Summary
Denne protokollen presenterer en locus-spesifikk kromatinisolasjonsmetode basert på stedsspesifikk rekombinasjon for å rense et enkeltkopigenlokus av interesse i sin opprinnelige kromatinkontekst fra spirende gjær, Saccharomyces cerevisiae.
Abstract
Den grunnleggende organisatoriske enheten av eukaryot kromatin er nukleosomkjernepartikkelen (NCP), som består av DNA pakket ~ 1, 7 ganger rundt en histonoktamer. Kromatin er definert som enheten av NCP og mange andre proteinkomplekser, inkludert transkripsjonsfaktorer, kromatinremodellering og modifiserende enzymer. Det er fortsatt uklart hvordan disse protein-DNA-interaksjonene orkestreres på nivået av spesifikke genomiske loci under forskjellige stadier av cellesyklusen. Dette skyldes hovedsakelig de nåværende tekniske begrensningene, som gjør det utfordrende å oppnå presise målinger av slike dynamiske interaksjoner. Her beskriver vi en forbedret metode som kombinerer stedsspesifikk rekombinasjon med en effektiv ett-trinns affinitetsrensingsprotokoll for å isolere et enkeltkopigenlokus av interesse i sin opprinnelige kromatintilstand. Metoden muliggjør robust anrikning av mållokuset over genomisk kromatin, noe som gjør denne teknikken til en effektiv strategi for å identifisere og kvantifisere proteininteraksjoner på en objektiv og systematisk måte, for eksempel ved massespektrometri. I tillegg til slike sammensetningsanalyser vil naturlig kromatin renset med denne metoden sannsynligvis reflektere in vivo-situasjonen med hensyn til nukleosomposisjonering og histonmodifikasjoner, og er derfor egnet til ytterligere strukturelle og biokjemiske analyser av kromatin avledet fra praktisk talt ethvert genomisk locus i gjær.
Introduction
Den dynamiske organisasjonen av eukaryote genomer i kromatin komprimerer DNA for å passe innenfor rammen av kjernen, samtidig som det sikres tilstrekkelig dynamikk for genuttrykk og tilgjengelighet for regulatoriske faktorer. Delvis er denne allsidigheten formidlet av nukleosomet, den grunnleggende enheten av kromatin, som består av en kjernepartikkel med 147 bp DNA pakket ~ 1, 7 ganger rundt histonoktameren1. Nukleosomet er en svært dynamisk struktur med hensyn til sammensetningen, med mange histonvarianter og posttranslasjonelle modifikasjoner (PTM) på N- og C-terminale histonhaler. Videre interagerer eukaryot kromatin med en rekke andre viktige komponenter, for eksempel transkripsjonsfaktorer, DNA- og RNA-behandlingsmaskiner, arkitektoniske proteiner, enzymer involvert i kromatinremodellering og modifikasjon, og RNA-molekyler assosiert med kromatin. Disse viktige machineries involvert i transkripsjon, replikering og reparasjon alle krever tilgang til kromatin, som fungerer som det naturlige substratet for disse prosessene. Følgelig krever forståelsen av de molekylære mekanismene som ligger til grunn for disse DNA-transaksjonene en presis definisjon av de kollektive endringene i kromatinstrukturen i de spesifikke genomiske regionene der disse maskinene konvergerer og letter biologiske reaksjoner.
Til tross for identifisering av mange kromatinfaktorer gjennom genetikk- og protein-proteininteraksjonsstudier, har det fortsatt vært en betydelig hindring å utføre direkte, objektive og omfattende analyser av kromatininteraksjoner på bestemte genomiske steder 2,3. I utgangspunktet kunne bare svært tallrike regioner av genomet (dvs. repeterende loci) eller multikopiplasmider isoleres i tilstrekkelige mengder og renhet for massespektrometrisk identifikasjon av de assosierte proteinene 4,5,6,7. En rekke nye tilnærminger basert på direkte hybridisering av fangstprober til kromatinisert DNA, nærhetsbiotinylering ved hjelp av CRISPR-dCas9-systemet, eller binding av sekvensspesifikke adapterproteiner til stedet av interesse har begynt å avdekke proteomet til enkeltkopi-loci fra gjær- og pattedyrgenomer 8,9,10. Imidlertid krever alle disse metodene formaldehyd-tverrbinding for å stabilisere protein-DNA-interaksjonene og sonikering for å solubilisere kromatinet for etterfølgende rensing. Sammen utelukker begge manipulasjonene muligheten for etterfølgende strukturelle og funksjonelle studier av det rensede kromatinet.
For å overvinne disse begrensningene utviklet vi tidligere en metodikk som bruker stedsspesifikk rekombinasjon for å trekke ut målrettede kromosomale domener fra gjær11,12. I hovedsak er den genomiske regionen av interesse omgitt av anerkjennelsessteder (RS) for den stedsspesifikke R-rekombinasen fra Zygosaccharomyces rouxi, samtidig som den inkorporerer en gruppe på tre DNA-bindingssteder for det prokaryote transkripsjonsrepressoren LexA-protein (LexA) i samme region. Gjærcellene inneholder en ekspresjonskassett for samtidig ekspresjon av R-rekombinase og et LexA-protein fusjonert til en tandem affinitetsrensing (TAP) tag. Etter induksjon av R-rekombinase fjerner enzymet effektivt det målrettede området fra kromosomet i form av et sirkulært kromatindomene. Dette domenet kan renses via LexA-TAP-adapterproteinet, som binder seg til LexA DNA-bindingsstedene, samt til en affinitetsstøtte. Denne metoden har nylig blitt brukt til å isolere forskjellige kromatindomener som inneholder utvalgte replikasjonsopprinnelser av gjærkromosom III13.
En stor fordel med denne ex vivo-tilnærmingen er at den muliggjør funksjonelle analyser av det isolerte materialet. For eksempel kan replikasjonsopprinnelsesdomener renset med denne metoden bli utsatt for in vitro-replikasjonsanalyser for å vurdere effektiviteten av opprinnelsesfyring i et reagensrør fra innfødte in vivo-monterte kromatinmaler. Til slutt kan den biokjemiske og funksjonelle karakteriseringen av det isolerte materialet tillate rekonstituering av nukleære prosesser ved bruk av rensede proteiner sammen med den opprinnelige kromatinmalen. Oppsummert åpner denne metoden en spennende vei i kromatinforskning, da det vil være mulig å følge de kollektive sammensetnings- og strukturelle kromatinendringene i en bestemt genomisk region som gjennomgår en viss kromosomal transaksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Se materialfortegnelsen for detaljer knyttet til alle materialer og instrumenter som brukes i denne protokollen. Se tabell 1 for en liste over løsningene, bufferne og mediene som brukes.
1. Rekombinant gjærstammekonstruksjon
- For å konstruere en rekombinasjonskompetent gjærstamme, transformer SbfI-fordøyd plasmid K238 til en gjærstamme med integrerte LexA-bindingssteder og RS-rekombinasjonssteder ved stedet av interesse13,14.
MERK: Det transformerte SbfI-restriksjonsfragmentet inneholder den nødvendige uttrykkskassetten for konstitutivt uttrykk av LexA-TAP-fusjonsproteinet og R-rekombinasen sammen med homologe sekvenser av gjærkromosom I for genomisk integrasjon av ekspresjonskassetten ved homolog rekombinasjon (figur 1). - For å konstruere en kontrollstamme, ta en isogen gjærstamme som mangler integrerte RS- og LexA-bindingssteder, og transformer den med SbfI-fordøyd K238-plasmid under de samme forholdene som brukes til den rekombinasjonskompetente stammen.
- Velg de kompetente gjærcellene basert på LEU2-valgmarkøren på SCD-LEU-agarplater14.
2. Kobling av IgG-antistoffer mot epoksyaktiverte magnetiske perler
MERK: Par IgG-antistoffer mot epoksyaktiverte magnetiske perler i henhold til følgende publiserte protokoll11.
- Stopp 300 mg epoksyaktiverte perler i 10 ml 50% aceton (300 mg tilsvarer ~ 5,1 × 1010 perler) i et 50 ml konisk rør. Rist kraftig på en virvelmikser.
- Sentrifuger røret som inneholder perlene ved 820 × g og 4 °C i 2 minutter. Fjern supernatanten.
- Vask kulene 3x med 20 ml 0,1 M natriumfosfatbuffer (pH 7,4). Fjern supernatanten etter hvert vasketrinn ved sentrifugering som beskrevet i trinn 2.2.
- Heng kulene i 16 ml med 0,1 M natriumfosfatbuffer (pH 7,4), og roter forsiktig i en hybridiseringsovn i 5 minutter ved romtemperatur.
- Løs opp kaninens IgG (100 mg) i 7 mldH2O(endelig konsentrasjon: 14 mg/ml).
- Sentrifuger IgG-suspensjonen ved 13 000 × g og 4 °C i 10 minutter for å klargjøre suspensjonen.
- Overfør 3,5 ml av supernatanten (tilsvarende 50 mg kanin-IgG) til en ny 50 ml konisk tube.
- Fortynn IgG-oppløsningen med 9,85 ml 0,1 M natriumfosfatbuffer (pH 7,4), etterfulgt av dråpevis tilsetning av 6,65 ml 3 M ammoniumsulfat i 0,1 M natriumfosfat (pH 7,4) under forsiktig blanding.
MERK: Unngå å tilsette ammoniumsulfat raskt til løsningen, da en høy lokal konsentrasjon av saltet vil forårsake utfelling av kaninens IgG. - Sentrifuger IgG-oppløsningen ved 820 × g og 4 °C i 3 minutter, og tilsett den resulterende supernatanten til den magnetiske dråpesuspensjonen.
- Inkuber røret over natten eller i det minste i 18 timer ved 30 °C med forsiktig rotasjon i en hybridiseringsovn.
- Fjern supernatanten som beskrevet i trinn 2.2.
- Vask perlene med 20 ml 100 mM glycin-HCl (pH 2,5). Fjern oppløsningen raskt som beskrevet i trinn 2.2 for å unngå denaturering av IgG-polypeptidene.
- Vask kulene én gang med 20 ml 10 mM Tris-HCl (pH 8,8). Aspirer supernatanten som beskrevet i trinn 2.2.
- Tilsett 20 ml 0,1 M trietylaminoppløsning i 5-10 minutter under forsiktig rotasjon for å deaktivere de gjenværende reaktive epoksygruppene. Fjern supernatanten som beskrevet i trinn 2.2.
- Vask perlene 4x med 20 ml PBS (pH 7,4) i 5 minutter med forsiktig rotasjon. Fjern supernatanten som beskrevet i trinn 2.2 etter hvert vasketrinn.
- Vask perlene 2x med 20 ml PBS (pH 7,4) med 0,5 % Triton X-100 (w/v) i 5 minutter og 15 minutter hver under forsiktig rotasjon i en hybridiseringsovn. Fjern supernatanten som beskrevet i trinn 2.2.
- Oppløs kulene i et endelig volum på 16 ml PBS (pH 7,4) med 0,02 % natriumazid (w/v). Oppbevares som 1 ml alikoter ved 4 °C inntil bruk.
3. Gjærcellekultur og høsting
- Inokulere kontroll og rekombinasjon kompetente gjærstammer fra YPD-plater i 5 ml YPR medium, og inkubere over natten ved 30 ° C og 200 rpm.
- Inokuler 2 ml av denne kulturen i 100 ml YPR medium, og inkuber over natten ved 30 ° C og 200 rpm.
- For hver stamme dispenseres 1 800 ml autoklavert YP-medium og 200 ml autoklavert raffinoseoppløsning (20 % w/v) i hver av to 5 l Erlenmeyer-kolber (4 l dyrkningsmedium totalt for hver stamme, delt i to kolber).
- Inokuler de voksende gjærcellene ved OD600 0,2 i deres respektive medium, og inkuber som beskrevet i trinn 3.1 i ca. 6 timer eller til cellene når ønsket OD600 på 1,0. For å sikre normal vekst av cellene, fri for forurensning, sjekk OD med 2 timers intervaller.
- Tilsett 200 ml galaktose (20 % w/v) for å indusere stedsspesifikk rekombinasjon.
- Tilsett 110 μL (50 ng / ml) YMFA (samtidig med galaktosen, trinn 3.5) for å arrestere cellene i G1-fasen, og inkubere i 2 timer.
MERK: Tilsetningen av YMFA til cellene avhenger av eksperimentelle forhold og biologiske spørsmål som skal behandles. Nettopp, for dette eksperimentet, blir cellene arrestert i G1-fase for å oppnå en homogen cellepopulasjon med lisensiert replikasjonsopprinnelse; i denne prosessen binder det prereplikative komplekset til opprinnelsen i G1-fasen før initiering av DNA-replikasjon i S-fasen. - Overfør cellesuspensjonen til 1 l sentrifugebøtter og sentrifuger ved 6000 × g og 4 °C i 10 minutter. Kast supernatanten og resuspender cellepellets i et totalt volum på 10-15 ml dH2O.
- Forsegle en 25 ml sprøyte med en Luerplugg, og plasser den i et 50 ml konisk rør fylt med vann. Overfør cellesuspensjonen til sprøyteenheten, og sentrifuge ved 2 397 × g i 10 minutter ved romtemperatur. Kast supernatanten.
- Fjern Luer-pluggen fra sprøyten, og ekstruder cellene til flytende nitrogen for å danne celle "spaghetti".
MERK: Bruk av 4 liter kulturmedium gir en våtvekt av sluttcellepellets på 7-10 g. - Overfør frossencellespaghetti til et 50 ml konisk rør, og oppbevar ved -80 °C inntil videre bruk.
4. Rensing av kromatinlokus
MERK: Se figur 2 for en skjematisk oversikt over trinnene som er involvert i denne locus-spesifikke kromatinrensingsprotokollen.
- Kjøl ned en kommersiell kaffekvern ved å male 30-50 g tørris ved å riste kaffekvernen kraftig 2x i 30 s hver gang. Når det er avkjølt, kast tørrispulveret.
- Bland 3 g frossen gjærcellespaghetti med ~30-50 g tørris i den forkjølte kaffekvernen.
- Forsegl krysset mellom hetten og kvernen med parafilm for å forhindre tap av gjærcellepulver under fresing.
- Fres gjærcelle-tørrisblandingen 10x i 30 s hver gang, med 30 s intervaller mellom hver runde (totalt tidsestimat: ~10 min). For å unngå at tørris og cellepulver fester seg til veggene i kaffekvernen, banker du kontinuerlig på sidene av kaffekvernen under fresing.
- Overfør det resulterende gjærcelle-tørrispulveret til et plastbeger ved hjelp av en ren og tørr slikkepott.
- Hold begerglassene i romtemperatur for å fordampe tørrisen.
- Når tørrisen fordamper, tilsett 2,25 ml MB buffer med 1x protease og fosfatasehemmere (750 μL / g gjærceller) til gjærcellepulveret.
- Pipetter cellebufferblandingen kraftig for å sikre fullstendig suspensjon av cellene med bufferen, og overfør til et 15 ml konisk rør.
- Ta prøver for DNA (0,1%) og protein (0,05%) analyse fra den resulterende cellesuspensjonen (råcelleekstrakter [CCE]). Oppbevares ved -20 °C inntil videre behandling (beskrevet i avsnitt 7).
- Overfør cellesuspensjonen til lavbindende 2 ml reaksjonsrør og sentrifuge ved 21 130 × g i 30 minutter ved 4 °C for å skille cellerestene fra råcellelysatet.
- Samle supernatantene fra alle rørene i ett 15 ml konisk rør.
- Ta prøver fra supernatanten (input [IN]) for DNA (0,1%) og proteinanalyse (0,05%). Oppbevares ved -20 °C inntil videre behandling (beskrevet i avsnitt 7).
- Likevekt 500 μL IgG-koblet magnetisk perleoppslemming (for hver gjærstamme) ved å vaske 2x med 500 μL kald MB-buffer med 1x protease- og fosfatasehemmere i 5 minutter hver ved 4 °C ved rotasjon ved 20 o / min. Kast supernatanten fra perlene ved hjelp av et magnetstativ etter hvert vasketrinn.
- Inkuber de IgG-koblede magnetiske kulene i 500 μL kald MB-buffer med 1x protease- og fosfatasehemmere i 1 time ved 4 °C ved rotasjon ved 20 o / min. Kast supernatanten fra perlene ved hjelp av et magnetstativ.
- Bland den likevektede magnetiske perleoppslemmingen med cellelysatet, og inkuber med rotasjon ved 20 o / min i 2 timer ved 4 ° C.
- Overfør den komplette magnetiske perlecellelysatsuspensjonen til lavbindende reaksjonsrør.
- Separat de magnetiske perlene, som nå bærer kromatinringene av interesse, fra cellelysatet ved hjelp av et magnetstativ.
- Overfør gjenværende gjennomstrømning (FT) fra hvert rør til et nytt 15 ml konisk rør, og ta prøver for DNA (0,1%) og protein (0,05%) analyse. Oppbevares ved -20 °C inntil videre behandling (beskrevet i avsnitt 7).
- Heng magnetkulene fra hvert rør i 300 μL kald MB-buffer, og samle perlene i ett reaksjonsrør. Vask 5x i 10 minutter hver med 750 μL kald MB buffer med 1x protease og fosfatasehemmere ved 4 °C på rotasjon ved 20 o / min. Utfør den endelige vasken med 750 μL kald MB-buffer uten protease- og fosfatasehemmere.
- Heng perlene i 40 μL kald MB-buffer uten protease- og fosfatasehemmere.
MERK: Det endelige volumet av eluat kan justeres i henhold til forventet nedstrømsapplikasjon. TEV-elusjonen fungerer vanligvis effektivt innenfor området 100-300 μL.
5. TEV-proteasemediert eluering
- For å frigjøre LexA-CBP-kromatinringkomplekser fra perlene, inkuber kulene med 2 μL 6x His-merket rekombinant TEV-protease over natten ved 4 °C og 450 o / min i en termomikser.
- Separer perlene fra det endelige eluatet ved hjelp av et magnetstativ. Overfør eluatet, som inneholder spaltede kromatinringer, til et nytt 1,5 ml reaksjonsrør.
- Hold rørene på et magnetisk stativ igjen for å skille eventuelle gjenværende perler fra det endelige eluatet.
- Resuspender perlene (TB) i 750 μL kald AC-buffer, og ta prøver for DNA (0,1%) og protein (0,05%) analyse. Oppbevares ved -20 °C inntil videre behandling (beskrevet i avsnitt 7).
- Fra det endelige eluatet (TE), ta prøver for DNA (0,5%) og protein (0,25%) analyse. Oppbevares ved -20 °C inntil videre behandling (beskrevet i avsnitt 7).
MERK: På grunn av det lave volumet av det endelige eluatet, økes prosentandelen av prøvene samlet for DNA- og proteinanalyse for å oppnå en bedre representasjon av protein- og DNA-innholdet under analysen.
6. Denaturering eluering
- Vask kulene 2x i 750 μL kald AC-buffer i 20 minutter hver gang ved 4 °C ved rotasjon ved 20 o / min.
- For å trekke ut de gjenværende bundne LexA-kromatinkompleksene, utfør denatureringseluering ved å tilsette 500 μL 0,5MNH4OH til perlene, og inkuber i 30 minutter ved romtemperatur.
- Separer kulene fra suspensjonen ved hjelp av et magnetstativ, og overfør eluatet til et lavbindende reaksjonsrør.
- Inkuber kulene igjen som i trinn 6.2 for å gjenopprette de maksimale kromatinlociene i eluatet.
- Separer kulene fra suspensjonen ved hjelp av et magnetstativ, og samle det resulterende eluatet i det samme røret som inneholder eluatet fra trinn 6.3.
- Resuspender perlene (DB) i 750 μL dH2O, og ta prøver for DNA (0, 1%) og protein (0, 05%) analyse.
- Fra det endelige eluatet (DE), ta prøver for DNA (0,5%) og protein (0,25%) analyse.
7. DNA- og proteinanalyse
- DNA-analyse
- Prøve forberedelse
- Tilsett DNA-prøvene 100 μL IRN-buffer, og øk volumet med dH2O til et endelig volum på 200 μL.
- Tilsett 1 ng K071 pigg-i plasmid-DNA.
- Tilsett 1 μL RNAse A (10 mg/ml), og inkuber ved 37 °C i 1 time.
- Tilsett 5 μl proteinase K (10 mg/ml) og 10 μl SDS (20 %), og inkuber i 1 time ved 56 °C.
- Tilsett 200 μL fenol / kloroform / isopropylalkohol (25: 24: 1), og virvel grundig 2x i 10 s hver gang.
- Sentrifuge prøvene ved 21 130 × g i 7 minutter for å skille de organiske og vandige fasene.
- Overfør supernatanten til nye 1,5 ml rør inneholdende 1,5 μl glykogen (5 mg/ml) og 2,5x 100 % etanol.
- Inkuber rørene ved -20 ° C i minst 2 timer og maksimalt over natten for å utfelle DNA.
- Sentrifuge ved 21 130 × g, 4 °C i 45 minutter. Kast supernatanten.
- Tilsett 150 μL 70 % etanol uten å resuspendere DNA-pelleten, og sentrifuge igjen ved 21 130 × g ved 4 °C i 10 minutter.
- Tørk DNA-pellets ved romtemperatur i 10-15 minutter, og resuspender i 40 μL dH2O.
- Utfør restriksjonsenzymfordøyelse for å linearisere DNA isolert i trinn 7.1.1.11 med HpaI-restriksjon endonuklease. For en 50 μL reaksjonsblanding, inkuber 40 μL isolert DNA + 2 μL HpaI-enzym + 5 μL restriksjonsenzymbuffer + 3 μLdH2Oover natten ved 37 °C.
- qPCR-analyse
- Fortynn det restriksjonsfordøyde DNA i forholdet 1: 5 (10 μL av restriksjonsfordøyd DNA oppnådd fra trinn 7.1.1.12 i 40 μL dH2O).
- Bruk primerpar designet for ARS316-regionen, PDC1 og pigg-inn plasmid-DNA.
- Kjør qPCR ved hjelp av programmet gitt i tabell 2.
- Analyser qPCR-resultatene ved relativ kvantifisering ved hjelp av ARS316-regionen og spike-in plasmid-DNA som mål og PDC1 (eller et hvilket som helst annet gen eller genomisk region) som referanselokus.
- Vurder ARS316 locus utvinningsprosent over PDC1 ved å normalisere ARS316 og PDC1 primer relative kvantifiseringsverdier med prosentandelen av fraksjonsvolumet tatt for hver prøve. For eksempel, multipliser 0,1% for gjennomstrømningen med en faktor på 1,000 og 0,5% for TEV-eluatet med en faktor på 200.
- Normaliser ARS316- og PDC1-utvinningsprosentene med de relative kvantifiseringsverdiene for plasmid-DNA.
- Vurdere anrikningen av ARS316-lokuset over totalkromatin ved å evaluere oppnådde relative kvantifiseringsmål/referanseverdier ved hjelp av ligning (1).
(1)
- Analyse av sørlig flekk
- Til 20 μL restriksjonsenzymfordøyd DNA-prøve, tilsett 5 μL gellastingsfargestoff.
- Kjør prøvene i en 1% agarosegel ved 110 V i ~ 3 timer.
- Overfør gelen til et brett, og suge den i renseoppløsning med forsiktig risting i 20 minutter.
- Skyll gelen med dH2O, og suge den i denatureringsløsning i 15 minutter med risting. Kast denatureringsoppløsningen.
- Bløtlegg gelen i denatureringsløsning i 15 min med forsiktig risting.
- Skyll gelen med dH2O, og vask den 2x i 15 min hver gang med overføringsbufferen med forsiktig risting.
- Fyll opp et brett med 1-1,5 L overføringsbuffer, og legg det på en stabil plattform.
- Klipp et langt stykke Whatman-papir, og legg det på plattformen på en slik måte at de to endene av papiret blir gjennomvåt i overføringsbufferen.
- Klipp en stripe positiv nylonmembran og fire strimler Whatman-papir lik størrelsen på gelen.
- Plasser to stykker Whatman-papir dynket i overføringsbufferen på plattformen.
- Legg gelen med forsiden ned på toppen av bitene av Whatman-papir.
- På toppen av gelen plasserer du den positive nylonmembranen, etterfulgt av de resterende to stykkene Whatman-papir dynket i overføringsbuffer. Sørg for å holde stabelen våt med overføringsbufferen.
- Fjern eventuelle fangede luftbobler ved å rulle dem av med en glassstang.
- Legg en bunke med tørkepapir på toppen av den sammensatte stabelen, etterfulgt av en gjenstand på 0,5 kg (f.eks. en glassflaske).
- La forsamlingen stå over natten ved romtemperatur.
- Etter overføring kryssbinder UV-membranen med en total energiproduksjon på 1,200 J/cm2.
- For påvisning av ARS316-lokuset, utfør hybridisering av sørlige blott ved hjelp av radioaktive sonder syntetisert ved hjelp av det refererte DNA-merkingssystemet.
MERK: Utfør alle trinnene heretter på is inntil annet er nevnt. - I et lavbindende reaksjonsrør fortynnes 25-40 ng PCR-fragment (sonde) i 19 μLdH2O, og inkuberes ved 95 °C i 5 minutter. Avkjøl umiddelbart på is.
- Legg til 1 μL hver på 500 μM dCTP, 500 μM dGTP og 500 μM dTTP til røret.
- Legg til 20 μL av bufferen som inneholder tilfeldige nukleotidheksamaner som følger med settet.
- Tilsett 5 μL av det radioaktivt merkede nukleotidet [α-32P] dATP til røret. Utfør alle trinn som involverer radioaktivt merket materiale under et radioaktivitetsgodkjent beskyttelsesmiljø.
- Tilsett 1 μL Klenow-fragment, og inkuber ved 37 °C på en termomikser i 15 minutter for enkeltstrenget DNA-syntese.
- Tilsett 5 μL stoppbuffer for å stoppe reaksjonen.
- Sentrifuge en størrelsesekskluderingskolonne i 2 minutter ved 1,500 × g for å fjerne lagringsbufferen. Kast gjennomstrømningen, og plasser kolonnen i et nytt rør.
- Før sondeblandingen gjennom kolonnen for å fjerne ikke-inkorporerte radioaktive nukleotider. Sentrifuge i 30 s ved 1,500 × g for å samle sonden.
- Tilsett 150 μL laksesperm-DNA (1:100) for å blokkere den ikke-spesifikke bindingen av sonden til membranen.
- Inkuber sondeblandingen ved 95 °C i 5 minutter for å denaturere det dobbeltstrengede DNA.
- Snap-fryse på is i noen sekunder, og sentrifuge i noen sekunder ved 500 × g for å få ned vanndråpene kondensert på lokket.
- Vask kort den sørlige blotmembranen med hybridiseringsbufferen i 5-10 minutter med rotasjon.
- Prehybridiser membranen med hybridiseringsbufferen i 1 time ved 55 °C med rotasjon. Kast hybridiseringsbufferen.
- Tilsett 15 ml fersk hybridiseringsbuffer (forvarmet ved 55 °C) til membranen sammen med den preparerte sonden. Inkuber membranen over natten ved 55 °C med rotasjon.
- Utfør vask etter hybridisering 2x i 15 minutter hver med 0,3x SSC, 0,1 % SDS ved 55 °C med rotasjon.
- Utfør posthybridisering vasker 2x i 15 minutter hver med 0,1x SSC, 0,1% SDS ved 55 °C med rotasjon.
- Utfør vask etter hybridisering 2x i 15 minutter hver med 0,1x SSC, 1,5 % SDS ved 55 °C med rotasjon.
- Fjern membranen fra hybridiseringsrøret, og utsett membranen for en fosforimerskjerm i opptil 3 dager for å oppnå de radioaktive avtrykkene på filmen.
- Skaff bilder av filmen ved hjelp av et fosforimagerende laserskanningssystem.
- Prøve forberedelse
- Protein analyse
- Prøve forberedelse
- Juster alle proteinprøvene til deres endelige volum (200 μL, 100 μL, 100 μL, 20 μL og 20 μL for henholdsvis råcelleekstrakt, inngang, gjennomstrømning, perler og eluatprøver) ved å tilsette 1 μL β-merkaptoetanol, PAGE LDS-prøvebuffer (1x) og dH2O.
- Denaturer prøvene ved 95 °C i 5 minutter.
- Western blot analyse
MERK: Utfør SDS-PAGE og western blotting ved hjelp av standardprotokoller15,16.- Legg 15 μL av hver prøve i hver brønn med en 1,5 mm SDS-PAGE gel.
- Utfør immunfarging av blotten ved bruk av PAP (1:2 000) og LexA (1:1 000) antistoffer med inkubasjon over natten ved 4 °C. Fortynn i 5 % tørrmelk/PBST-oppløsning.
MERK: Etter PAP-analyse kan flekken strippes ved hjelp av en mild strippeprotokoll17 før immunfarging med det andre LexA-antistoffet.
- Prøve forberedelse
(1)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Rensingen av ~1,4 kb ARS316-kromatindomenet ble mediert av det konstitutivt uttrykte LexA-TAP-adapterproteinet. For å tjene som en negativ kontroll, utførte vi rensinger ved hjelp av en isogen stamme som uttrykker LexA-TAP, men inneholder ikke integrerte RS- og LexA-bindingssteder. Figur 3 illustrerer DNA-analyseresultatet fra et standard renseeksperiment utført på både kontroll- og en rekombinasjonskompetent stamme rettet mot ARS316-lokuset. Etter DNA-isolering og restriksjonsenzymfordøyelse for å linearisere de sirkulære DNA-molekylene, ble qPCR-analyse utført for å vurdere renseeffektiviteten til ARS316-mållokuset over det ikke-relaterte genomiske kontrollstedet PDC1.
Videre ble anrikningen av ARS316-lokuset over det totale kromatinet kvantifisert (figur 3A,B). Den negative kontrollstammen viste ingen gjenvinning av ARS316- eller PDC1-loci i noen av fraksjonene bortsett fra råcelleekstraktet, inngang og gjennomstrømning, noe som tyder på at ingen spesifikk anrikning kunne observeres i TEV og denaturerende elueringer. I motsetning til dette ble ARS316-lokuset kvantitativt utarmet i gjennomstrømningen i rekombinasjonsstammen og kunne gjenvinnes på perlene etter TEV-eluering og i denatureringselusjonen. Etter TEV-eluering viste perlene en høyere utvinningsprosent av ARS316-lokuset, da TEV-spaltningseffektiviteten ikke var 100%. Dette resulterte i at en brøkdel av kromatinringene forble bundet til perlene. TEV-proteasespaltningseffektiviteten kan forbedres ved å øke elueringsvolumet over 100 μL. I kontrast viste denatureringselusjonen 80% -90% utvinning av ARS316-lokuset i rekombinasjonsstammen (figur 3A), tilsvarende den høye anrikningen av ARS316-molekyler når man tar hensyn til størrelsen på gjærgenomet (figur 3B).
Southern blot ble i tillegg utført for å validere qPCR-resultatene. På grunn av sin høye følsomhet kan den oppdage relativt lavere konsentrasjoner av mål-DNA, og dermed muliggjøre kvantitativ analyse av prøvene. Resultatene fra den sørlige blot-analysen ved bruk av radioaktivt merket sonde bekreftet den spesifikke anrikningen av ARS316-lokuset i fraksjonene samlet fra rekombinasjonsstammen, men ikke i kontrollstammefraksjonene (figur 3C). I rekombinasjonsstammen ble det observert høyere anrikning av ARS316-lokuset basert på signalintensiteten i TEV-kulene og denatureringselueringsprøvene, i samsvar med qPCR-resultatene. På samme måte er de svake signalene observert i prøvene av TEV-eluering og denatureringsperler i samsvar med den observerte lave anrikningen av ARS316-lokuset i disse fraksjonene (figur 3C).
LexA-TAP-spaltnings- og nedtrekkseffektiviteten ble også vurdert ved hjelp av western blot-analyse. LexA-TAP-proteinet har en molekylvekt på ~80 kDa (figur 4A). I både rekombinasjons- og kontrollstammene ble western blot-analyse utført ved bruk av PAP-antistoffet, som retter seg mot proteinet A-delen av LexA-TAP i renseprøvene. Som forventet viste resultatene nesten total uttømming av LexA-TAP i gjennomstrømningen, med restitusjon observert i de endelige perle- og elueringsfraksjonene (figur 4B[i]). PAP-antistoffet oppdager også det lille proteinet A-fragmentet på ~ 15 kDa som forblir på perlene etter TEV-eluering. Den samme vestlige flekken ble strippet og immunfarget med et antistoff mot LexA-delen av LexA-TAP (figur 4B[ii]), som viste komplementære resultater (figur 4B[ii]). Det sterke båndet ved ~ 50 kDa i begge blottene indikerer den IgG tunge kjeden koblet til magnetkulene, som krysshybridiserer med de primære / sekundære antistoffkonjugatene (figur 4B [ii]).
Figur 1: Skjema over gjærstammekonstruksjon. En modifisert gjærstamme med integrert LexA og rekombinasjonssteder på kromosom III transformeres med et plasmid (K238) med ekspresjonskassetter for det konstitutive uttrykket av LexA-TAP-fusjonsproteinet ved bruk av TEF2-promotoren og den galaktoseinduserbare ekspresjonskassetten for R-rekombinase (RecR) -uttrykk ved bruk av en GAL10-promotor. Plasmidet lineariseres ved SbfI-restriksjonsfordøyelse, og derved skapes homologe rekombinasjonsarmer for integrering av uttrykkskassetten i en intergenisk plassering på kromosom I. Kompetente celler velges basert på LEU2-seleksjonsmarkøren på vekstmediet som mangler leucin. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Rensing av ARS316-kromatinlokuset fra gjærsoppen Saccharomyces cerevisiae. ARS316-lokuset blir skåret ut i form av kromatinringer fra sin genomiske plassering i gjærceller ved galaktoseindusert stedsspesifikk rekombinasjon. Disse kromatinringene isoleres fra råcelleekstraktet ved hjelp av LexA-TAP-affinitetsmerket bundet til IgG-koblede magnetiske perler. Kromatinringer kan frigjøres fra perlene ved to metoder: i) TEV-proteasemediert spaltning, eller ii) denatureringseluering ved bruk av ammoniumløsning. Den stiplede pilen representerer muligheten for å utføre denatureringseluering etter TEV-proteasemediert eluering for å frigjøre de gjenværende perlebundne kromatinringene, da TEV-proteasespaltningseffektiviteten ikke er 100%. De skisserte boksene representerer prøvene oppnådd på forskjellige trinn i rensingen for protein- og DNA-analyser. Forkortelse: RS = rekombinasjonssider. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: DNA-analyse for å evaluere ARS316 locus rensing. (A) Søylediagram som viser rensingen av ARS316-lokuset og en ikke-relatert region, PDC1, i en serie DNA-prøver samlet under ARS316 kromatinlokusrensing fra rekombinasjonsgjærstammen. (B) Søylediagram som viser anrikningen av ARS316-lokuset over totalt kromatin i en serie DNA-prøver samlet inn under ARS316 kromatinlokusrensing fra kontroll- og rekombinasjonsgjærstammer. (C) Southern blot-bilde som viser anrikningen av ARS316-lokuset i en serie DNA-prøver samlet inn under ARS316-kromatinlokusrensing fra kontroll- og rekombinasjonsgjærstammer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Proteinanalyse for å evaluere LexA-TAP nedtrekk og spaltningseffektivitet. (A) Tegneserie som representerer de forskjellige proteindomenene til LexA-TAP-fusjonsproteinet, sammen med størrelsen på hvert domene. (B) Western blot-bilder som viser immunfarging mot (i) PAP og (ii) LexA i en serie proteinprøver samlet under ARS316 kromatinlokusrensing fra kontroll- og rekombinasjonsgjærstammer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Flytskjema som fremhever potensielle nedstrøms anvendelser av kromatindomener renset ved hjelp av LexA-TAP affinitetsrensing. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tabell 1: En liste over løsningene og mediene som brukes i denne protokollen. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tabell 2: Kvantitativt PCR-program. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Identifiseringen av faktorene og kromatinlandskapet i en bestemt målgenomisk region fortsetter å utgjøre en stor utfordring i kromatinforskning18. Denne protokollen beskriver et effektivt system for å spesifikt skjære ut og rense forskjellige kromatindomener fra gjærkromosomer. Så vidt vi vet, overvinner renheten og utbyttet av denne ett-trinns rensingen mange av begrensningene i locus-spesifikke kromatinrensingsmetoder, og muliggjør dermed oppnåelse av svært høy anrikning av de målrettede stedene sammenlignet med andre ikke-relaterte genomiske regioner.
På grunn av det ekstra eksisjonstrinnet ved bruk av stedsspesifikk R-rekombinase, er en annen fordel at man nøyaktig kan bestemme hvilken genomisk region som renses avhengig av den nøyaktige plasseringen av rekombinasjonsstedene i genomet. I motsetning til dette er andre metoder avhengige av skjæring av DNA ved sonikering, noe som resulterer i heterogene molekyllengder; Denne heterogeniteten gjør disse metodene mindre presise når det gjelder rensing av et veldefinert mållokus.
Til slutt benytter denne rensestrategien innfødte forhold uten inkludering av kjemiske kryssbindere som formaldehyd. Dermed er det isolerte materialet oppnådd ved denne tilnærmingen egnet til strukturelle og funksjonelle analyser. Et kritisk trinn i renseprotokollen er effektiviteten til TEV-elueringen, som sterkt avhenger av flere parametere, inkludert aktiviteten til TEV-proteasen, reaksjonsbetingelsene og reaksjonsvolumene. For forsøket som ble vist, ble elueringsvolumet satt til et minimum, noe som påvirket effektiviteten av eluering. Å øke volumet og mengden av TEV-protease kan imidlertid forbedre elueringseffektiviteten betydelig. Til tross for lav effektivitet gir TEV-eluering svært spesifikk spaltning og gjenoppretting av de ønskede kromatindomenene. Til sammenligning har denatureringseluering en elueringseffektivitet på mer enn 90%, men kan eluere noen ikke-spesifikke DNA- eller proteinmolekyler fra perlene. Derfor avhenger den valgte metoden av ønsket nedstrøms anvendelse av det isolerte materialet. For eksempel har denaturerende eluering vist seg å tillate massespektrometrisk identifisering av de assosierte kromatinfaktorene, mens innfødt TEV-eluering foretrekkes for nedstrøms funksjonelle analyser som in vitro-transkripsjon eller replikasjonsanalyser. Figur 5 oppsummerer de potensielle nedstrøms applikasjonene til den beskrevne renseprotokollen. Oppsummert adresserer denne forbedrede arbeidsflyten og den svært effektive metoden for å studere kromatinsammensetningen av enkle loci en langvarig utfordring i kromatinforskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse.
Acknowledgments
Arbeidet i SH-laboratoriet ble støttet av DFG gjennom SFB1064 (prosjekt-ID 213249687), Det europeiske forskningsrådet (ERC Starting Grant 852798 ConflictResolution) og Helmholtz Gesellschaft.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast strains | |||
| Control Strain: MATa; ura3Δ0; leu2Δ0; his3Δ1; met15Δ0; bar1::kanMX4; Chr I 212kb::LEU2 pTEF2-LEXA-TAP pGAL1-10 RecR | Section 1, see references 13 and 14 | ||
| Recombination Strain: MATa; ura3Δ0; leu2Δ0; his3Δ1; met15Δ0; bar1::kanMX4; RS_LEXA_NS-3_ARS316_NS+3_RS; Chr I 212kb::LEU2 pTEF2-LEXA-TAP pGAL1-10 RecR | Section 1, see reference 13 and 14 | ||
| Plasmid | |||
| K238 plasmid | Section 1, see reference 13 Storage: Store at -20 °C |
||
| K071 Spike-in plasmid DNA | Section 7.1, see reference 13 Storage: Store at -20 °C |
||
| Reagents | |||
| Acetone | Carl Roth | 5025.1 | Section 2 Storage: Store at room temperature |
| Ammonium acetate (NH4Ac) | Sigma Aldrich | A7262 | Section 6 and 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Ammonium solution (NH4OH) 25% | Merck Millipore | 533003 | Section 6 Storage: Store at room temperature |
| Ammonium sulfate | Santa Cruz | Sc-29085 | Section 2 Storage: Store at room temperature |
| Bacto agar | BD (VWR) | 90000-760 | Section 3 Storage: Store at room temperature |
| Bacto peptone | BD (VWR) | 211820 | Section 3 Storage: Store at room temperature |
| β-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | 07604 | Section 7.2 Storage: Store at 4 °C |
| Chemiluminescent substrate kit | ThermoFisher | 34580 | Section 7.2 Storage: Store at 4 °C |
| Di-Sodium Hydrogen phosphate dodecahydrate | Merck | 1.06579.1000 | Section 2 and 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Dithiothreitol (DTT) | ThermoFisher | 15508013 | Section 4 Storage: Store at 4 °C |
| Ethanol | Merck | 100983 | Section 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | ED | Section 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Galactose (20% (w/v) stock) | Sigma Aldrich | G0625-1KG / 5KG | Section 3 Storage: Store at room temperature |
| Gel loading dye (6x) | BioLabs | B7024A | Section 7.1 Storage: Store at -20 °C |
| Glusose | Sigma-Aldrich | G8270 | Section Storage: Store at room temperature |
| Glycine | Carl Roth | .0079.4 | Section 2 Storage: Store at room temperature |
| Glycogen (5 mg/mL) | Invitrogen | AM9510 | Section 7.1 Storage: Store at -20 °C |
| Hydrochloric acid (HCl) | PanReac AppliChem | 182109.1211 | Section 2, 4 and 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Magnesium Acetate (MgAc) | Bernd Kraft | 15274.2600/C035 | Section 4 Storage: Store at room temperature |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma Aldrich | M8266 | Section 6 Storage: Store at room temperature |
| Nu PAGE LDS sample buffer (4x) | Invitrogen | 2399549 | Section 7.2 Storage: Store at room temperature |
| Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1 v/v) | Invitrogen | 15593-031 | Section 7.1 Storage: Store at 4 °C |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9541 | Section 4 Storage: Store at room temperature |
| Radioactively labeled α-32P dATP (3,000 Ci/mmol, 10 mCi/mL) | Hartmann Analytic | SRP-203 | Section 7.1 Storage: Store at 4 °C |
| RadPrime labeling system | ThermoFisher | 18428-011 | Section 7.1 Storage: Store at -20 °C |
| Raffinose (20% (w/v) stock) | SERVA | 34140.03 | Section 3 Storage: Store at room temperature |
| Sodium chloride (NaCl) | Merck | K53710504142 | Section 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Sodium citrate (Na3C6H5O7) | Sigma-Aldrich | 71402 | Section 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma Aldrich | S5881 | Section 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Sodium n-dodecyl sulfate (SDS) (5% stock (w/v) ) | Alfa Aesar | A11183 | Section 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | 71496 | Section 2 and 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Sodium azide | Santa Cruz Biotechnology | sc-208393 | Section 2 Storage: Store at -20 °C |
| Triethylamine | Sigma Aldrich | 90340 | Section 2 Storage: Store at room temperature |
| Tris base | Chem Cruz | SC-3715B | Section 2 and 4 Storage: Store at room temperature |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | Section 2 and 4 Storage: Store at room temperature |
| Tween-20 | Bernd Kraft | 18014332 | Section 4 Storage: Store at room temperature |
| Yeast extract | BD (VWR) | 212720 | Section 3 Storage: Store at room temperature |
| Yeast mating factor alpha (1 µg/mL stock ) | Biomol | Y2016.5 | Section 3 Storage: Store at -20 °C |
| Yeast Synthetic Drop-out medium Supplements without LEUCINE | Sigma Aldrich | Y1376 | Section 1, see reference 14 |
| Enzymes | |||
| HpaI restriction enzyme (5,000 U/mL) | NEB | R0105S | Section 7.1 Storage: Store at -20 °C |
| Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100x) | ThermoFisher Scientific | 78446 | Section 4 Storage: Store at4 °C |
| Proteinase K (10 mg/mL) | SERVA | 33756 | Section 7.1 Storage: Store at -20 °C |
| RNase A (10 mg/mL) | ThermoFisher | EN0531 | Section 7.1 Storage: Store at -20 °C |
| TEV protease (10000 U/µL) | NEB | P8112S | Section 5 Storage: Store at -20 °C |
| Materials | |||
| BcMag Epoxy-Activated Magnetic Beads | Bioclone Inc. | FC-102 | Section 2 Storage: Store at 4 °C |
| Dry ice | Section 4 | ||
| Low-binding centrifuge tubes 2.0 mL | Eppendorf | 22431102 | Section 4 |
| Microspin G-25 Columns | Cytiva | 27-5325-01 | Section 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Parafilm | Merck | P7793 | Section 4 |
| Positive nylon membrane | Biozol | 11MEMP0001 | Section 7.1 Storage: Store at room temperature |
| PVDF transfer membrane | Immobilon-Merck Millipore | IPVH00010 | Section 7.2 Storage: Store at room temperature |
| SDS-PAGE gel 4-12% bis-tris (15 well, 1.5 mm) | Invitrogen | NP0336BOX | Section 7.2 Storage: Store at 4 °C |
| Syringe (25 mL) with luer fitting | Henke Sass Wolf | 4200-000V0 | Section 3 |
| Whatman paper (Grade 3MM CHR Cellulose Western Blotting Paper Sheet) | Cytiva | 3030-917 | Section 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Antibodies | |||
| Anti-LexA, rabbit polyclonal IgG, DNA binding region antibody | Merck Millipore | 06-719 | Section 7.2 Storage: Store at -20 °C |
| Goat Anti-Rabbit IgG (H+L), Horseradish peroxidase conjugate | Invitrogen | G21234 | Section 7.2 Storage: Store at -20 °C |
| Peroxidase Anti-Peroxidase (PAP) antibody produced in rabbit for the detection of TAP-tagged proteins | Sigma Aldrich | P1291-500UL | Section 7.2 Storage: Store at -20 °C |
| Rabbit IgG antibodies | Sigma | I5006-100MG | Section 2 Storage: Store at 4 °C |
| Primers (10 µM) | |||
| ARS316: fwd 5'- CGGCATTATCGTACACAACCT, rev 5'- GTTCTTCGTTGCCTACATTTTCT | Section 7.1 | ||
| K071 Spike-in plasmid DNA: fwd: 5'-TTTTCGCTGCTTGTCCTTTT, rev 5'- CATTTTCGTCCTCCCAACAT | Section 7.1 | ||
| PCR fragment from yeast genomic DNA as a template for ARS316 amplification (for southern blot): fwd 5’- AAATTCTGCCCTTGATTCGT rev 5’- TTTGTTTATCTCATCACTAAT | Section 7.1 | ||
| PDC1: fwd 5'- CATGATCAGATGGGGCTTCA, rev 5'-ACCGGTGGTAGCGACTCTGT | Section 7.1 | ||
| Equipment | |||
| Coffee grinder | Gastroback | 42601 | Section 4 |
| Dewar flask | NAL GENE | 4150-2000 | Section 3 |
| DynaMag TM-2 magnetic rack | Invitrogen | 12321D | Section 4, 5 and 6 |
| Hybridization oven | Hybaid Mini10 | Ri418 | Section 2 |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424R | Section 4 and 7.1 |
| UV-crosslinker | Analytikjena | 95-0174-02 | Section 7.1 |
References
- Kornberg, R. D., Lorch, Y. Twenty-five years of the nucleosome, fundamental particle of the eukaryote chromosome. Cell. 98 (3), 285-294 (1999).
- Gauchier, M., van Mierlo, G., Vermeulen, M., Déjardin, J. Purification and enrichment of specific chromatin loci. Nature Methods. 17 (4), 380-389 (2020).
- Korthout, T., et al. Decoding the chromatin proteome of a single genomic locus by DNA sequencing. PLoS Biology. 16 (7), e2005542 (2018).
- Antão, J. M., Mason, J. M., Déjardin, J., Kingston, R. E. Protein landscape at Drosophila melanogaster telomere-associated sequence repeats. Molecular and Cellular Biology. 32 (12), 2170-2182 (2012).
- Déjardin, J., Kingston, R. E. Purification of proteins associated with specific genomic loci. Cell. 136 (1), 175-186 (2009).
- Ide, S., Dejardin, J. End-targeting proteomics of isolated chromatin segments of a mammalian ribosomal RNA gene promoter. Nature Communications. 6, 6674 (2015).
- Unnikrishnan, A., Gafken, P. R., Tsukiyama, T. Dynamic changes in histone acetylation regulate origins of DNA replication. Nature Structural & Molecular Biology. 17 (4), 430 (2010).
- Buxton, K. E., et al. Elucidating protein-DNA interactions in human alphoid chromatin via hybridization capture and mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 16 (9), 3433-3442 (2017).
- Kennedy-Darling, J., et al. Discovery of chromatin-associated proteins via sequence-specific capture and mass spectrometric protein identification in Saccharomyces cerevisiae. Journal of Proteome Research. 13 (8), 3810-3825 (2014).
- Liu, S. J., et al. CRISPRi-based genome-scale identification of functional long noncoding RNA loci in human cells. Science. 355, 7111 (2017).
- Hamperl, S., et al. Purification of specific chromatin domains from single-copy gene loci in Saccharomyces cerevisiae. Functional Analysis of DNA and Chromatin. 1094, 329-341 (2014).
- Hamperl, S., et al. Compositional and structural analysis of selected chromosomal domains from Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 42 (1), 2 (2014).
- Weiβ, M. Single-copy locus proteomics of early- and late-firing DNA replication origins identifies a role of Ask1/DASH complex in replication timing control. Cell Reports. 42 (2), 112045 (2023).
- Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nature Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Western blot membrane stripping for restaining protocol. Abcam. , Available from: https://www.abcam.com/protocols/western-blot-membrane-stripping-for-restaining-protocol (2023).
- Vermeulen, M., Déjardin, J.
