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Biochemistry

Saccharomyces cerevisiae में सिंगल-कॉपी जीन लोकस क्रोमैटिन शुद्धि

Published: November 17, 2023 doi: 10.3791/65460
Automatic Translation
1, 1
1Institute of Epigenetics and Stem Cells, Helmholtz Zentrum München

Summary

यह प्रोटोकॉल साइट-विशिष्ट पुनर्संयोजन के आधार पर एक स्थान-विशिष्ट क्रोमैटिन अलगाव विधि प्रस्तुत करता है ताकि नवोदित खमीर, सैक्रोमाइसेस सेरेविसिया से अपने मूल क्रोमैटिन संदर्भ में ब्याज की एकल-प्रतिलिपि जीन लोकस को शुद्ध किया जा सके।

Abstract

यूकेरियोटिक क्रोमैटिन की मूल संगठनात्मक इकाई न्यूक्लियोसोम कोर कण (एनसीपी) है, जिसमें हिस्टोन ऑक्टेमर के चारों ओर ~ 1.7 बार लिपटे डीएनए शामिल हैं। क्रोमैटिन को एनसीपी और कई अन्य प्रोटीन परिसरों की इकाई के रूप में परिभाषित किया गया है, जिसमें प्रतिलेखन कारक, क्रोमैटिन रीमॉडेलिंग और एंजाइम को संशोधित करना शामिल है। यह अभी भी स्पष्ट नहीं है कि कोशिका चक्र के विभिन्न चरणों के दौरान विशिष्ट जीनोमिक लोकी के स्तर पर इन प्रोटीन-डीएनए इंटरैक्शन को कैसे ऑर्केस्ट्रेटेड किया जाता है। यह मुख्य रूप से वर्तमान तकनीकी सीमाओं के कारण है, जो इस तरह के गतिशील इंटरैक्शन के सटीक माप प्राप्त करना चुनौतीपूर्ण बनाते हैं। यहां, हम अपने मूल क्रोमैटिन राज्य में ब्याज की एकल-प्रतिलिपि जीन स्थान को अलग करने के लिए एक कुशल एकल-चरण आत्मीयता शुद्धि प्रोटोकॉल के साथ साइट-विशिष्ट पुनर्संयोजन के संयोजन की एक बेहतर विधि का वर्णन करते हैं। विधि जीनोमिक क्रोमैटिन पर लक्ष्य स्थान के मजबूत संवर्धन के लिए अनुमति देती है, जिससे यह तकनीक निष्पक्ष और व्यवस्थित तरीके से प्रोटीन इंटरैक्शन की पहचान करने और मात्रा निर्धारित करने के लिए एक प्रभावी रणनीति बनाती है, उदाहरण के लिए मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा। इस तरह के रचनात्मक विश्लेषणों के अलावा, इस विधि द्वारा शुद्ध देशी क्रोमैटिन संभवतः न्यूक्लियोसोम पोजिशनिंग और हिस्टोन संशोधनों के बारे में विवो स्थिति को दर्शाता है और इसलिए, खमीर में लगभग किसी भी जीनोमिक लोकस से प्राप्त क्रोमैटिन के आगे संरचनात्मक और जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए उत्तरदायी है।

Introduction

क्रोमैटिन में यूकेरियोटिक जीनोम का गतिशील संगठन डीएनए को नाभिक की सीमाओं के भीतर फिट करने के लिए कॉम्पैक्ट करता है, जबकि जीन अभिव्यक्ति के लिए पर्याप्त गतिशीलता और नियामक कारकों के लिए पहुंच सुनिश्चित करता है। भाग में, इस बहुमुखी प्रतिभा की मध्यस्थता न्यूक्लियोसोम द्वारा की जाती है, क्रोमैटिन की मूल इकाई, जिसमें हिस्टोन ऑक्टेमर1 के चारों ओर ~ 1.7 बार लिपटे डीएनए के 147 बीपी के साथ एक कोर कण होता है। न्यूक्लियोसोम इसकी संरचना के संबंध में एक अत्यधिक गतिशील संरचना है, जिसमें एन- और सी-टर्मिनल हिस्टोन पूंछ पर कई हिस्टोन वेरिएंट और पोस्टट्रांसलेशनल संशोधन (पीटीएम) हैं। इसके अलावा, यूकेरियोटिक क्रोमैटिन अन्य आवश्यक घटकों की एक भीड़ के साथ बातचीत करता है, जैसे कि प्रतिलेखन कारक, डीएनए और आरएनए प्रसंस्करण मशीनरी, वास्तुशिल्प प्रोटीन, क्रोमैटिन रीमॉडेलिंग और संशोधन में शामिल एंजाइम, और क्रोमैटिन से जुड़े आरएनए अणु। प्रतिलेखन, प्रतिकृति और मरम्मत में शामिल इन महत्वपूर्ण मशीनरी को क्रोमैटिन तक पहुंच की आवश्यकता होती है, जो इन प्रक्रियाओं के लिए प्राकृतिक सब्सट्रेट के रूप में कार्य करता है। नतीजतन, इन डीएनए लेनदेन में अंतर्निहित आणविक तंत्र को समझने के लिए विशिष्ट जीनोमिक क्षेत्रों में क्रोमैटिन संरचना में सामूहिक परिवर्तनों की एक सटीक परिभाषा की आवश्यकता होती है जहां ये मशीनरी अभिसरण करती हैं और जैविक प्रतिक्रियाओं को सुविधाजनक बनाती हैं।

आनुवंशिकी और प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन अध्ययनों के माध्यम से कई क्रोमैटिन कारकों की पहचान के बावजूद, विशेष जीनोमिक साइटों पर क्रोमैटिन इंटरैक्शन के प्रत्यक्ष, निष्पक्ष और व्यापक विश्लेषण करना एक महत्वपूर्ण बाधा 2,3 बना हुआ है। प्रारंभ में, जीनोम (यानी, दोहराव लोकी) या बहु प्रतिलिपि प्लास्मिड के केवल अत्यधिक प्रचुर मात्रा में क्षेत्रों संबद्ध प्रोटीन 4,5,6,7 के बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्रिक पहचान के लिए पर्याप्त मात्रा और शुद्धता में अलग किया जा सकता है. क्रोमैटिनाइज्ड डीएनए पर कब्जा जांच के प्रत्यक्ष संकरण के आधार पर नए दृष्टिकोणों की एक श्रृंखला, CRISPR-dCas9 प्रणाली का उपयोग करके निकटता बायोटिनाइलेशन, या ब्याज के स्थान के लिए अनुक्रम-विशिष्ट एडाप्टर प्रोटीन के बंधन ने खमीर और स्तनधारी जीनोम 8,9,10 से एकल-कॉपी लोकी के प्रोटिओम को उजागर करना शुरू कर दिया है. हालांकि, इन सभी विधियों को प्रोटीन-डीएनए इंटरैक्शन को स्थिर करने के लिए फॉर्मलाडेहाइड क्रॉसलिंकिंग की आवश्यकता होती है और बाद में शुद्धि के लिए क्रोमैटिन को घुलनशील करने के लिए सोनिकेशन की आवश्यकता होती है। साथ में, दोनों जोड़तोड़ शुद्ध क्रोमैटिन के बाद के संरचनात्मक और कार्यात्मक अध्ययन की संभावना को बाहर करते हैं।

इन सीमाओं को दूर करने के लिए, हम पहले खमीर11,12 से लक्षित गुणसूत्र डोमेन निकालने के लिए साइट-विशिष्ट पुनर्संयोजन को रोजगार है कि एक पद्धति तैयार की. संक्षेप में, ब्याज का जीनोमिक क्षेत्र ज़ीगोसैक्रोमाइसेस रूक्सी से साइट-विशिष्ट आर-रीकॉम्बिनेज के लिए मान्यता साइटों (आरएस) से घिरा हुआ है, साथ ही साथ एक ही क्षेत्र के भीतर प्रोकैरियोटिक ट्रांसक्रिप्शनल रिप्रेसर लेक्सा प्रोटीन (लेक्सा) के लिए तीन डीएनए बाध्यकारी साइटों के एक समूह को शामिल करता है। खमीर कोशिकाओं में आर-रीकॉम्बिनेज की एक साथ अभिव्यक्ति के लिए एक अभिव्यक्ति कैसेट होता है और एक लेक्सा प्रोटीन एक अग्रानुक्रम आत्मीयता शुद्धि (टीएपी) टैग से जुड़ा होता है। आर-रीकॉम्बिनेज के शामिल होने के बाद, एंजाइम एक परिपत्र क्रोमैटिन डोमेन के रूप में गुणसूत्र से लक्षित क्षेत्र को कुशलता से उत्तेजित करता है। इस डोमेन को लेक्सा-टीएपी एडाप्टर प्रोटीन के माध्यम से शुद्ध किया जा सकता है, जो लेक्सा डीएनए बाध्यकारी साइटों के साथ-साथ एक आत्मीयता समर्थन के लिए बांधता है। इस विधि हाल ही में खमीर गुणसूत्र III13 के चयनित प्रतिकृति मूल युक्त अलग क्रोमैटिन डोमेन को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया गया है.

इस पूर्व विवो दृष्टिकोण का एक बड़ा लाभ यह है कि यह पृथक सामग्री के कार्यात्मक विश्लेषण की अनुमति देता है। उदाहरण के लिए, प्रतिकृति मूल डोमेन इस विधि के साथ शुद्ध इन विट्रो प्रतिकृति assays में विवो इकट्ठे क्रोमेटिन टेम्पलेट्स में देशी से एक टेस्ट ट्यूब में मूल फायरिंग की दक्षता का आकलन करने के अधीन किया जा सकता है. अंततः, पृथक सामग्री का जैव रासायनिक और कार्यात्मक लक्षण वर्णन देशी क्रोमैटिन टेम्पलेट के साथ शुद्ध प्रोटीन का उपयोग करके परमाणु प्रक्रियाओं के पुनर्गठन की अनुमति दे सकता है। सारांश में, यह पद्धति क्रोमैटिन अनुसंधान में एक रोमांचक एवेन्यू खोलती है, क्योंकि एक निश्चित गुणसूत्र लेनदेन से गुजरने वाले एक विशिष्ट जीनोमिक क्षेत्र के सामूहिक संरचना और संरचनात्मक क्रोमैटिन परिवर्तनों का पालन करना संभव होगा।

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Protocol

इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली सभी सामग्रियों और उपकरणों से संबंधित विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें। उपयोग किए गए समाधानों, बफ़र्स और मीडिया की सूची के लिए तालिका 1 देखें।

1. पुनः संयोजक खमीर तनाव निर्माण

  1. एक पुनर्संयोजन-सक्षम खमीर तनाव का निर्माण करने के लिए, एसबीएफआई-पचाने वाले प्लाज्मिड K238 को ब्याज13,14 के स्थान पर एकीकृत लेक्सा-बाध्यकारी साइटों और आरएस पुनर्संयोजन साइटों के साथ एक खमीर तनाव में बदल दें।
    नोट: रूपांतरित एसबीएफआई प्रतिबंध टुकड़े में लेक्सा-टीएपी फ्यूजन प्रोटीन और आर-रीकॉम्बिनेज की संवैधानिक अभिव्यक्ति के लिए आवश्यक अभिव्यक्ति कैसेट शामिल है, साथ ही खमीर गुणसूत्र I के समरूप अनुक्रमों के साथ समरूप पुनर्संयोजन(चित्रा 1)द्वारा अभिव्यक्ति कैसेट के जीनोमिक एकीकरण के लिए।
  2. एक नियंत्रण तनाव का निर्माण करने के लिए, एकीकृत आरएस और लेक्सा-बाध्यकारी साइटों की कमी वाले एक आइसोजेनिक खमीर तनाव लें, और इसे एसबीएफआई-पचाने वाले के 238 प्लाज्मिड के साथ उसी शर्तों के तहत बदलें जैसा कि पुनर्संयोजन-सक्षम तनाव के लिए उपयोग किया जाता है।
  3. SCD-LEU अगर प्लेटों14 पर LEU2 चयन मार्कर के आधार पर सक्षम खमीर कोशिकाओं का चयन करें.

2. IgG एंटीबॉडी को epoxy-सक्रिय चुंबकीय मोतियों के साथ जोड़ना

नोट: निम्नलिखित प्रकाशित प्रोटोकॉल11 के अनुसार epoxy सक्रिय चुंबकीय मोती के लिए युगल आईजीजी एंटीबॉडी.

  1. 50% एसीटोन के 10 एमएल में 300 मिलीग्राम एपॉक्सी-सक्रिय मोतियों को निलंबित करें (300 मिलीग्राम 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में ~ 5.1 × 1010 मोतियों से मेल खाती है)। एक भंवर मिक्सर पर जोर से हिलाओ.
  2. 2 मिन के लिए 820 × ग्राम और 4 डिग्री सेल्सियस पर मोतियों वाली ट्यूब को सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरनेवाला निकालें.
  3. 0.1 एम सोडियम फॉस्फेट बफर (पीएच 7.4) के 20 एमएल के साथ मोती 3x धो लें। चरण 2.2 में वर्णित के रूप में centrifugation द्वारा प्रत्येक धोने कदम के बाद सतह पर तैरनेवाला निकालें.
  4. 0.1 एम सोडियम फॉस्फेट बफर (पीएच 7.4) के 16 एमएल में मोती निलंबित, और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए एक संकरण ओवन में धीरे घुमाएं।
  5. खरगोश आईजीजी (100 मिलीग्राम) को डीएच2ओ (अंतिम एकाग्रता: 14 मिलीग्राम / एमएल) के 7 एमएल में भंग करें।
  6. निलंबन को स्पष्ट करने के लिए 10 मिनट के लिए 13,000 × ग्राम और 4 डिग्री सेल्सियस पर आईजीजी निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें।
  7. एक नई 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब के लिए सतह पर तैरनेवाला (खरगोश IgGs के 50 मिलीग्राम के अनुरूप) के 3.5 एमएल स्थानांतरण.
  8. आईजीजी समाधान को 0.1 एम सोडियम फॉस्फेट बफर (पीएच 7.4) के 9.85 एमएल के साथ पतला करें, इसके बाद कोमल मिश्रण के तहत 0.1 एम सोडियम फॉस्फेट (पीएच 7.4) में 3 एम अमोनियम सल्फेट के 6.65 एमएल के ड्रॉपवाइज जोड़ दें।
    नोट: अमोनियम सल्फेट को जल्दी से समाधान में जोड़ने से बचें क्योंकि नमक की उच्च स्थानीय सांद्रता खरगोश आईजीजी की वर्षा का कारण बनेगी।
  9. 3 मिन के लिए 820 × ग्राम और 4 डिग्री सेल्सियस पर आईजीजी समाधान को सेंट्रीफ्यूज करें, और चुंबकीय मनका निलंबन के परिणामस्वरूप सतह पर तैरनेवाला जोड़ें।
  10. ट्यूब रातोंरात या कम से कम 18 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर एक संकरण ओवन में कोमल रोटेशन के साथ सेते हैं.
  11. चरण 2.2 में वर्णित के रूप में सतह पर तैरनेवाला निकालें.
  12. 100 मिमी ग्लाइसिन-एचसीएल (पीएच 2.5) के 20 एमएल के साथ मोती धो लें। आईजीजी पॉलीपेप्टाइड्स के विकृतीकरण से बचने के लिए चरण 2.2 में वर्णित समाधान को तेजी से निकालें।
  13. 10 मिमी Tris-HCl (पीएच 8.8) के 20 एमएल के साथ एक बार मोती धो लें. सतह पर तैरनेवाला महाप्राण के रूप में कदम 2.2 में वर्णित है.
  14. अवशिष्ट प्रतिक्रियाशील epoxy समूहों को निष्क्रिय करने के लिए कोमल रोटेशन के तहत 5-10 मिनट के लिए 0.1M triethylamine समाधान के 20 एमएल जोड़ें. चरण 2.2 में वर्णित के रूप में सतह पर तैरनेवाला निकालें.
  15. कोमल रोटेशन के साथ 5 मिनट के लिए पीबीएस (पीएच 7.4) के 20 एमएल के साथ मोती 4x धो लें। प्रत्येक धोने कदम के बाद चरण 2.2 में वर्णित के रूप में सतह पर तैरनेवाला निकालें.
  16. 5 मिनट के लिए 0.5% ट्राइटन एक्स -100 (डब्ल्यू / वी) के साथ पीबीएस (पीएच 7.4) के 20 एमएल के साथ मोती 2x धो लें और एक संकरण ओवन में कोमल रोटेशन के तहत प्रत्येक 15 मिनट। चरण 2.2 में वर्णित के रूप में सतह पर तैरनेवाला निकालें.
  17. 0.02% सोडियम एज़ाइड (डब्ल्यू / वी) के साथ पीबीएस (पीएच 7.4) के 16 एमएल की अंतिम मात्रा में मोतियों को निलंबित करें। उपयोग करने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 एमएल एलिकोट के रूप में स्टोर करें।

3. खमीर सेल संस्कृति और कटाई

  1. YPR माध्यम के 5 एमएल में YPD प्लेटों से नियंत्रण और पुनर्संयोजन सक्षम खमीर उपभेदों को टीका लगाएं, और 30 डिग्री सेल्सियस और 200 आरपीएम पर रात भर इनक्यूबेट करें।
  2. इस संस्कृति के 2 एमएल को वाईपीआर माध्यम के 100 एमएल में टीका लगाएं, और 30 डिग्री सेल्सियस और 200 आरपीएम पर रात भर इनक्यूबेट करें।
  3. प्रत्येक तनाव के लिए, आटोक्लेव्ड वाईपी माध्यम के 1,800 एमएल और ऑटोक्लेव्ड रैफिनोज समाधान (20% डब्ल्यू / वी) के 200 एमएल को दो 5 एल एर्लेनमेयर फ्लास्क (प्रत्येक तनाव के लिए कुल में संस्कृति माध्यम के 4 एल, दो फ्लास्क में विभाजित) में से प्रत्येक में वितरित करें।
  4. अपने संबंधित माध्यम में आयुध डिपो600 0.2 पर बढ़ती खमीर कोशिकाओं को टीका लगाएं, और लगभग 6 घंटे के लिए चरण 3.1 में वर्णित के रूप में या कोशिकाओं को 1.0 के वांछित आयुध डिपो600 तक पहुंचने तक इनक्यूबेट करें। कोशिकाओं की सामान्य वृद्धि सुनिश्चित करने के लिए, किसी भी संदूषण से मुक्त, 2 घंटे अंतराल पर आयुध डिपो की जांच करें।
  5. साइट-विशिष्ट पुनर्संयोजन को प्रेरित करने के लिए गैलेक्टोज (20% डब्ल्यू / वी) के 200 एमएल जोड़ें।
  6. जी 1 चरण में कोशिकाओं को गिरफ्तार करने के लिए वाईएमएफए (गैलेक्टोज, चरण 3.5 के रूप में एक ही समय में) के 110 माइक्रोन (50 एनजी / एमएल) जोड़ें, और 2 घंटे के लिए सेते हैं।
    नोट: कोशिकाओं में वाईएमएफए के अलावा प्रयोगात्मक स्थितियों और जैविक प्रश्न को संबोधित करने पर निर्भर करता है। संक्षेप में, इस प्रयोग के लिए, कोशिकाओं को लाइसेंस प्राप्त प्रतिकृति उत्पत्ति के साथ एक समरूप सेल आबादी प्राप्त करने के लिए जी 1 चरण में गिरफ्तार किया जाता है; इस प्रक्रिया में, पूर्व-प्रतिकृति परिसर एस-चरण में डीएनए प्रतिकृति की दीक्षा से पहले जी 1 चरण में उत्पत्ति से बांधता है।
  7. सेल निलंबन को 1 एल अपकेंद्रित्र बाल्टी में स्थानांतरित करें, और 10 मिनट के लिए 6,000 × ग्राम और 4 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला त्यागें, और डीएच2ओ के 10-15 एमएल की कुल मात्रा में सेल छर्रों को फिर से निलंबित करें।
  8. एक Luer प्लग के साथ एक 25 एमएल सिरिंज सील, और पानी से भरा एक 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब के अंदर जगह है. सिरिंज विधानसभा के लिए सेल निलंबन स्थानांतरण, और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 2,397 × ग्राम पर अपकेंद्रित्र. सतह पर तैरनेवाला त्यागें.
  9. सिरिंज से Luer प्लग निकालें, और सेल "स्पेगेटी" फार्म तरल नाइट्रोजन में कोशिकाओं बाहर निकालना.
    नोट: संस्कृति माध्यम के 4 एल का उपयोग 7-10 ग्राम के अंतिम सेल छर्रों का एक गीला वजन प्रदान करता है।
  10. जमे हुए सेल स्पेगेटी को 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें, और आगे उपयोग तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

4. क्रोमैटिन लोकस शुद्धि

नोट: इस स्थान-विशिष्ट क्रोमैटिन शुद्धि प्रोटोकॉल में शामिल चरणों के योजनाबद्ध अवलोकन के लिए चित्र 2 देखें।

  1. हर बार कॉफी ग्राइंडर को 30 सेकंड के लिए 2x के लिए जोर से हिलाकर 30-50 ग्राम सूखी बर्फ पीसकर एक वाणिज्यिक कॉफी ग्राइंडर को ठंडा करें। ठंडा होने के बाद, ड्राई आइस पाउडर को फेंक दें।
  2. प्रीकूल्ड कॉफी ग्राइंडर में ~ 30-50 ग्राम सूखी बर्फ के साथ जमे हुए खमीर सेल स्पेगेटी के 3 ग्राम मिलाएं।
  3. मिलिंग के दौरान खमीर सेल पाउडर के नुकसान को रोकने के लिए पैराफिल्म के साथ टोपी और चक्की के बीच जंक्शन को सील करें।
  4. मिल खमीर सेल सूखी बर्फ मिश्रण 10x 30 एस के लिए हर बार, प्रत्येक दौर (कुल समय अनुमान: ~ 10 मिनट) के बीच 30 एस अंतराल के साथ. कॉफी ग्राइंडर की दीवारों से चिपके सूखी बर्फ और सेल पाउडर से बचने के लिए, मिलिंग के दौरान कॉफी ग्राइंडर के किनारों को लगातार टैप करें।
  5. परिणामस्वरूप खमीर सेल-सूखी बर्फ पाउडर को एक साफ और सूखे स्पैटुला का उपयोग करके प्लास्टिक बीकर में स्थानांतरित करें।
  6. सूखी बर्फ को वाष्पित करने के लिए कमरे के तापमान पर बीकर रखें।
  7. एक बार सूखी बर्फ वाष्पित हो जाने के बाद, खमीर सेल पाउडर में 1x प्रोटीज और फॉस्फेट इनहिबिटर (खमीर कोशिकाओं के 750 μL/g) के साथ 2.25 एमएल एमबी बफर जोड़ें।
  8. सेल बफर के साथ कोशिकाओं का पूरा निलंबन सुनिश्चित करने के लिए सख्ती से सेल बफर मिश्रण पिपेट, और एक 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब के लिए हस्तांतरण.
  9. परिणामस्वरूप सेल निलंबन (क्रूड सेल अर्क [सीसीई]) से डीएनए (0.1%) और प्रोटीन (0.05%) विश्लेषण के लिए नमूने लें। आगे की प्रक्रिया तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें (धारा 7 में वर्णित)।
  10. सेल निलंबन को कम बाध्यकारी 2 एमएल प्रतिक्रिया ट्यूबों में स्थानांतरित करें, और कच्चे सेल लाइसेट से सेल मलबे को अलग करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 21,130 × ग्राम पर अपकेंद्रित्र।
  11. सभी ट्यूबों से सुपरनेटेंट को एक 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में पूल करें।
  12. डीएनए (0.1%) और प्रोटीन विश्लेषण (0.05%) के लिए सतह पर तैरनेवाला (इनपुट [में]) से नमूने लें। आगे की प्रक्रिया तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें (धारा 7 में वर्णित)।
  13. आईजीजी-युग्मित चुंबकीय मनका घोल (प्रत्येक खमीर तनाव के लिए) के 500 माइक्रोन को 1x प्रोटीज के साथ 2x धोने और फॉस्फेट अवरोधकों के साथ 5 मिनट के लिए 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रत्येक 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 माइक्रोन धोकर आईजीजी-युग्मित चुंबकीय मनका घोल (प्रत्येक खमीर तनाव के लिए) को संतुलित करें। प्रत्येक धोने कदम के बाद एक चुंबकीय रैक का उपयोग मोती से सतह पर तैरनेवाला त्यागें.
  14. 20 आरपीएम पर रोटेशन पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए 1x प्रोटीज और फॉस्फेट अवरोधकों के साथ ठंडे एमबी बफर के 500 माइक्रोन में आईजीजी-युग्मित चुंबकीय मोतियों को इनक्यूबेट करें। एक चुंबकीय रैक का उपयोग मोती से सतह पर तैरनेवाला त्यागें.
  15. सेल लाइसेट के साथ संतुलित चुंबकीय मनका घोल मिलाएं, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए 20 आरपीएम पर रोटेशन के साथ सेते हैं।
  16. कम बाध्यकारी प्रतिक्रिया ट्यूबों के लिए पूरा चुंबकीय मनका सेल lysate निलंबन स्थानांतरण.
  17. चुंबकीय मोतियों को अलग करें, अब ब्याज के क्रोमैटिन के छल्ले ले जा रहे हैं, एक चुंबकीय रैक का उपयोग करके सेल लाइसेट से।
  18. प्रत्येक ट्यूब से शेष प्रवाह के माध्यम से (एफटी) को एक ताजा 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें, और डीएनए (0.1%) और प्रोटीन (0.05%) विश्लेषण के लिए नमूने लें। आगे की प्रक्रिया तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें (धारा 7 में वर्णित)।
  19. ठंड एमबी बफर के 300 माइक्रोन में प्रत्येक ट्यूब से चुंबकीय मोती को निलंबित करें, और मोतियों को एक प्रतिक्रिया ट्यूब में पूल करें। 20 आरपीएम पर रोटेशन पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 1x प्रोटीज और फॉस्फेट अवरोधकों के साथ ठंडे एमबी बफर के 750 माइक्रोन के साथ प्रत्येक 10 मिनट के लिए 5x धो लें। प्रोटीज और फॉस्फेट इनहिबिटर के बिना ठंडे एमबी बफर के 750 माइक्रोन के साथ अंतिम धुलाई करें।
  20. प्रोटीज और फॉस्फेट अवरोधकों के बिना ठंड एमबी बफर के 40 माइक्रोन में मोतियों को निलंबित करें।
    नोट: एल्यूएट की अंतिम मात्रा को इसके प्रत्याशित डाउनस्ट्रीम एप्लिकेशन के अनुसार समायोजित किया जा सकता है। TEV क्षालन आमतौर पर 100-300 μL की सीमा के भीतर कुशलता से काम करता है।

5. टीईवी प्रोटीज़-मध्यस्थता क्षालन

  1. मोतियों से लेक्सा-सीबीपी क्रोमैटिन रिंग कॉम्प्लेक्स को मुक्त करने के लिए, थर्मोमिक्सर में 4 डिग्री सेल्सियस और 450 आरपीएम पर रातोंरात 6x उसके टैग किए गए पुनः संयोजक टीईवी प्रोटीज के 2 माइक्रोन के साथ मोतियों को इनक्यूबेट करें।
  2. एक चुंबकीय रैक का उपयोग अंतिम eluate से मोती अलग. क्लीव्ड क्रोमैटिन के छल्ले युक्त एल्यूएट को एक नई 1.5 एमएल प्रतिक्रिया ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  3. अंतिम एल्यूएट से किसी भी अवशिष्ट मोतियों को अलग करने के लिए फिर से एक चुंबकीय रैक पर ट्यूबों रखें।
  4. ठंड एसी बफर के 750 माइक्रोन में मोती (टीबी) को फिर से निलंबित करें, और डीएनए (0.1%) और प्रोटीन (0.05%) विश्लेषण के लिए नमूने लें। आगे की प्रक्रिया तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें (धारा 7 में वर्णित)।
  5. अंतिम एल्यूएट (टीई) से, डीएनए (0.5%) और प्रोटीन (0.25%) विश्लेषण के लिए नमूने लें। आगे की प्रक्रिया तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें (धारा 7 में वर्णित)।
    नोट: अंतिम एल्यूट की कम मात्रा के कारण, विश्लेषण के दौरान उनके प्रोटीन और डीएनए सामग्री का बेहतर प्रतिनिधित्व प्राप्त करने के लिए डीएनए और प्रोटीन विश्लेषण के लिए एकत्र किए गए नमूनों का प्रतिशत बढ़ जाता है।

6. विकृतीकरण क्षालन

  1. 20 आरपीएम पर रोटेशन पर 4 डिग्री सेल्सियस पर हर बार 20 मिनट के लिए ठंडे एसी बफर के 750 माइक्रोन में मोती 2x धोएं।
  2. शेष बाध्य लेक्सा-क्रोमैटिन परिसरों को निकालने के लिए, मोतियों को 0.5 एम एनएच4ओएच के 500 माइक्रोन जोड़कर विकृतीकरण क्षालन करें, और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  3. एक चुंबकीय रैक का उपयोग निलंबन से मोती अलग, और एक कम बाध्यकारी प्रतिक्रिया ट्यूब के लिए eluate हस्तांतरण.
  4. मोती को फिर से चरण 6.2 में एल्यूएट में अधिकतम क्रोमैटिन लोकी को पुनर्प्राप्त करने के लिए इनक्यूबेट करें।
  5. एक चुंबकीय रैक का उपयोग निलंबन से मोती अलग, और जिसके परिणामस्वरूप 6.3 कदम से eluate युक्त एक ही ट्यूब में पूल.
  6. डीएच2ओ के 750 माइक्रोन में मोतियों (डीबी) को फिर से निलंबित करें, और डीएनए (0.1%) और प्रोटीन (0.05%) विश्लेषण के लिए नमूने लें।
  7. अंतिम एल्यूएट (डीई) से, डीएनए (0.5%) और प्रोटीन (0.25%) विश्लेषण के लिए नमूने लें।

7. डीएनए और प्रोटीन विश्लेषण

  1. डीएनए विश्लेषण
    1. नमूना तैयार करना
      1. डीएनए नमूनों में, आईआरएन बफर के 100 माइक्रोन जोड़ें, और डीएच2ओ के साथ मात्रा को 200 माइक्रोन की अंतिम मात्रा में बढ़ाएं।
      2. K071 स्पाइक-इन प्लास्मिड डीएनए का 1 एनजी जोड़ें।
      3. आरएनए ए (10 मिलीग्राम/एमएल) के 1 माइक्रोन जोड़ें, और 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
      4. एमएल) के 5 माइक्रोन और एसडीएस (20%) के 10 माइक्रोन जोड़ें, और 56 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए सेते हैं।
      5. फिनोल/क्लोरोफॉर्म/आइसोप्रोपिल अल्कोहल (25:24:1) के 200 माइक्रोन जोड़ें, और हर बार 10 एस के लिए भंवर को अच्छी तरह से 2x करें।
      6. कार्बनिक और जलीय चरणों को अलग करने के लिए 7 मिन के लिए 21,130 × ग्राम पर नमूनों को सेंट्रीफ्यूज करें।
      7. सतह पर तैरनेवाला को ग्लाइकोजन (5 मिलीग्राम/एमएल) के 1.5 माइक्रोन और 2.5x 100% इथेनॉल युक्त नए 1.5 एमएल ट्यूबों में स्थानांतरित करें।
      8. डीएनए अवक्षेपण करने के लिए न्यूनतम 2 घंटे और अधिकतम रात भर के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूबों को इनक्यूबेट करें।
      9. 21,130 × ग्राम पर अपकेंद्रित्र, 45 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस। सतह पर तैरनेवाला त्यागें.
      10. डीएनए गोली को निलंबित किए बिना 70% इथेनॉल के 150 माइक्रोन जोड़ें, और 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 21,130 × ग्राम पर फिर से अपकेंद्रित्र।
      11. 10-15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर डीएनए छर्रों सूखी, और डीएच2ओ के 40 माइक्रोन में फिर से निलंबित करें।
      12. HpaI प्रतिबंध endonuclease के साथ चरण 7.1.1.11 में पृथक डीएनए linearize करने के लिए प्रतिबंध एंजाइम पाचन प्रदर्शन. 50 माइक्रोन प्रतिक्रिया मिश्रण के लिए, पृथक डीएनए के 40 माइक्रोन + एचपीएआई एंजाइम के 2 डिग्री एल + प्रतिबंध एंजाइम बफर के 5 डिग्री एल + डीएफएच2ओ के 3 डिग्री एल को रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    2. qPCR विश्लेषण
      1. प्रतिबंध-पचाने वाले डीएनए को 1: 5 अनुपात (प्रतिबंधित-पचाने वाले डीएनए के 10 माइक्रोन डीएच2ओ के 40 माइक्रोन में चरण 7.1.1.12 से प्राप्त प्रतिबंध-पचाने वाले डीएनए के 40 माइक्रोन) पर पतला करें।
      2. ARS316 क्षेत्र, PDC1, और स्पाइक-इन प्लास्मिड डीएनए के लिए डिज़ाइन किए गए प्राइमर जोड़े का उपयोग करें।
      3. तालिका 2 में दिए गए कार्यक्रम का उपयोग कर qPCR चलाएँ.
      4. संदर्भ स्थान के रूप में ARS316 क्षेत्र और लक्ष्य और PDC1 (या किसी अन्य जीन या जीनोमिक क्षेत्र) के रूप में प्लाज्मिड डीएनए में स्पाइक का उपयोग करके सापेक्ष मात्रा का ठहराव करके qPCR परिणामों का विश्लेषण करें।
      5. प्रत्येक नमूने के लिए लिए गए अंश मात्रा के प्रतिशत से ARS316 और PDC316 प्राइमर सापेक्ष परिमाणीकरण मूल्यों को सामान्य करके PDC1 पर ARS316 लोकस रिकवरी प्रतिशत का आकलन करें। उदाहरण के लिए, प्रवाह-थ्रू के लिए 0.1% को 1,000 के कारक से गुणा करें और TEV के लिए 0.5% को 200 के कारक से गुणा करें।
      6. स्पाइक-इन प्लास्मिड डीएनए सापेक्ष मात्रा का ठहराव मूल्यों के साथ ARS316 और PDC1 वसूली प्रतिशत को सामान्य करें।
      7. समीकरण (1) का उपयोग करके प्राप्त सापेक्ष परिमाणीकरण लक्ष्य/संदर्भ मूल्यों का मूल्यांकन करके कुल क्रोमैटिन पर ARS316 स्थान के संवर्धन का आकलन करें।
        Equation 1(1)
    3. दक्षिणी धब्बा विश्लेषण
      1. प्रतिबंध एंजाइम-पचाने वाले डीएनए नमूने के 20 माइक्रोन तक, जेल लोडिंग डाई के 5 माइक्रोन जोड़ें।
      2. ~ 3 घंटे के लिए 110 वी पर एक 1% agarose जेल में नमूने चलाएँ.
      3. जेल को एक ट्रे में स्थानांतरित करें, और इसे 20 मिनट के लिए कोमल झटकों के साथ अशुद्धिकरण समाधान में भिगोएँ।
      4. डीएच2ओ के साथ जेल कुल्ला, और झटकों के साथ 15 मिनट के लिए विकृतीकरण समाधान में भिगोएँ। विकृतीकरण समाधान त्यागें।
      5. कोमल मिलाते हुए के साथ 15 मिनट के लिए विकृतीकरण समाधान में जेल भिगोएँ.
      6. डीएच2ओ के साथ जेल कुल्ला, और कोमल मिलाते हुए के साथ हस्तांतरण बफर के साथ हर बार 15 मिनट के लिए इसे 2x धो लें।
      7. स्थानांतरण बफर के 1-1.5 एल के साथ एक ट्रे भरें, और इसे एक स्थिर मंच पर रखें।
      8. व्हाटमैन पेपर का एक लंबा टुकड़ा काटें और उसे प्लेटफार्म पर इस तरह रखें कि कागज के दोनों सिरे ट्रांसफर बफर में भीग जाएं।
      9. सकारात्मक नायलॉन झिल्ली की एक पट्टी और जेल के आकार के बराबर व्हाटमैन पेपर के चार स्ट्रिप्स काटें।
      10. प्लेटफॉर्म पर ट्रांसफर बफर में भिगोए हुए व्हाटमैन पेपर के दो टुकड़े रखें।
      11. व्हाटमैन पेपर के टुकड़ों के ऊपर जेल का चेहरा नीचे रखें।
      12. जेल के शीर्ष पर, सकारात्मक नायलॉन झिल्ली रखें, इसके बाद ट्रांसफर बफर में भिगोए गए व्हाटमैन पेपर के शेष दो टुकड़े हों। स्थानांतरण बफर के साथ ढेर गीला रखने के लिए सुनिश्चित करें.
      13. एक कांच की छड़ का उपयोग कर उन्हें बंद रोलिंग द्वारा किसी भी फंस हवा बुलबुले निकालें.
      14. इकट्ठे ढेर के ऊपर कागज़ के तौलिये का ढेर रखें, उसके बाद 0.5 किलो की वस्तु (जैसे, एक कांच की बोतल) रखें।
      15. कमरे के तापमान पर रात भर स्थानांतरण के लिए विधानसभा छोड़ दें।
      16. स्थानांतरण के बाद, यूवी-क्रॉसलिंक झिल्ली को 1,200 जे / सेमी2 के कुल ऊर्जा उत्पादन के साथ।
      17. ARS316 स्थान का पता लगाने के लिए, संदर्भित डीएनए लेबलिंग प्रणाली का उपयोग कर संश्लेषित रेडियोधर्मी जांच का उपयोग कर दक्षिणी धब्बा संकरण प्रदर्शन.
        नोट: इसके बाद बर्फ पर सभी चरणों का पालन करें जब तक कि अन्यथा उल्लेख न किया गया हो।
      18. एक कम बाध्यकारी प्रतिक्रिया ट्यूब में, डीएच2ओ के 19 माइक्रोन में पीसीआर टुकड़ा (जांच) के 25-40 एनजी पतला, और 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं. बर्फ पर तुरंत ठंडा करें।
      19. ट्यूब में 500 माइक्रोन डीसीटीपी, 500 माइक्रोन डीजीटीपी और 500 माइक्रोन डीटीटीपी के 1 माइक्रोन प्रत्येक में जोड़ें।
      20. किट के साथ प्रदान की यादृच्छिक न्यूक्लियोटाइड hexamers युक्त बफर के 20 माइक्रोन जोड़ें.
      21. ट्यूब में रेडियोधर्मी रूप से लेबल न्यूक्लियोटाइड [α-32पी] डीएटीपी के 5 माइक्रोन जोड़ें। रेडियोधर्मिता-अनुमोदित सुरक्षात्मक वातावरण के तहत रेडियोधर्मी रूप से लेबल वाली सामग्री से जुड़े सभी चरणों का पालन करें।
      22. क्लेनो टुकड़े के 1 माइक्रोन जोड़ें, और एकल फंसे डीएनए संश्लेषण के लिए 15 मिनट के लिए थर्मोमिक्सर पर 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
      23. प्रतिक्रिया को रोकने के लिए स्टॉप बफर के 5 माइक्रोन जोड़ें।
      24. भंडारण बफर को हटाने के लिए 1,500 × ग्राम पर 2 मिन के लिए एक आकार बहिष्करण कॉलम अपकेंद्रित्र। के माध्यम से प्रवाह त्यागें, और एक ताजा ट्यूब में स्तंभ जगह.
      25. अनिगमित रेडियोधर्मी न्यूक्लियोटाइड को हटाने के लिए स्तंभ के माध्यम से जांच मिश्रण पास करें। जांच एकत्र करने के लिए 1,500 × ग्राम पर 30 एस के लिए अपकेंद्रित्र।
      26. झिल्ली के लिए जांच के गैर-विशिष्ट बंधन को अवरुद्ध करने के लिए सैल्मन शुक्राणु डीएनए (1:100) के 150 माइक्रोन जोड़ें।
      27. डबल फंसे डीएनए को विकृत करने के लिए 5 मिन के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर जांच मिश्रण को इनक्यूबेट करें।
      28. कुछ सेकंड के लिए बर्फ पर स्नैप-फ्रीज, और ढक्कन पर संघनित पानी की बूंदों को नीचे लाने के लिए 500 × ग्राम पर कुछ सेकंड के लिए अपकेंद्रित्र।
      29. संक्षेप में रोटेशन के साथ 5-10 मिनट के लिए संकरण बफर के साथ दक्षिणी धब्बा झिल्ली धो लें।
      30. रोटेशन के साथ 55 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए संकरण बफर के साथ झिल्ली को पूर्व-संकरण करें। संकरण बफर त्यागें।
      31. तैयार जांच के साथ झिल्ली के लिए ताजा संकरण बफर (55 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व गर्म) के 15 एमएल जोड़ें. रोटेशन के साथ 55 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात झिल्ली सेते हैं.
      32. पोस्ट-संकरण 0.3x एसएससी के साथ प्रत्येक 15 मिनट के लिए 2x धोता है, रोटेशन के साथ 55 डिग्री सेल्सियस पर 0.1% एसडीएस करता है।
      33. संकरण के बाद 0.1x एसएससी के साथ प्रत्येक 15 मिनट के लिए 2x धोता है, रोटेशन के साथ 55 डिग्री सेल्सियस पर 0.1% एसडीएस करता है।
      34. पोस्ट-संकरण 0.1x एसएससी के साथ प्रत्येक 15 मिनट के लिए 2x धोता है, रोटेशन के साथ 55 डिग्री सेल्सियस पर 1.5% एसडीएस करता है।
      35. संकरण ट्यूब से झिल्ली निकालें, और फिल्म पर रेडियोधर्मी छाप प्राप्त करने के लिए 3 दिनों तक एक फॉस्फोरइमेजर स्क्रीन पर झिल्ली को उजागर करें।
      36. फॉस्फोरइमेजिंग लेजर स्कैनिंग सिस्टम का उपयोग करके फिल्म की छवियां प्राप्त करें।
  2. प्रोटीन विश्लेषण
    1. नमूना तैयार करना
      1. सभी प्रोटीन नमूनों को उनके अंतिम संस्करणों (200 माइक्रोन, 100 माइक्रोन, 100 माइक्रोन, 20 माइक्रोन, और कच्चे सेल निकालने, इनपुट, प्रवाह-थ्रू, मोती, और क्रमशः नमूनों को एल्यूट करने के लिए 20 माइक्रोन) में समायोजित करें) β-मर्कैप्टोथेनॉल, पेज एलडीएस नमूना बफर (1x), और डीएच2ओ के 1 माइक्रोन जोड़कर
      2. 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर नमूने denature.
    2. पश्चिमी धब्बा विश्लेषण
      नोट: मानक प्रोटोकॉल15,16 का उपयोग कर एसडीएस-पेज और पश्चिमी सोख्ता प्रदर्शन करें।
      1. प्रत्येक नमूने के 15 माइक्रोन को 1.5 मिमी एसडीएस-पेज जेल के प्रत्येक कुएं में लोड करें।
      2. 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेशन के साथ पीएपी (1: 2,000) और लेक्सा (1: 1,000) एंटीबॉडी का उपयोग करके धब्बा की इम्यूनोस्टेनिंग करें। 5% सूखे दूध/पीबीएसटी समाधान में पतला।
        नोट: पीएपी विश्लेषण के बाद, धब्बा दूसरे LexA एंटीबॉडी के साथ immunostaining से पहले एक हल्के अलग अलग प्रोटोकॉल17 का उपयोग कर छीन लिया जा सकता है.

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Representative Results

~ 1.4 kb ARS316 क्रोमैटिन डोमेन की शुद्धि संवैधानिक रूप से व्यक्त LexA-TAP एडाप्टर प्रोटीन द्वारा मध्यस्थता की गई थी। एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए, हमने एक आइसोजेनिक तनाव का उपयोग करके शुद्धिकरण किया जो लेक्सा-टीएपी को व्यक्त करता है लेकिन इसमें एकीकृत आरएस और लेक्सा-बाध्यकारी साइटें शामिल नहीं हैं। चित्रा 3 ARS316 स्थान को लक्षित करने वाले नियंत्रण और पुनर्संयोजन-सक्षम तनाव दोनों पर किए गए मानक शुद्धि प्रयोग से डीएनए विश्लेषण परिणाम दिखाता है। परिपत्र डीएनए अणुओं को रैखिक बनाने के लिए डीएनए अलगाव और प्रतिबंध एंजाइम पाचन के बाद, क्यूपीसीआर विश्लेषण असंबंधित जीनोमिक नियंत्रण स्थान पीडीसी 1 पर एआरएस 316 लक्ष्य स्थान की शुद्धि दक्षता का आकलन करने के लिए किया गया था।

इसके अलावा, कुल क्रोमैटिन पर ARS316 स्थान का संवर्धन मात्रा निर्धारित किया गया था (चित्र 3A, B)। नकारात्मक नियंत्रण तनाव ने कच्चे सेल निकालने, इनपुट और प्रवाह-थ्रू को छोड़कर किसी भी अंश में ARS316 या PDC1 लोकी की कोई वसूली नहीं दिखाई, यह सुझाव देते हुए कि TEV और विकृतीकरण एल्यूशन में कोई विशिष्ट संवर्धन नहीं देखा जा सकता है। इसके विपरीत, ARS316 लोकस को पुनर्संयोजन तनाव में प्रवाह-थ्रू में मात्रात्मक रूप से समाप्त कर दिया गया था और TEV क्षालन के बाद और विकृतीकरण क्षालन में मोतियों पर पुनर्प्राप्त किया जा सकता था। TEV क्षालन के बाद, मोतियों ने ARS316 स्थान का उच्च पुनर्प्राप्ति प्रतिशत दिखाया क्योंकि TEV दरार दक्षता 100% नहीं थी। इसके परिणामस्वरूप क्रोमैटिन के छल्ले का एक अंश मोतियों से बंधा रहा। TEV प्रोटीज दरार दक्षता को 100 μL से ऊपर क्षालन मात्रा बढ़ाकर सुधार किया जा सकता है। इसके विपरीत, विकृतीकरण क्षालन ने पुनर्संयोजन तनाव(चित्रा 3ए)में एआरएस316 स्थान की 80% -90% वसूली दिखाई, जो खमीर जीनोम(चित्रा 3बी)के आकार में फैक्टरिंग करते समय एआरएस316 अणुओं के उच्च संवर्धन के अनुरूप है।

क्यूपीसीआर परिणामों को मान्य करने के लिए दक्षिणी धब्बा भी किया गया था। इसकी उच्च संवेदनशीलता के कारण, यह लक्ष्य डीएनए की अपेक्षाकृत कम सांद्रता का पता लगा सकता है, इस प्रकार नमूनों के मात्रात्मक विश्लेषण की अनुमति देता है। रेडियोधर्मी रूप से लेबल जांच का उपयोग करके दक्षिणी धब्बा विश्लेषण से प्राप्त परिणामों ने पुनर्संयोजन तनाव से एकत्र किए गए अंशों में एआरएस316 लोकस के विशिष्ट संवर्धन की पुष्टि की, लेकिन नियंत्रण तनाव अंशों(चित्रा 3सी)में नहीं। पुनर्संयोजन तनाव में, ARS316 लोकस का उच्च संवर्धन TEV मोतियों में सिग्नल तीव्रता और qPCR परिणामों के अनुरूप विकृतीकरण क्षालन नमूनों के आधार पर देखा गया था। इसी तरह, टीईवी क्षालन और विकृतीकरण मोती के नमूनों में देखे गए कमजोर संकेत इन अंशों(चित्रा 3सी)में एआरएस316 स्थान के मनाया कम संवर्धन के अनुरूप हैं।

LexA-TAP दरार और पुलडाउन क्षमता का मूल्यांकन पश्चिमी धब्बा विश्लेषण द्वारा भी किया गया था। लेक्सा-टीएपी प्रोटीन में ~ 80 केडीए(चित्रा 4ए)का आणविक भार होता है। पुनर्संयोजन और नियंत्रण उपभेदों दोनों में, पश्चिमी धब्बा विश्लेषण पीएपी एंटीबॉडी का उपयोग करके किया गया था, जो शुद्धि नमूनों में लेक्सा-टीएपी के प्रोटीन ए मोइटी को लक्षित करता है। जैसा कि प्रत्याशित था, परिणामों ने प्रवाह-थ्रू में लेक्सा-टीएपी की निकट-कुल कमी का प्रदर्शन किया, अंतिम मनका और क्षालन अंशों(चित्रा 4बी[मैं]) में देखी गई वसूली के साथ। पीएपी एंटीबॉडी भी छोटे प्रोटीन ~ 15 केडीए के टुकड़े का पता लगाता है जो टीईवी क्षालन के बाद मोतियों पर रहता है। एक ही पश्चिमी धब्बा छीन लिया गया था और लेक्सा-टीएपी (चित्रा 4 बी [द्वितीय]) के लेक्सा मोइटी के खिलाफ एक एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोस्टेन्ड किया गया था, पूरक परिणाम दिखा रहा है (चित्रा 4 बी [ii])। दोनों धब्बों में ~ 50 केडीए पर मजबूत बैंड चुंबकीय मोतियों के साथ युग्मित आईजीजी भारी श्रृंखला को इंगित करता है, जो प्राथमिक/माध्यमिक एंटीबॉडी संयुग्म(चित्रा 4बी[द्वितीय]) के साथ क्रॉस-हाइब्रिडाइज करता है।

Figure 1
चित्रा 1: खमीर तनाव निर्माण के योजनाबद्ध। गुणसूत्र III पर एकीकृत LexA और पुनर्संयोजन साइटों के साथ एक संशोधित खमीर तनाव TEF2 प्रमोटर और गैलेक्टोज-इंड्यूसिबल एक्सप्रेशन कैसेट का उपयोग करके LexA-TAP फ्यूजन प्रोटीन की संवैधानिक अभिव्यक्ति के लिए अभिव्यक्ति कैसेट के साथ एक प्लाज्मिड (K238) के साथ बदल जाता है और GAL10 प्रमोटर का उपयोग करके R recombinase (RecR) अभिव्यक्ति के लिए गैलेक्टोज-इंड्यूसिबल एक्सप्रेशन कैसेट। प्लास्मिड को एसबीएफआई प्रतिबंध पाचन द्वारा रैखिक किया जाता है, जिससे गुणसूत्र I पर एक इंटरजेनिक स्थान में अभिव्यक्ति कैसेट के एकीकरण के लिए समरूप पुनर्संयोजन हथियार बनते हैं। सक्षम कोशिकाओं का चयन ल्यूसीन की कमी वाले विकास माध्यम पर LEU2 चयन मार्कर के आधार पर किया जाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: खमीर Saccharomyces cerevisiae से ARS316 क्रोमैटिन स्थान की शुद्धि। ARS316 लोकस को गैलेक्टोज-प्रेरित साइट-विशिष्ट पुनर्संयोजन द्वारा खमीर कोशिकाओं में अपने जीनोमिक स्थान से क्रोमैटिन के छल्ले के रूप में निकाला जाता है। इन क्रोमैटिन के छल्ले LexA-TAP आत्मीयता टैग का उपयोग करके कच्चे सेल निकालने से अलग होते हैं जो IgG-युग्मित चुंबकीय मोतियों से बंधे होते हैं। क्रोमैटिन के छल्ले दो तरीकों से मोतियों से मुक्त किए जा सकते हैं: i) TEV प्रोटीज-मध्यस्थता दरार, या ii) अमोनियम समाधान का उपयोग करके विकृतीकरण क्षालन। बिंदीदार तीर शेष मनका-बाध्य क्रोमैटिन के छल्ले को छोड़ने के लिए टीईवी प्रोटीज़-मध्यस्थता क्षालन के बाद विकृतीकरण क्षालन करने की संभावना का प्रतिनिधित्व करता है, क्योंकि टीईवी प्रोटीज दरार दक्षता 100% नहीं है। उल्लिखित बक्से प्रोटीन और डीएनए विश्लेषण के लिए शुद्धि के विभिन्न चरणों में प्राप्त नमूनों का प्रतिनिधित्व करते हैं। संक्षिप्त: आरएस = पुनर्संयोजन साइट। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: एआरएस316 लोकस शुद्धि का मूल्यांकन करने के लिए डीएनए विश्लेषण। (ए) बार ग्राफ ARS316 स्थान और एक असंबंधित क्षेत्र, PDC1 की शुद्धि दिखा रहा है, पुनर्संयोजन खमीर तनाव से ARS316 क्रोमैटिन स्थान शुद्धि के दौरान एकत्र डीएनए नमूनों की एक श्रृंखला में। (बी) बार ग्राफ नियंत्रण और पुनर्संयोजन खमीर उपभेदों से ARS316 क्रोमेटिन लोकस शुद्धि के दौरान एकत्र किए गए डीएनए नमूनों की एक श्रृंखला में कुल क्रोमैटिन पर ARS316 स्थान के संवर्धन को दर्शाता है। (सी)दक्षिणी धब्बा छवि नियंत्रण और पुनर्संयोजन खमीर उपभेदों से ARS316 क्रोमैटिन लोकस शुद्धि के दौरान एकत्र किए गए डीएनए नमूनों की एक श्रृंखला में ARS316 स्थान के संवर्धन को दर्शाती है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: प्रोटीन विश्लेषण लेक्सा-टीएपी पुल-डाउन और दरार दक्षता का मूल्यांकन करने के लिए। (ए) कार्टून प्रत्येक डोमेन के आकार के साथ-साथ लेक्सा-टीएपी फ्यूजन प्रोटीन के विभिन्न प्रोटीन डोमेन का प्रतिनिधित्व करता है। (बी) नियंत्रण और पुनर्संयोजन खमीर उपभेदों से ARS316 क्रोमेटिन लोकस शुद्धि के दौरान एकत्र किए गए प्रोटीन नमूनों की एक श्रृंखला में (i) पीएपी और (ii) लेक्सा के खिलाफ इम्यूनोस्टेनिंग दिखाने वाली पश्चिमी धब्बा छवियां। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: फ्लो आरेख लेक्सा-टीएपी आत्मीयता शुद्धि का उपयोग करके शुद्ध क्रोमैटिन डोमेन के संभावित डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों को उजागर करता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 1: इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले समाधान और मीडिया की एक सूची। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 2: मात्रात्मक पीसीआर कार्यक्रम। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

कारकों और एक विशिष्ट लक्ष्य जीनोमिक क्षेत्र के क्रोमेटिन परिदृश्य की पहचान क्रोमेटिन अनुसंधान18 में एक बड़ी चुनौती पैदा करने के लिए जारी है. यह प्रोटोकॉल खमीर गुणसूत्रों से अलग-अलग क्रोमैटिन डोमेन को विशेष रूप से उत्पाद शुल्क और शुद्ध करने के लिए एक कुशल प्रणाली का वर्णन करता है। हमारे ज्ञान के लिए, इस एकल-चरण शुद्धि की शुद्धता और उपज लोकस-विशिष्ट क्रोमैटिन शुद्धि विधियों की कई सीमाओं को दूर करती है, इस प्रकार अन्य असंबंधित जीनोमिक क्षेत्रों की तुलना में लक्षित लोकी के बहुत उच्च संवर्धन की उपलब्धि की अनुमति देती है।

साइट-विशिष्ट आर-रीकॉम्बिनेज का उपयोग करके अतिरिक्त छांटना कदम के कारण, एक और लाभ यह है कि कोई यह निर्धारित कर सकता है कि जीनोम में पुनर्संयोजन साइटों के सटीक स्थान के आधार पर कौन सा जीनोमिक क्षेत्र शुद्ध है। इसके विपरीत, अन्य विधियां सोनिकेशन द्वारा डीएनए के कतरनी पर निर्भर हैं, जिसके परिणामस्वरूप विषम अणु लंबाई होती है; यह विषमता उन तरीकों को एक अच्छी तरह से परिभाषित लक्ष्य स्थान की शुद्धि के संदर्भ में कम सटीक बनाती है।

अंत में, यह शुद्धिकरण रणनीति फॉर्मलाडेहाइड जैसे रासायनिक क्रॉसलिंकर्स को शामिल किए बिना देशी स्थितियों का उपयोग करती है। इस प्रकार, इस दृष्टिकोण द्वारा प्राप्त पृथक सामग्री संरचनात्मक और कार्यात्मक विश्लेषण के लिए उत्तरदायी है। शुद्धिकरण प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम टीईवी क्षालन की दक्षता है, जो दृढ़ता से कई मापदंडों पर निर्भर करता है, जिसमें टीईवी प्रोटीज की गतिविधि, प्रतिक्रिया की स्थिति और प्रतिक्रिया की मात्रा शामिल है। दिखाए गए प्रयोग के लिए, क्षालन मात्रा को न्यूनतम पर सेट किया गया था, जिसने क्षालन की दक्षता को प्रभावित किया। हालांकि, टीईवी प्रोटीज की मात्रा और मात्रा बढ़ाने से क्षालन दक्षता में काफी सुधार हो सकता है। कम दक्षता होने के बावजूद, टीईवी क्षालन अत्यधिक विशिष्ट दरार और वांछित क्रोमैटिन डोमेन की वसूली पैदा करता है। इसकी तुलना में, विकृतीकरण क्षालन में 90% से अधिक की क्षालन दक्षता होती है, लेकिन मोतियों से कुछ गैर-विशिष्ट डीएनए या प्रोटीन अणुओं को बाहर निकाल सकता है। इसलिए, पसंद की विधि पृथक सामग्री के वांछित डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोग पर निर्भर करती है। उदाहरण के लिए, संबंधित क्रोमेटिन कारकों के बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्रिक पहचान की अनुमति देने के लिए विकृतीकरण क्षालन का प्रदर्शन किया गया है, जबकि देशी टीईवी क्षालन को डाउनस्ट्रीम कार्यात्मक परख जैसे इन विट्रो प्रतिलेखन या प्रतिकृति परख के लिए पसंद किया जाता है। चित्रा 5 वर्णित शुद्धि प्रोटोकॉल के संभावित बहाव अनुप्रयोगों को सारांशित करता है। सारांश में, एकल लोकी की क्रोमैटिन संरचना का अध्ययन करने के लिए यह बेहतर वर्कफ़्लो और अत्यधिक कुशल विधि क्रोमैटिन अनुसंधान में लंबे समय से चली आ रही चुनौती को संबोधित करती है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

एसएच प्रयोगशाला में काम को डीएफजी द्वारा SFB1064 (प्रोजेक्ट आईडी 213249687), यूरोपीय अनुसंधान परिषद (ईआरसी स्टार्टिंग ग्रांट 852798 कॉन्फ्लिक्टरिज़ॉल्यूशन), और हेल्महोल्ट्ज़ गेसेलशाफ्ट के माध्यम से समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Yeast strains
Control Strain: MATa; ura3Δ0; leu2Δ0; his3Δ1; met15Δ0; bar1::kanMX4; Chr I 212kb::LEU2 pTEF2-LEXA-TAP pGAL1-10 RecR Section 1, see references 13 and 14
Recombination Strain: MATa; ura3Δ0; leu2Δ0; his3Δ1; met15Δ0; bar1::kanMX4; RS_LEXA_NS-3_ARS316_NS+3_RS; Chr I 212kb::LEU2 pTEF2-LEXA-TAP pGAL1-10 RecR Section 1, see reference 13 and 14
Plasmid
K238 plasmid Section 1, see reference 13
Storage: Store at -20 °C
K071 Spike-in plasmid DNA Section 7.1, see reference 13
Storage: Store at -20 °C
Reagents
Acetone Carl Roth 5025.1 Section 2
Storage: Store at room temperature
Ammonium acetate (NH4Ac) Sigma Aldrich A7262 Section 6 and 7.1
Storage: Store at room temperature
Ammonium solution (NH4OH) 25% Merck Millipore 533003 Section 6
Storage: Store at room temperature
Ammonium sulfate Santa Cruz Sc-29085 Section 2
Storage: Store at room temperature
Bacto agar BD (VWR) 90000-760 Section 3
Storage: Store at room temperature
Bacto peptone BD (VWR) 211820 Section 3
Storage: Store at room temperature
β-Mercaptoethanol Sigma Aldrich 07604 Section 7.2
Storage: Store at 4 °C
Chemiluminescent substrate kit ThermoFisher 34580 Section 7.2
Storage: Store at 4 °C
Di-Sodium Hydrogen phosphate dodecahydrate Merck 1.06579.1000 Section 2 and 7.1
Storage: Store at room temperature
Dithiothreitol (DTT) ThermoFisher 15508013 Section 4
Storage: Store at 4 °C
Ethanol Merck 100983 Section 7.1
Storage: Store at room temperature
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma Aldrich ED Section 7.1
Storage: Store at room temperature
Galactose (20% (w/v) stock) Sigma Aldrich G0625-1KG  /  5KG Section 3
Storage: Store at room temperature
Gel loading dye (6x) BioLabs B7024A Section 7.1
Storage: Store at -20 °C
Glusose Sigma-Aldrich G8270 Section
Storage: Store at room temperature
Glycine Carl Roth .0079.4 Section 2
Storage: Store at room temperature
Glycogen (5 mg/mL) Invitrogen AM9510 Section 7.1
Storage: Store at -20 °C
Hydrochloric acid (HCl) PanReac AppliChem 182109.1211 Section 2, 4 and 7.1
Storage: Store at room temperature
Magnesium Acetate (MgAc) Bernd Kraft 15274.2600/C035 Section 4
Storage: Store at room temperature
Magnesium chloride (MgCl2) Sigma Aldrich M8266 Section 6
Storage: Store at room temperature
Nu PAGE LDS sample buffer (4x) Invitrogen 2399549 Section 7.2
Storage: Store at room temperature
Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1 v/v) Invitrogen 15593-031 Section 7.1
Storage: Store at 4 °C
Potassium chloride (KCl) Sigma P9541 Section 4
Storage: Store at room temperature
Radioactively labeled α-32P dATP (3,000 Ci/mmol, 10 mCi/mL) Hartmann Analytic SRP-203 Section 7.1
Storage: Store at 4 °C
RadPrime labeling system ThermoFisher 18428-011 Section 7.1
Storage: Store at -20 °C
Raffinose (20% (w/v) stock) SERVA 34140.03 Section 3
Storage: Store at room temperature
Sodium chloride (NaCl) Merck K53710504142 Section 7.1
Storage: Store at room temperature
Sodium citrate (Na3C6H5O7) Sigma-Aldrich 71402 Section 7.1
Storage: Store at room temperature
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma Aldrich S5881 Section 7.1
Storage: Store at room temperature
Sodium n-dodecyl sulfate (SDS) (5% stock (w/v) ) Alfa Aesar A11183 Section 7.1
Storage: Store at room temperature
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich 71496 Section 2 and 7.1
Storage: Store at room temperature
Sodium azide Santa Cruz Biotechnology sc-208393 Section 2
Storage: Store at -20 °C
 Triethylamine Sigma Aldrich 90340 Section 2
Storage: Store at room temperature
Tris base Chem Cruz SC-3715B Section 2 and 4
Storage: Store at room temperature
Triton X-100 Sigma Aldrich X100 Section 2 and 4
Storage: Store at room temperature
Tween-20 Bernd Kraft 18014332 Section 4
Storage: Store at room temperature
Yeast extract BD (VWR) 212720 Section 3
Storage: Store at room temperature
Yeast mating factor alpha (1 µg/mL stock )  Biomol Y2016.5 Section 3
Storage: Store at -20 °C
Yeast Synthetic Drop-out medium Supplements without LEUCINE Sigma Aldrich Y1376 Section 1, see reference 14
Enzymes
HpaI restriction enzyme (5,000 U/mL) NEB R0105S Section 7.1
Storage: Store at -20 °C
Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100x) ThermoFisher Scientific 78446 Section 4
Storage: Store at4 °C
Proteinase K (10 mg/mL) SERVA 33756 Section 7.1
Storage: Store at -20 °C
RNase A (10 mg/mL)  ThermoFisher EN0531 Section 7.1
Storage: Store at -20 °C
TEV protease (10000 U/µL) NEB P8112S Section 5
Storage: Store at -20 °C
Materials
BcMag Epoxy-Activated Magnetic Beads Bioclone Inc. FC-102 Section 2
Storage: Store at 4 °C
Dry ice Section 4
Low-binding centrifuge tubes 2.0 mL Eppendorf 22431102 Section 4
Microspin G-25 Columns Cytiva 27-5325-01 Section 7.1
Storage: Store at room temperature
Parafilm Merck P7793 Section 4
Positive nylon membrane Biozol 11MEMP0001 Section 7.1
Storage: Store at room temperature
PVDF transfer membrane Immobilon-Merck Millipore IPVH00010 Section 7.2
Storage: Store at room temperature
SDS-PAGE gel 4-12% bis-tris (15 well, 1.5 mm) Invitrogen  NP0336BOX Section 7.2
Storage: Store at 4 °C
Syringe (25 mL) with luer fitting Henke Sass Wolf 4200-000V0 Section 3
Whatman paper (Grade 3MM CHR Cellulose Western Blotting Paper Sheet) Cytiva 3030-917 Section 7.1
Storage: Store at room temperature
Antibodies
Anti-LexA, rabbit polyclonal IgG, DNA binding region antibody Merck Millipore 06-719 Section 7.2
Storage: Store at -20 °C
Goat Anti-Rabbit IgG (H+L), Horseradish peroxidase conjugate Invitrogen G21234 Section 7.2
Storage: Store at -20 °C
Peroxidase Anti-Peroxidase (PAP) antibody produced in rabbit for the detection of TAP-tagged proteins Sigma Aldrich P1291-500UL Section 7.2
Storage: Store at -20 °C
Rabbit IgG antibodies Sigma I5006-100MG Section 2
Storage: Store at 4 °C
Primers (10 µM)
ARS316: fwd 5'- CGGCATTATCGTACACAACCT, rev 5'- GTTCTTCGTTGCCTACATTTTCT Section 7.1
K071 Spike-in plasmid DNA: fwd: 5'-TTTTCGCTGCTTGTCCTTTT, rev 5'- CATTTTCGTCCTCCCAACAT Section 7.1
PCR fragment from yeast genomic DNA as a template  for ARS316 amplification (for southern blot): fwd 5’- AAATTCTGCCCTTGATTCGT                                                  rev 5’- TTTGTTTATCTCATCACTAAT Section 7.1
PDC1: fwd 5'- CATGATCAGATGGGGCTTCA, rev 5'-ACCGGTGGTAGCGACTCTGT Section 7.1
Equipment
Coffee grinder Gastroback 42601 Section 4
Dewar flask NAL GENE 4150-2000 Section 3
DynaMag TM-2 magnetic rack Invitrogen 12321D Section 4, 5 and 6
Hybridization oven Hybaid Mini10 Ri418 Section 2
Microcentrifuge Eppendorf 5424R Section 4 and 7.1
UV-crosslinker Analytikjena 95-0174-02 Section 7.1

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References

  1. Kornberg, R. D., Lorch, Y. Twenty-five years of the nucleosome, fundamental particle of the eukaryote chromosome. Cell. 98 (3), 285-294 (1999).
  2. Gauchier, M., van Mierlo, G., Vermeulen, M., Déjardin, J. Purification and enrichment of specific chromatin loci. Nature Methods. 17 (4), 380-389 (2020).
  3. Korthout, T., et al. Decoding the chromatin proteome of a single genomic locus by DNA sequencing. PLoS Biology. 16 (7), e2005542 (2018).
  4. Antão, J. M., Mason, J. M., Déjardin, J., Kingston, R. E. Protein landscape at Drosophila melanogaster telomere-associated sequence repeats. Molecular and Cellular Biology. 32 (12), 2170-2182 (2012).
  5. Déjardin, J., Kingston, R. E. Purification of proteins associated with specific genomic loci. Cell. 136 (1), 175-186 (2009).
  6. Ide, S., Dejardin, J. End-targeting proteomics of isolated chromatin segments of a mammalian ribosomal RNA gene promoter. Nature Communications. 6, 6674 (2015).
  7. Unnikrishnan, A., Gafken, P. R., Tsukiyama, T. Dynamic changes in histone acetylation regulate origins of DNA replication. Nature Structural & Molecular Biology. 17 (4), 430 (2010).
  8. Buxton, K. E., et al. Elucidating protein-DNA interactions in human alphoid chromatin via hybridization capture and mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 16 (9), 3433-3442 (2017).
  9. Kennedy-Darling, J., et al. Discovery of chromatin-associated proteins via sequence-specific capture and mass spectrometric protein identification in Saccharomyces cerevisiae. Journal of Proteome Research. 13 (8), 3810-3825 (2014).
  10. Liu, S. J., et al. CRISPRi-based genome-scale identification of functional long noncoding RNA loci in human cells. Science. 355, 7111 (2017).
  11. Hamperl, S., et al. Purification of specific chromatin domains from single-copy gene loci in Saccharomyces cerevisiae. Functional Analysis of DNA and Chromatin. 1094, 329-341 (2014).
  12. Hamperl, S., et al. Compositional and structural analysis of selected chromosomal domains from Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 42 (1), 2 (2014).
  13. Weiβ, M. Single-copy locus proteomics of early- and late-firing DNA replication origins identifies a role of Ask1/DASH complex in replication timing control. Cell Reports. 42 (2), 112045 (2023).
  14. Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nature Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).
  15. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  16. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  17. Western blot membrane stripping for restaining protocol. Abcam. , Available from: https://www.abcam.com/protocols/western-blot-membrane-stripping-for-restaining-protocol (2023).
  18. Vermeulen, M., Déjardin, J. Locus-specific chromatin isolation. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 21 (5), 249-250 (2020).

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Sajid, A., Hamperl, S. Single-Copy Gene Locus Chromatin Purification in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (201), e65460, doi:10.3791/65460 (2023).

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