Summary
Bu protokol, tomurcuklanan maya, Saccharomyces cerevisiae'den doğal kromatin bağlamında ilgilenilen tek kopyalı bir gen lokusunu saflaştırmak için bölgeye özgü rekombinasyona dayalı lokusa özgü bir kromatin izolasyon yöntemi sunar.
Abstract
Ökaryotik kromatinin temel organizasyon birimi, bir histon oktamerinin etrafına ~1.7 kez sarılmış DNA'yı içeren nükleozom çekirdek parçacığıdır (NCP). Kromatin, NCP'lerin ve transkripsiyon faktörleri, kromatin yeniden şekillenmesi ve modifiye edici enzimler dahil olmak üzere çok sayıda başka protein kompleksinin varlığı olarak tanımlanır. Bu protein-DNA etkileşimlerinin, hücre döngüsünün farklı aşamalarında spesifik genomik lokuslar düzeyinde nasıl düzenlendiği hala belirsizdir. Bunun başlıca nedeni, bu tür dinamik etkileşimlerin hassas ölçümlerini elde etmeyi zorlaştıran mevcut teknik sınırlamalardır. Burada, doğal kromatin durumunda ilgilenilen tek kopyalı bir gen lokusunu izole etmek için bölgeye özgü rekombinasyonu verimli bir tek adımlı afinite saflaştırma protokolü ile birleştiren geliştirilmiş bir yöntemi açıklıyoruz. Yöntem, hedef lokusun genomik kromatin üzerinde sağlam bir şekilde zenginleştirilmesine izin vererek, bu tekniği protein etkileşimlerini tarafsız ve sistematik bir şekilde, örneğin kütle spektrometrisi ile tanımlamak ve ölçmek için etkili bir strateji haline getirir. Bu tür bileşimsel analizlere ek olarak, bu yöntemle saflaştırılan doğal kromatin, muhtemelen nükleozom konumlandırma ve histon modifikasyonları ile ilgili in vivo durumu yansıtır ve bu nedenle, mayadaki hemen hemen her genomik lokustan türetilen kromatinin daha ileri yapısal ve biyokimyasal analizlerine uygundur.
Introduction
Ökaryotik genomların kromatine dinamik organizasyonu, DNA'yı çekirdeğin sınırlarına sığacak şekilde sıkıştırırken, gen ekspresyonu için yeterli dinamikleri ve düzenleyici faktörler için erişilebilirliği sağlar. Kısmen, bu çok yönlülüğe, histon oktamer1'in etrafına ~1.7 kez sarılmış 147 bp DNA'ya sahip bir çekirdek parçacığı içeren kromatinin temel birimi olan nükleozom aracılık eder. Nükleozom, N ve C terminal histon kuyruklarında çok sayıda histon varyantı ve posttranslasyonel modifikasyon (PTM'ler) ile bileşimine göre oldukça dinamik bir yapıdır. Ayrıca, ökaryotik kromatin, transkripsiyon faktörleri, DNA ve RNA işleme makineleri, mimari proteinler, kromatinin yeniden şekillenmesi ve modifikasyonunda yer alan enzimler ve kromatin ile ilişkili RNA molekülleri gibi çok sayıda başka temel bileşenle etkileşime girer. Transkripsiyon, replikasyon ve onarımda yer alan bu önemli makinelerin tümü, bu işlemler için doğal substrat görevi gören kromatine erişim gerektirir. Sonuç olarak, bu DNA işlemlerinin altında yatan moleküler mekanizmaların anlaşılması, bu makinelerin birleştiği ve biyolojik reaksiyonları kolaylaştırdığı spesifik genomik bölgelerdeki kromatin yapısındaki kolektif değişikliklerin kesin bir tanımını gerektirir.
Genetik ve protein-protein etkileşimi çalışmaları yoluyla çok sayıda kromatin faktörünün tanımlanmasına rağmen, belirli genomik bölgelerde kromatin etkileşimlerinin doğrudan, tarafsız ve kapsamlı analizlerinin yapılması önemli bir engel olarak kalmıştır 2,3. Başlangıçta, genomun yalnızca yüksek oranda bol bölgeleri (yani, tekrarlayan lokuslar) veya çok kopyalı plazmitler, ilişkili proteinlerinkütle spektrometrik tanımlaması için yeterli miktarda ve saflıkta izole edilebilirdi 4,5,6,7. Yakalama problarının kromatinize DNA'ya doğrudan hibridizasyonuna, CRISPR-dCas9 sistemi kullanılarak yakınlık biyotinilasyonuna veya diziye özgü adaptör proteinlerinin ilgilenilen lokusa bağlanmasına dayanan bir dizi yeni yaklaşım, maya ve memeli genomlarından tek kopya lokusların proteomunu çözmeye başlamıştır 8,9,10. Bununla birlikte, tüm bu yöntemler, protein-DNA etkileşimlerini stabilize etmek için formaldehit çapraz bağlama ve sonraki saflaştırma için kromatini çözündürmek için sonikasyon gerektirir. Birlikte, her iki manipülasyon da saflaştırılmış kromatinin müteakip yapısal ve fonksiyonel çalışmaları olasılığını dışlar.
Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için, daha önce maya 11,12'den hedeflenen kromozomal alanları çıkarmak için bölgeye özgü rekombinasyon kullanan bir metodoloji tasarladık. Özünde, ilgilenilen genomik bölge, Zygosaccharomyces rouxi'den bölgeye özgü R-rekombinaz için tanıma bölgeleri (RS) ile çevrilidir ve aynı zamanda aynı bölgedeki prokaryotik transkripsiyonel baskılayıcı LexA proteini (LexA) için üç DNA bağlanma bölgesinden oluşan bir grup içerir. Maya hücreleri, R-rekombinazın eşzamanlı ekspresyonu için bir ekspresyon kaseti ve bir tandem afinite saflaştırma (TAP) etiketine kaynaşmış bir LexA proteini içerir. R-rekombinazın indüksiyonundan sonra, enzim hedeflenen bölgeyi kromozomdan dairesel bir kromatin alanı şeklinde verimli bir şekilde çıkarır. Bu alan, LexA DNA bağlanma bölgelerine ve ayrıca bir afinite desteğine bağlanan LexA-TAP adaptör proteini aracılığıyla saflaştırılabilir. Bu yöntem son zamanlarda maya kromozomu III13'ün seçilmiş replikasyon kökenlerini içeren farklı kromatin alanlarını izole etmek için kullanılmıştır.
Bu ex vivo yaklaşımın en büyük avantajlarından biri, izole edilmiş malzemenin fonksiyonel analizlerine izin vermesidir. Örneğin, bu yöntemle saflaştırılan replikasyon orijin alanları, doğal in vivo montajlı kromatin şablonlarından bir test tüpünde orijin ateşlemesinin verimliliğini değerlendirmek için in vitro replikasyon testlerine tabi tutulabilir. Sonuç olarak, izole edilmiş materyalin biyokimyasal ve fonksiyonel karakterizasyonu, doğal kromatin şablonu ile birlikte saflaştırılmış proteinler kullanılarak nükleer işlemlerin yeniden oluşturulmasına izin verebilir. Özetle, bu metodoloji, belirli bir kromozomal işlem geçiren belirli bir genomik bölgenin kolektif bileşimsel ve yapısal kromatin değişikliklerini takip etmek mümkün olacağından, kromatin araştırmalarında heyecan verici bir yol açar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokolde kullanılan tüm malzeme ve aletlerle ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın. Kullanılan çözümlerin, arabelleklerin ve ortamların listesi için Tablo 1'e bakın.
1. Rekombinant maya suşu yapısı
- Rekombinasyona yetkin bir maya suşu oluşturmak için, SbfI ile sindirilmiş plazmid K238'i, ilgilenilen lokusta entegre LexA bağlanma bölgeleri ve RS rekombinasyon bölgeleri olan bir maya suşuna dönüştürün13,14.
NOT: Dönüştürülmüş SbfI kısıtlama fragmanı, ekspresyon kasetinin homolog rekombinasyon ile genomik entegrasyonu için maya kromozomu I'in homolog dizileri ile birlikte LexA-TAP füzyon proteini ve R-rekombinazın yapısal ekspresyonu için gerekli ekspresyon kasetini içerir (Şekil 1). - Bir kontrol suşu oluşturmak için, entegre RS ve LexA bağlanma bölgelerinden yoksun bir izojenik maya suşu alın ve rekombinasyona yetkin suş için kullanılanla aynı koşullar altında SbfI ile sindirilmiş K238 plazmidi ile dönüştürün.
- SCD-LEU agar plakaları14 üzerindeki LEU2 seçim işaretleyicisine dayalı olarak yetkili maya hücrelerini seçin.
2. IgG antikorlarının epoksi ile aktive edilmiş manyetik boncuklara bağlanması
NOT: IgG antikorlarını epoksi ile aktive edilen manyetik boncuklara aşağıdaki yayınlanmış protokol11'e göre eşleştirin.
- 50 mL'lik konik bir tüpte 10 mL% 50 asetonda (300 mg ~5.1 ×10 10 boncuğa karşılık gelir) 300 mg epoksi ile aktive edilmiş boncukları askıya alın. Bir girdap karıştırıcı üzerinde kuvvetlice çalkalayın.
- Boncukları içeren tüpü 820 × g ve 4 °C'de 2 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın.
- Boncukları 3x 20 mL 0.1 M sodyum fosfat tamponu (pH 7.4) ile yıkayın. Her yıkama adımından sonra süpernatanı adım 2.2'de açıklandığı gibi santrifüjleme ile çıkarın.
- Boncukları 16 mL 0.1 M sodyum fosfat tamponunda (pH 7.4) süspanse edin ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca bir hibridizasyon fırınında hafifçe döndürün.
- Tavşan IgG'lerini (100 mg) 7 mLdH2O(son konsantrasyon: 14 mg / mL) içinde çözün.
- Süspansiyonu netleştirmek için IgG süspansiyonunu 13.000 × g ve 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin.
- 3.5 mL süpernatanı (50 mg tavşan IgG'sine karşılık gelir) yeni bir 50 mL konik tüpe aktarın.
- IgG çözeltisini 9.85 mL 0.1 M sodyum fosfat tamponu (pH 7.4) ile seyreltin, ardından hafifçe karıştırma altında 0.1 M sodyum fosfat (pH 7.4) içinde damla damla 6.65 mL 3 M amonyum sülfat ekleyin.
NOT: Çözeltiye hızlı bir şekilde amonyum sülfat eklemekten kaçının, çünkü yüksek yerel tuz konsantrasyonu tavşan IgG'lerinin çökelmesine neden olur. - IgG çözeltisini 820 × g ve 4 °C'de 3 dakika santrifüjleyin ve elde edilen süpernatanı manyetik boncuk süspansiyonuna ekleyin.
- Tüpü gece boyunca veya en az 18 saat boyunca 30 °C'de bir hibridizasyon fırınında hafifçe döndürerek inkübe edin.
- Süpernatanı adım 2.2'de açıklandığı gibi çıkarın.
- Boncukları 20 mL 100 mM glisin-HCl (pH 2.5) ile yıkayın. IgG polipeptitlerinin denatürasyonunu önlemek için çözeltiyi adım 2.2'de açıklandığı gibi hızla çıkarın.
- Boncukları bir kez 20 mL 10 mM Tris-HCl (pH 8.8) ile yıkayın. Süpernatanı adım 2.2'de açıklandığı gibi aspire edin.
- Kalıntı reaktif epoksi gruplarını etkisiz hale getirmek için hafif rotasyon altında 5-10 dakika boyunca 20 mL 0.1M trietilamin çözeltisi ekleyin. Süpernatanı adım 2.2'de açıklandığı gibi çıkarın.
- Boncukları 4x 20 mL PBS (pH 7.4) ile 5 dakika boyunca hafifçe döndürerek yıkayın. Her yıkama adımından sonra süpernatanı adım 2.2'de açıklandığı gibi çıkarın.
- Boncukları 2x 20 mL PBS (pH 7.4) ile% 0.5 Triton X-100 (a / h) ile her biri 5 dakika ve 15 dakika boyunca bir hibridizasyon fırınında hafif rotasyon altında yıkayın. Süpernatanı adım 2.2'de açıklandığı gibi çıkarın.
- Boncukları,% 0.02 sodyum azid (a / h) ile 16 mL PBS (pH 7.4) nihai hacminde askıya alın. Kullanana kadar 4 °C'de 1 mL alikot olarak saklayın.
3. Maya hücre kültürü ve hasadı
- YPD plakalarından kontrol ve rekombinasyona yetkin maya suşlarını 5 mL YPR ortamında aşılayın ve gece boyunca 30 °C ve 200 rpm'de inkübe edin.
- Bu kültürün 2 mL'sini 100 mL YPR ortamına aşılayın ve gece boyunca 30 °C ve 200 rpm'de inkübe edin.
- Her suş için, iki 5 L Erlenmeyer şişesinin her birine (her suş için toplam 4 L kültür ortamı, iki şişeye bölünmüş) 1.800 mL otoklavlanmış YP ortamı ve 200 mL otoklavlanmış rafinoz çözeltisi (% 20 a/h) dağıtın.
- Büyüyen maya hücrelerini OD600 0.2'de kendi ortamlarında aşılayın ve adım 3.1'de açıklandığı gibi yaklaşık 6 saat boyunca veya hücreler istenen OD600 / 1.0'a ulaşana kadar inkübe edin. Hücrelerin herhangi bir kontaminasyondan arınmış normal büyümesini sağlamak için OD'yi 2 saat aralıklarla kontrol edin.
- Bölgeye özgü rekombinasyonu indüklemek için 200 mL galaktoz (%20 a/h) ekleyin.
- G1 fazındaki hücreleri tutuklamak için 110 μL (50 ng / mL) YMFA (galaktoz ile aynı anda, adım 3.5) ekleyin ve 2 saat inkübe edin.
NOT: YMFA'nın hücrelere eklenmesi, deneysel koşullara ve ele alınacak biyolojik soruya bağlıdır. Kesin olarak, bu deney için, lisanslı replikasyon kökenlerine sahip homojen bir hücre popülasyonu elde etmek için hücreler G1 fazında durdurulur; Bu süreçte, replikatif kompleks, S fazında DNA replikasyonunun başlamasından önce G1 fazındaki orijinlere bağlanır. - Hücre süspansiyonunu 1 L'lik santrifüj kovalarına aktarın ve 6.000 × g ve 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve hücre peletlerini toplam 10-15 mL dH2O hacminde yeniden süspanse edin.
- 25 mL'lik bir şırıngayı bir Luer tapası ile kapatın ve suyla dolu 50 mL'lik konik bir tüpün içine yerleştirin. Hücre süspansiyonunu şırınga düzeneğine aktarın ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 2.397 × g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın.
- Luer tapasını şırıngadan çıkarın ve hücre "spagetti" oluşturmak için hücreleri sıvı nitrojene ekstrüde edin.
NOT: 4 L kültür ortamının kullanılması, 7-10 g'lık bir ıslak nihai hücre peletleri sağlar. - Dondurulmuş hücreli spagettiyi 50 mL'lik konik bir tüpe aktarın ve daha fazla kullanana kadar −80 °C'de saklayın.
4. Kromatin lokusu saflaştırması
NOT: Bu lokusa özgü kromatin saflaştırma protokolünde yer alan adımların şematik bir özeti için Şekil 2'ye bakın.
- Ticari bir kahve öğütücüsünü, kahve öğütücüyü her seferinde 30 saniye boyunca 2 kez kuvvetlice sallayarak 30-50 g kuru buz öğüterek soğutun. Soğuduktan sonra kuru buz tozunu atın.
- Önceden soğutulmuş kahve değirmeninde 3 g donmuş maya hücreli spagettiyi ~30-50 g kuru buzla karıştırın.
- Öğütme sırasında maya hücresi tozunun kaybını önlemek için kapak ile öğütücü arasındaki bağlantıyı parafilm ile kapatın.
- Maya hücresi-kuru buz karışımını, her tur arasında 30 sn aralıklarla her seferinde 10 sn boyunca 10 kez öğütün (toplam süre tahmini: ~10 dakika). Kuru buz ve hücre tozunun kahve öğütücünün duvarlarına yapışmasını önlemek için, öğütme sırasında kahve öğütücünün kenarlarına sürekli olarak vurun.
- Elde edilen maya hücresi kuru buz tozunu temiz ve kuru bir spatula kullanarak plastik bir behere aktarın.
- Kuru buzu buharlaştırmak için beherleri oda sıcaklığında tutun.
- Kuru buz buharlaştıktan sonra, maya hücresi tozuna 1x proteaz ve fosfataz inhibitörleri (750 μL/g maya hücresi) içeren 2,25 mL MB tamponu ekleyin.
- Hücrelerin tamponla tamamen süspansiyonunu sağlamak için hücre-tampon karışımını kuvvetlice pipetleyin ve 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın.
- Elde edilen hücre süspansiyonundan (ham hücre ekstraktları [CCE]) DNA (%0.1) ve protein (%0.05) analizi için örnekler alın. Daha fazla işleme kadar −20 °C'de saklayın (bölüm 7'de açıklanmıştır).
- Hücre süspansiyonunu düşük bağlayıcı 2 mL reaksiyon tüplerine aktarın ve hücre kalıntılarını ham hücre lizatından ayırmak için 4 ° C'de 30 dakika boyunca 21.130 × g'da santrifüjleyin.
- Tüm tüplerdeki süpernatanları 15 mL'lik bir konik tüpte toplayın.
- DNA (% 0.1) ve protein analizi (% 0.05) için süpernatanttan (giriş [IN]) örnekler alın. Daha fazla işleme kadar −20 °C'de saklayın (bölüm 7'de açıklanmıştır).
- 500 μL IgG'ye bağlı manyetik boncuk bulamacını (her maya suşu için), 20 rpm'de 4 °C'de 4 °C'de her biri 5 dakika boyunca 1x proteaz ve fosfataz inhibitörleri ile 500 μL soğuk MB tamponu ile 2x yıkayarak dengeleyin. Her yıkama adımından sonra manyetik bir raf kullanarak süpernatanı boncuklardan atın.
- IgG'ye bağlı manyetik boncukları, 20 rpm'de rotasyonda 4 ° C'de 1 saat boyunca 1x proteaz ve fosfataz inhibitörleri ile 500 μL soğuk MB tamponunda inkübe edin. Süpernatanı manyetik bir raf kullanarak boncuklardan atın.
- Dengelenmiş manyetik boncuk bulamacını hücre lizatı ile karıştırın ve 4 ° C'de 2 saat boyunca 20 rpm'de rotasyonla inkübe edin.
- Manyetik boncuk hücreli lizat süspansiyonunun tamamını düşük bağlayıcı reaksiyon tüplerine aktarın.
- Şimdi ilgilenilen kromatin halkalarını taşıyan manyetik boncukları, manyetik bir raf kullanarak hücre lizatından ayırın.
- Her tüpten kalan akışı (FT) 15 mL'lik yeni bir konik tüpe aktarın ve DNA (% 0.1) ve protein (% 0.05) analizi için örnekler alın. Daha fazla işleme kadar −20 °C'de saklayın (bölüm 7'de açıklanmıştır).
- Manyetik boncukları her tüpten 300 μL soğuk MB tamponuna süspanse edin ve boncukları bir reaksiyon tüpünde toplayın. 20 rpm'de 4 ° C'de 4 ° C'de 1x proteaz ve fosfataz inhibitörleri içeren 750 μL soğuk MB tamponu ile her biri 5x'i 10 dakika boyunca yıkayın. Son yıkamayı proteaz ve fosfataz inhibitörleri olmadan 750 μL soğuk MB tamponu ile gerçekleştirin.
- Boncukları proteaz ve fosfataz inhibitörleri olmadan 40 μL soğuk MB tamponunda askıya alın.
NOT: Elüatın nihai hacmi, beklenen aşağı akış uygulamasına göre ayarlanabilir. TEV elüsyonu genellikle 100-300 μL aralığında verimli bir şekilde çalışır.
5. TEV proteaz aracılı elüsyon
- LexA-CBP kromatin halka komplekslerini boncuklardan serbest bırakmak için, boncukları bir termomikserde 2 ° C ve 6 rpm'de gece boyunca 4 μL 450x His etiketli rekombinant TEV proteaz ile inkübe edin.
- Manyetik bir raf kullanarak boncukları son elüattan ayırın. Bölünmüş kromatin halkaları içeren elüatı yeni bir 1.5 mL reaksiyon tüpüne aktarın.
- Kalan boncukları son elüattan ayırmak için tüpleri tekrar manyetik bir rafta tutun.
- Boncukları (TB) 750 μL soğuk AC tamponunda yeniden süspanse edin ve DNA (% 0.1) ve protein (% 0.05) analizi için örnekler alın. Daha fazla işleme kadar −20 °C'de saklayın (bölüm 7'de açıklanmıştır).
- Son elüattan (TE), DNA (% 0.5) ve protein (% 0.25) analizi için örnekler alın. Daha fazla işleme kadar −20 °C'de saklayın (bölüm 7'de açıklanmıştır).
NOT: Nihai elüatın düşük hacmi nedeniyle, analiz sırasında protein ve DNA içeriğinin daha iyi bir temsilini elde etmek için DNA ve protein analizi için toplanan numunelerin yüzdesi arttırılır.
6. Denatürasyon elüsyonu
- Boncukları 2 kez 750 μL soğuk AC tamponunda 20 rpm'de 4 °C'de her seferinde 4 dakika boyunca yıkayın.
- Kalan bağlı LexA-kromatin komplekslerini çıkarmak için, boncuklara 500 μL 0.5MNH4OHekleyerek denatürasyon elüsyonu gerçekleştirin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
- Manyetik bir raf kullanarak boncukları süspansiyondan ayırın ve elüatı düşük bağlayıcı bir reaksiyon tüpüne aktarın.
- Elüattaki maksimum kromatin lokuslarını geri kazanmak için boncukları adım 6.2'deki gibi tekrar inkübe edin.
- Manyetik bir raf kullanarak boncukları süspansiyondan ayırın ve elde edilen elüatı adım 6.3'teki elüatı içeren aynı tüpte toplayın.
- Boncukları (DB) 750 μLdH2O'dayeniden süspanse edin ve DNA (% 0.1) ve protein (% 0.05) analizi için örnekler alın.
- Son elüattan (DE), DNA (% 0.5) ve protein (% 0.25) analizi için örnekler alın.
7. DNA ve protein analizi
- DNA analizi
- Numune hazırlama
- DNA örneklerine 100 μL IRN tamponu ekleyin ve hacmidH2Oile 200 μL'lik bir nihai hacme yükseltin.
- 1 ng K071 spike-in plazmit DNA'sı ekleyin.
- 1 μL RNAse A (10 mg/mL) ekleyin ve 37 °C'de 1 saat inkübe edin.
- 5 μL proteinaz K (10 mg/mL) ve 10 μL SDS (%20) ekleyin ve 56 °C'de 1 saat inkübe edin.
- 200 μL fenol/kloroform/izopropil alkol (25:24:1) ekleyin ve her seferinde 10 saniye boyunca 2 kez iyice girdaplayın.
- Organik ve sulu fazları ayırmak için numuneleri 21.130 × g'da 7 dakika santrifüjleyin.
- Süpernatanı 1.5 μL glikojen (5 mg/mL) ve 2.5x %100 etanol içeren yeni 1.5 mL'lik tüplere aktarın.
- DNA'yı çökeltmek için tüpleri en az 2 saat ve en fazla gece boyunca −20 ° C'de inkübe edin.
- 21.130 × g'da, 4 °C'de 45 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın.
- DNA peletini yeniden süspanse etmeden 150 μL %70 etanol ekleyin ve 10 dakika boyunca 4 °C'de 21.130 × g'da tekrar santrifüjleyin.
- DNA peletlerini oda sıcaklığında 10-15 dakika kurutun ve 40 μLdH2Oiçinde yeniden süspanse edin.
- Adım 7.1.1.11'de izole edilen DNA'yı HpaI restriksiyon endonükleazı ile doğrusallaştırmak için restriksiyon enzimi sindirimi gerçekleştirin. 50 μL'lik bir reaksiyon karışımı için, 40 μL izole DNA + 2 μL HpaI enzimi + 5 μL restriksiyon enzimi tamponu + 3 μLdH2Ogece boyunca 37 °C'de inkübe edin.
- qPCR analizi
- Restriksiyonla sindirilen DNA'yı 1:5 oranında seyreltin (40 μL dH2O'da 7.1.1.12 adımından elde edilen restriksiyonla sindirilmiş DNA'nın 10μL'si).
- ARS316 bölgesi, PDC1 ve spike-in plazmit DNA için tasarlanmış primer çiftleri kullanın.
- Tablo 2'de verilen programı kullanarak qPCR'yi çalıştırın.
- qPCR sonuçlarını, hedef olarak ARS316 bölgesini ve spike-in plazmit DNA'sını ve referans lokus olarak PDC1'i (veya başka herhangi bir gen veya genomik bölgeyi) kullanarak nispi miktar tayini ile analiz edin.
- ARS316 ve PDC1 primer nispi niceleme değerlerini her numune için alınan fraksiyon hacminin yüzdesine göre normalleştirerek PDC1 üzerinden ARS316 lokusu geri kazanım yüzdesini değerlendirin. Örneğin, akış için% 0.1'i 1,000 faktörü ve TEV elüatı için% 0.5'i 200 faktörü ile çarpın.
- ARS316 ve PDC1 geri kazanım yüzdelerini, spike-in plazmit DNA nispi kantifikasyon değerleri ile normalleştirin.
- Denklem (1) kullanılarak elde edilen bağıl niceleme hedefi/referans değerlerini değerlendirerek ARS316 lokusunun toplam kromatin üzerindeki zenginleşmesini değerlendirin.
(1)
- Güney leke analizi
- 20 μL restriksiyon enzimi ile sindirilmiş DNA örneğine 5 μL jel yükleme boyası ekleyin.
- Numuneleri ~3 saat boyunca 110 V'ta %1'lik bir agaroz jel içinde çalıştırın.
- Jeli bir tepsiye aktarın ve 20 dakika hafifçe çalkalayarak depurinasyon solüsyonuna batırın.
- JelidH2Oile durulayın ve çalkalayarak 15 dakika boyunca denatürasyon solüsyonuna batırın. Denatürasyon çözeltisini atın.
- Jeli hafifçe çalkalayarak 15 dakika denatürasyon solüsyonuna batırın.
- Jeli dH2O ile durulayın ve her seferinde 15 dakika boyunca 2 kez transfer tamponu ile hafifçe çalkalayarak yıkayın.
- Bir tepsiyi 1-1,5 L transfer tamponu ile doldurun ve sabit bir platform üzerine yerleştirin.
- Uzun bir Whatman kağıdı parçası kesin ve kağıdın iki ucu transfer tamponuna batırılacak şekilde platforma yerleştirin.
- Jelin boyutuna eşit bir şerit pozitif naylon membran ve dört şerit Whatman kağıdı kesin.
- Platformdaki transfer tamponuna batırılmış iki parça Whatman kağıdı yerleştirin.
- Jeli yüzü aşağı bakacak şekilde Whatman kağıt parçalarının üzerine yerleştirin.
- Jelin üzerine, pozitif naylon zarı yerleştirin, ardından kalan iki parça Whatman kağıdını transfer tamponuna batırın. Yığını transfer tamponu ile ıslak tuttuğunuzdan emin olun.
- Sıkışan hava kabarcıklarını bir cam çubuk kullanarak yuvarlayarak çıkarın.
- Birleştirilmiş yığının üzerine bir yığın kağıt havlu ve ardından 0,5 kg'lık bir nesne (örneğin bir cam şişe) yerleştirin.
- Düzeneği gece boyunca oda sıcaklığında transfer için bırakın.
- Transferden sonra, membranı toplam 1.200 J/cm2 enerji çıkışı ile UV çapraz bağlayın.
- ARS316 lokusunun tespiti için, referans DNA etiketleme sistemi kullanılarak sentezlenen radyoaktif probları kullanarak güney leke hibridizasyonu.
NOT: Aksi belirtilmedikçe bundan sonraki tüm adımları buz üzerinde gerçekleştirin. - Düşük bağlayıcı bir reaksiyon tüpünde, 25-40 ng PCR fragmanını (prob) 19 μLdH2Oiçinde seyreltin ve 95 ° C'de 5 dakika inkübe edin. Hemen buz üzerinde soğutun.
- Tüpe 500 μM dCTP, 500 μM dGTP ve 500 μM dTTP'nin her birine 1 μL ekleyin.
- Kit ile birlikte verilen rastgele nükleotid heksamerleri içeren tampondan 20 μL ekleyin.
- Tüpe 5 μL radyoaktif olarak etiketlenmiş nükleotid [α-32P] dATP ekleyin. Radyoaktif olarak etiketlenmiş materyali içeren tüm adımları radyoaktivite onaylı bir koruyucu ortam altında gerçekleştirin.
- 1 μL Klenow fragmanı ekleyin ve tek sarmallı DNA sentezi için bir termomikser üzerinde 37 °C'de 15 dakika inkübe edin.
- Reaksiyonu durdurmak için 5 μL durdurma tamponu ekleyin.
- Depolama arabelleğini çıkarmak için bir boyut dışlama sütununu 1.500 × g'da 2 dakika santrifüjleyin. Akışı atın ve sütunu yeni bir tüpe yerleştirin.
- Dahil edilmemiş radyoaktif nükleotidleri çıkarmak için prob karışımını kolondan geçirin. Probu toplamak için 1.500 × g'da 30 saniye santrifüjleyin.
- Probun membrana spesifik olmayan bağlanmasını engellemek için 150 μL somon sperm DNA'sı (1:100) ekleyin.
- Çift sarmallı DNA'yı denatüre etmek için prob karışımını 95 °C'de 5 dakika inkübe edin.
- Buz üzerinde birkaç saniye dondurun ve kapakta yoğunlaşan su damlacıklarını azaltmak için 500 × g'da birkaç saniye santrifüjleyin.
- Güney leke zarını hibridizasyon tamponu ile 5-10 dakika boyunca rotasyonla kısaca yıkayın.
- Membranı hibridizasyon tamponu ile 55 ° C'de 1 saat rotasyonla önceden hibridleyin. Hibridizasyon tamponunu atın.
- Hazırlanan prob ile birlikte membrana 15 mL taze hibridizasyon tamponu (55 °C'de önceden ısıtılmış) ekleyin. Membranı gece boyunca 55 °C'de döndürerek inkübe edin.
- Rotasyonla 55 °C'de 0,3x SSC, %0,1 SDS ile her biri 15 dakika boyunca 2x hibridizasyon sonrası yıkama gerçekleştirin.
- Rotasyonlu 55 °C'de 0,1x SSC, %0,1 SDS ile her biri 15 dakika boyunca 2x hibridizasyon sonrası yıkama gerçekleştirin.
- Rotasyonlu 55 °C'de 0,1x SSC, %1,5 SDS ile her biri 15 dakika boyunca 2x hibridizasyon sonrası yıkama gerçekleştirin.
- Membranı hibridizasyon tüpünden çıkarın ve film üzerindeki radyoaktif izleri elde etmek için membranı 3 güne kadar bir fosfor görüntüleyici ekranına maruz bırakın.
- Bir fosfor görüntüleme lazer tarama sistemi kullanarak filmin görüntülerini elde edin.
- Numune hazırlama
- Protein analizi
- Numune hazırlama
- 1 μL β-merkaptoetanol, PAGE LDS numune tamponu (1x) ve dH2O ekleyerek tüm protein örneklerini nihai hacimlerine (ham hücre ekstraktı, giriş, akış, boncuklar ve elüat numuneleri için sırasıyla 200 μL, 100 μL, 100 μL, 20 μL ve 20 μL) ayarlayın.
- Numuneleri 95 °C'de 5 dakika denatüre edin.
- Batı lekesi analizi
NOT: Standart protokolleri15,16 kullanarak SDS-PAGE ve batı lekeleme gerçekleştirin.- 1.5 mm'lik bir SDS-PAGE jelin her bir oyuğuna her bir numuneden 15 μL yükleyin.
- 4 ° C'de gece boyunca inkübasyon ile PAP (1: 2.000) ve LexA (1: 1.000) antikorlarını kullanarak lekenin immün boyamasını gerçekleştirin. % 5 kuru süt / PBST çözeltisi ile seyreltin.
NOT: PAP analizinden sonra, leke, ikinci LexA antikoru ile immün boyamadan önce hafif bir sıyırma protokolü17 kullanılarak sıyrılabilir.
- Numune hazırlama
(1)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
~ 1.4 kb ARS316 kromatin alanının saflaştırılmasına, yapısal olarak eksprese edilen LexA-TAP adaptör proteini aracılık etti. Negatif bir kontrol olarak hizmet etmek için, LexA-TAP'ı eksprese eden ancak entegre RS ve LexA bağlanma bölgeleri içermeyen izojenik bir suş kullanarak saflaştırmalar gerçekleştirdik. Şekil 3 , ARS316 lokusunu hedef alan hem kontrol hem de rekombinasyon yetkin bir suş üzerinde gerçekleştirilen standart bir saflaştırma deneyinden elde edilen DNA analiz sonucunu göstermektedir. Dairesel DNA moleküllerini doğrusallaştırmak için DNA izolasyonu ve restriksiyon enzim sindiriminden sonra, ARS316 hedef lokusunun ilişkisiz genomik kontrol lokusu PDC1 üzerindeki saflaştırma etkinliğini değerlendirmek için qPCR analizi yapıldı.
Ayrıca, ARS316 lokusunun toplam kromatin üzerindeki zenginleşmesi ölçülmüştür (Şekil 3A,B). Negatif kontrol suşu, ham hücre ekstraktı, girdi ve akış dışında fraksiyonların hiçbirinde ARS316 veya PDC1 lokuslarında herhangi bir geri kazanım göstermedi, bu da TEV'de ve denatüre edici elutiyonlarda spesifik bir zenginleşmenin gözlenemediğini düşündürdü. Buna karşılık, ARS316 lokusu, rekombinasyon suşundaki akışta kantitatif olarak tükenmiştir ve TEV elüsyonundan sonra ve denatüre edici elüsyonda boncuklar üzerinde geri kazanılabilir. TEV elüsyonundan sonra, TEV bölünme verimliliği %100 olmadığı için boncuklar ARS316 lokusunun daha yüksek bir geri kazanım yüzdesi gösterdi. Bu, kromatin halkalarının bir kısmının boncuklara bağlı kalmasına neden oldu. TEV proteaz bölünme verimliliği, elüsyon hacmi 100 μL'nin üzerine çıkarılarak iyileştirilebilir. Buna karşılık, denatüre edici elüsyon, maya genomunun boyutunu hesaba katarken ARS316 moleküllerinin yüksek zenginleşmesine karşılık gelen rekombinasyon suşunda ARS316 lokusunun %80-90 oranında geri kazanıldığını gösterdi (Şekil 3A).
qPCR sonuçlarını doğrulamak için ek olarak southern blot yapıldı. Yüksek hassasiyeti nedeniyle, nispeten daha düşük hedef DNA konsantrasyonlarını tespit edebilir, böylece numunelerin kantitatif analizine izin verir. Radyoaktif olarak etiketlenmiş prob kullanılarak yapılan güney leke analizinden elde edilen sonuçlar, rekombinasyon suşundan toplanan fraksiyonlarda ARS316 lokusunun spesifik zenginleşmesini doğruladı, ancak kontrol suş fraksiyonlarında değil (Şekil 3C). Rekombinasyon suşunda, qPCR sonuçlarıyla uyumlu olarak, TEV boncuklarındaki sinyal yoğunluğuna ve denatürasyon elüsyon örneklerine bağlı olarak ARS316 lokusunun daha yüksek zenginleşmesi gözlendi. Benzer şekilde, TEV elüsyonu ve denatürasyon boncuk örneklerinde gözlenen zayıf sinyaller, bu fraksiyonlarda ARS316 lokusunun gözlenen düşük zenginleşmesi ile uyumludur (Şekil 3C).
LexA-TAP bölünme ve aşağı çekme verimlilikleri de western blot analizi ile değerlendirildi. LexA-TAP proteininin moleküler ağırlığı ~80 kDa'dır (Şekil 4A). Hem rekombinasyon hem de kontrol suşlarında, saflaştırma örneklerinde LexA-TAP'ın protein A kısmını hedefleyen PAP antikoru kullanılarak western blot analizi yapıldı. Beklendiği gibi, sonuçlar, son boncuk ve elüsyon fraksiyonlarında iyileşme gözlenen akışta LexA-TAP'ın neredeyse tamamen tükendiğini gösterdi (Şekil 4B[i]). PAP antikoru ayrıca TEV elüsyonundan sonra boncuklar üzerinde kalan ~15 kDa'lık küçük protein A fragmanını da tespit eder. Aynı batı lekesi sıyrıldı ve LexA-TAP'ın LexA kısmına karşı bir antikor ile immün boyandı (Şekil 4B[ii]), tamamlayıcı sonuçlar gösterdi (Şekil 4B[ii]). Her iki lekede ~50 kDa'daki güçlü bant, birincil/ikincil antikor konjugatları ile çapraz hibritleşen manyetik boncuklara bağlı IgG ağır zincirini gösterir (Şekil 4B[ii]).
Şekil 1: Maya suşu yapısının şemaları. Kromozom III üzerinde entegre LexA ve rekombinasyon bölgelerine sahip modifiye edilmiş bir maya suşu, TEF2 promotörü kullanılarak LexA-TAP füzyon proteininin yapısal ekspresyonu için ekspresyon kasetleri ve bir GAL10 promotörü kullanılarak R rekombinaz (RecR) ekspresyonu için galaktozla indüklenebilir ekspresyon kaseti ile bir plazmit (K238) ile dönüştürülür. Plazmit, SbfI kısıtlama sindirimi ile doğrusallaştırılır, böylece ekspresyon kasetinin kromozom I üzerinde intergenik bir konuma entegrasyonu için homolog rekombinasyon kolları oluşturulur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: ARS316 kromatin lokusunun Saccharomyces cerevisiae mayasından saflaştırılması. ARS316 lokusu, galaktozun neden olduğu bölgeye özgü rekombinasyon ile maya hücrelerindeki genomik konumundan kromatin halkaları şeklinde eksize edilir. Bu kromatin halkaları, IgG'ye bağlı manyetik boncuklara bağlı LexA-TAP afinite etiketi kullanılarak ham hücre ekstraktından izole edilir. Kromatin halkaları boncuklardan iki yöntemle salınabilir: i) TEV proteaz aracılı bölünme veya ii) amonyum çözeltisi kullanılarak denatürasyon elüsyonu. Noktalı ok, TEV proteaz bölünme verimliliği %100 olmadığından, kalan boncuk bağlı kromatin halkalarını serbest bırakmak için TEV proteaz aracılı elüsyondan sonra denatürasyon elüsyonu gerçekleştirme olasılığını temsil eder. Belirtilen kutular, protein ve DNA analizleri için saflaştırmanın farklı aşamalarında elde edilen numuneleri temsil eder. Kısaltma: RS = rekombinasyon siteleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: ARS316 lokus saflaştırmasını değerlendirmek için DNA analizi. (A) ARS316 kromatin lokusunun rekombinasyon maya suşundan saflaştırılması sırasında toplanan bir dizi DNA örneğinde ARS316 lokusunun ve ilgisiz bir bölge olan PDC1'in saflaştırılmasını gösteren çubuk grafik. (B) Kontrol ve rekombinasyon maya suşlarından ARS316 kromatin lokusu saflaştırması sırasında toplanan bir dizi DNA örneğinde ARS316 lokusunun toplam kromatin üzerinden zenginleşmesini gösteren çubuk grafik. (C) Kontrol ve rekombinasyon maya suşlarından ARS316 kromatin lokusu saflaştırması sırasında toplanan bir dizi DNA örneğinde ARS316 lokusunun zenginleştirilmesini gösteren güney leke görüntüsü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: LexA-TAP aşağı çekme ve bölünme verimliliğini değerlendirmek için protein analizi. (A) LexA-TAP füzyon proteininin farklı protein alanlarını ve her bir alanın boyutunu temsil eden karikatür. (B) Kontrol ve rekombinasyon maya suşlarından ARS316 kromatin lokusu saflaştırması sırasında toplanan bir dizi protein örneğinde (i) PAP ve (ii) LexA'ya karşı immün boyamayı gösteren Western blot görüntüleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: LexA-TAP afinite saflaştırması kullanılarak saflaştırılan kromatin alanlarının potansiyel aşağı akış uygulamalarını vurgulayan akış diyagramı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 1: Bu protokolde kullanılan çözümlerin ve medyanın listesi. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 2: Kantitatif PCR programı. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Belirli bir hedef genomik bölgenin faktörlerinin ve kromatin manzarasının tanımlanması, kromatin araştırmalarında büyük bir zorluk oluşturmaya devam etmektedir18. Bu protokol, maya kromozomlarından farklı kromatin alanlarını spesifik olarak çıkarmak ve saflaştırmak için etkili bir sistemi tanımlar. Bildiğimiz kadarıyla, bu tek aşamalı saflaştırmanın saflığı ve verimi, lokusa özgü kromatin saflaştırma yöntemlerinin birçok sınırlamasının üstesinden gelir, böylece diğer ilgisiz genomik bölgelere kıyasla hedeflenen lokusların çok yüksek oranda zenginleştirilmesine izin verir.
Bölgeye özgü R-rekombinaz kullanan ek eksizyon adımı nedeniyle, diğer bir avantaj, genomdaki rekombinasyon bölgelerinin kesin konumuna bağlı olarak hangi genomik bölgenin saflaştırıldığının tam olarak belirlenebilmesidir. Buna karşılık, diğer yöntemler, heterojen molekül uzunlukları ile sonuçlanan sonikasyon ile DNA'nın kesilmesine bağlıdır; Bu heterojenlik, bu yöntemleri iyi tanımlanmış bir hedef lokusun saflaştırılması açısından daha az hassas hale getirir.
Son olarak, bu saflaştırma stratejisi, formaldehit gibi kimyasal çapraz bağlayıcılar dahil edilmeden doğal koşulları kullanır. Bu nedenle, bu yaklaşımla elde edilen izole malzeme, yapısal ve fonksiyonel analizlere uygundur. Saflaştırma protokolündeki kritik bir adım, TEV proteazın aktivitesi, reaksiyon koşulları ve reaksiyon hacimleri dahil olmak üzere çeşitli parametrelere güçlü bir şekilde bağlı olan TEV elüsyonunun verimliliğidir. Gösterilen deney için, elüsyon hacmi minimuma ayarlandı ve bu da elüsyonun verimliliğini etkiledi. Bununla birlikte, TEV proteazın hacminin ve miktarının arttırılması, elüsyon verimliliğini önemli ölçüde artırabilir. Düşük verimliliğe sahip olmasına rağmen, TEV elüsyonu oldukça spesifik bölünme ve istenen kromatin alanlarının geri kazanılmasını sağlar. Buna karşılık, denatürasyon elüsyonu %90'dan fazla bir elüsyon verimliliğine sahiptir, ancak boncuklardan bazı spesifik olmayan DNA veya protein moleküllerini elüsyon edebilir. Bu nedenle, tercih edilen yöntem, izole edilmiş malzemenin istenen aşağı akış uygulamasına bağlıdır. Örneğin, denatüre edici elüsyonun, ilişkili kromatin faktörlerinin kütle spektrometrik tanımlanmasına izin verdiği gösterilmiştir, oysa doğal TEV elüsyon, in vitro transkripsiyon veya replikasyon testleri gibi aşağı akış fonksiyonel testler için tercih edilir. Şekil 5 , açıklanan saflaştırma protokolünün potansiyel aşağı akış uygulamalarını özetlemektedir. Özetle, bu geliştirilmiş iş akışı ve tek lokusların kromatin bileşimini incelemek için yüksek verimli yöntem, kromatin araştırmalarında uzun süredir devam eden bir zorluğu ele almaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların ifşa edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
S.H. laboratuvarındaki çalışmalar, SFB1064 (proje kimliği 213249687), Avrupa Araştırma Konseyi (ERC Başlangıç Hibesi 852798 Çatışma Çözümü) ve Helmholtz Gesellschaft aracılığıyla DFG tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast strains | |||
| Control Strain: MATa; ura3Δ0; leu2Δ0; his3Δ1; met15Δ0; bar1::kanMX4; Chr I 212kb::LEU2 pTEF2-LEXA-TAP pGAL1-10 RecR | Section 1, see references 13 and 14 | ||
| Recombination Strain: MATa; ura3Δ0; leu2Δ0; his3Δ1; met15Δ0; bar1::kanMX4; RS_LEXA_NS-3_ARS316_NS+3_RS; Chr I 212kb::LEU2 pTEF2-LEXA-TAP pGAL1-10 RecR | Section 1, see reference 13 and 14 | ||
| Plasmid | |||
| K238 plasmid | Section 1, see reference 13 Storage: Store at -20 °C |
||
| K071 Spike-in plasmid DNA | Section 7.1, see reference 13 Storage: Store at -20 °C |
||
| Reagents | |||
| Acetone | Carl Roth | 5025.1 | Section 2 Storage: Store at room temperature |
| Ammonium acetate (NH4Ac) | Sigma Aldrich | A7262 | Section 6 and 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Ammonium solution (NH4OH) 25% | Merck Millipore | 533003 | Section 6 Storage: Store at room temperature |
| Ammonium sulfate | Santa Cruz | Sc-29085 | Section 2 Storage: Store at room temperature |
| Bacto agar | BD (VWR) | 90000-760 | Section 3 Storage: Store at room temperature |
| Bacto peptone | BD (VWR) | 211820 | Section 3 Storage: Store at room temperature |
| β-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | 07604 | Section 7.2 Storage: Store at 4 °C |
| Chemiluminescent substrate kit | ThermoFisher | 34580 | Section 7.2 Storage: Store at 4 °C |
| Di-Sodium Hydrogen phosphate dodecahydrate | Merck | 1.06579.1000 | Section 2 and 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Dithiothreitol (DTT) | ThermoFisher | 15508013 | Section 4 Storage: Store at 4 °C |
| Ethanol | Merck | 100983 | Section 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | ED | Section 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Galactose (20% (w/v) stock) | Sigma Aldrich | G0625-1KG / 5KG | Section 3 Storage: Store at room temperature |
| Gel loading dye (6x) | BioLabs | B7024A | Section 7.1 Storage: Store at -20 °C |
| Glusose | Sigma-Aldrich | G8270 | Section Storage: Store at room temperature |
| Glycine | Carl Roth | .0079.4 | Section 2 Storage: Store at room temperature |
| Glycogen (5 mg/mL) | Invitrogen | AM9510 | Section 7.1 Storage: Store at -20 °C |
| Hydrochloric acid (HCl) | PanReac AppliChem | 182109.1211 | Section 2, 4 and 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Magnesium Acetate (MgAc) | Bernd Kraft | 15274.2600/C035 | Section 4 Storage: Store at room temperature |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma Aldrich | M8266 | Section 6 Storage: Store at room temperature |
| Nu PAGE LDS sample buffer (4x) | Invitrogen | 2399549 | Section 7.2 Storage: Store at room temperature |
| Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1 v/v) | Invitrogen | 15593-031 | Section 7.1 Storage: Store at 4 °C |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9541 | Section 4 Storage: Store at room temperature |
| Radioactively labeled α-32P dATP (3,000 Ci/mmol, 10 mCi/mL) | Hartmann Analytic | SRP-203 | Section 7.1 Storage: Store at 4 °C |
| RadPrime labeling system | ThermoFisher | 18428-011 | Section 7.1 Storage: Store at -20 °C |
| Raffinose (20% (w/v) stock) | SERVA | 34140.03 | Section 3 Storage: Store at room temperature |
| Sodium chloride (NaCl) | Merck | K53710504142 | Section 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Sodium citrate (Na3C6H5O7) | Sigma-Aldrich | 71402 | Section 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma Aldrich | S5881 | Section 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Sodium n-dodecyl sulfate (SDS) (5% stock (w/v) ) | Alfa Aesar | A11183 | Section 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | 71496 | Section 2 and 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Sodium azide | Santa Cruz Biotechnology | sc-208393 | Section 2 Storage: Store at -20 °C |
| Triethylamine | Sigma Aldrich | 90340 | Section 2 Storage: Store at room temperature |
| Tris base | Chem Cruz | SC-3715B | Section 2 and 4 Storage: Store at room temperature |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | Section 2 and 4 Storage: Store at room temperature |
| Tween-20 | Bernd Kraft | 18014332 | Section 4 Storage: Store at room temperature |
| Yeast extract | BD (VWR) | 212720 | Section 3 Storage: Store at room temperature |
| Yeast mating factor alpha (1 µg/mL stock ) | Biomol | Y2016.5 | Section 3 Storage: Store at -20 °C |
| Yeast Synthetic Drop-out medium Supplements without LEUCINE | Sigma Aldrich | Y1376 | Section 1, see reference 14 |
| Enzymes | |||
| HpaI restriction enzyme (5,000 U/mL) | NEB | R0105S | Section 7.1 Storage: Store at -20 °C |
| Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100x) | ThermoFisher Scientific | 78446 | Section 4 Storage: Store at4 °C |
| Proteinase K (10 mg/mL) | SERVA | 33756 | Section 7.1 Storage: Store at -20 °C |
| RNase A (10 mg/mL) | ThermoFisher | EN0531 | Section 7.1 Storage: Store at -20 °C |
| TEV protease (10000 U/µL) | NEB | P8112S | Section 5 Storage: Store at -20 °C |
| Materials | |||
| BcMag Epoxy-Activated Magnetic Beads | Bioclone Inc. | FC-102 | Section 2 Storage: Store at 4 °C |
| Dry ice | Section 4 | ||
| Low-binding centrifuge tubes 2.0 mL | Eppendorf | 22431102 | Section 4 |
| Microspin G-25 Columns | Cytiva | 27-5325-01 | Section 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Parafilm | Merck | P7793 | Section 4 |
| Positive nylon membrane | Biozol | 11MEMP0001 | Section 7.1 Storage: Store at room temperature |
| PVDF transfer membrane | Immobilon-Merck Millipore | IPVH00010 | Section 7.2 Storage: Store at room temperature |
| SDS-PAGE gel 4-12% bis-tris (15 well, 1.5 mm) | Invitrogen | NP0336BOX | Section 7.2 Storage: Store at 4 °C |
| Syringe (25 mL) with luer fitting | Henke Sass Wolf | 4200-000V0 | Section 3 |
| Whatman paper (Grade 3MM CHR Cellulose Western Blotting Paper Sheet) | Cytiva | 3030-917 | Section 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Antibodies | |||
| Anti-LexA, rabbit polyclonal IgG, DNA binding region antibody | Merck Millipore | 06-719 | Section 7.2 Storage: Store at -20 °C |
| Goat Anti-Rabbit IgG (H+L), Horseradish peroxidase conjugate | Invitrogen | G21234 | Section 7.2 Storage: Store at -20 °C |
| Peroxidase Anti-Peroxidase (PAP) antibody produced in rabbit for the detection of TAP-tagged proteins | Sigma Aldrich | P1291-500UL | Section 7.2 Storage: Store at -20 °C |
| Rabbit IgG antibodies | Sigma | I5006-100MG | Section 2 Storage: Store at 4 °C |
| Primers (10 µM) | |||
| ARS316: fwd 5'- CGGCATTATCGTACACAACCT, rev 5'- GTTCTTCGTTGCCTACATTTTCT | Section 7.1 | ||
| K071 Spike-in plasmid DNA: fwd: 5'-TTTTCGCTGCTTGTCCTTTT, rev 5'- CATTTTCGTCCTCCCAACAT | Section 7.1 | ||
| PCR fragment from yeast genomic DNA as a template for ARS316 amplification (for southern blot): fwd 5’- AAATTCTGCCCTTGATTCGT rev 5’- TTTGTTTATCTCATCACTAAT | Section 7.1 | ||
| PDC1: fwd 5'- CATGATCAGATGGGGCTTCA, rev 5'-ACCGGTGGTAGCGACTCTGT | Section 7.1 | ||
| Equipment | |||
| Coffee grinder | Gastroback | 42601 | Section 4 |
| Dewar flask | NAL GENE | 4150-2000 | Section 3 |
| DynaMag TM-2 magnetic rack | Invitrogen | 12321D | Section 4, 5 and 6 |
| Hybridization oven | Hybaid Mini10 | Ri418 | Section 2 |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424R | Section 4 and 7.1 |
| UV-crosslinker | Analytikjena | 95-0174-02 | Section 7.1 |
References
- Kornberg, R. D., Lorch, Y. Twenty-five years of the nucleosome, fundamental particle of the eukaryote chromosome. Cell. 98 (3), 285-294 (1999).
- Gauchier, M., van Mierlo, G., Vermeulen, M., Déjardin, J. Purification and enrichment of specific chromatin loci. Nature Methods. 17 (4), 380-389 (2020).
- Korthout, T., et al. Decoding the chromatin proteome of a single genomic locus by DNA sequencing. PLoS Biology. 16 (7), e2005542 (2018).
- Antão, J. M., Mason, J. M., Déjardin, J., Kingston, R. E. Protein landscape at Drosophila melanogaster telomere-associated sequence repeats. Molecular and Cellular Biology. 32 (12), 2170-2182 (2012).
- Déjardin, J., Kingston, R. E. Purification of proteins associated with specific genomic loci. Cell. 136 (1), 175-186 (2009).
- Ide, S., Dejardin, J. End-targeting proteomics of isolated chromatin segments of a mammalian ribosomal RNA gene promoter. Nature Communications. 6, 6674 (2015).
- Unnikrishnan, A., Gafken, P. R., Tsukiyama, T. Dynamic changes in histone acetylation regulate origins of DNA replication. Nature Structural & Molecular Biology. 17 (4), 430 (2010).
- Buxton, K. E., et al. Elucidating protein-DNA interactions in human alphoid chromatin via hybridization capture and mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 16 (9), 3433-3442 (2017).
- Kennedy-Darling, J., et al. Discovery of chromatin-associated proteins via sequence-specific capture and mass spectrometric protein identification in Saccharomyces cerevisiae. Journal of Proteome Research. 13 (8), 3810-3825 (2014).
- Liu, S. J., et al. CRISPRi-based genome-scale identification of functional long noncoding RNA loci in human cells. Science. 355, 7111 (2017).
- Hamperl, S., et al. Purification of specific chromatin domains from single-copy gene loci in Saccharomyces cerevisiae. Functional Analysis of DNA and Chromatin. 1094, 329-341 (2014).
- Hamperl, S., et al. Compositional and structural analysis of selected chromosomal domains from Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 42 (1), 2 (2014).
- Weiβ, M. Single-copy locus proteomics of early- and late-firing DNA replication origins identifies a role of Ask1/DASH complex in replication timing control. Cell Reports. 42 (2), 112045 (2023).
- Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nature Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Western blot membrane stripping for restaining protocol. Abcam. , Available from: https://www.abcam.com/protocols/western-blot-membrane-stripping-for-restaining-protocol (2023).
- Vermeulen, M., Déjardin, J.
