Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Purificação de cromatina de locus gênico de cópia única em Saccharomyces cerevisiae

Published: November 17, 2023 doi: 10.3791/65460
Automatic Translation
1, 1
1Institute of Epigenetics and Stem Cells, Helmholtz Zentrum München

Summary

Este protocolo apresenta um método de isolamento de cromatina locus-específico baseado em recombinação sítio-específica para purificar um locus gênico de cópia única de interesse em seu contexto de cromatina nativa a partir de levedura brotante, Saccharomyces cerevisiae.

Abstract

A unidade organizacional básica da cromatina eucariótica é a partícula núcleo do nucleossomo (NCP), que compreende DNA envolto ~1,7 vezes em torno de um octâmero de histona. A cromatina é definida como a entidade de NCPs e numerosos outros complexos proteicos, incluindo fatores de transcrição, remodelamento da cromatina e enzimas modificadoras. Ainda não está claro como essas interações proteína-DNA são orquestradas no nível de loci genômicos específicos durante diferentes estágios do ciclo celular. Isso se deve principalmente às limitações técnicas atuais, que tornam difícil obter medidas precisas dessas interações dinâmicas. Aqui, descrevemos um método aprimorado combinando recombinação sítio-específica com um eficiente protocolo de purificação de afinidade em etapa única para isolar um locus gênico de cópia única de interesse em seu estado nativo de cromatina. O método permite o enriquecimento robusto do locus alvo sobre a cromatina genômica, tornando esta técnica uma estratégia eficaz para identificar e quantificar interações proteicas de forma imparcial e sistemática, por exemplo, por espectrometria de massas. Além dessas análises composicionais, a cromatina nativa purificada por este método provavelmente reflete a situação in vivo em relação ao posicionamento do nucleossomo e modificações de histonas e, portanto, é passível de análises estruturais e bioquímicas adicionais da cromatina derivada de praticamente qualquer locus genômico em levedura.

Introduction

A organização dinâmica de genomas eucarióticos em cromatina compacta o DNA para caber dentro dos limites do núcleo, garantindo dinâmica suficiente para a expressão gênica e acessibilidade para fatores regulatórios. Em parte, essa versatilidade é mediada pelo nucleossomo, a unidade básica da cromatina, que compreende uma partícula central com 147 pb de DNA envolto ~1,7 vezes em torno do oitâmero de histona1. O nucleossomo é uma estrutura altamente dinâmica em relação à sua composição, com numerosas variantes de histonas e modificações pós-traducionais (MPTs) nas caudas das histonas N- e C-terminais. Além disso, a cromatina eucariótica interage com uma infinidade de outros componentes essenciais, tais como fatores de transcrição, maquinário de processamento de DNA e RNA, proteínas arquitetônicas, enzimas envolvidas no remodelamento e modificação da cromatina e moléculas de RNA associadas à cromatina. Essas máquinas cruciais envolvidas na transcrição, replicação e reparo requerem acesso à cromatina, que serve como substrato natural para esses processos. Consequentemente, compreender os mecanismos moleculares subjacentes a essas transações de DNA requer uma definição precisa das alterações coletivas na estrutura da cromatina nas regiões genômicas específicas onde essas máquinas convergem e facilitam as reações biológicas.

Apesar da identificação de numerosos fatores da cromatina através de estudos genéticos e de interação proteína-proteína, a realização de análises diretas, imparciais e abrangentes das interações da cromatina em sítios genômicos específicos tem permanecido um obstáculo significativo 2,3. Inicialmente, apenas regiões altamente abundantes do genoma (isto é, loci repetitivos) ou plasmídeos multicópias poderiam ser isolados em quantidade e pureza suficientes para a identificação espectrométrica de massa das proteínas associadas 4,5,6,7. Uma série de novas abordagens baseadas na hibridização direta de sondas de captura para DNA cromatinizado, biotinilação de proximidade usando o sistema CRISPR-dCas9 ou a ligação de proteínas adaptadoras sequenciais específicas ao locus de interesse começaram a desvendar o proteoma de loci de cópia única de genomas de leveduras e mamíferos8,9,10 . No entanto, todos esses métodos requerem reticulação de formaldeído para estabilizar as interações proteína-DNA e sonicação para solubilizar a cromatina para posterior purificação. Juntas, ambas as manipulações excluem a possibilidade de estudos estruturais e funcionais subsequentes da cromatina purificada.

Para superar essas limitações, desenvolvemos previamente uma metodologia que emprega recombinação sítio-específica para extrair domínios cromossômicos direcionados de leveduras11,12. Em essência, a região genômica de interesse é cercada por sítios de reconhecimento (RS) para a R-recombinase sítio-específica de Zygosaccharomyces rouxi, incorporando simultaneamente um grupo de três sítios de ligação ao DNA para a proteína LexA repressora transcricional procariótica (LexA) dentro da mesma região. As células de levedura contêm um de expressão para a expressão simultânea de R-recombinase e uma proteína LexA fundida a uma etiqueta de purificação de afinidade em tandem (TAP). Após a indução da R-recombinase, a enzima excisa eficientemente a região alvo do cromossomo na forma de um domínio circular da cromatina. Este domínio pode ser purificado através da proteína adaptadora LexA-TAP, que se liga aos sítios de ligação do ADN LexA, bem como a um suporte de afinidade. Este método tem sido recentemente utilizado para isolar domínios distintos da cromatina contendo origens de replicação selecionadas do cromossomo III da levedura13.

Uma grande vantagem desta abordagem ex vivo é que ela permite análises funcionais do material isolado. Por exemplo, domínios de origem de replicação purificados com este método podem ser submetidos a ensaios de replicação in vitro para avaliar a eficiência de disparo de origem em um tubo de ensaio a partir de modelos de cromatina montados in vivo nativos. Em última análise, a caracterização bioquímica e funcional do material isolado pode permitir a reconstituição de processos nucleares utilizando proteínas purificadas em conjunto com o molde de cromatina nativa. Em resumo, esta metodologia abre um caminho empolgante na pesquisa da cromatina, pois será possível acompanhar as mudanças composicionais e estruturais coletivas da cromatina de uma região genômica específica submetida a uma determinada transação cromossômica.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todos os materiais e instrumentos utilizados neste protocolo. Consulte a Tabela 1 para obter uma lista das soluções, buffers e mídia usados.

1. Construção de cepas de leveduras recombinantes

  1. Para construir uma linhagem de levedura competente em recombinação, transforme o plasmídeo K238 digerido por SbfI em uma linhagem de levedura com sítios de ligação de LexA integrados e sítios de recombinação de RS no locus de interesse13,14.
    NOTA: O fragmento de restrição SbfI transformado contém o de expressão necessário para a expressão constitutiva da proteína de fusão LexA-TAP e da R-recombinase, juntamente com sequências homólogas do cromossoma I da levedura para integração genómica do de expressão por recombinação homóloga (Figura 1).
  2. Para construir uma cepa controle, pegue uma cepa de levedura isogênica sem sítios integrados de ligação RS e LexA e transforme-a com o plasmídeo K238 digerido por SbfI nas mesmas condições usadas para a cepa competente em recombinação.
  3. Selecionar as células de levedura competentes com base no marcador de seleção LEU2 em placas de ágar SCD-LEU14.

2. Acoplamento de anticorpos IgG a esferas magnéticas epóxi-ativadas

NOTA: Acoplar anticorpos IgG contra esferas magnéticas epóxi-ativadas de acordo com o seguinte protocolo publicado11.

  1. Suspender 300 mg de esferas epóxi-ativadas em 10 mL de acetona a 50% (300 mg corresponde a ~5,1 × 10 contas10 ) em um tubo cônico de 50 mL. Agite vigorosamente em uma batedeira de vórtices.
  2. Centrifugar o tubo contendo as esferas a 820 × g e 4 °C durante 2 min. Remova o sobrenadante.
  3. Lavar as esferas 3x com 20 mL de tampão fosfato de sódio 0,1 M (pH 7,4). Retire o sobrenadante após cada etapa de lavagem por centrifugação, conforme descrito na etapa 2.2.
  4. Suspender as esferas em 16 mL de tampão fosfato de sódio 0,1 M (pH 7,4) e girar suavemente em estufa de hibridização por 5 min à temperatura ambiente.
  5. Dissolver as IgGs de coelho (100 mg) em 7 mL de dH2O (concentração final: 14 mg/mL).
  6. Centrifugar a suspensão de IgG a 13.000 × g e 4 °C por 10 min para esclarecer a suspensão.
  7. Transferir 3,5 mL do sobrenadante (correspondente a 50 mg de IgGs de coelho) para um novo tubo cônico de 50 mL.
  8. Diluir a solução de IgG com 9,85 mL de tampão fosfato de sódio 0,1 M (pH 7,4), seguido da adição gota a gota de 6,65 mL de sulfato de amônio 3 M em fosfato de sódio 0,1 M (pH 7,4) sob mistura suave.
    NOTA: Evite adicionar sulfato de amônio rapidamente à solução, pois uma alta concentração local do sal causará a precipitação das IgGs de coelho.
  9. Centrifugar a solução de IgG a 820 × g e 4 °C durante 3 minutos e adicionar o sobrenadante resultante à suspensão do cordão magnético.
  10. Incubar o tubo durante a noite ou, pelo menos, durante 18 h a 30 °C com rotação suave num forno de hibridização.
  11. Remova o sobrenadante conforme descrito no passo 2.2.
  12. Lavar as contas com 20 mL de glicina-HCl 100 mM (pH 2,5). Remova a solução rapidamente conforme descrito na etapa 2.2 para evitar a desnaturação dos polipeptídeos IgG.
  13. Lavar as contas uma vez com 20 mL de Tris-HCl 10 mM (pH 8,8). Aspirar o sobrenadante conforme descrito no passo 2.2.
  14. Adicionar 20 mL de solução de trietilamina 0,1M por 5-10 min sob rotação suave para inativar os grupos epóxi reativos residuais. Remova o sobrenadante conforme descrito no passo 2.2.
  15. Lave as contas 4x com 20 mL de PBS (pH 7,4) por 5 min com rotação suave. Retire o sobrenadante conforme descrito no passo 2.2 após cada etapa de lavagem.
  16. Lavar as contas 2x com 20 mL de PBS (pH 7,4) com Triton X-100 a 0,5% (p/v) por 5 min e 15 min cada em rotação suave em estufa de hibridização. Remova o sobrenadante conforme descrito no passo 2.2.
  17. Suspender as esferas em volume final de 16 mL de PBS (pH 7,4) com azida sódica a 0,02% (p/v). Conservar como alíquotas de 1 ml a 4 °C até à utilização.

3. Cultura e colheita de células de levedura

  1. Inocular o controle e a recombinação de cepas de leveduras competentes de placas YPD em 5 mL de meio YPR e incubar durante a noite a 30 °C e 200 rpm.
  2. Inocular 2 mL dessa cultura em 100 mL de meio YPR e incubar durante a noite a 30 °C e 200 rpm.
  3. Para cada cepa, dispensar 1.800 mL de meio YP autoclavado e 200 mL de solução de rafinose autoclavada (20% p/v) em cada um dos dois frascos de Erlenmeyer de 5 L (4 L de meio de cultura no total para cada cepa, divididos em dois frascos).
  4. Inocular as células de levedura em crescimento a OD600 0,2 em seu respectivo meio e incubar conforme descrito na etapa 3.1 por aproximadamente 6 h ou até que as células atinjam o ODdesejado 600 de 1,0. Para garantir o crescimento normal das células, livre de qualquer contaminação, verifique o DO em intervalos de 2 h.
  5. Adicionar 200 mL de galactose (20% p/v) para induzir a recombinação sítio-específica.
  6. Adicionar 110 μL (50 ng/mL) de YMFA (ao mesmo tempo que a galactose, passo 3.5) para prender as células na fase G1 e incubar por 2 h.
    NOTA: A adição de YMFA às células depende das condições experimentais e da questão biológica a ser abordada. Precisamente, para este experimento, as células são presas na fase G1 para obter uma população celular homogênea com origens de replicação licenciadas; nesse processo, o complexo pré-replicativo liga-se às origens na fase G1 antes do início da replicação do DNA na fase S.
  7. Transfira a suspensão da célula para baldes de centrífuga de 1 L e centrifuja a 6.000 × g e 4 °C por 10 min. Descarte o sobrenadante e ressuspenda os pellets celulares em um volume total de 10-15 mL de dH2O.
  8. Sele uma seringa de 25 mL com um plugue Luer e coloque-a dentro de um tubo cônico de 50 mL cheio de água. Transfira a suspensão da célula para o conjunto da seringa e centrifugar a 2.397 × g por 10 min à temperatura ambiente. Descarte o sobrenadante.
  9. Retire o plugue Luer da seringa e extruda as células em nitrogênio líquido para formar o "espaguete" celular.
    NOTA: Usando 4 L de meio de cultura fornece um peso úmido de pellets de células finais de 7-10 g.
  10. Transfira o espaguete de células congeladas para um tubo cônico de 50 mL e armazene a -80 °C até uso posterior.

4. Purificação do locus da cromatina

NOTA: Consulte a Figura 2 para obter uma visão geral esquemática das etapas envolvidas neste protocolo de purificação de cromatina locus-específico.

  1. Resfriar um moedor de café comercial moendo 30-50 g de gelo seco agitando vigorosamente o moedor de café 2x por 30 s de cada vez. Depois de resfriado, descarte o pó de gelo seco.
  2. Misture 3 g de espaguete de célula de levedura congelado com ~30-50 g de gelo seco no moedor de café pré-resfriado.
  3. Sele a junção entre a tampa e o moedor com parafilme para evitar a perda de pó de célula de levedura durante a moagem.
  4. Moer a mistura de gelo seco da célula de levedura 10x por 30 s de cada vez, com intervalos de 30 s entre cada rodada (estimativa de tempo total: ~10 min). Para evitar que o gelo seco e o pó celular grudem nas paredes do moedor de café, bata nas laterais do moedor de café continuamente durante a moagem.
  5. Transfira o pó de gelo seco da célula de levedura resultante para um copo de plástico usando uma espátula limpa e seca.
  6. Mantenha os copos à temperatura ambiente para evaporar o gelo seco.
  7. Uma vez que o gelo seco evaporar, adicione 2,25 mL de tampão MB com 1x inibidores de protease e fosfatase (750 μL/g de células de levedura) ao pó de células de levedura.
  8. Pipetar a mistura célula-tampão vigorosamente para garantir a suspensão completa das células com o tampão e transferir para um tubo cônico de 15 mL.
  9. Coletar amostras para análise de DNA (0,1%) e proteína (0,05%) da suspensão celular resultante (extratos de células brutas [CCE]). Conservar a -20 °C até nova transformação (descrito na secção 7).
  10. Transferir a suspensão celular para tubos de reação de 2 mL de baixa ligação e centrifugar a 21.130 × g por 30 min a 4 °C para separar os restos celulares do lisado bruto de células.
  11. Junte os sobrenadantes de todos os tubos em um tubo cônico de 15 mL.
  12. Colher amostras do sobrenadante (entrada [IN]) para análise de DNA (0,1%) e proteína (0,05%). Conservar a -20 °C até nova transformação (descrito na secção 7).
  13. Equilibrar 500 μL de pasta magnética de esferas acoplada a IgG (para cada cepa de levedura) lavando 2x com 500 μL de tampão MB frio com 1x inibidores de protease e fosfatase por 5 min cada a 4 °C em rotação a 20 rpm. Descarte o sobrenadante das contas usando um rack magnético após cada etapa de lavagem.
  14. Incubar as esferas magnéticas acopladas a IgG em 500 μL de tampão MB frio com 1x inibidores de protease e fosfatase por 1 h a 4 °C em rotação a 20 rpm. Descarte o sobrenadante das contas usando um rack magnético.
  15. Misturar a pasta de esferas magnéticas equilibrada com o lisado celular e incubar com rotação a 20 rpm durante 2 h a 4 °C.
  16. Transfira a suspensão completa de lisado de células de esferas magnéticas para tubos de reação de baixa ligação.
  17. Separe as esferas magnéticas, agora carregando os anéis de cromatina de interesse, do lisado celular usando um rack magnético.
  18. Transferir o fluxo restante (FT) de cada tubo para um tubo cônico fresco de 15 mL e coletar amostras para análise de DNA (0,1%) e proteína (0,05%). Conservar a -20 °C até nova transformação (descrito na secção 7).
  19. Suspenda as esferas magnéticas de cada tubo em 300 μL de tampão MB frio e junte as contas em um tubo de reação. Lavar 5x por 10 min cada com 750 μL de tampão MB frio com 1x inibidores de protease e fosfatase a 4 °C em rotação a 20 rpm. Realizar a lavagem final com 750 μL de tampão MB frio sem inibidores de protease e fosfatase.
  20. Suspender as esferas em 40 μL de tampão MB frio sem inibidores de protease e fosfatase.
    NOTA: O volume final de eluato pode ser ajustado de acordo com a sua aplicação a jusante prevista. A eluição do TEV geralmente funciona eficientemente dentro da faixa de 100-300 μL.

5. Eluição mediada por protease TEV

  1. Para liberar complexos de anéis de cromatina LexA-CBP das contas, incube as esferas com 2 μL de protease TEV recombinante marcada com 6x His durante a noite a 4 °C e 450 rpm em um termomisturador.
  2. Separe as contas do eluato final usando um rack magnético. Transferir o eluato, contendo anéis de cromatina clivados, para um novo tubo de reação de 1,5 mL.
  3. Mantenha os tubos em um rack magnético novamente para separar quaisquer contas residuais do eluato final.
  4. Ressuspender as esferas (TB) em 750 μL de tampão AC frio e colher amostras para análise de DNA (0,1%) e proteína (0,05%). Conservar a -20 °C até nova transformação (descrito na secção 7).
  5. A partir do eluato final (TE), colher amostras para análise de DNA (0,5%) e proteína (0,25%). Conservar a -20 °C até nova transformação (descrito na secção 7).
    NOTA: Devido ao baixo volume do eluato final, a porcentagem das amostras coletadas para análise de DNA e proteínas é aumentada para obter uma melhor representação de seu conteúdo de proteína e DNA durante a análise.

6. Eluição da desnaturação

  1. Lavar as esferas 2x em 750 μL de tampão CA frio durante 20 min de cada vez a 4 °C em rotação a 20 rpm.
  2. Para extrair os complexos LexA-cromatina ligados restantes, realizar a eluição da desnaturação adicionando 500 μL de NH4OH 0,5M às esferas e incubar por 30 min à temperatura ambiente.
  3. Separe as esferas da suspensão usando um rack magnético e transfira o eluato para um tubo de reação de baixa ligação.
  4. Incubar novamente as esferas como no passo 6.2 para recuperar os loci máximos de cromatina no eluato.
  5. Separe as esferas da suspensão usando um rack magnético e junte o eluato resultante no mesmo tubo contendo o eluato da etapa 6.3.
  6. Ressuspender as esferas (DB) em 750 μL de dH2O e colher amostras para análise de DNA (0,1%) e proteína (0,05%).
  7. A partir do eluato final (DE), colher amostras para análise de DNA (0,5%) e proteína (0,25%).

7. Análise de DNA e proteínas

  1. Análise de DNA
    1. Preparo da amostra
      1. Às amostras de DNA, adicionar 100 μL de tampão IRN e aumentar o volume com dH2O para um volume final de 200 μL.
      2. Adicione 1 ng de DNA plasmidial de espícula K071.
      3. Adicionar 1 μL de RNAse A (10 mg/mL) e incubar a 37 °C por 1 h.
      4. Adicionar 5 μL de proteinase K (10 mg/mL) e 10 μL de SDS (20%) e incubar por 1 h a 56 °C.
      5. Adicionar 200 μL de fenol/clorofórmio/álcool isopropílico (25:24:1) e agitar completamente 2x por 10 s de cada vez.
      6. Centrifugar as amostras a 21.130 × g por 7 min para separar as fases orgânica e aquosa.
      7. Transferir o sobrenadante para novos tubos de 1,5 mL contendo 1,5 μL de glicogênio (5 mg/mL) e 2,5 x 100% de etanol.
      8. Incubar os tubos a -20 °C durante um mínimo de 2 h e um máximo de durante a noite para precipitar o ADN.
      9. Centrifugar a 21.130 × g, 4 °C por 45 min. Descarte o sobrenadante.
      10. Adicionar 150 μL de etanol a 70% sem ressuspender o pellet de DNA e centrifugar novamente a 21.130 × g a 4 °C por 10 min.
      11. Secar os pellets de DNA à temperatura ambiente por 10-15 min e ressuspender em 40 μL de dH2O.
      12. Realizar digestão enzimática de restrição para linearizar o DNA isolado na etapa 7.1.1.11 com endonuclease de restrição HpaI. Para uma mistura de reação de 50 μL, incubar 40 μL de DNA isolado + 2 μL de enzima HpaI + 5 μL de tampão de enzima de restrição + 3 μL de dH2O durante a noite a 37 °C.
    2. Análise de qPCR
      1. Diluir o ADN digerido por restrição numa proporção de 1:5 (10 μL do ADN digerido por restrição obtido a partir da etapa 7.1.1.12 em 40 μL de dH2O).
      2. Use pares de primers projetados para a região ARS316, PDC1 e DNA plasmidial spike-in.
      3. Execute o qPCR usando o programa fornecido na Tabela 2.
      4. Analisar os resultados da qPCR por quantificação relativa usando a região ARS316 e o DNA plasmidial spike-in como alvos e PDC1 (ou qualquer outro gene ou região genômica) como locus de referência.
      5. Avaliar a porcentagem de recuperação do locus ARS316 sobre PDC1 normalizando os valores de quantificação relativa dos primers ARS316 e PDC1 pela porcentagem do volume da fração tomada para cada amostra. Por exemplo, multiplique 0,1% para o flow-through por um fator de 1.000 e 0,5% para o eluato de TEV por um fator de 200.
      6. Normalize as porcentagens de recuperação ARS316 e PDC1 com os valores de quantificação relativa do DNA plasmidial spike-in.
      7. Avaliar o enriquecimento do locus ARS316 sobre a cromatina total, avaliando os valores-alvo de quantificação relativa/de referência obtidos usando a equação (1).
        Equation 1(1º)
    3. Análise de Southern blot
      1. Para 20 μL de amostra de DNA digerido por enzima de restrição, adicionar 5 μL de corante de carga de gel.
      2. Executar as amostras em gel de agarose a 1% a 110 V por ~3 h.
      3. Transfira o gel para uma bandeja e mergulhe-o em solução de depuração com agitação suave por 20 min.
      4. Enxaguar o gel com dH2O e mergulhá-lo em solução de desnaturação por 15 min com agitação. Descarte a solução de desnaturação.
      5. Mergulhe o gel em solução de desnaturação por 15 min com agitação suave.
      6. Enxaguar o gel com dH2O e lavá-lo 2x por 15 min cada vez com o tampão de transferência com agitação suave.
      7. Encha uma bandeja com 1-1,5 L de buffer de transferência e coloque-a em uma plataforma estável.
      8. Corte um pedaço longo de papel Whatman e coloque-o na plataforma de tal forma que as duas extremidades do papel fiquem embebidas no buffer de transferência.
      9. Corte uma tira de membrana de nylon positiva e quatro tiras de papel Whatman igual ao tamanho do gel.
      10. Coloque dois pedaços de papel Whatman embebidos no buffer de transferência na plataforma.
      11. Coloque o gel virado para baixo em cima dos pedaços de papel Whatman.
      12. Por cima do gel, coloque a membrana de nylon positiva, seguida dos dois pedaços restantes de papel Whatman embebidos em tampão de transferência. Certifique-se de manter a pilha molhada com o buffer de transferência.
      13. Remova quaisquer bolhas de ar presas rolando-as usando uma haste de vidro.
      14. Coloque uma pilha de toalhas de papel em cima da pilha montada, seguida de um objeto de 0,5 kg (por exemplo, uma garrafa de vidro).
      15. Deixe o conjunto para transferência durante a noite à temperatura ambiente.
      16. Após a transferência, reticule UV a membrana com uma saída de energia total de 1.200 J/cm2.
      17. Para a detecção do locus ARS316, realizar a hibridização southern blot utilizando sondas radioativas sintetizadas usando o sistema de marcação de DNA referenciado.
        NOTA: Execute todas as etapas a seguir no gelo até mencionar o contrário.
      18. Em um tubo de reação de baixa ligação, diluir 25-40 ng do fragmento de PCR (sonda) em 19 μL de dH2O e incubar a 95 °C por 5 min. Resfriar imediatamente no gelo.
      19. Adicionar 1 μL cada de 500 μM dCTP, 500 μM dGTP e 500 μM dTTP ao tubo.
      20. Adicionar 20 μL do tampão contendo hexâmeros nucleotídicos aleatórios fornecidos com o kit.
      21. Adicionar 5 μL do nucleotídeo radioativamente marcado [α-32P] dATP ao tubo. Executar todas as etapas que envolvem material marcado radioativamente sob um ambiente de proteção aprovado por radioatividade.
      22. Adicionar 1 μL de fragmento de Klenow e incubar a 37 °C num termomisturador durante 15 minutos para síntese de ADN de fita simples.
      23. Adicionar 5 μL de tampão de paragem para parar a reacção.
      24. Centrifugar uma coluna de exclusão de tamanho por 2 min a 1.500 × g para remover o buffer de armazenamento. Descarte o fluxo e coloque a coluna em um tubo novo.
      25. Passe a mistura de sonda através da coluna para remover nucleotídeos radioativos não incorporados. Centrifugar por 30 s a 1.500 × g para coletar a sonda.
      26. Adicionar 150 μL de ADN de esperma de salmão (1:100) para bloquear a ligação inespecífica da sonda à membrana.
      27. Incubar a mistura de sonda a 95 °C durante 5 min para desnaturar o ADN de fita dupla.
      28. Congele no gelo por alguns segundos e centrifugue por alguns segundos a 500 × g para derrubar as gotículas de água condensadas na tampa.
      29. Lavar brevemente a membrana do Southern blot com o tampão de hibridização por 5-10 min com rotação.
      30. Pré-hibridizar a membrana com o tampão de hibridização por 1 h a 55 °C com rotação. Descarte o buffer de hibridização.
      31. Adicionar 15 ml de tampão de hibridização fresco (pré-aquecido a 55 °C) à membrana juntamente com a sonda preparada. Incubar a membrana durante a noite a 55 °C com rotação.
      32. Realizar lavagens pós-hibridização 2x por 15 min cada com 0,3x SSC, 0,1% SDS a 55 °C com rotação.
      33. Realizar lavagens pós-hibridização 2x por 15 min cada com 0,1x SSC, 0,1% SDS a 55 °C com rotação.
      34. Realizar lavagens pós-hibridização 2x por 15 min cada com 0,1x SSC, 1,5% SDS a 55 °C com rotação.
      35. Remova a membrana do tubo de hibridização e exponha a membrana a uma tela de fosforimageador por até 3 dias para obter as impressões radioativas no filme.
      36. Adquira imagens do filme usando um sistema de varredura a laser de imagem de fósforo.
  2. Análise de proteínas
    1. Preparo da amostra
      1. Ajustar todas as amostras de proteína aos seus volumes finais (200 μL, 100 μL, 100 μL, 20 μL e 20 μL para as amostras de extrato bruto de células, entrada, fluxo, contas e eluato, respectivamente) adicionando 1 μL de β-mercaptoetanol, tampão de amostra PAGE LDS (1x) e dH2O.
      2. Desnaturar as amostras a 95 °C durante 5 min.
    2. Análise de Western blot
      NOTA: Executar SDS-PAGE e western blotting usando protocolos padrão15,16.
      1. Carregar 15 μL de cada amostra em cada poço de um gel SDS-PAGE de 1,5 mm.
      2. Realizar a imunomarcação do blot usando anticorpos PAP (1:2.000) e LexA (1:1.000) com incubação noturna a 4 °C. Diluir em solução de leite a 5% em pó/PBST.
        NOTA: Após a análise PAP, o blot pode ser removido usando um protocolo de stripping leve17 antes da imunomarcação com o segundo anticorpo LexA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

A purificação do domínio da cromatina ARS316 de ~1,4 kb foi mediada pela proteína adaptadora LexA-TAP constitutivamente expressa. Para servir como controle negativo, realizamos purificações usando uma cepa isogênica que expressa LexA-TAP, mas não contém sítios integrados de ligação de RS e LexA. A Figura 3 ilustra o resultado da análise de DNA de um experimento de purificação padrão realizado tanto no controle quanto em uma cepa competente em recombinação visando o locus ARS316. Após o isolamento do DNA e digestão da enzima de restrição para linearizar as moléculas circulares de DNA, a análise de qPCR foi realizada para avaliar a eficiência de purificação do locus alvo ARS316 sobre o locus de controle genômico não relacionado PDC1.

Além disso, o enriquecimento do locus ARS316 sobre a cromatina total foi quantificado (Figura 3A,B). A linhagem controle negativo não mostrou recuperação dos locos ARS316 ou PDC1 em nenhuma das frações, exceto para o extrato bruto de células, entrada e fluxo, sugerindo que nenhum enriquecimento específico pôde ser observado nas eluções TEV e desnaturante. Em contraste, o locus ARS316 foi quantitativamente esgotado no flow-through na cepa de recombinação e pôde ser recuperado nos cordões após a eluição do TEV e na eluição desnaturante. Após a eluição do VET, as esferas apresentaram maior porcentagem de recuperação do locus ARS316, uma vez que a eficiência de clivagem do TEV não foi de 100%. Isso resultou em uma fração de anéis de cromatina permanecendo ligados às contas. A eficiência de clivagem da protease TEV pode ser melhorada aumentando o volume de eluição acima de 100 μL. Em contraste, a eluição desnaturante mostrou 80%-90% de recuperação do locus ARS316 na cepa de recombinação (Figura 3A), correspondendo ao alto enriquecimento das moléculas ARS316 quando considerado o tamanho do genoma da levedura (Figura 3B).

Southern blot foi adicionalmente realizado para validar os resultados da qPCR. Devido à sua alta sensibilidade, pode detectar concentrações relativamente menores de DNA-alvo, permitindo assim a análise quantitativa das amostras. Os resultados obtidos na análise do Southern blot usando sonda marcada radioativamente confirmaram o enriquecimento específico do locus ARS316 nas frações coletadas da deformação de recombinação, mas não nas frações de deformação controle (Figura 3C). Na cepa de recombinação, maior enriquecimento do locus ARS316 foi observado com base na intensidade de sinal nas esferas de TEV e nas amostras de eluição de desnaturação, concordando com os resultados da qPCR. Da mesma forma, os fracos sinais observados nas amostras de esferas de eluição e desnaturação do TEV estão de acordo com o baixo enriquecimento observado do locus ARS316 nessas frações (Figura 3C).

As eficiências de clivagem e pulldown do LexA-TAP também foram avaliadas pela análise de western blot. A proteína LexA-TAP tem peso molecular de ~80 kDa (Figura 4A). Tanto na cepa de recombinação quanto na controle, a análise de western blot foi realizada usando o anticorpo PAP, que tem como alvo a porção de proteína A do LexA-TAP nas amostras de purificação. Como previsto, os resultados demonstraram depleção quase total do LexA-TAP no flow-through, com recuperação observada nas frações final do cordão e eluição (Figura 4B[i]). O anticorpo PAP também detecta o pequeno fragmento de proteína A de ~15 kDa que permanece nas esferas após a eluição do TEA. O mesmo western blot foi retirado e imunomarcado com um anticorpo contra a porção LexA do LexA-TAP (Figura 4B[ii]), mostrando resultados complementares (Figura 4B[ii]). A banda forte em ~50 kDa em ambos os blots indica a cadeia pesada de IgG acoplada às esferas magnéticas, que se hibridiza cruzadamente com os conjugados de anticorpos primários/secundários (Figura 4B[ii]).

Figure 1
Figura 1: Esquema da construção da cepa de levedura. Uma cepa de levedura modificada com LexA integrado e sítios de recombinação no cromossomo III é transformada com um plasmídeo (K238) com de expressão para a expressão constitutiva da proteína de fusão LexA-TAP usando o promotor TEF2 e o de expressão induzível por galactose para expressão de R recombinase (RecR) usando um promotor GAL10. O plasmídeo é linearizado pela digestão de restrição de SbfI, criando assim braços de recombinação homólogos para a integração do de expressão em um local intergênico no cromossomo I. As células competentes são selecionadas com base no marcador de seleção LEU2 no meio de crescimento sem leucina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Purificação do locus da cromatina ARS316 da levedura Saccharomyces cerevisiae. O locus ARS316 é extirpado na forma de anéis de cromatina de sua localização genômica em células de levedura por recombinação sítio-específica induzida por galactose. Estes anéis de cromatina são isolados do extrato bruto da célula usando a etiqueta de afinidade LexA-TAP ligada a esferas magnéticas acopladas a IgG. Anéis de cromatina podem ser liberados das esferas por dois métodos: i) clivagem mediada por protease TEV ou ii) eluição de desnaturação usando solução de amônio. A seta pontilhada representa a possibilidade de realizar a eluição da desnaturação após a eluição mediada pela protease do TEV para liberar os anéis de cromatina restantes ligados ao grânulo, uma vez que a eficiência de clivagem da protease do TEV não é de 100%. As caixas delineadas representam as amostras obtidas em diferentes etapas da purificação para análises de proteínas e DNA. Abreviação: RS = sítios de recombinação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Análise de DNA para avaliação da purificação do locus ARS316. (A) Gráfico de barras mostrando a purificação do locus ARS316 e de uma região não relacionada, PDC1, em uma série de amostras de DNA coletadas durante a purificação do locus de cromatina ARS316 da cepa de levedura de recombinação. (B) Gráfico de barras mostrando o enriquecimento do locus ARS316 sobre a cromatina total em uma série de amostras de DNA coletadas durante a purificação do locus de cromatina ARS316 de cepas de levedura controle e recombinadas. (C) Imagem de Southern blot mostrando o enriquecimento do locus ARS316 em uma série de amostras de DNA coletadas durante a purificação do locus de cromatina ARS316 de cepas de leveduras controle e recombinadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Análise proteica para avaliar a eficiência de pull-down e clivagem do LexA-TAP. (A) Desenho animado representando os diferentes domínios proteicos da proteína de fusão LexA-TAP, juntamente com o tamanho de cada domínio. (B) Imagens de Western blot mostrando imunomarcação contra (i) PAP e (ii) LexA em uma série de amostras de proteínas coletadas durante a purificação do locus de cromatina ARS316 de cepas de leveduras controle e recombinadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Diagrama de fluxo destacando as potenciais aplicações a jusante de domínios de cromatina purificados usando purificação de afinidade LexA-TAP. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Uma lista das soluções e mídias usadas neste protocolo. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 2: Programa de PCR quantitativo. Clique aqui para baixar esta tabela.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

A identificação dos fatores e da paisagem da cromatina de uma região genômica alvo específica continua a representar um grande desafio na pesquisa da cromatina18. Este protocolo descreve um sistema eficiente para especificamente excisar e purificar domínios distintos da cromatina dos cromossomos de leveduras. Até onde sabemos, a pureza e o rendimento desta purificação em etapa única superam muitas das limitações dos métodos de purificação de cromatina locus-específicos, permitindo assim a obtenção de um enriquecimento muito alto dos loci alvo em comparação com outras regiões genômicas não relacionadas.

Devido à etapa adicional de excisão usando R-recombinase sítio-específica, outra vantagem é que se pode determinar exatamente qual região genômica é purificada dependendo da localização precisa dos sítios de recombinação no genoma. Em contraste, outros métodos dependem do cisalhamento do DNA por sonicação, o que resulta em comprimentos de moléculas heterogêneos; Essa heterogeneidade torna esses métodos menos precisos em termos de purificação de um locus alvo bem definido.

Finalmente, esta estratégia de purificação utiliza condições nativas sem a inclusão de reticulantes químicos como formaldeído. Assim, o material isolado obtido por esta abordagem é passível de análises estruturais e funcionais. Uma etapa crítica no protocolo de purificação é a eficiência da eluição do TIV, que depende fortemente de vários parâmetros, incluindo a atividade da protease do VET, as condições de reação e os volumes de reação. Para o experimento mostrado, o volume de eluição foi ajustado para um mínimo, o que afetou a eficiência da eluição. No entanto, o aumento do volume e da quantidade de protease TEV poderia melhorar significativamente a eficiência de eluição. Apesar de ter baixa eficiência, a eluição do TEV produz clivagem altamente específica e recuperação dos domínios desejados da cromatina. Em comparação, a eluição de desnaturação tem uma eficiência de eluição de mais de 90%, mas pode eluir algumas moléculas de DNA ou proteína não específicas das contas. Portanto, o método de escolha depende da aplicação desejada a jusante do material isolado. Por exemplo, foi demonstrado que a eluição desnaturante permite a identificação por espectrometria de massa dos fatores de cromatina associados, enquanto a eluição nativa do TEV é preferida para ensaios funcionais a jusante, como ensaios de transcrição ou replicação in vitro . A Figura 5 resume as potenciais aplicações a jusante do protocolo de purificação descrito. Em resumo, este fluxo de trabalho melhorado e um método altamente eficiente para estudar a composição da cromatina de loci único abordam um desafio de longa data na pesquisa da cromatina.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Acknowledgments

O trabalho no laboratório de S.H. foi apoiado pela DFG através do SFB1064 (projeto ID 213249687), do Conselho Europeu de Pesquisa (ERC Starting Grant 852798 ConflictResolution) e da Helmholtz Gesellschaft.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Yeast strains
Control Strain: MATa; ura3Δ0; leu2Δ0; his3Δ1; met15Δ0; bar1::kanMX4; Chr I 212kb::LEU2 pTEF2-LEXA-TAP pGAL1-10 RecR Section 1, see references 13 and 14
Recombination Strain: MATa; ura3Δ0; leu2Δ0; his3Δ1; met15Δ0; bar1::kanMX4; RS_LEXA_NS-3_ARS316_NS+3_RS; Chr I 212kb::LEU2 pTEF2-LEXA-TAP pGAL1-10 RecR Section 1, see reference 13 and 14
Plasmid
K238 plasmid Section 1, see reference 13
Storage: Store at -20 °C
K071 Spike-in plasmid DNA Section 7.1, see reference 13
Storage: Store at -20 °C
Reagents
Acetone Carl Roth 5025.1 Section 2
Storage: Store at room temperature
Ammonium acetate (NH4Ac) Sigma Aldrich A7262 Section 6 and 7.1
Storage: Store at room temperature
Ammonium solution (NH4OH) 25% Merck Millipore 533003 Section 6
Storage: Store at room temperature
Ammonium sulfate Santa Cruz Sc-29085 Section 2
Storage: Store at room temperature
Bacto agar BD (VWR) 90000-760 Section 3
Storage: Store at room temperature
Bacto peptone BD (VWR) 211820 Section 3
Storage: Store at room temperature
β-Mercaptoethanol Sigma Aldrich 07604 Section 7.2
Storage: Store at 4 °C
Chemiluminescent substrate kit ThermoFisher 34580 Section 7.2
Storage: Store at 4 °C
Di-Sodium Hydrogen phosphate dodecahydrate Merck 1.06579.1000 Section 2 and 7.1
Storage: Store at room temperature
Dithiothreitol (DTT) ThermoFisher 15508013 Section 4
Storage: Store at 4 °C
Ethanol Merck 100983 Section 7.1
Storage: Store at room temperature
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma Aldrich ED Section 7.1
Storage: Store at room temperature
Galactose (20% (w/v) stock) Sigma Aldrich G0625-1KG  /  5KG Section 3
Storage: Store at room temperature
Gel loading dye (6x) BioLabs B7024A Section 7.1
Storage: Store at -20 °C
Glusose Sigma-Aldrich G8270 Section
Storage: Store at room temperature
Glycine Carl Roth .0079.4 Section 2
Storage: Store at room temperature
Glycogen (5 mg/mL) Invitrogen AM9510 Section 7.1
Storage: Store at -20 °C
Hydrochloric acid (HCl) PanReac AppliChem 182109.1211 Section 2, 4 and 7.1
Storage: Store at room temperature
Magnesium Acetate (MgAc) Bernd Kraft 15274.2600/C035 Section 4
Storage: Store at room temperature
Magnesium chloride (MgCl2) Sigma Aldrich M8266 Section 6
Storage: Store at room temperature
Nu PAGE LDS sample buffer (4x) Invitrogen 2399549 Section 7.2
Storage: Store at room temperature
Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1 v/v) Invitrogen 15593-031 Section 7.1
Storage: Store at 4 °C
Potassium chloride (KCl) Sigma P9541 Section 4
Storage: Store at room temperature
Radioactively labeled α-32P dATP (3,000 Ci/mmol, 10 mCi/mL) Hartmann Analytic SRP-203 Section 7.1
Storage: Store at 4 °C
RadPrime labeling system ThermoFisher 18428-011 Section 7.1
Storage: Store at -20 °C
Raffinose (20% (w/v) stock) SERVA 34140.03 Section 3
Storage: Store at room temperature
Sodium chloride (NaCl) Merck K53710504142 Section 7.1
Storage: Store at room temperature
Sodium citrate (Na3C6H5O7) Sigma-Aldrich 71402 Section 7.1
Storage: Store at room temperature
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma Aldrich S5881 Section 7.1
Storage: Store at room temperature
Sodium n-dodecyl sulfate (SDS) (5% stock (w/v) ) Alfa Aesar A11183 Section 7.1
Storage: Store at room temperature
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich 71496 Section 2 and 7.1
Storage: Store at room temperature
Sodium azide Santa Cruz Biotechnology sc-208393 Section 2
Storage: Store at -20 °C
 Triethylamine Sigma Aldrich 90340 Section 2
Storage: Store at room temperature
Tris base Chem Cruz SC-3715B Section 2 and 4
Storage: Store at room temperature
Triton X-100 Sigma Aldrich X100 Section 2 and 4
Storage: Store at room temperature
Tween-20 Bernd Kraft 18014332 Section 4
Storage: Store at room temperature
Yeast extract BD (VWR) 212720 Section 3
Storage: Store at room temperature
Yeast mating factor alpha (1 µg/mL stock )  Biomol Y2016.5 Section 3
Storage: Store at -20 °C
Yeast Synthetic Drop-out medium Supplements without LEUCINE Sigma Aldrich Y1376 Section 1, see reference 14
Enzymes
HpaI restriction enzyme (5,000 U/mL) NEB R0105S Section 7.1
Storage: Store at -20 °C
Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100x) ThermoFisher Scientific 78446 Section 4
Storage: Store at4 °C
Proteinase K (10 mg/mL) SERVA 33756 Section 7.1
Storage: Store at -20 °C
RNase A (10 mg/mL)  ThermoFisher EN0531 Section 7.1
Storage: Store at -20 °C
TEV protease (10000 U/µL) NEB P8112S Section 5
Storage: Store at -20 °C
Materials
BcMag Epoxy-Activated Magnetic Beads Bioclone Inc. FC-102 Section 2
Storage: Store at 4 °C
Dry ice Section 4
Low-binding centrifuge tubes 2.0 mL Eppendorf 22431102 Section 4
Microspin G-25 Columns Cytiva 27-5325-01 Section 7.1
Storage: Store at room temperature
Parafilm Merck P7793 Section 4
Positive nylon membrane Biozol 11MEMP0001 Section 7.1
Storage: Store at room temperature
PVDF transfer membrane Immobilon-Merck Millipore IPVH00010 Section 7.2
Storage: Store at room temperature
SDS-PAGE gel 4-12% bis-tris (15 well, 1.5 mm) Invitrogen  NP0336BOX Section 7.2
Storage: Store at 4 °C
Syringe (25 mL) with luer fitting Henke Sass Wolf 4200-000V0 Section 3
Whatman paper (Grade 3MM CHR Cellulose Western Blotting Paper Sheet) Cytiva 3030-917 Section 7.1
Storage: Store at room temperature
Antibodies
Anti-LexA, rabbit polyclonal IgG, DNA binding region antibody Merck Millipore 06-719 Section 7.2
Storage: Store at -20 °C
Goat Anti-Rabbit IgG (H+L), Horseradish peroxidase conjugate Invitrogen G21234 Section 7.2
Storage: Store at -20 °C
Peroxidase Anti-Peroxidase (PAP) antibody produced in rabbit for the detection of TAP-tagged proteins Sigma Aldrich P1291-500UL Section 7.2
Storage: Store at -20 °C
Rabbit IgG antibodies Sigma I5006-100MG Section 2
Storage: Store at 4 °C
Primers (10 µM)
ARS316: fwd 5'- CGGCATTATCGTACACAACCT, rev 5'- GTTCTTCGTTGCCTACATTTTCT Section 7.1
K071 Spike-in plasmid DNA: fwd: 5'-TTTTCGCTGCTTGTCCTTTT, rev 5'- CATTTTCGTCCTCCCAACAT Section 7.1
PCR fragment from yeast genomic DNA as a template  for ARS316 amplification (for southern blot): fwd 5’- AAATTCTGCCCTTGATTCGT                                                  rev 5’- TTTGTTTATCTCATCACTAAT Section 7.1
PDC1: fwd 5'- CATGATCAGATGGGGCTTCA, rev 5'-ACCGGTGGTAGCGACTCTGT Section 7.1
Equipment
Coffee grinder Gastroback 42601 Section 4
Dewar flask NAL GENE 4150-2000 Section 3
DynaMag TM-2 magnetic rack Invitrogen 12321D Section 4, 5 and 6
Hybridization oven Hybaid Mini10 Ri418 Section 2
Microcentrifuge Eppendorf 5424R Section 4 and 7.1
UV-crosslinker Analytikjena 95-0174-02 Section 7.1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kornberg, R. D., Lorch, Y. Twenty-five years of the nucleosome, fundamental particle of the eukaryote chromosome. Cell. 98 (3), 285-294 (1999).
  2. Gauchier, M., van Mierlo, G., Vermeulen, M., Déjardin, J. Purification and enrichment of specific chromatin loci. Nature Methods. 17 (4), 380-389 (2020).
  3. Korthout, T., et al. Decoding the chromatin proteome of a single genomic locus by DNA sequencing. PLoS Biology. 16 (7), e2005542 (2018).
  4. Antão, J. M., Mason, J. M., Déjardin, J., Kingston, R. E. Protein landscape at Drosophila melanogaster telomere-associated sequence repeats. Molecular and Cellular Biology. 32 (12), 2170-2182 (2012).
  5. Déjardin, J., Kingston, R. E. Purification of proteins associated with specific genomic loci. Cell. 136 (1), 175-186 (2009).
  6. Ide, S., Dejardin, J. End-targeting proteomics of isolated chromatin segments of a mammalian ribosomal RNA gene promoter. Nature Communications. 6, 6674 (2015).
  7. Unnikrishnan, A., Gafken, P. R., Tsukiyama, T. Dynamic changes in histone acetylation regulate origins of DNA replication. Nature Structural & Molecular Biology. 17 (4), 430 (2010).
  8. Buxton, K. E., et al. Elucidating protein-DNA interactions in human alphoid chromatin via hybridization capture and mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 16 (9), 3433-3442 (2017).
  9. Kennedy-Darling, J., et al. Discovery of chromatin-associated proteins via sequence-specific capture and mass spectrometric protein identification in Saccharomyces cerevisiae. Journal of Proteome Research. 13 (8), 3810-3825 (2014).
  10. Liu, S. J., et al. CRISPRi-based genome-scale identification of functional long noncoding RNA loci in human cells. Science. 355, 7111 (2017).
  11. Hamperl, S., et al. Purification of specific chromatin domains from single-copy gene loci in Saccharomyces cerevisiae. Functional Analysis of DNA and Chromatin. 1094, 329-341 (2014).
  12. Hamperl, S., et al. Compositional and structural analysis of selected chromosomal domains from Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 42 (1), 2 (2014).
  13. Weiβ, M. Single-copy locus proteomics of early- and late-firing DNA replication origins identifies a role of Ask1/DASH complex in replication timing control. Cell Reports. 42 (2), 112045 (2023).
  14. Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nature Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).
  15. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  16. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  17. Western blot membrane stripping for restaining protocol. Abcam. , Available from: https://www.abcam.com/protocols/western-blot-membrane-stripping-for-restaining-protocol (2023).
  18. Vermeulen, M., Déjardin, J. Locus-specific chromatin isolation. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 21 (5), 249-250 (2020).

Tags

Este mês em JoVE Edição 201 Cromatina nativa purificação de afinidade de etapa única recombinação sítio-específica modificações de histonas proteômica locus-específica bioquímica da cromatina
Purificação de cromatina de locus gênico de cópia única em <em>Saccharomyces cerevisiae</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sajid, A., Hamperl, S. Single-Copy… More

Sajid, A., Hamperl, S. Single-Copy Gene Locus Chromatin Purification in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (201), e65460, doi:10.3791/65460 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter