Summary
В этом протоколе представлен локусоспецифический метод выделения хроматина, основанный на сайт-специфической рекомбинации, для очистки однокопийного гена, представляющего интерес в его нативном контексте хроматина, от почковавшихся дрожжей Saccharomyces cerevisiae.
Abstract
Основной организационной единицей эукариотического хроматина является частица ядра нуклеосомы (NCP), которая состоит из ДНК, обернутой ~1,7 раза вокруг октамера гистона. Хроматин определяется как сущность NCP и многих других белковых комплексов, включая транскрипционные факторы, ремоделирование хроматина и модифицирующие ферменты. До сих пор неясно, как эти белок-ДНК-взаимодействия организуются на уровне специфических геномных локусов на разных стадиях клеточного цикла. В основном это связано с текущими техническими ограничениями, которые затрудняют получение точных измерений таких динамических взаимодействий. В этой статье мы опишем усовершенствованный метод, сочетающий сайт-специфичную рекомбинацию с эффективным одноступенчатым протоколом аффинной очистки для выделения интересующего нас однокопийного гена в его нативном хроматиновом состоянии. Этот метод позволяет надежно обогащать целевой локус с помощью геномного хроматина, что делает этот метод эффективной стратегией для идентификации и количественной оценки белковых взаимодействий непредвзятым и систематическим образом, например, с помощью масс-спектрометрии. В дополнение к такому анализу состава, нативный хроматин, очищенный этим методом, вероятно, отражает ситуацию in vivo в отношении позиционирования нуклеосом и модификаций гистонов и, следовательно, поддается дальнейшему структурному и биохимическому анализу хроматина, полученного практически из любого геномного локуса у дрожжей.
Introduction
Динамическая организация эукариотических геномов в хроматин уплотняет ДНК, чтобы она помещалась в пределах ядра, обеспечивая при этом достаточную динамику для экспрессии генов и доступность регуляторных факторов. Отчасти эта универсальность опосредована нуклеосомой, основной единицей хроматина, которая состоит из основной частицы со 147.н. ДНК, обернутой ~1,7 раза вокруг октамера гистонов1. Нуклеосома представляет собой очень динамичную структуру по отношению к своему составу, с многочисленными вариантами гистонов и посттрансляционными модификациями (ПТМ) на N- и C-концевых хвостах гистонов. Кроме того, эукариотический хроматин взаимодействует с множеством других важных компонентов, таких как транскрипционные факторы, механизмы обработки ДНК и РНК, архитектурные белки, ферменты, участвующие в ремоделировании и модификации хроматина, и молекулы РНК, связанные с хроматином. Эти важнейшие механизмы, участвующие в транскрипции, репликации и репарации, требуют доступа к хроматину, который служит естественным субстратом для этих процессов. Следовательно, понимание молекулярных механизмов, лежащих в основе этих трансакций ДНК, требует точного определения коллективных изменений в структуре хроматина в конкретных областях генома, где эти механизмы сходятся и способствуют биологическим реакциям.
Несмотря на идентификацию многочисленных факторов хроматина с помощью генетики и исследований белок-белкового взаимодействия, проведение прямого, непредвзятого и всестороннего анализа взаимодействий хроматина на конкретных участках генома остается существенным препятствием 2,3. Первоначально для масс-спектрометрической идентификации ассоциированных белков 4,5,6,7 можно было выделить только очень распространенные участки генома (т.е. повторяющиеся локусы) или многокопийные плазмиды. Ряд новых подходов, основанных на прямой гибридизации зондов захвата с хроматинизированной ДНК, бесконтактном биотинилировании с использованием системы CRISPR-dCas9 или связывании последовательно-специфических белков-адаптеров с интересующим локусом, начал распутывать протеом однокопийных локусов из геномов дрожжей и млекопитающих 8,9,10. Однако все эти методы требуют сшивания формальдегида для стабилизации белок-ДНК взаимодействий и ультразвуковой обработки для солюбилизации хроматина для последующей очистки. В совокупности обе манипуляции исключают возможность последующих структурно-функциональных исследований очищенного хроматина.
Чтобы преодолеть эти ограничения, мы ранее разработали методологию, которая использует сайт-специфическую рекомбинацию для извлечения целевых хромосомных доменов из дрожжей11,12. По сути, интересующая область генома окружена сайт-специфической R-рекомбиназой из Zygosaccharomyces rouxi и одновременно включает группу из трех сайтов связывания ДНК для прокариотического транскрипционного репрессора белка LexA (LexA) в пределах одной и той же области. Дрожжевые клетки содержат экспрессионную кассету для одновременной экспрессии R-рекомбиназы и белка LexA, соединенного с меткой тандемной аффинной очистки (TAP). После индукции R-рекомбиназы фермент эффективно удаляет целевой участок из хромосомы в виде кольцевого домена хроматина. Этот домен может быть очищен с помощью белка-адаптера LexA-TAP, который связывается с сайтами связывания ДНК LexA, а также с аффинной опорой. Этот метод недавно был использован для выделения отдельных доменов хроматина, содержащих выбранные репликационные источники13-й хромосомы дрожжей.
Одним из основных преимуществ этого подхода ex vivo является то, что он позволяет проводить функциональный анализ изолированного материала. Например, репликационные исходные домены, очищенные с помощью этого метода, могут быть подвергнуты анализу репликации in vitro для оценки эффективности возбуждения исходного сырья в пробирке из нативных хроматиновых матриц in vivo . В конечном счете, биохимическая и функциональная характеристика выделенного материала может позволить восстановить ядерные процессы с использованием очищенных белков вместе с нативным хроматиновым шаблоном. Таким образом, эта методология открывает захватывающие возможности в исследовании хроматина, поскольку можно будет проследить коллективные изменения состава и структуры хроматина в определенной области генома, претерпевающей определенную хромосомную трансакцию.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Смотрите Таблицу материалов для получения подробной информации, связанной со всеми материалами и инструментами, используемыми в этом протоколе. В таблице 1 приведен список используемых решений, буферов и носителей.
1. Построение штамма рекомбинантных дрожжей
- Чтобы сконструировать рекомбинационно-компетентный штамм дрожжей, трансформируют SbfI-переваренную плазмиду K238 в штамм дрожжей с интегрированными LexA-связывающими сайтами и сайтами рекомбинации RS в интересующем локусе13,14.
ПРИМЕЧАНИЕ: Трансформированный фрагмент рестрикции SbfI содержит необходимую экспрессионную кассету для конститутивной экспрессии белка слияния LexA-TAP и R-рекомбиназы вместе с гомологичными последовательностями хромосомы I дрожжей для геномной интеграции экспрессионной кассеты путем гомологичной рекомбинации (рис. 1). - Для создания контрольного штамма берут изогенный штамм дрожжей, в котором отсутствуют интегрированные RS- и LexA-связывающие сайты, и трансформируют его с SbfI-расщепленной плазмидой K238 в тех же условиях, что и для рекомбинационно-компетентного штамма.
- Выберите компетентные дрожжевые клетки на основе маркера отбора LEU2 на агаровых пластинах SCD-LEU14.
2. Связывание антител IgG с эпоксидно-активированными магнитными шариками
ПРИМЕЧАНИЕ: Соедините антитела IgG с магнитными шариками, активированными эпоксидной смолой, в соответствии со следующим опубликованным протоколом11.
- Суспендировать 300 мг гранул, активированных эпоксидной смолой, в 10 мл 50% ацетона (300 мг соответствует ~5,1 ×10 10 шариков) в конической пробирке объемом 50 мл. Энергично встряхните на вихревом миксере.
- Центрифугируют пробирку с гранулами при 820 × г и 4 °C в течение 2 мин. Удалите надосадочную жидкость.
- Промойте шарики 3 раза 20 мл 0,1 М натрий-фосфатного буфера (pH 7,4). Удаляйте надосадочную жидкость после каждого этапа промывки центрифугированием, как описано в шаге 2.2.
- Суспендируйте шарики в 16 мл 0,1 М натрий-фосфатного буфера (pH 7,4) и осторожно вращайте в гибридизационной печи в течение 5 минут при комнатной температуре.
- Растворите IgG кролика (100 мг) в 7 мл dH2O (конечная концентрация: 14 мг/мл).
- Центрифугируют суспензию IgG при 13 000 × г и 4 °C в течение 10 мин для осветления суспензии.
- Переложите 3,5 мл надосадочной жидкости (что соответствует 50 мг кроличьих IgG) в новую коническую пробирку объемом 50 мл.
- Раствор IgG разбавляют 9,85 мл 0,1 М натрийфосфатного буфера (рН 7,4) с последующим добавлением по каплям 6,65 мл 3 М сульфата аммония в 0,1 М фосфата натрия (рН 7,4) при осторожном перемешивании.
ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте быстрого добавления сульфата аммония в раствор, так как высокая локальная концентрация соли вызовет осаждение IgG кролика. - Центрифугируют раствор IgG при 820 × g и 4 °C в течение 3 мин и добавляют полученную надосадочную жидкость к суспензии магнитного шарика.
- Инкубируйте пробирку в течение ночи или не менее 18 ч при 30 °C при осторожном вращении в гибридизационной печи.
- Удалите надосадочную жидкость, как описано в шаге 2.2.
- Промойте шарики 20 мл 100 мМ глицина-HCl (рН 2,5). Быстро удалите раствор, как описано в шаге 2.2, чтобы избежать денатурации полипептидов IgG.
- Промойте бусины один раз 20 мл 10 мМ Tris-HCl (pH 8,8). Аспирируйте надосадочную жидкость, как описано в шаге 2.2.
- Добавьте 20 мл 0,1М раствора триэтиламина в течение 5-10 мин при осторожном вращении для инактивации остаточных реакционноспособных эпоксидных групп. Удалите надосадочную жидкость, как описано в шаге 2.2.
- Промойте бусины 4 раза 20 мл PBS (pH 7,4) в течение 5 минут с легким вращением. Удаляйте надосадочную жидкость, как описано в шаге 2.2, после каждого этапа стирки.
- Промойте бусины 2 раза 20 мл PBS (pH 7,4) с 0,5% Triton X-100 (w/v) в течение 5 минут и 15 минут каждый при осторожном вращении в гибридизационной печи. Удалите надосадочную жидкость, как описано в шаге 2.2.
- Суспендировать шарики в конечном объеме 16 мл PBS (pH 7,4) с 0,02% азида натрия (w/v). Хранить в виде аликвот по 1 мл при температуре 4 °C до использования.
3. Культивирование и сбор дрожжевых клеток
- Высейте контрольные и рекомбинационные компетентные штаммы дрожжей с планшетов YPD в 5 мл среды YPR и инкубируйте в течение ночи при 30 °C и 200 об/мин.
- Высейте 2 мл этой культуры в 100 мл среды YPR и инкубируйте в течение ночи при 30 °C и 200 об/мин.
- Для каждого штамма дозируют 1 800 мл автоклавной среды YP и 200 мл автоклавного раствора рафинозы (20% по массе) в каждую из двух 5-литровых колб Эрленмейера (всего 4 л питательной среды для каждого штамма, разделенных на две колбы).
- Посев растущих дрожжевых клеток при наружном диаметре600 0,2 в соответствующую среду и инкубируют, как описано в шаге 3.1, в течение примерно 6 ч или до тех пор, пока клетки не достигнут желаемого наружного диаметра600 1,0. Чтобы обеспечить нормальный рост клеток, свободных от каких-либо загрязнений, проверяйте наружный диаметр с интервалом в 2 часа.
- Добавьте 200 мл галактозы (20% по массе), чтобы индуцировать сайт-специфическую рекомбинацию.
- Добавьте 110 мкл (50 нг/мл) YMCA (одновременно с галактозой, шаг 3,5), чтобы остановить клетки в фазе G1, и инкубируйте в течение 2 ч.
Примечание: Добавление YMFA к клеткам зависит от условий эксперимента и биологического вопроса, который необходимо решить. В частности, для этого эксперимента клетки задерживаются в фазе G1 для получения однородной клеточной популяции с лицензированным репликационным происхождением; в этом процессе пререпликативный комплекс связывается с источниками в фазе G1 до начала репликации ДНК в фазе S. - Переложите клеточную суспензию в центрифужные ведра объемом 1 л и центрифугируйте при температуре 6 000 × г и температуре 4 °C в течение 10 мин. Надосадочную жидкость выбросить, и повторно суспендировать клеточные гранулы в общем объеме 10-15 мл dH2O.
- Запечатайте шприц объемом 25 мл пробкой Луэра и поместите его в коническую пробирку объемом 50 мл, наполненную водой. Переложите клеточную суспензию в шприцевой узел и центрифугируйте при 2,397 × г в течение 10 мин при комнатной температуре. Выбросьте надосадочную жидкость.
- Выньте пробку Люэра из шприца и выдавите клетки в жидкий азот, чтобы сформировать клеточные «спагетти».
ПРИМЕЧАНИЕ: Использование 4 л питательной среды обеспечивает влажную массу конечных клеточных гранул 7-10 г. - Переложите спагетти с замороженными клетками в коническую пробирку объемом 50 мл и храните при температуре −80 °C до дальнейшего использования.
4. Очистка локуса хроматина
ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 2 приведен схематический обзор этапов, выполняемых в этом протоколе локус-специфической очистки хроматина.
- Охладите коммерческую кофемолку, измельчив 30-50 г сухого льда, энергично встряхивая кофемолку 2 раза в течение 30 секунд каждый раз. После охлаждения выбросьте порошок сухого льда.
- Смешайте 3 г замороженных спагетти с дрожжами с ~30-50 г сухого льда в предварительно охлажденной кофемолке.
- Загерметизируйте стык между крышкой и измельчителем парапленкой, чтобы предотвратить потерю порошка дрожжевых клеток во время измельчения.
- Измельчите смесь дрожжевых клеток и сухого льда 10 раз в течение 30 секунд каждый раз, с интервалом 30 секунд между каждым раундом (общее время: ~10 минут). Чтобы сухой лед и клеточный порошок не прилипали к стенкам кофемолки, постоянно постукивайте по стенкам кофемолки во время измельчения.
- Переложите полученную дрожжевую клетку-сухой порошок льда в пластиковый стакан с помощью чистой и сухой лопатки.
- Держите стаканы при комнатной температуре, чтобы испарился сухой лед.
- Как только сухой лед испарится, добавьте 2,25 мл буфера MB с 1 ингибиторами протеазы и фосфатазы (750 мкл/г дрожжевых клеток) в порошок дрожжевых клеток.
- Энергично пипетируйте клеточно-буферную смесь, чтобы обеспечить полную суспензию клеток с буфером, и перелейте в коническую пробирку объемом 15 мл.
- Возьмите образцы для анализа ДНК (0,1%) и белка (0,05%) из полученной клеточной суспензии (экстракты сырых клеток [CCE]). Хранить при температуре −20 °C до дальнейшей обработки (описанной в разделе 7).
- Переложите клеточную суспензию в реакционные пробирки объемом 2 мл с низким связыванием и центрифугируйте при 21 130 × г в течение 30 мин при 4 °C, чтобы отделить клеточный мусор от сырого клеточного лизата.
- Смешайте надосадочную жидкость из всех пробирок в одну коническую пробирку объемом 15 мл.
- Возьмите образцы из надосадочной жидкости (вход [IN]) для анализа ДНК (0,1%) и белка (0,05%). Хранить при температуре −20 °C до дальнейшей обработки (описанной в разделе 7).
- Уравновешивают 500 мкл суспензии магнитных шариков, связанных с IgG (для каждого штамма дрожжей), промывая 2 раза 500 мкл холодного буфера MB с 1 ингибиторами протеазы и фосфатазы в течение 5 мин каждый при 4 °C при вращении при 20 об/мин. Удаляйте надосадочную жидкость из бусин с помощью магнитной решетки после каждого этапа стирки.
- Инкубируют магнитные шарики, связанные с IgG, в 500 мкл холодного буфера MB с 1x ингибиторами протеазы и фосфатазы в течение 1 ч при 4 °C при вращении при 20 об/мин. Выбросьте надосадочную жидкость из бусин с помощью магнитной стойки.
- Смешайте уравновешенную суспензию магнитных шариков с клеточным лизатом и инкубируйте при вращении при 20 об/мин в течение 2 ч при 4 °C.
- Перенесите полную суспензию лизата магнитных шариков в реакционные пробирки с низким связыванием.
- Отделите магнитные шарики, несущие интересующие кольца хроматина, от клеточного лизата с помощью магнитной стойки.
- Перелейте оставшуюся проточную часть (FT) из каждой пробирки в свежую коническую пробирку объемом 15 мл и возьмите образцы для анализа ДНК (0,1%) и белка (0,05%). Хранить при температуре −20 °C до дальнейшей обработки (описанной в разделе 7).
- Суспендируйте магнитные шарики из каждой пробирки в 300 мкл холодного буфера MB и объедините шарики в одну реакционную пробирку. Промыть 5 раз по 10 мин каждый с 750 мкл холодного буфера MB с 1 ингибитором протеазы и фосфатазы при 4 °C при вращении при 20 об/мин. Окончательную промывку проводят 750 мкл холодного буфера MB без ингибиторов протеазы и фосфатазы.
- Суспендировать шарики в 40 мкл холодного буфера МБ без ингибиторов протеазы и фосфатазы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательный объем элюата может быть скорректирован в соответствии с его предполагаемым последующим применением. Элюирование ТЭВ обычно эффективно работает в диапазоне 100-300 мкл.
5. Протеаза-опосредованное элюирование ТЭВ
- Чтобы высвободить кольцевые комплексы хроматина LexA-CBP из гранул, инкубируйте гранулы с 2 мкл 6-кратной рекомбинантной протеазы ТЭВ, помеченной His, в течение ночи при 4 °C и 450 об/мин в термомиксере.
- Отделите бисер от готового элюата с помощью магнитной стойки. Переложите элюат, содержащий расщепленные кольца хроматина, в новую реакционную пробирку объемом 1,5 мл.
- Снова поместите пробирки на магнитную решетку, чтобы отделить остатки гранул от конечного элюата.
- Ресуспендант гранул (TB) в 750 мкл холодного буфера переменного тока и возьмите образцы для анализа ДНК (0,1%) и белка (0,05%). Хранить при температуре −20 °C до дальнейшей обработки (описанной в разделе 7).
- Из окончательного элюата (TE) берут образцы для анализа ДНК (0,5%) и белка (0,25%). Хранить при температуре −20 °C до дальнейшей обработки (описанной в разделе 7).
ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за малого объема конечного элюата процент образцов, собранных для анализа ДНК и белка, увеличивается, чтобы получить лучшее представление о содержании белка и ДНК в них во время анализа.
6. Элюирование денатурации
- Промыть шарики 2 раза в 750 мкл холодного буфера переменного тока в течение 20 минут каждый раз при 4 °C при вращении при 20 об/мин.
- Для извлечения оставшихся связанных комплексов LexA-хроматина проводят денатурационное элюирование, добавляя к гранулам 500 мкл 0,5М NH4OH, и инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре.
- Отделите гранулы от суспензии с помощью магнитной стойки и перенесите элюат в реакционную пробирку с низким связыванием.
- Снова инкубируйте шарики, как показано на шаге 6.2, чтобы восстановить максимальное количество локусов хроматина в элюате.
- Отделите шарики от суспензии с помощью магнитной стойки и соберите полученный элюат в ту же пробирку, содержащую элюат из шага 6.3.
- Ресуспендируйте шарики (DB) в 750 мкл dH2O и возьмите образцы для анализа ДНК (0,1%) и белка (0,05%).
- Из конечного элюата (ДЭ) берут образцы для анализа ДНК (0,5%) и белка (0,25%).
7. Анализ ДНК и белков
- Анализ ДНК
- Пробоподготовка
- К образцам ДНК добавляют 100 мкл буфера IRN и увеличивают объем dH2Oдо конечного объема 200 мкл.
- Добавьте 1 нг спайковой плазмидной ДНК K071.
- Добавьте 1 мкл РНКазы А (10 мг/мл) и инкубируйте при 37 °C в течение 1 ч.
- Добавьте 5 мкл протеиназы К (10 мг/мл) и 10 мкл SDS (20%) и инкубируйте в течение 1 ч при 56 °C.
- Добавьте 200 мкл фенола/хлороформа/изопропилового спирта (25:24:1) и тщательно перемешайте 2 раза в течение 10 секунд каждый раз.
- Центрифугируют образцы при 21 130 × г в течение 7 мин для разделения органической и водной фаз.
- Перелейте надосадочную жидкость в новые пробирки объемом 1,5 мл, содержащие 1,5 мкл гликогена (5 мг/мл) и 2,5 100% этанола.
- Инкубируйте пробирки при температуре −20 °C не менее 2 ч и не более ночи до осаждения ДНК.
- Центрифуга при 21 130 × г, 4 °C в течение 45 мин. Выбросьте надосадочную жидкость.
- Добавьте 150 мкл 70% этанола без ресуспендирования гранулы ДНК и снова центрифугируйте при 21 130 × г при 4 °C в течение 10 мин.
- Высушите гранулы ДНК при комнатной температуре в течение 10-15 мин и ресуспендируйте в 40 мкл dH2O.
- Выполните расщепление ферментом рестрикции для линеаризации ДНК, выделенной на этапе 7.1.1.11, эндонуклеазой рестрикции HpaI. Для реакционной смеси объемом 50 мкл инкубируют 40 мкл изолированной ДНК + 2 мкл фермента HpaI + 5 мкл буфера фермента рестрикции + 3 мкл dH2O в течение ночи при 37 °C.
- кПЦР-анализ
- Разбавляют рестрикционно-расщепленную ДНК в соотношении 1:5 (10 мкл рестрикционно-расщепленной ДНК, полученной на стадии 7.1.1.12, в 40 мкл dH2O).
- Используйте пары праймеров, предназначенные для области ARS316, PDC1 и спайковой плазмидной ДНК.
- Запустите qPCR с помощью программы, приведенной в таблице 2.
- Анализируйте результаты кПЦР путем относительного количественного определения, используя область ARS316 и спайковую плазмидную ДНК в качестве мишеней и PDC1 (или любой другой ген или область генома) в качестве референсного локуса.
- Оцените процент извлечения локуса ARS316 по сравнению с PDC1 путем нормализации относительных количественных значений праймеров ARS316 и PDC1 на процент объема фракции, взятой для каждого образца. Например, умножьте 0,1% для проточного значения на коэффициент 1 000 и 0,5% для элюирования ТЭВ на коэффициент 200.
- Нормализуйте проценты восстановления ARS316 и PDC1 с помощью относительных количественных значений спайковой плазмидной ДНК.
- Оцените обогащение локуса ARS316 по общему хроматину, оценив полученные относительные количественные целевые/референсные значения с помощью уравнения (1).
(1)
- Анализ Саузерн блоттинг
- К 20 мкл образца ДНК, расщепленного ферментом рестрикции, добавляют 5 мкл красителя с гелевой загрузкой.
- Прогонят образцы в 1% агарозном геле при 110 В в течение ~3 ч.
- Переложите гель на лоток и замочите его в растворе для депурирования при легком встряхивании на 20 минут.
- Смойте гель dH2O и замочите его в денатурационном растворе на 15 минут при встряхивании. Раствор для денатурации выбросьте.
- Замочите гель в денатурационном растворе на 15 мин при легком встряхивании.
- Смойте гель dH2O и промывайте его 2 раза в течение 15 минут каждый раз с помощью буфера для переноса с легким встряхиванием.
- Наполните лоток 1-1,5 л буфера для перекачки и поставьте его на устойчивую платформу.
- Отрежьте длинный кусок ватмана и положите его на платформу таким образом, чтобы два конца бумаги пропитались буфером для переноса.
- Отрежьте одну полоску положительной нейлоновой мембраны и четыре полоски ватмана, равные размеру геля.
- Положите на платформу два листа ватмана, смоченных в буфере для переноса.
- Положите гель лицевой стороной вниз на кусочки ватмана.
- Поверх геля положите положительную нейлоновую мембрану, а затем оставшиеся два кусочка ватмана, смоченные в трансферном буфере. Следите за тем, чтобы стек оставался влажным с буфером передачи.
- Удалите все застрявшие пузырьки воздуха, скрутив их стеклянной палочкой.
- Положите стопку бумажных полотенец поверх собранной стопки, а затем предмет весом 0,5 кг (например, стеклянную бутылку).
- Оставьте сборку для переноса на ночь при комнатной температуре.
- После переноса мембрану сшивают с помощью УФ-излучения с общей выходной энергией 1 200 Дж/см2.
- Для детектирования локуса ARS316 проводят южную блот-гибридизацию с использованием радиоактивных зондов, синтезированных с использованием референсной системы мечения ДНК.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте все дальнейшие действия на льду, если не указано иное. - В реакционной пробирке с низким связыванием разводят 25-40 нг ПЦР-фрагмента (зонда) в 19 мкл dH2O и инкубируют при 95 °C в течение 5 мин. Остудить сразу на льду.
- Добавьте в пробирку по 1 мкл 500 мкМ dCTP, 500 мкМ dGTP и 500 мкМ dTTP.
- Добавьте 20 мкл буфера, содержащего случайные нуклеотидные гексамеры, поставляемые в комплекте.
- Добавьте в пробирку 5 мкл радиоактивно меченого нуклеотида [α-32P] dATP. Выполняйте все действия, связанные с радиоактивно меченым материалом, в защищенной среде, одобренной для радиоактивности.
- Добавьте 1 мкл фрагмента Кленова и инкубируйте при 37 °C на термомиксере в течение 15 мин для синтеза одноцепочечной ДНК.
- Добавьте 5 мкл стоп-буфера, чтобы остановить реакцию.
- Центрифугируйте колонку исключения размера в течение 2 минут при 1 500 × g , чтобы удалить буфер хранения. Отбросьте поток и поместите колонку в новую трубку.
- Пропустите зондовую смесь через колонку, чтобы удалить неинкорпорированные радиоактивные нуклеотиды. Центрифуга в течение 30 с при давлении 1 500 × г для сбора зонда.
- Добавьте 150 мкл ДНК сперматозоидов лосося (1:100), чтобы заблокировать неспецифическое связывание зонда с мембраной.
- Инкубируйте смесь зондов при 95 °C в течение 5 мин для денатурации двухцепочечной ДНК.
- Заморозьте на льду в течение нескольких секунд и центрифугируйте в течение нескольких секунд при 500 × г , чтобы капли воды конденсировались на крышке.
- Кратковременно промывают южную блоттинговую мембрану буфером для гибридизации в течение 5-10 мин с ротацией.
- Предварительно гибридизируют мембрану с буфером для гибридизации в течение 1 ч при 55 °C с вращением. Откажитесь от буфера гибридизации.
- Добавьте 15 мл свежего буфера для гибридизации (предварительно подогретого до 55 °C) в мембрану вместе с подготовленным зондом. Инкубируйте мембрану в течение ночи при температуре 55 °C с вращением.
- Выполните постгибридизационные промывки 2 раза по 15 мин каждая с 0,3x SSC, 0,1% SDS при 55 °C с вращением.
- Выполните постгибридизационные промывки 2 раза по 15 мин каждая с 0,1x SSC, 0,1% SDS при 55 °C с вращением.
- Выполните постгибридизационные промывки 2 раза по 15 мин каждая с 0,1x SSC, 1,5% SDS при 55 °C с вращением.
- Снимите мембрану с гибридизационной пробирки и подвергните мембрану воздействию люминографического экрана на срок до 3 дней, чтобы получить радиоактивные отпечатки на пленке.
- Получение изображений пленки с помощью системы лазерного сканирования с люминографической визуализацией.
- Пробоподготовка
- Анализ белков
- Пробоподготовка
- Отрегулируйте все образцы белка до их окончательных объемов (200 мкл, 100 мкл, 100 мкл, 20 мкл и 20 мкл для образцов экстракта сырых клеток, входных, проточных, гранул и элюата соответственно), добавив 1 мкл β-меркаптоэтанола, буфер для образцов PAGE LDS (1x) и dH2O.
- Денатурируют образцы при 95 °C в течение 5 мин.
- Вестерн-блоттинг-анализ
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте SDS-PAGE и вестерн-блоттинг по стандартным протоколам15,16.- Загрузите 15 мкл каждого образца в каждую лунку геля SDS-PAGE толщиной 1,5 мм.
- Проводят иммуноокрашивание блота с использованием антител PAP (1:2 000) и LexA (1:1 000) с ночной инкубацией при 4 °C. Развести в 5% растворе сухого молока/ПБСТ.
ПРИМЕЧАНИЕ: После ПАП-анализа блот может быть удален с помощью протокола мягкой стриппинга17 перед иммуноокрашиванием вторым антителом LexA.
- Пробоподготовка
(1)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Очистка домена хроматина ARS316 ~1,4 kb была опосредована конститутивно экспрессируемым белком-адаптером LexA-TAP. В качестве отрицательного контроля мы проводили очистки с использованием изогенного штамма, экспрессирующего LexA-TAP, но не содержащего интегрированных RS и LexA-связывающих сайтов. На рисунке 3 показаны результаты анализа ДНК стандартного эксперимента по очистке, проведенного как на контрольном, так и на рекомбинационно-компетентном штамме, нацеленном на локус ARS316. После выделения ДНК и расщепления ферментом рестрикции для линеаризации кольцевых молекул ДНК был проведен количественный ПЦР-анализ для оценки эффективности очистки целевого локуса ARS316 по сравнению с неродственным геномным контрольным локусом PDC1.
Кроме того, было количественно оценено обогащение локуса ARS316 по общему хроматину (рис. 3A, B). Отрицательный контрольный штамм не показал восстановления локусов ARS316 или PDC1 ни в одной из фракций, за исключением экстракции, ввода и протекания сырых клеток, что позволяет предположить, что специфического обогащения в ТЭВ и денатурирующих элюциях не наблюдалось. В отличие от этого, локус ARS316 был количественно истощен в потоке в рекомбинационном штамме и мог быть восстановлен на шариках после элюирования ТЭВ и при денатурирующем элюировании. После элюирования ТЭВ гранулы показали более высокий процент восстановления локуса ARS316, так как эффективность расщепления ТЭВ не была 100%. Это привело к тому, что часть колец хроматина осталась связанной с бусинами. Эффективность расщепления протеазы ТЭВ может быть улучшена за счет увеличения объема элюирования выше 100 мкл. Напротив, денатурирующее элюирование показало 80%-90% восстановления локуса ARS316 в рекомбинационном штамме (рис. 3A), что соответствует высокому обогащению молекул ARS316 с учетом размера генома дрожжей (рис. 3B).
Для валидации результатов кПЦР дополнительно проводили южную блоттингу. Благодаря своей высокой чувствительности он может обнаруживать относительно более низкие концентрации целевой ДНК, что позволяет проводить количественный анализ образцов. Результаты, полученные при анализе саузерн-блоттинга с использованием радиоактивно меченого зонда, подтвердили специфическое обогащение локуса ARS316 фракциями, собранными из рекомбинационного штамма, но не фракциями контрольного штамма (рис. 3В). В рекомбинационном штамме наблюдалось более высокое обогащение локуса ARS316 на основе интенсивности сигнала в гранулах ТЭВ и образцах денатурационного элюирования, согласующихся с результатами кПЦР. Аналогичным образом, слабые сигналы, наблюдаемые в образцах гранул элюирования и денатурации TEV, согласуются с наблюдаемым низким обогащением локуса ARS316 в этих фракциях (рис. 3C).
Эффективность расщепления и вытягивания LexA-TAP также оценивали с помощью вестерн-блоттинг-анализа. Белок LexA-TAP имеет молекулярную массу ~80 кДа (рис. 4A). Как в рекомбинационном, так и в контрольном штаммах вестерн-блоттинг проводили с использованием антител PAP, которые нацелены на фрагмент белка А LexA-TAP в образцах очистки. Как и ожидалось, результаты продемонстрировали почти полное истощение LexA-TAP в проточной части, с восстановлением, наблюдаемым в конечных фракциях гранул и элюирующих фракциях (рис. 4B[i]). Антитело PAP также обнаруживает небольшой фрагмент белка А ~15 кДа, который остается на шариках после элюирования TEV. Тот же вестерн-блот был удален и иммуноокрашен антителами против фрагмента LexA LexA-TAP (рис. 4B[ii]), что показало комплементарные результаты (рис. 4B[ii]). Сильная полоса при ~50 кДа в обоих блотах указывает на тяжелую цепь IgG, связанную с магнитными шариками, которая перекрестно гибридизируется с конъюгатами первичных/вторичных антител (рис. 4B[ii]).
Рисунок 1: Схема построения штамма дрожжей. Модифицированный штамм дрожжей с интегрированным LexA и сайтами рекомбинации на хромосоме III трансформируют плазмидой (K238) с экспрессирующими кассетами для конститутивной экспрессии белка слияния LexA-TAP с использованием промотора TEF2 и кассетой экспрессии, индуцируемой галактозой, для экспрессии R-рекомбиназы (RecR) с использованием промотора GAL10. Плазмида линеаризуется путем рестрикционного расщепления SbfI, тем самым создавая гомологичные рекомбинационные плечи для интеграции экспрессионной кассеты в межгенную локацию на хромосоме I. Компетентные клетки отбираются на основе маркера отбора LEU2 на питательной среде, в которой отсутствует лейцин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Очистка локуса хроматина ARS316 от дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Локус ARS316 вырезается в виде колец хроматина из его геномного расположения в клетках дрожжей путем сайт-специфической рекомбинации, индуцированной галактозой. Эти кольца хроматина выделяют из экстракта сырых клеток с помощью аффинной метки LexA-TAP, связанной с магнитными шариками, связанными с IgG. Кольца хроматина могут быть высвобождены из шариков двумя методами: i) расщеплением, опосредованным протеазой TEV, или ii) элюированием денатурации с помощью раствора аммония. Пунктирная стрелка представляет возможность выполнения денатурационного элюирования после ТЭВ-опосредованного протеазного элюирования для высвобождения оставшихся связанных с шариками колец хроматина, поскольку эффективность расщепления протеазы ТЭВ не составляет 100%. В обведенных прямоугольниках представлены образцы, полученные на разных этапах очистки для анализа белков и ДНК. Аббревиатура: RS = сайты рекомбинации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Анализ ДНК для оценки очистки локуса ARS316. (A) Гистограмма, показывающая очистку локуса ARS316 и неродственного участка PDC1 в серии образцов ДНК, собранных во время очистки локуса хроматина ARS316 от рекомбинационного штамма дрожжей. (B) Гистограмма, показывающая обогащение локуса ARS316 по общему хроматину в серии образцов ДНК, собранных во время очистки локуса хроматина ARS316 от контрольных и рекомбинационных штаммов дрожжей. (C) Изображение Southern Blot, показывающее обогащение локуса ARS316 в серии образцов ДНК, собранных во время очистки локуса хроматина ARS316 от контрольных и рекомбинационных штаммов дрожжей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Анализ белков для оценки эффективности растяжения и расщепления LexA-TAP. (A) Карикатура, представляющая различные белковые домены белка слияния LexA-TAP, а также размер каждого домена. (B) Вестерн-блоттинговые изображения, показывающие иммуноокрашивание против (i) PAP и (ii) LexA в серии белковых образцов, собранных во время очистки локуса хроматина ARS316 от контрольных и рекомбинационных штаммов дрожжей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Блок-схема, показывающая потенциальное применение доменов хроматина, очищенных с помощью аффинной очистки LexA-TAP. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Таблица 1: Список решений и носителей, используемых в этом протоколе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.
Таблица 2: Программа количественной ПЦР. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Идентификация факторов и хроматинового ландшафта конкретной целевой области генома по-прежнему представляет собой серьезную проблему в исследованиях хроматина18. Этот протокол описывает эффективную систему специфического удаления и очистки различных доменов хроматина из хромосом дрожжей. Насколько нам известно, чистота и выход этой одноступенчатой очистки преодолевают многие ограничения локус-специфических методов очистки хроматина, что позволяет достичь очень высокого обогащения целевых локусов по сравнению с другими неродственными областями генома.
Благодаря дополнительному этапу эксцизии с использованием сайт-специфической R-рекомбиназы еще одним преимуществом является то, что можно точно определить, какая область генома очищается, в зависимости от точного расположения сайтов рекомбинации в геноме. В отличие от них, другие методы основаны на сдвиге ДНК с помощью ультразвука, что приводит к гетерогенной длине молекул; Эта гетерогенность делает эти методы менее точными с точки зрения очистки четко определенного целевого локуса.
Наконец, эта стратегия очистки использует естественные условия без включения химических сшивающих веществ, таких как формальдегид. Таким образом, изолированный материал, полученный таким подходом, поддается структурному и функциональному анализу. Критическим этапом в протоколе очистки является эффективность элюирования ТЭВ, которая сильно зависит от нескольких параметров, включая активность протеазы ТЭВ, условия реакции и объемы реакции. Для показанного эксперимента объем элюирования был установлен минимальным, что повлияло на эффективность элюирования. Тем не менее, увеличение объема и количества протеазы ТЭВ может значительно повысить эффективность элюирования. Несмотря на низкую эффективность, элюирование ТЭВ обеспечивает высокоспецифичное расщепление и восстановление нужных доменов хроматина. Для сравнения, денатурационное элюирование имеет эффективность элюирования более 90%, но может элюировать некоторые неспецифические молекулы ДНК или белка из шариков. Таким образом, выбор метода зависит от желаемого последующего применения изолированного материала. Например, было продемонстрировано, что денатурирующее элюирование позволяет проводить масс-спектрометрическую идентификацию ассоциированных факторов хроматина, в то время как нативное элюирование ТЭВ предпочтительно для последующих функциональных анализов, таких как транскрипция in vitro или репликационные анализы. На рисунке 5 обобщены потенциальные последующие применения описанного протокола очистки. Таким образом, этот улучшенный рабочий процесс и высокоэффективный метод изучения состава хроматина отдельных локусов решает давнюю проблему в исследованиях хроматина.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.
Acknowledgments
Работа в лаборатории S.H. поддерживалась DFG через SFB1064 (идентификатор проекта 213249687), Европейским исследовательским советом (ERC Starting Grant 852798 ConflictResolution) и Обществом Гельмгольца.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast strains | |||
| Control Strain: MATa; ura3Δ0; leu2Δ0; his3Δ1; met15Δ0; bar1::kanMX4; Chr I 212kb::LEU2 pTEF2-LEXA-TAP pGAL1-10 RecR | Section 1, see references 13 and 14 | ||
| Recombination Strain: MATa; ura3Δ0; leu2Δ0; his3Δ1; met15Δ0; bar1::kanMX4; RS_LEXA_NS-3_ARS316_NS+3_RS; Chr I 212kb::LEU2 pTEF2-LEXA-TAP pGAL1-10 RecR | Section 1, see reference 13 and 14 | ||
| Plasmid | |||
| K238 plasmid | Section 1, see reference 13 Storage: Store at -20 °C |
||
| K071 Spike-in plasmid DNA | Section 7.1, see reference 13 Storage: Store at -20 °C |
||
| Reagents | |||
| Acetone | Carl Roth | 5025.1 | Section 2 Storage: Store at room temperature |
| Ammonium acetate (NH4Ac) | Sigma Aldrich | A7262 | Section 6 and 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Ammonium solution (NH4OH) 25% | Merck Millipore | 533003 | Section 6 Storage: Store at room temperature |
| Ammonium sulfate | Santa Cruz | Sc-29085 | Section 2 Storage: Store at room temperature |
| Bacto agar | BD (VWR) | 90000-760 | Section 3 Storage: Store at room temperature |
| Bacto peptone | BD (VWR) | 211820 | Section 3 Storage: Store at room temperature |
| β-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | 07604 | Section 7.2 Storage: Store at 4 °C |
| Chemiluminescent substrate kit | ThermoFisher | 34580 | Section 7.2 Storage: Store at 4 °C |
| Di-Sodium Hydrogen phosphate dodecahydrate | Merck | 1.06579.1000 | Section 2 and 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Dithiothreitol (DTT) | ThermoFisher | 15508013 | Section 4 Storage: Store at 4 °C |
| Ethanol | Merck | 100983 | Section 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | ED | Section 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Galactose (20% (w/v) stock) | Sigma Aldrich | G0625-1KG / 5KG | Section 3 Storage: Store at room temperature |
| Gel loading dye (6x) | BioLabs | B7024A | Section 7.1 Storage: Store at -20 °C |
| Glusose | Sigma-Aldrich | G8270 | Section Storage: Store at room temperature |
| Glycine | Carl Roth | .0079.4 | Section 2 Storage: Store at room temperature |
| Glycogen (5 mg/mL) | Invitrogen | AM9510 | Section 7.1 Storage: Store at -20 °C |
| Hydrochloric acid (HCl) | PanReac AppliChem | 182109.1211 | Section 2, 4 and 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Magnesium Acetate (MgAc) | Bernd Kraft | 15274.2600/C035 | Section 4 Storage: Store at room temperature |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma Aldrich | M8266 | Section 6 Storage: Store at room temperature |
| Nu PAGE LDS sample buffer (4x) | Invitrogen | 2399549 | Section 7.2 Storage: Store at room temperature |
| Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1 v/v) | Invitrogen | 15593-031 | Section 7.1 Storage: Store at 4 °C |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9541 | Section 4 Storage: Store at room temperature |
| Radioactively labeled α-32P dATP (3,000 Ci/mmol, 10 mCi/mL) | Hartmann Analytic | SRP-203 | Section 7.1 Storage: Store at 4 °C |
| RadPrime labeling system | ThermoFisher | 18428-011 | Section 7.1 Storage: Store at -20 °C |
| Raffinose (20% (w/v) stock) | SERVA | 34140.03 | Section 3 Storage: Store at room temperature |
| Sodium chloride (NaCl) | Merck | K53710504142 | Section 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Sodium citrate (Na3C6H5O7) | Sigma-Aldrich | 71402 | Section 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma Aldrich | S5881 | Section 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Sodium n-dodecyl sulfate (SDS) (5% stock (w/v) ) | Alfa Aesar | A11183 | Section 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | 71496 | Section 2 and 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Sodium azide | Santa Cruz Biotechnology | sc-208393 | Section 2 Storage: Store at -20 °C |
| Triethylamine | Sigma Aldrich | 90340 | Section 2 Storage: Store at room temperature |
| Tris base | Chem Cruz | SC-3715B | Section 2 and 4 Storage: Store at room temperature |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | Section 2 and 4 Storage: Store at room temperature |
| Tween-20 | Bernd Kraft | 18014332 | Section 4 Storage: Store at room temperature |
| Yeast extract | BD (VWR) | 212720 | Section 3 Storage: Store at room temperature |
| Yeast mating factor alpha (1 µg/mL stock ) | Biomol | Y2016.5 | Section 3 Storage: Store at -20 °C |
| Yeast Synthetic Drop-out medium Supplements without LEUCINE | Sigma Aldrich | Y1376 | Section 1, see reference 14 |
| Enzymes | |||
| HpaI restriction enzyme (5,000 U/mL) | NEB | R0105S | Section 7.1 Storage: Store at -20 °C |
| Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100x) | ThermoFisher Scientific | 78446 | Section 4 Storage: Store at4 °C |
| Proteinase K (10 mg/mL) | SERVA | 33756 | Section 7.1 Storage: Store at -20 °C |
| RNase A (10 mg/mL) | ThermoFisher | EN0531 | Section 7.1 Storage: Store at -20 °C |
| TEV protease (10000 U/µL) | NEB | P8112S | Section 5 Storage: Store at -20 °C |
| Materials | |||
| BcMag Epoxy-Activated Magnetic Beads | Bioclone Inc. | FC-102 | Section 2 Storage: Store at 4 °C |
| Dry ice | Section 4 | ||
| Low-binding centrifuge tubes 2.0 mL | Eppendorf | 22431102 | Section 4 |
| Microspin G-25 Columns | Cytiva | 27-5325-01 | Section 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Parafilm | Merck | P7793 | Section 4 |
| Positive nylon membrane | Biozol | 11MEMP0001 | Section 7.1 Storage: Store at room temperature |
| PVDF transfer membrane | Immobilon-Merck Millipore | IPVH00010 | Section 7.2 Storage: Store at room temperature |
| SDS-PAGE gel 4-12% bis-tris (15 well, 1.5 mm) | Invitrogen | NP0336BOX | Section 7.2 Storage: Store at 4 °C |
| Syringe (25 mL) with luer fitting | Henke Sass Wolf | 4200-000V0 | Section 3 |
| Whatman paper (Grade 3MM CHR Cellulose Western Blotting Paper Sheet) | Cytiva | 3030-917 | Section 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Antibodies | |||
| Anti-LexA, rabbit polyclonal IgG, DNA binding region antibody | Merck Millipore | 06-719 | Section 7.2 Storage: Store at -20 °C |
| Goat Anti-Rabbit IgG (H+L), Horseradish peroxidase conjugate | Invitrogen | G21234 | Section 7.2 Storage: Store at -20 °C |
| Peroxidase Anti-Peroxidase (PAP) antibody produced in rabbit for the detection of TAP-tagged proteins | Sigma Aldrich | P1291-500UL | Section 7.2 Storage: Store at -20 °C |
| Rabbit IgG antibodies | Sigma | I5006-100MG | Section 2 Storage: Store at 4 °C |
| Primers (10 µM) | |||
| ARS316: fwd 5'- CGGCATTATCGTACACAACCT, rev 5'- GTTCTTCGTTGCCTACATTTTCT | Section 7.1 | ||
| K071 Spike-in plasmid DNA: fwd: 5'-TTTTCGCTGCTTGTCCTTTT, rev 5'- CATTTTCGTCCTCCCAACAT | Section 7.1 | ||
| PCR fragment from yeast genomic DNA as a template for ARS316 amplification (for southern blot): fwd 5’- AAATTCTGCCCTTGATTCGT rev 5’- TTTGTTTATCTCATCACTAAT | Section 7.1 | ||
| PDC1: fwd 5'- CATGATCAGATGGGGCTTCA, rev 5'-ACCGGTGGTAGCGACTCTGT | Section 7.1 | ||
| Equipment | |||
| Coffee grinder | Gastroback | 42601 | Section 4 |
| Dewar flask | NAL GENE | 4150-2000 | Section 3 |
| DynaMag TM-2 magnetic rack | Invitrogen | 12321D | Section 4, 5 and 6 |
| Hybridization oven | Hybaid Mini10 | Ri418 | Section 2 |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424R | Section 4 and 7.1 |
| UV-crosslinker | Analytikjena | 95-0174-02 | Section 7.1 |
References
- Kornberg, R. D., Lorch, Y. Twenty-five years of the nucleosome, fundamental particle of the eukaryote chromosome. Cell. 98 (3), 285-294 (1999).
- Gauchier, M., van Mierlo, G., Vermeulen, M., Déjardin, J. Purification and enrichment of specific chromatin loci. Nature Methods. 17 (4), 380-389 (2020).
- Korthout, T., et al. Decoding the chromatin proteome of a single genomic locus by DNA sequencing. PLoS Biology. 16 (7), e2005542 (2018).
- Antão, J. M., Mason, J. M., Déjardin, J., Kingston, R. E. Protein landscape at Drosophila melanogaster telomere-associated sequence repeats. Molecular and Cellular Biology. 32 (12), 2170-2182 (2012).
- Déjardin, J., Kingston, R. E. Purification of proteins associated with specific genomic loci. Cell. 136 (1), 175-186 (2009).
- Ide, S., Dejardin, J. End-targeting proteomics of isolated chromatin segments of a mammalian ribosomal RNA gene promoter. Nature Communications. 6, 6674 (2015).
- Unnikrishnan, A., Gafken, P. R., Tsukiyama, T. Dynamic changes in histone acetylation regulate origins of DNA replication. Nature Structural & Molecular Biology. 17 (4), 430 (2010).
- Buxton, K. E., et al. Elucidating protein-DNA interactions in human alphoid chromatin via hybridization capture and mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 16 (9), 3433-3442 (2017).
- Kennedy-Darling, J., et al. Discovery of chromatin-associated proteins via sequence-specific capture and mass spectrometric protein identification in Saccharomyces cerevisiae. Journal of Proteome Research. 13 (8), 3810-3825 (2014).
- Liu, S. J., et al. CRISPRi-based genome-scale identification of functional long noncoding RNA loci in human cells. Science. 355, 7111 (2017).
- Hamperl, S., et al. Purification of specific chromatin domains from single-copy gene loci in Saccharomyces cerevisiae. Functional Analysis of DNA and Chromatin. 1094, 329-341 (2014).
- Hamperl, S., et al. Compositional and structural analysis of selected chromosomal domains from Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 42 (1), 2 (2014).
- Weiβ, M. Single-copy locus proteomics of early- and late-firing DNA replication origins identifies a role of Ask1/DASH complex in replication timing control. Cell Reports. 42 (2), 112045 (2023).
- Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nature Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Western blot membrane stripping for restaining protocol. Abcam. , Available from: https://www.abcam.com/protocols/western-blot-membrane-stripping-for-restaining-protocol (2023).
- Vermeulen, M., Déjardin, J.
