro . La figure 5 résume les applications potentielles en aval du protocole de purification décrit. En résumé, ce flux de travail amélioré et cette méthode très efficace pour étudier la composition en chromatine de loci uniques répondent à un défi de longue date dans la recherche sur la chromatine.

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Disclosures

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Acknowledgments

Les travaux du laboratoire S.H. ont été soutenus par la DFG par le biais de SFB1064 (ID de projet 213249687), le Conseil européen de la recherche (ERC Starting Grant 852798 ConflictResolution) et la Helmholtz Gesellschaft.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Yeast strains
Control Strain: MATa; ura3Δ0; leu2Δ0; his3Δ1; met15Δ0; bar1::kanMX4; Chr I 212kb::LEU2 pTEF2-LEXA-TAP pGAL1-10 RecR Section 1, see references 13 and 14
Recombination Strain: MATa; ura3Δ0; leu2Δ0; his3Δ1; met15Δ0; bar1::kanMX4; RS_LEXA_NS-3_ARS316_NS+3_RS; Chr I 212kb::LEU2 pTEF2-LEXA-TAP pGAL1-10 RecR Section 1, see reference 13 and 14
Plasmid
K238 plasmid Section 1, see reference 13
Storage: Store at -20 °C
K071 Spike-in plasmid DNA Section 7.1, see reference 13
Storage: Store at -20 °C
Reagents
Acetone Carl Roth 5025.1 Section 2
Storage: Store at room temperature
Ammonium acetate (NH4Ac) Sigma Aldrich A7262 Section 6 and 7.1
Storage: Store at room temperature
Ammonium solution (NH4OH) 25% Merck Millipore 533003 Section 6
Storage: Store at room temperature
Ammonium sulfate Santa Cruz Sc-29085 Section 2
Storage: Store at room temperature
Bacto agar BD (VWR) 90000-760 Section 3
Storage: Store at room temperature
Bacto peptone BD (VWR) 211820 Section 3
Storage: Store at room temperature
β-Mercaptoethanol Sigma Aldrich 07604 Section 7.2
Storage: Store at 4 °C
Chemiluminescent substrate kit ThermoFisher 34580 Section 7.2
Storage: Store at 4 °C
Di-Sodium Hydrogen phosphate dodecahydrate Merck 1.06579.1000 Section 2 and 7.1
Storage: Store at room temperature
Dithiothreitol (DTT) ThermoFisher 15508013 Section 4
Storage: Store at 4 °C
Ethanol Merck 100983 Section 7.1
Storage: Store at room temperature
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma Aldrich ED Section 7.1
Storage: Store at room temperature
Galactose (20% (w/v) stock) Sigma Aldrich G0625-1KG  /  5KG Section 3
Storage: Store at room temperature
Gel loading dye (6x) BioLabs B7024A Section 7.1
Storage: Store at -20 °C
Glusose Sigma-Aldrich G8270 Section
Storage: Store at room temperature
Glycine Carl Roth .0079.4 Section 2
Storage: Store at room temperature
Glycogen (5 mg/mL) Invitrogen AM9510 Section 7.1
Storage: Store at -20 °C
Hydrochloric acid (HCl) PanReac AppliChem 182109.1211 Section 2, 4 and 7.1
Storage: Store at room temperature
Magnesium Acetate (MgAc) Bernd Kraft 15274.2600/C035 Section 4
Storage: Store at room temperature
Magnesium chloride (MgCl2) Sigma Aldrich M8266 Section 6
Storage: Store at room temperature
Nu PAGE LDS sample buffer (4x) Invitrogen 2399549 Section 7.2
Storage: Store at room temperature
Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1 v/v) Invitrogen 15593-031 Section 7.1
Storage: Store at 4 °C
Potassium chloride (KCl) Sigma P9541 Section 4
Storage: Store at room temperature
Radioactively labeled α-32P dATP (3,000 Ci/mmol, 10 mCi/mL) Hartmann Analytic SRP-203 Section 7.1
Storage: Store at 4 °C
RadPrime labeling system ThermoFisher 18428-011 Section 7.1
Storage: Store at -20 °C
Raffinose (20% (w/v) stock) SERVA 34140.03 Section 3
Storage: Store at room temperature
Sodium chloride (NaCl) Merck K53710504142 Section 7.1
Storage: Store at room temperature
Sodium citrate (Na3C6H5O7) Sigma-Aldrich 71402 Section 7.1
Storage: Store at room temperature
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma Aldrich S5881 Section 7.1
Storage: Store at room temperature
Sodium n-dodecyl sulfate (SDS) (5% stock (w/v) ) Alfa Aesar A11183 Section 7.1
Storage: Store at room temperature
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich 71496 Section 2 and 7.1
Storage: Store at room temperature
Sodium azide Santa Cruz Biotechnology sc-208393 Section 2
Storage: Store at -20 °C
 Triethylamine Sigma Aldrich 90340 Section 2
Storage: Store at room temperature
Tris base Chem Cruz SC-3715B Section 2 and 4
Storage: Store at room temperature
Triton X-100 Sigma Aldrich X100 Section 2 and 4
Storage: Store at room temperature
Tween-20 Bernd Kraft 18014332 Section 4
Storage: Store at room temperature
Yeast extract BD (VWR) 212720 Section 3
Storage: Store at room temperature
Yeast mating factor alpha (1 µg/mL stock )  Biomol Y2016.5 Section 3
Storage: Store at -20 °C
Yeast Synthetic Drop-out medium Supplements without LEUCINE Sigma Aldrich Y1376 Section 1, see reference 14
Enzymes
HpaI restriction enzyme (5,000 U/mL) NEB R0105S Section 7.1
Storage: Store at -20 °C
Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100x) ThermoFisher Scientific 78446 Section 4
Storage: Store at4 °C
Proteinase K (10 mg/mL) SERVA 33756 Section 7.1
Storage: Store at -20 °C
RNase A (10 mg/mL)  ThermoFisher EN0531 Section 7.1
Storage: Store at -20 °C
TEV protease (10000 U/µL) NEB P8112S Section 5
Storage: Store at -20 °C
Materials
BcMag Epoxy-Activated Magnetic Beads Bioclone Inc. FC-102 Section 2
Storage: Store at 4 °C
Dry ice Section 4
Low-binding centrifuge tubes 2.0 mL Eppendorf 22431102 Section 4
Microspin G-25 Columns Cytiva 27-5325-01 Section 7.1
Storage: Store at room temperature
Parafilm Merck P7793 Section 4
Positive nylon membrane Biozol 11MEMP0001 Section 7.1
Storage: Store at room temperature
PVDF transfer membrane Immobilon-Merck Millipore IPVH00010 Section 7.2
Storage: Store at room temperature
SDS-PAGE gel 4-12% bis-tris (15 well, 1.5 mm) Invitrogen  NP0336BOX Section 7.2
Storage: Store at 4 °C
Syringe (25 mL) with luer fitting Henke Sass Wolf 4200-000V0 Section 3
Whatman paper (Grade 3MM CHR Cellulose Western Blotting Paper Sheet) Cytiva 3030-917 Section 7.1
Storage: Store at room temperature
Antibodies
Anti-LexA, rabbit polyclonal IgG, DNA binding region antibody Merck Millipore 06-719 Section 7.2
Storage: Store at -20 °C
Goat Anti-Rabbit IgG (H+L), Horseradish peroxidase conjugate Invitrogen G21234 Section 7.2
Storage: Store at -20 °C
Peroxidase Anti-Peroxidase (PAP) antibody produced in rabbit for the detection of TAP-tagged proteins Sigma Aldrich P1291-500UL Section 7.2
Storage: Store at -20 °C
Rabbit IgG antibodies Sigma I5006-100MG Section 2
Storage: Store at 4 °C
Primers (10 µM)
ARS316: fwd 5'- CGGCATTATCGTACACAACCT, rev 5'- GTTCTTCGTTGCCTACATTTTCT Section 7.1
K071 Spike-in plasmid DNA: fwd: 5'-TTTTCGCTGCTTGTCCTTTT, rev 5'- CATTTTCGTCCTCCCAACAT Section 7.1
PCR fragment from yeast genomic DNA as a template  for ARS316 amplification (for southern blot): fwd 5’- AAATTCTGCCCTTGATTCGT                                                  rev 5’- TTTGTTTATCTCATCACTAAT Section 7.1
PDC1: fwd 5'- CATGATCAGATGGGGCTTCA, rev 5'-ACCGGTGGTAGCGACTCTGT Section 7.1
Equipment
Coffee grinder Gastroback 42601 Section 4
Dewar flask NAL GENE 4150-2000 Section 3
DynaMag TM-2 magnetic rack Invitrogen 12321D Section 4, 5 and 6
Hybridization oven Hybaid Mini10 Ri418 Section 2
Microcentrifuge Eppendorf 5424R Section 4 and 7.1
UV-crosslinker Analytikjena 95-0174-02 Section 7.1

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References

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Ce mois-ci dans JoVE Numéro 201 Chromatine native purification d’affinité en une seule étape recombinaison spécifique au site modifications des histones protéomique spécifique au locus biochimie de la chromatine
Purification de la chromatine du locus génique en copie unique chez <em>Saccharomyces cerevisiae</em>
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Sajid, A., Hamperl, S. Single-Copy Gene Locus Chromatin Purification in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (201), e65460, doi:10.3791/65460 (2023).

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