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Biochemistry

Purificación de cromatina del locus del gen de copia única en Saccharomyces cerevisiae

Published: November 17, 2023 doi: 10.3791/65460
Automatic Translation
1, 1
1Institute of Epigenetics and Stem Cells, Helmholtz Zentrum München

Summary

Este protocolo presenta un método de aislamiento de cromatina específico de locus basado en la recombinación específica del sitio para purificar un locus de gen de una sola copia de interés en su contexto de cromatina nativa a partir de la levadura en ciernes, Saccharomyces cerevisiae.

Abstract

La unidad organizativa básica de la cromatina eucariota es la partícula del núcleo del nucleosoma (NCP), que comprende el ADN envuelto ~ 1,7 veces alrededor de un octámero de histonas. La cromatina se define como la entidad de los NCP y muchos otros complejos proteicos, incluidos los factores de transcripción, la remodelación de la cromatina y las enzimas modificadoras. Todavía no está claro cómo se orquestan estas interacciones proteína-ADN a nivel de loci genómicos específicos durante las diferentes etapas del ciclo celular. Esto se debe principalmente a las limitaciones técnicas actuales, que dificultan la obtención de mediciones precisas de dichas interacciones dinámicas. Aquí, describimos un método mejorado que combina la recombinación específica del sitio con un protocolo eficiente de purificación de afinidad de un solo paso para aislar un locus de interés de un gen de copia única en su estado nativo de cromatina. El método permite el enriquecimiento robusto del locus diana sobre la cromatina genómica, lo que convierte a esta técnica en una estrategia eficaz para identificar y cuantificar las interacciones de proteínas de forma imparcial y sistemática, por ejemplo, mediante espectrometría de masas. Además de estos análisis de composición, la cromatina nativa purificada por este método probablemente refleje la situación in vivo con respecto al posicionamiento de los nucleosomas y las modificaciones de las histonas y, por lo tanto, es susceptible de análisis estructurales y bioquímicos adicionales de la cromatina derivada de prácticamente cualquier locus genómico en la levadura.

Introduction

La organización dinámica de los genomas eucariotas en cromatina compacta el ADN para que quepa dentro de los confines del núcleo, al tiempo que garantiza una dinámica suficiente para la expresión génica y la accesibilidad para los factores reguladores. En parte, esta versatilidad está mediada por el nucleosoma, la unidad básica de la cromatina, que comprende una partícula central con 147 pb de ADN envuelto ~ 1,7 veces alrededor del octámerode histonas 1. El nucleosoma es una estructura altamente dinámica con respecto a su composición, con numerosas variantes de histonas y modificaciones postraduccionales (PTM) en las colas de histonas N- y C-terminales. Además, la cromatina eucariota interactúa con una multitud de otros componentes esenciales, como factores de transcripción, maquinaria de procesamiento de ADN y ARN, proteínas arquitectónicas, enzimas involucradas en la remodelación y modificación de la cromatina y moléculas de ARN asociadas con la cromatina. Estas maquinarias cruciales involucradas en la transcripción, replicación y reparación requieren acceso a la cromatina, que sirve como sustrato natural para estos procesos. En consecuencia, la comprensión de los mecanismos moleculares que subyacen a estas transacciones de ADN requiere una definición precisa de las alteraciones colectivas en la estructura de la cromatina en las regiones genómicas específicas donde estas maquinarias convergen y facilitan las reacciones biológicas.

A pesar de la identificación de numerosos factores de cromatina a través de estudios genéticos y de interacción proteína-proteína, la realización de análisis directos, imparciales y exhaustivos de las interacciones de la cromatina en sitios genómicos particulares ha seguido siendo un obstáculo importante 2,3. Inicialmente, solo se pudieron aislar regiones muy abundantes del genoma (es decir, loci repetitivos) o plásmidos de copia múltiple en cantidades y pureza suficientes para la identificación por espectrometría de masas de las proteínas asociadas 4,5,6,7. Una serie de nuevos enfoques basados en la hibridación directa de sondas de captura con ADN cromatinizado, la biotinilación de proximidad mediante el sistema CRISPR-dCas9 o la unión de proteínas adaptadoras específicas de secuencia al locus de interés han comenzado a desentrañar el proteoma de loci de copia única de genomas de levaduras y mamíferos 8,9,10. Sin embargo, todos estos métodos requieren reticulación de formaldehído para estabilizar las interacciones proteína-ADN y sonicación para solubilizar la cromatina para su posterior purificación. Juntas, ambas manipulaciones excluyen la posibilidad de estudios estructurales y funcionales posteriores de la cromatina purificada.

Para superar estas limitaciones, previamente ideamos una metodología que emplea la recombinación específica del sitio para extraer dominios cromosómicos específicos de la levadura11,12. En esencia, la región genómica de interés está rodeada por sitios de reconocimiento (RS) para la R-recombinasa específica del sitio de Zygosaccharomyces rouxi, mientras que simultáneamente incorpora un grupo de tres sitios de unión al ADN para la proteína LexA represora transcripcional procariota (LexA) dentro de la misma región. Las células de levadura contienen un casete de expresión para la expresión simultánea de R-recombinasa y una proteína LexA fusionada a una etiqueta de purificación de afinidad en tándem (TAP). Después de la inducción de la R-recombinasa, la enzima extirpa eficientemente la región objetivo del cromosoma en forma de un dominio circular de cromatina. Este dominio se puede purificar a través de la proteína adaptadora LexA-TAP, que se une a los sitios de unión del ADN LexA, así como a un soporte de afinidad. Este método se ha utilizado recientemente para aislar distintos dominios de cromatina que contienen orígenes de replicación seleccionados del cromosoma III13 de levadura.

Una de las principales ventajas de este enfoque ex vivo es que permite realizar análisis funcionales del material aislado. Por ejemplo, los dominios de origen de replicación purificados con este método pueden someterse a ensayos de replicación in vitro para evaluar la eficiencia de la cocción de origen en un tubo de ensayo a partir de plantillas de cromatina ensambladas in vivo nativas. En última instancia, la caracterización bioquímica y funcional del material aislado puede permitir la reconstitución de procesos nucleares utilizando proteínas purificadas junto con la plantilla de cromatina nativa. En resumen, esta metodología abre una vía emocionante en la investigación de la cromatina, ya que será posible seguir los cambios colectivos en la composición y la estructura de la cromatina de una región genómica específica que sufre una determinada transacción cromosómica.

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Protocol

Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles relacionados con todos los materiales e instrumentos utilizados en este protocolo. Consulte la Tabla 1 para obtener una lista de las soluciones, los búferes y los medios utilizados.

1. Construcción de cepas de levadura recombinante

  1. Para construir una cepa de levadura competente para la recombinación, transforme el plásmido K238 digerido por SbfI en una cepa de levadura con sitios de unión a LexA integrados y sitios de recombinación RS en el locus de interés13,14.
    NOTA: El fragmento de restricción de SbfI transformado contiene el casete de expresión requerido para la expresión constitutiva de la proteína de fusión LexA-TAP y la R-recombinasa junto con secuencias homólogas del cromosoma I de levadura para la integración genómica del casete de expresión por recombinación homóloga (Figura 1).
  2. Para construir una cepa de control, se toma una cepa de levadura isogénica que carece de sitios integrados de unión a RS y LexA, y se transforma con plásmido K238 digerido por SbfI en las mismas condiciones que se utilizan para la cepa competente para la recombinación.
  3. Seleccione las células de levadura competentes basándose en el marcador de selección de LEU2 en placas de agar SCD-LEU14.

2. Acoplamiento de anticuerpos IgG a perlas magnéticas activadas por epoxi

NOTA: Acoplar anticuerpos IgG contra perlas magnéticas activadas por epoxi de acuerdo con el siguiente protocolo publicado11.

  1. Suspender 300 mg de perlas activadas con epoxi en 10 ml de acetona al 50% (300 mg corresponden a ~5,1 ×10 perlas) en un tubo cónico de 50 ml. Agite vigorosamente en una batidora de vórtice.
  2. Centrifugar el tubo que contiene las perlas a 820 × g y 4 °C durante 2 min. Retire el sobrenadante.
  3. Lavar las perlas 3 veces con 20 ml de tampón de fosfato de sodio 0,1 M (pH 7,4). Retire el sobrenadante después de cada paso de lavado por centrifugación como se describe en el paso 2.2.
  4. Suspender las perlas en 16 mL de tampón fosfato sódico 0,1 M (pH 7,4) y girar suavemente en un horno de hibridación durante 5 min a temperatura ambiente.
  5. Disolver las IgG de conejo (100 mg) en 7 mL dedH2O (concentración final: 14 mg/mL).
  6. Centrifugar la suspensión de IgG a 13.000 × g y 4 °C durante 10 min para aclarar la suspensión.
  7. Transferir 3,5 mL del sobrenadante (correspondiente a 50 mg de IgG de conejo) a un nuevo tubo cónico de 50 mL.
  8. Diluir la solución de IgG con 9,85 mL de tampón fosfato de sodio 0,1 M (pH 7,4), seguido de la adición gota a gota de 6,65 mL de sulfato de amonio 3 M en fosfato sódico 0,1 M (pH 7,4) bajo una mezcla suave.
    NOTA: Evite agregar sulfato de amonio rápidamente a la solución, ya que una alta concentración local de la sal provocará la precipitación de las IgG de conejo.
  9. Centrifugar la solución de IgG a 820 × g y 4 °C durante 3 min, y añadir el sobrenadante resultante a la suspensión de perlas magnéticas.
  10. Incubar el tubo durante la noche o al menos durante 18 h a 30 °C con una rotación suave en un horno de hibridación.
  11. Retire el sobrenadante como se describe en el paso 2.2.
  12. Lavar las perlas con 20 mL de 100 mM de glicina-HCl (pH 2,5). Retire la solución rápidamente como se describe en el paso 2.2 para evitar la desnaturalización de los polipéptidos IgG.
  13. Lavar las perlas una vez con 20 mL de Tris-HCl 10 mM (pH 8,8). Aspire el sobrenadante como se describe en el paso 2.2.
  14. Añadir 20 ml de solución de trietilamina 0,1M durante 5-10 min bajo una rotación suave para inactivar los grupos epoxi reactivos residuales. Retire el sobrenadante como se describe en el paso 2.2.
  15. Lave las perlas 4 veces con 20 ml de PBS (pH 7,4) durante 5 minutos con una rotación suave. Retire el sobrenadante como se describe en el paso 2.2 después de cada paso de lavado.
  16. Lave las perlas 2 veces con 20 ml de PBS (pH 7,4) con Triton X-100 al 0,5% (p/v) durante 5 minutos y 15 minutos cada una con una rotación suave en un horno de hibridación. Retire el sobrenadante como se describe en el paso 2.2.
  17. Suspender las perlas en un volumen final de 16 mL de PBS (pH 7,4) con azida sódica al 0,02% (p/v). Conservar en forma de alícuotas de 1 ml a 4 °C hasta su uso.

3. Cultivo y recolección de células de levadura

  1. Inocular cepas de levadura competentes para el control y la recombinación de placas YPD en 5 mL de medio YPR e incubar durante la noche a 30 °C y 200 rpm.
  2. Inocular 2 mL de este cultivo en 100 mL de medio YPR e incubar durante la noche a 30 °C y 200 rpm.
  3. Para cada cepa, dispensar 1.800 ml de medio YP esterilizado en autoclave y 200 ml de solución de rafinosa esterilizada en autoclave (20% p/v) en cada uno de los dos matraces Erlenmeyer de 5 L (4 L de medio de cultivo en total para cada cepa, divididos en dos frascos).
  4. Inocular las células de levadura en crecimiento a DO600 0,2 en su medio respectivo e incubar como se describe en el paso 3.1 durante aproximadamente 6 h o hasta que las células alcancen el DOdeseado 600 de 1,0. Para garantizar un crecimiento normal de las células, libres de cualquier contaminación, compruebe el OD a intervalos de 2 h.
  5. Añadir 200 mL de galactosa (20% p/v) para inducir la recombinación específica del sitio.
  6. Añadir 110 μL (50 ng/mL) de YMFA (al mismo tiempo que la galactosa, paso 3.5) para detener las células en la fase G1, e incubar durante 2 h.
    NOTA: La adición de YMFA a las células depende de las condiciones experimentales y de la cuestión biológica que se vaya a abordar. Precisamente, para este experimento, las células se detienen en fase G1 para obtener una población celular homogénea con orígenes de replicación autorizados; en este proceso, el complejo pre-replicativo se une a los orígenes en la fase G1 antes del inicio de la replicación del ADN en la fase S.
  7. Transfiera la suspensión celular a cubos de centrífuga de 1 L y centrifugue a 6.000 × g y 4 °C durante 10 min. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender los gránulos celulares en un volumen total de 10-15 mL de dH2O.
  8. Selle una jeringa de 25 ml con un tapón Luer y colóquela dentro de un tubo cónico de 50 ml lleno de agua. Transfiera la suspensión de la celda al conjunto de la jeringa y centrifugue a 2.397 × g durante 10 minutos a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante.
  9. Retire el tapón Luer de la jeringa y extruya las células en nitrógeno líquido para formar "espaguetis" celulares.
    NOTA: El uso de 4 L de medio de cultivo proporciona un peso húmedo de los gránulos de celda final de 7-10 g.
  10. Transfiera los espaguetis celulares congelados a un tubo cónico de 50 ml y guárdelos a -80 °C hasta su nuevo uso.

4. Purificación del locus de la cromatina

NOTA: Consulte la Figura 2 para obtener una descripción general esquemática de los pasos involucrados en este protocolo de purificación de cromatina específico del locus.

  1. Enfríe un molinillo de café comercial moliendo 30-50 g de hielo seco agitando vigorosamente el molinillo de café 2 veces durante 30 s cada vez. Una vez enfriado, deseche el polvo de hielo seco.
  2. Mezcle 3 g de espaguetis congelados con células de levadura con ~ 30-50 g de hielo seco en el molinillo de café preenfriado.
  3. Selle la unión entre la tapa y el molinillo con parafilm para evitar la pérdida de polvo de células de levadura durante la molienda.
  4. Moler la mezcla de hielo seco y celda de levadura 10 veces durante 30 s cada vez, con intervalos de 30 s entre cada ronda (tiempo total estimado: ~10 min). Para evitar que el hielo seco y el polvo celular se adhieran a las paredes del molinillo de café, golpee los lados del molinillo de café continuamente durante la molienda.
  5. Transfiera el polvo de hielo seco de células de levadura resultante a un vaso de plástico con una espátula limpia y seca.
  6. Mantenga los vasos de precipitados a temperatura ambiente para evaporar el hielo seco.
  7. Una vez que el hielo seco se evapore, agregue 2,25 ml de tampón MB con 1x inhibidores de proteasa y fosfatasa (750 μL/g de células de levadura) al polvo de células de levadura.
  8. Pipetear vigorosamente la mezcla de células y tampones para asegurar la suspensión completa de las células con el tampón y transferirla a un tubo cónico de 15 ml.
  9. Tomar muestras para análisis de ADN (0,1%) y proteínas (0,05%) de la suspensión celular resultante (extractos celulares crudos [CCE]). Conservar a -20 °C hasta su posterior procesamiento (descrito en la sección 7).
  10. Transfiera la suspensión celular a tubos de reacción de 2 ml de baja unión y centrifugue a 21,130 × g durante 30 min a 4 °C para separar los restos celulares del lisado celular crudo.
  11. Agrupe los sobrenadantes de todos los tubos en un tubo cónico de 15 ml.
  12. Tomar muestras del sobrenadante (entrada [IN]) para análisis de ADN (0,1%) y proteínas (0,05%). Conservar a -20 °C hasta su posterior procesamiento (descrito en la sección 7).
  13. Equilibre 500 μL de lodo magnético de perlas acoplado a IgG (para cada cepa de levadura) lavando 2 veces con 500 μL de tampón MB frío con 1 inhibidor de proteasa y fosfatasa durante 5 min cada uno a 4 °C en rotación a 20 rpm. Deseche el sobrenadante de las perlas con una rejilla magnética después de cada paso de lavado.
  14. Incubar las perlas magnéticas acopladas a IgG en 500 μL de tampón MB frío con inhibidores de proteasa y fosfatasa 1x durante 1 h a 4 °C en rotación a 20 rpm. Deseche el sobrenadante de las cuentas con una rejilla magnética.
  15. Mezclar la suspensión de perlas magnéticas equilibradas con el lisado celular e incubar con rotación a 20 rpm durante 2 h a 4 °C.
  16. Transfiera la suspensión completa de lisado de células de perlas magnéticas a tubos de reacción de baja unión.
  17. Separe las perlas magnéticas, que ahora llevan los anillos de cromatina de interés, del lisado celular utilizando una rejilla magnética.
  18. Transfiera el flujo de paso restante (FT) de cada tubo a un tubo cónico nuevo de 15 ml y tome muestras para el análisis de ADN (0,1 %) y proteínas (0,05 %). Conservar a -20 °C hasta su posterior procesamiento (descrito en la sección 7).
  19. Suspenda las perlas magnéticas de cada tubo en 300 μL de tampón MB frío y agrupe las perlas en un tubo de reacción. Lavar 5 veces durante 10 minutos cada una con 750 μL de tampón MB frío con 1x inhibidores de la proteasa y la fosfatasa a 4 °C en rotación a 20 rpm. Realizar el lavado final con 750 μL de tampón MB frío sin inhibidores de proteasa y fosfatasa.
  20. Suspender las perlas en 40 μL de tampón MB frío sin inhibidores de la proteasa y la fosfatasa.
    NOTA: El volumen final del eluido se puede ajustar de acuerdo con su aplicación posterior anticipada. La elución de TEV generalmente funciona de manera eficiente dentro del rango de 100-300 μL.

5. Elución mediada por proteasa TEV

  1. Para liberar los complejos de anillos de cromatina LexA-CBP de las perlas, incube las perlas con 2 μL de proteasa TEV recombinante marcada con 6x His durante la noche a 4 °C y 450 rpm en un termomezclador.
  2. Separe las perlas del eluido final con una rejilla magnética. Transfiera el eluido, que contiene anillos de cromatina escindidos, a un nuevo tubo de reacción de 1,5 ml.
  3. Mantenga los tubos en una rejilla magnética nuevamente para separar las perlas residuales del eluido final.
  4. Resuspender las perlas (TB) en 750 μL de tampón AC frío y tomar muestras para análisis de ADN (0,1%) y proteínas (0,05%). Conservar a -20 °C hasta su posterior procesamiento (descrito en la sección 7).
  5. A partir del eluido final (TE), tomar muestras para análisis de ADN (0,5%) y proteínas (0,25%). Conservar a -20 °C hasta su posterior procesamiento (descrito en la sección 7).
    NOTA: Debido al bajo volumen del eluido final, se incrementa el porcentaje de las muestras recogidas para el análisis de ADN y proteínas para obtener una mejor representación de su contenido en proteínas y ADN durante el análisis.

6. Elución por desnaturalización

  1. Lave las perlas 2 veces en 750 μL de tampón de CA frío durante 20 minutos cada vez a 4 °C en rotación a 20 rpm.
  2. Para extraer los complejos de cromatina LexA unidos restantes, se lleva a cabo la elución por desnaturalización añadiendo 500 μL de 0,5M de NH4OH a las perlas y se incuba durante 30 min a temperatura ambiente.
  3. Separe las perlas de la suspensión con una rejilla magnética y transfiera el eluido a un tubo de reacción de baja unión.
  4. Vuelva a incubar las perlas como en el paso 6.2 para recuperar los loci máximos de cromatina en el eluido.
  5. Separe las perlas de la suspensión con una rejilla magnética y agrupe el eluido resultante en el mismo tubo que contiene el eluido del paso 6.3.
  6. Resuspender las perlas (DB) en 750 μL dedH2O, y tomar muestras para análisis de ADN (0,1%) y proteínas (0,05%).
  7. A partir del eluido final (DE), tomar muestras para análisis de ADN (0,5%) y proteínas (0,25%).

7. Análisis de ADN y proteínas

  1. Análisis de ADN
    1. Preparación de la muestra
      1. A las muestras de ADN, añadir 100 μL de tampón IRN y aumentar el volumen condH2O hasta un volumen final de 200 μL.
      2. Agregue 1 ng de ADN plasmídico con pico K071.
      3. Añadir 1 μL de ARNasa A (10 mg/mL) e incubar a 37 °C durante 1 h.
      4. Añadir 5 μL de proteinasa K (10 mg/mL) y 10 μL de SDS (20%), e incubar durante 1 h a 56 °C.
      5. Añadir 200 μL de fenol/cloroformo/alcohol isopropílico (25:24:1) y vórtice a fondo 2 veces durante 10 s cada vez.
      6. Centrifugar las muestras a 21.130 × g durante 7 min para separar las fases orgánica y acuosa.
      7. Transfiera el sobrenadante a nuevos tubos de 1,5 ml que contengan 1,5 μl de glucógeno (5 mg/ml) y 2,5 veces etanol al 100 %.
      8. Incubar los tubos a -20 °C durante un mínimo de 2 h y un máximo de toda la noche para precipitar el ADN.
      9. Centrifugar a 21.130 × g, 4 °C durante 45 min. Deseche el sobrenadante.
      10. Añadir 150 μL de etanol al 70% sin resuspender el gránulo de ADN, y centrifugar de nuevo a 21.130 × g a 4 °C durante 10 min.
      11. Secar los gránulos de ADN a temperatura ambiente durante 10-15 min, y volver a suspender en 40 μL dedH2O.
      12. Realice la digestión de la enzima de restricción para linealizar el ADN aislado en el paso 7.1.1.11 con endonucleasa de restricción de HpaI. Para una mezcla de reacción de 50 μL, incubar 40 μL de ADN aislado + 2 μL de enzima HpaI + 5 μL de tampón enzimático de restricción + 3 μL de dH2O durante la noche a 37 °C.
    2. Análisis de qPCR
      1. Diluir el ADN digerido por restricción en una proporción de 1:5 (10 μL del ADN digerido por restricción obtenido del paso 7.1.1.12 en 40 μL dedH2O).
      2. Utilice pares de cebadores diseñados para la región ARS316, PDC1 y ADN plasmídico de pico.
      3. Ejecute qPCR utilizando el programa que se indica en la Tabla 2.
      4. Analice los resultados de la qPCR mediante cuantificación relativa utilizando la región ARS316 y el ADN plasmídico de espiga como dianas y PDC1 (o cualquier otro gen o región genómica) como locus de referencia.
      5. Evalúe el porcentaje de recuperación del locus ARS316 sobre PDC1 normalizando los valores relativos de cuantificación de los cebadores ARS316 y PDC1 por el porcentaje del volumen de fracción tomado para cada muestra. Por ejemplo, multiplique el 0,1% para el flujo continuo por un factor de 1.000 y el 0,5% para el eluido TEV por un factor de 200.
      6. Normalice los porcentajes de recuperación de ARS316 y PDC1 con los valores de cuantificación relativa del ADN plasmídico de pico.
      7. Evaluar el enriquecimiento del locus ARS316 sobre la cromatina total mediante la evaluación de los valores nominales/referencia de cuantificación relativos obtenidos utilizando la ecuación (1).
        Equation 1(1)
    3. Análisis de Southern blot
      1. A 20 μL de muestra de ADN digerido por enzima de restricción, agregue 5 μL de colorante de carga de gel.
      2. Pasar las muestras en un gel de agarosa al 1% a 110 V durante ~3 h.
      3. Transfiera el gel a una bandeja y sumérjalo en una solución de desurinación agitando suavemente durante 20 minutos.
      4. Enjuague el gel con dH2O y sumérjalo en una solución de desnaturalización durante 15 minutos agitando. Deseche la solución de desnaturalización.
      5. Remojar el gel en una solución de desnaturalización durante 15 minutos agitando suavemente.
      6. Enjuague el gel con dH2O y lávelo 2 veces durante 15 minutos cada vez con el tampón de transferencia agitando suavemente.
      7. Llene una bandeja con 1-1,5 L de tampón de transferencia y colóquela sobre una plataforma estable.
      8. Corta un trozo largo de papel Whatman y colócalo en la plataforma de tal manera que los dos extremos del papel queden empapados en el búfer de transferencia.
      9. Corta una tira de membrana de nailon positivo y cuatro tiras de papel Whatman iguales al tamaño del gel.
      10. Coloque dos trozos de papel Whatman empapados en el búfer de transferencia en la plataforma.
      11. Coloca el gel boca abajo sobre los pedazos de papel Whatman.
      12. Encima del gel, coloque la membrana de nailon positivo, seguida de los dos trozos restantes de papel Whatman empapados en tampón de transferencia. Asegúrese de mantener la pila húmeda con el tampón de transferencia.
      13. Elimine las burbujas de aire atrapadas rodándolas con una varilla de vidrio.
      14. Coloque una pila de toallas de papel encima de la pila ensamblada, seguida de un objeto de 0,5 kg (por ejemplo, una botella de vidrio).
      15. Deje el conjunto para transferirlo durante la noche a temperatura ambiente.
      16. Después de la transferencia, reticulación UV de la membrana con una producción de energía total de 1.200 J/cm2.
      17. Para la detección del locus ARS316, realice la hibridación de Southern blot utilizando sondas radiactivas sintetizadas utilizando el sistema de marcaje de ADN referenciado.
        NOTA: Realice todos los pasos siguientes en hielo hasta que se indique lo contrario.
      18. En un tubo de reacción de baja unión, diluir 25-40 ng de fragmento de PCR (sonda) en 19 μL dedH2O, e incubar a 95 °C durante 5 min. Deje enfriar inmediatamente sobre hielo.
      19. Agregue 1 μL de 500 μM de dCTP, 500 μM de dGTP y 500 μM de dTTP al tubo.
      20. Añadir 20 μL del tampón que contiene hexámeros de nucleótidos aleatorios suministrado con el kit.
      21. Agregue 5 μL del nucleótido marcado radiactivamente [α-32P] dATP al tubo. Realice todos los pasos que involucren material marcado radiactivamente en un entorno protector aprobado por radiactividad.
      22. Añadir 1 μL de fragmento de Klenow e incubar a 37 °C en un termomezclador durante 15 min para la síntesis de ADN monocatenario.
      23. Añadir 5 μL de tampón de parada para detener la reacción.
      24. Centrifugar una columna de exclusión de tamaño durante 2 minutos a 1.500 × g para eliminar el búfer de almacenamiento. Deseche el flujo y coloque la columna en un tubo nuevo.
      25. Pase la mezcla de la sonda a través de la columna para eliminar los nucleótidos radiactivos no incorporados. Centrifugar durante 30 s a 1.500 × g para recoger la sonda.
      26. Añadir 150 μL de ADN de esperma de salmón (1:100) para bloquear la unión inespecífica de la sonda a la membrana.
      27. Incubar la mezcla de la sonda a 95 °C durante 5 min para desnaturalizar el ADN bicatenario.
      28. Congelar en hielo durante unos segundos y centrifugar durante unos segundos a 500 × g para reducir las gotas de agua condensadas en la tapa.
      29. Lave brevemente la membrana de Southern blot con el tampón de hibridación durante 5-10 min con rotación.
      30. Prehibridar la membrana con el tampón de hibridación durante 1 h a 55 °C con rotación. Deseche el tampón de hibridación.
      31. Añadir 15 ml de tampón de hibridación fresco (precalentado a 55 °C) a la membrana junto con la sonda preparada. Incubar la membrana durante la noche a 55 °C con rotación.
      32. Realice lavados posteriores a la hibridación 2 veces durante 15 minutos cada uno con 0,3x SSC, 0,1% SDS a 55 °C con rotación.
      33. Realice lavados posteriores a la hibridación 2 veces durante 15 minutos cada uno con 0,1x SSC, 0,1% SDS a 55 °C con rotación.
      34. Realice lavados posteriores a la hibridación 2 veces durante 15 minutos cada uno con 0,1x SSC, 1,5% SDS a 55 °C con rotación.
      35. Retire la membrana del tubo de hibridación y exponga la membrana a una pantalla de fosforografía durante un máximo de 3 días para obtener las huellas radiactivas en la película.
      36. Adquiera imágenes de la película utilizando un sistema de escaneo láser de imágenes de fósforo.
  2. Análisis de proteínas
    1. Preparación de la muestra
      1. Ajuste todas las muestras de proteínas a sus volúmenes finales (200 μL, 100 μL, 100 μL, 20 μL y 20 μL para el extracto de células crudas, entrada, flujo, perlas y muestras de eluido, respectivamente) agregando 1 μL de β-mercaptoetanol, tampón de muestra PAGE LDS (1x) y dH2O.
      2. Desnaturalizar las muestras a 95 °C durante 5 min.
    2. Análisis de Western blot
      NOTA: Realice SDS-PAGE y Western blot utilizando los protocolos estándar15,16.
      1. Cargue 15 μL de cada muestra en cada pocillo de un gel SDS-PAGE de 1,5 mm.
      2. Realizar la inmunotinción del blot utilizando anticuerpos PAP (1:2.000) y LexA (1:1.000) con incubación nocturna a 4 °C. Diluir en una solución de leche en polvo al 5% / PBST.
        NOTA: Después del análisis de Papanicolaou, la transferencia se puede eliminar utilizando un protocolo de extracción suave17 antes de la inmunotinción con el segundo anticuerpo LexA.

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Representative Results

La purificación del dominio de cromatina ARS316 de ~1,4 kb fue mediada por la proteína adaptadora LexA-TAP expresada constitutivamente. Para que sirviera como control negativo, realizamos purificaciones utilizando una cepa isogénica que expresa LexA-TAP pero que no contiene sitios integrados de unión a RS y LexA. La Figura 3 ilustra el resultado del análisis de ADN de un experimento de purificación estándar realizado tanto en el control como en una cepa competente para la recombinación dirigida al locus ARS316. Después del aislamiento del ADN y la digestión de la enzima de restricción para linealizar las moléculas circulares de ADN, se realizó un análisis de qPCR para evaluar la eficiencia de purificación del locus diana ARS316 sobre el locus de control genómico no relacionado PDC1.

Además, se cuantificó el enriquecimiento del locus ARS316 sobre la cromatina total (Figura 3A,B). La cepa de control negativo no mostró recuperación de los loci ARS316 o PDC1 en ninguna de las fracciones, excepto en el extracto celular crudo, la entrada y el flujo, lo que sugiere que no se pudo observar un enriquecimiento específico en el TEV y en las eluciones desnaturalizantes. Por el contrario, el locus ARS316 se agotó cuantitativamente en el flujo en la cepa de recombinación y pudo recuperarse en las perlas después de la elución de TEV y en la elución desnaturalizante. Después de la elución de TEV, las perlas mostraron un mayor porcentaje de recuperación del locus ARS316 ya que la eficiencia de escisión de TEV no fue del 100%. Esto dio como resultado que una fracción de los anillos de cromatina permanecieran unidos a las perlas. La eficiencia de escisión de la proteasa TEV se puede mejorar aumentando el volumen de elución por encima de 100 μL. Por el contrario, la elución desnaturalizante mostró una recuperación del 80%-90% del locus ARS316 en la cepa de recombinación (Figura 3A), lo que corresponde al alto enriquecimiento de las moléculas de ARS316 cuando se tiene en cuenta el tamaño del genoma de la levadura (Figura 3B).

Además, se realizó Southern blot para validar los resultados de la qPCR. Debido a su alta sensibilidad, puede detectar concentraciones relativamente más bajas de ADN diana, lo que permite el análisis cuantitativo de las muestras. Los resultados obtenidos del análisis de Southern blot utilizando sonda marcada radiactivamente confirmaron el enriquecimiento específico del locus ARS316 en las fracciones recogidas de la cepa de recombinación, pero no en las fracciones de la cepa control (Figura 3C). En la cepa de recombinación, se observó un mayor enriquecimiento del locus ARS316 en función de la intensidad de la señal en las perlas de TEV y las muestras de elución de desnaturalización, lo que concuerda con los resultados de la qPCR. De manera similar, las señales débiles observadas en las muestras de perlas de elución y desnaturalización de TEV son concordantes con el bajo enriquecimiento observado del locus ARS316 en estas fracciones (Figura 3C).

Las eficiencias de escisión y pulldown de LexA-TAP también se evaluaron mediante el análisis de Western blot. La proteína LexA-TAP tiene un peso molecular de ~80 kDa (Figura 4A). Tanto en la cepa de recombinación como en la de control, el análisis de Western blot se realizó utilizando el anticuerpo PAP, que se dirige a la fracción de proteína A de LexA-TAP en las muestras de purificación. Como se anticipó, los resultados demostraron un agotamiento casi total de LexA-TAP en el flujo continuo, con una recuperación observada en las fracciones finales de perlas y elución (Figura 4B[i]). El anticuerpo PAP también detecta el pequeño fragmento de proteína A de ~15 kDa que permanece en las perlas después de la elución de TEV. El mismo Western blot se extrajo e inmunotiñó con un anticuerpo contra la fracción LexA de LexA-TAP (Figura 4B[ii]), mostrando resultados complementarios (Figura 4B[ii]). La banda fuerte a ~50 kDa en ambos blots indica la cadena pesada de IgG acoplada a las perlas magnéticas, que se hibrida con los conjugados de anticuerpos primarios/secundarios (Figura 4B[ii]).

Figure 1
Figura 1: Esquemas de la construcción de cepas de levadura. Una cepa de levadura modificada con LexA integrada y sitios de recombinación en el cromosoma III se transforma con un plásmido (K238) con casetes de expresión para la expresión constitutiva de la proteína de fusión LexA-TAP utilizando el promotor TEF2 y el casete de expresión inducible por galactosa para la expresión de la recombinasa R (RecR) utilizando un promotor GAL10. El plásmido se linealiza mediante la digestión por restricción de SbfI, creando así brazos de recombinación homólogos para la integración del casete de expresión en una localización intergénica en el cromosoma I. Las células competentes se seleccionan en función del marcador de selección LEU2 en el medio de cultivo que carece de leucina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Purificación del locus de cromatina ARS316 de la levadura Saccharomyces cerevisiae. El locus ARS316 se extirpa en forma de anillos de cromatina de su ubicación genómica en las células de levadura mediante la recombinación específica del sitio inducida por galactosa. Estos anillos de cromatina se aíslan del extracto celular crudo utilizando la etiqueta de afinidad LexA-TAP unida a perlas magnéticas acopladas a IgG. Los anillos de cromatina se pueden liberar de las perlas mediante dos métodos: i) escisión mediada por proteasa TEV, o ii) elución por desnaturalización utilizando solución de amonio. La flecha punteada representa la posibilidad de realizar la elución por desnaturalización después de la elución mediada por la proteasa TEV para liberar los anillos de cromatina restantes unidos a perlas, ya que la eficiencia de escisión de la proteasa TEV no es del 100%. Los recuadros delineados representan las muestras obtenidas en diferentes etapas de la purificación para análisis de proteínas y ADN. Abreviatura: RS = sitios de recombinación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Análisis de ADN para evaluar la purificación del locus ARS316. (A) Gráfico de barras que muestra la purificación del locus ARS316 y una región no relacionada, PDC1, en una serie de muestras de ADN recogidas durante la purificación del locus de cromatina ARS316 de la cepa de levadura de recombinación. (B) Gráfico de barras que muestra el enriquecimiento del locus ARS316 sobre la cromatina total en una serie de muestras de ADN recogidas durante la purificación del locus de cromatina ARS316 a partir de cepas de levadura de control y recombinación. (C) Imagen de Southern blot que muestra el enriquecimiento del locus ARS316 en una serie de muestras de ADN recogidas durante la purificación del locus de cromatina ARS316 a partir de cepas de levadura de control y recombinación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Análisis de proteínas para evaluar la eficiencia de tracción y escisión de LexA-TAP. (A) Dibujo animado que representa los diferentes dominios proteicos de la proteína de fusión LexA-TAP, junto con el tamaño de cada dominio. (B) Imágenes de Western blot que muestran inmunotinción contra (i) PAP y (ii) LexA en una serie de muestras de proteínas recolectadas durante la purificación del locus de cromatina ARS316 de cepas de levadura de control y recombinación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Diagrama de flujo que destaca las posibles aplicaciones posteriores de los dominios de cromatina purificados mediante purificación por afinidad LexA-TAP. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Una lista de las soluciones y medios utilizados en este protocolo. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 2: Programa de PCR cuantitativa. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

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Discussion

La identificación de los factores y el panorama de la cromatina de una región genómica diana específica sigue planteando un reto importante en la investigación de la cromatina18. Este protocolo describe un sistema eficiente para extirpar y purificar específicamente distintos dominios de cromatina de los cromosomas de levadura. Hasta donde sabemos, la pureza y el rendimiento de esta purificación en un solo paso superan muchas de las limitaciones de los métodos de purificación de cromatina específicos del locus, lo que permite lograr un enriquecimiento muy alto de los loci objetivo en comparación con otras regiones genómicas no relacionadas.

Debido a la etapa adicional de escisión que utiliza la R-recombinasa específica del sitio, otra ventaja es que se puede determinar exactamente qué región genómica se purifica en función de la ubicación precisa de los sitios de recombinación en el genoma. Por el contrario, otros métodos dependen del cizallamiento del ADN por sonicación, lo que da lugar a longitudes de moléculas heterogéneas; Esta heterogeneidad hace que estos métodos sean menos precisos en términos de purificación de un locus diana bien definido.

Finalmente, esta estrategia de purificación utiliza condiciones nativas sin la inclusión de reticulantes químicos como el formaldehído. Por lo tanto, el material aislado obtenido por este enfoque es susceptible de análisis estructural y funcional. Un paso crítico en el protocolo de purificación es la eficiencia de la elución del TEV, que depende en gran medida de varios parámetros, incluida la actividad de la proteasa del TEV, las condiciones de reacción y los volúmenes de reacción. Para el experimento mostrado, el volumen de elución se estableció al mínimo, lo que afectó la eficiencia de la elución. Sin embargo, aumentar el volumen y la cantidad de proteasa TEV podría mejorar significativamente la eficiencia de elución. A pesar de tener una baja eficiencia, la elución de TEV produce una escisión altamente específica y la recuperación de los dominios de cromatina deseados. En comparación, la elución por desnaturalización tiene una eficiencia de elución de más del 90%, pero podría eluir algunas moléculas de ADN o proteínas no específicas de las perlas. Por lo tanto, el método de elección depende de la aplicación posterior deseada del material aislado. Por ejemplo, se ha demostrado que la elución desnaturalizante permite la identificación por espectrometría de masas de los factores de cromatina asociados, mientras que la elución nativa de TEV es preferible para ensayos funcionales posteriores, como la transcripción in vitro o los ensayos de replicación. En la Figura 5 se resumen las posibles aplicaciones posteriores del protocolo de purificación descrito. En resumen, este flujo de trabajo mejorado y un método altamente eficiente para estudiar la composición de la cromatina de loci individuales aborda un desafío de larga data en la investigación de la cromatina.

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Disclosures

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Acknowledgments

El trabajo en el laboratorio de S.H. contó con el apoyo de la DFG a través de SFB1064 (ID de proyecto 213249687), el Consejo Europeo de Investigación (ERC Starting Grant 852798 ConflictResolution) y la Helmholtz Gesellschaft.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Yeast strains
Control Strain: MATa; ura3Δ0; leu2Δ0; his3Δ1; met15Δ0; bar1::kanMX4; Chr I 212kb::LEU2 pTEF2-LEXA-TAP pGAL1-10 RecR Section 1, see references 13 and 14
Recombination Strain: MATa; ura3Δ0; leu2Δ0; his3Δ1; met15Δ0; bar1::kanMX4; RS_LEXA_NS-3_ARS316_NS+3_RS; Chr I 212kb::LEU2 pTEF2-LEXA-TAP pGAL1-10 RecR Section 1, see reference 13 and 14
Plasmid
K238 plasmid Section 1, see reference 13
Storage: Store at -20 °C
K071 Spike-in plasmid DNA Section 7.1, see reference 13
Storage: Store at -20 °C
Reagents
Acetone Carl Roth 5025.1 Section 2
Storage: Store at room temperature
Ammonium acetate (NH4Ac) Sigma Aldrich A7262 Section 6 and 7.1
Storage: Store at room temperature
Ammonium solution (NH4OH) 25% Merck Millipore 533003 Section 6
Storage: Store at room temperature
Ammonium sulfate Santa Cruz Sc-29085 Section 2
Storage: Store at room temperature
Bacto agar BD (VWR) 90000-760 Section 3
Storage: Store at room temperature
Bacto peptone BD (VWR) 211820 Section 3
Storage: Store at room temperature
β-Mercaptoethanol Sigma Aldrich 07604 Section 7.2
Storage: Store at 4 °C
Chemiluminescent substrate kit ThermoFisher 34580 Section 7.2
Storage: Store at 4 °C
Di-Sodium Hydrogen phosphate dodecahydrate Merck 1.06579.1000 Section 2 and 7.1
Storage: Store at room temperature
Dithiothreitol (DTT) ThermoFisher 15508013 Section 4
Storage: Store at 4 °C
Ethanol Merck 100983 Section 7.1
Storage: Store at room temperature
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma Aldrich ED Section 7.1
Storage: Store at room temperature
Galactose (20% (w/v) stock) Sigma Aldrich G0625-1KG  /  5KG Section 3
Storage: Store at room temperature
Gel loading dye (6x) BioLabs B7024A Section 7.1
Storage: Store at -20 °C
Glusose Sigma-Aldrich G8270 Section
Storage: Store at room temperature
Glycine Carl Roth .0079.4 Section 2
Storage: Store at room temperature
Glycogen (5 mg/mL) Invitrogen AM9510 Section 7.1
Storage: Store at -20 °C
Hydrochloric acid (HCl) PanReac AppliChem 182109.1211 Section 2, 4 and 7.1
Storage: Store at room temperature
Magnesium Acetate (MgAc) Bernd Kraft 15274.2600/C035 Section 4
Storage: Store at room temperature
Magnesium chloride (MgCl2) Sigma Aldrich M8266 Section 6
Storage: Store at room temperature
Nu PAGE LDS sample buffer (4x) Invitrogen 2399549 Section 7.2
Storage: Store at room temperature
Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1 v/v) Invitrogen 15593-031 Section 7.1
Storage: Store at 4 °C
Potassium chloride (KCl) Sigma P9541 Section 4
Storage: Store at room temperature
Radioactively labeled α-32P dATP (3,000 Ci/mmol, 10 mCi/mL) Hartmann Analytic SRP-203 Section 7.1
Storage: Store at 4 °C
RadPrime labeling system ThermoFisher 18428-011 Section 7.1
Storage: Store at -20 °C
Raffinose (20% (w/v) stock) SERVA 34140.03 Section 3
Storage: Store at room temperature
Sodium chloride (NaCl) Merck K53710504142 Section 7.1
Storage: Store at room temperature
Sodium citrate (Na3C6H5O7) Sigma-Aldrich 71402 Section 7.1
Storage: Store at room temperature
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma Aldrich S5881 Section 7.1
Storage: Store at room temperature
Sodium n-dodecyl sulfate (SDS) (5% stock (w/v) ) Alfa Aesar A11183 Section 7.1
Storage: Store at room temperature
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich 71496 Section 2 and 7.1
Storage: Store at room temperature
Sodium azide Santa Cruz Biotechnology sc-208393 Section 2
Storage: Store at -20 °C
 Triethylamine Sigma Aldrich 90340 Section 2
Storage: Store at room temperature
Tris base Chem Cruz SC-3715B Section 2 and 4
Storage: Store at room temperature
Triton X-100 Sigma Aldrich X100 Section 2 and 4
Storage: Store at room temperature
Tween-20 Bernd Kraft 18014332 Section 4
Storage: Store at room temperature
Yeast extract BD (VWR) 212720 Section 3
Storage: Store at room temperature
Yeast mating factor alpha (1 µg/mL stock )  Biomol Y2016.5 Section 3
Storage: Store at -20 °C
Yeast Synthetic Drop-out medium Supplements without LEUCINE Sigma Aldrich Y1376 Section 1, see reference 14
Enzymes
HpaI restriction enzyme (5,000 U/mL) NEB R0105S Section 7.1
Storage: Store at -20 °C
Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100x) ThermoFisher Scientific 78446 Section 4
Storage: Store at4 °C
Proteinase K (10 mg/mL) SERVA 33756 Section 7.1
Storage: Store at -20 °C
RNase A (10 mg/mL)  ThermoFisher EN0531 Section 7.1
Storage: Store at -20 °C
TEV protease (10000 U/µL) NEB P8112S Section 5
Storage: Store at -20 °C
Materials
BcMag Epoxy-Activated Magnetic Beads Bioclone Inc. FC-102 Section 2
Storage: Store at 4 °C
Dry ice Section 4
Low-binding centrifuge tubes 2.0 mL Eppendorf 22431102 Section 4
Microspin G-25 Columns Cytiva 27-5325-01 Section 7.1
Storage: Store at room temperature
Parafilm Merck P7793 Section 4
Positive nylon membrane Biozol 11MEMP0001 Section 7.1
Storage: Store at room temperature
PVDF transfer membrane Immobilon-Merck Millipore IPVH00010 Section 7.2
Storage: Store at room temperature
SDS-PAGE gel 4-12% bis-tris (15 well, 1.5 mm) Invitrogen  NP0336BOX Section 7.2
Storage: Store at 4 °C
Syringe (25 mL) with luer fitting Henke Sass Wolf 4200-000V0 Section 3
Whatman paper (Grade 3MM CHR Cellulose Western Blotting Paper Sheet) Cytiva 3030-917 Section 7.1
Storage: Store at room temperature
Antibodies
Anti-LexA, rabbit polyclonal IgG, DNA binding region antibody Merck Millipore 06-719 Section 7.2
Storage: Store at -20 °C
Goat Anti-Rabbit IgG (H+L), Horseradish peroxidase conjugate Invitrogen G21234 Section 7.2
Storage: Store at -20 °C
Peroxidase Anti-Peroxidase (PAP) antibody produced in rabbit for the detection of TAP-tagged proteins Sigma Aldrich P1291-500UL Section 7.2
Storage: Store at -20 °C
Rabbit IgG antibodies Sigma I5006-100MG Section 2
Storage: Store at 4 °C
Primers (10 µM)
ARS316: fwd 5'- CGGCATTATCGTACACAACCT, rev 5'- GTTCTTCGTTGCCTACATTTTCT Section 7.1
K071 Spike-in plasmid DNA: fwd: 5'-TTTTCGCTGCTTGTCCTTTT, rev 5'- CATTTTCGTCCTCCCAACAT Section 7.1
PCR fragment from yeast genomic DNA as a template  for ARS316 amplification (for southern blot): fwd 5’- AAATTCTGCCCTTGATTCGT                                                  rev 5’- TTTGTTTATCTCATCACTAAT Section 7.1
PDC1: fwd 5'- CATGATCAGATGGGGCTTCA, rev 5'-ACCGGTGGTAGCGACTCTGT Section 7.1
Equipment
Coffee grinder Gastroback 42601 Section 4
Dewar flask NAL GENE 4150-2000 Section 3
DynaMag TM-2 magnetic rack Invitrogen 12321D Section 4, 5 and 6
Hybridization oven Hybaid Mini10 Ri418 Section 2
Microcentrifuge Eppendorf 5424R Section 4 and 7.1
UV-crosslinker Analytikjena 95-0174-02 Section 7.1

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References

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Purificación de cromatina del locus del gen de copia única en <em>Saccharomyces cerevisiae</em>
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Sajid, A., Hamperl, S. Single-Copy Gene Locus Chromatin Purification in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (201), e65460, doi:10.3791/65460 (2023).

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