Summary
Detta protokoll presenterar en locus-specifik kromatinisoleringsmetod baserad på platsspecifik rekombination för att rena ett genlokus med en kopia av intresse i dess ursprungliga kromatinkontext från spirande jäst, Saccharomyces cerevisiae.
Abstract
Den grundläggande organisatoriska enheten för eukaryot kromatin är nukleosomkärnpartikeln (NCP), som består av DNA lindat ~1,7 gånger runt en histonoktamer. Kromatin definieras som enheten av NCP och många andra proteinkomplex, inklusive transkriptionsfaktorer, kromatinremodellering och modifierande enzymer. Det är fortfarande oklart hur dessa protein-DNA-interaktioner orkestreras på nivån av specifika genomiska loci under olika stadier av cellcykeln. Detta beror främst på de nuvarande tekniska begränsningarna, som gör det svårt att få exakta mätningar av sådana dynamiska interaktioner. Här beskriver vi en förbättrad metod som kombinerar platsspecifik rekombination med ett effektivt enstegs affinitetsreningsprotokoll för att isolera ett genlokus av intresse i dess ursprungliga kromatintillstånd. Metoden möjliggör robust anrikning av mållokus över genomiskt kromatin, vilket gör denna teknik till en effektiv strategi för att identifiera och kvantifiera proteininteraktioner på ett opartiskt och systematiskt sätt, till exempel genom masspektrometri. Utöver sådana sammansättningsanalyser återspeglar natiskt kromatin renat med denna metod sannolikt in vivo-situationen när det gäller nukleosompositionering och histonmodifieringar och är därför mottagligt för ytterligare strukturella och biokemiska analyser av kromatin som härrör från praktiskt taget alla genomiska lokus i jäst.
Introduction
Den dynamiska organisationen av eukaryota genom till kromatin komprimerar DNA:t så att det passar inom kärnans gränser samtidigt som det säkerställer tillräcklig dynamik för genuttryck och tillgänglighet för regulatoriska faktorer. Delvis förmedlas denna mångsidighet av nukleosomen, den grundläggande enheten för kromatin, som består av en kärnpartikel med 147 bp DNA lindat ~1,7 gånger runt histonoktameren1. Nukleosomen är en mycket dynamisk struktur med avseende på dess sammansättning, med många histonvarianter och posttranslationella modifieringar (PTM) på de N- och C-terminala histonsvansarna. Dessutom interagerar eukaryot kromatin med en mängd andra viktiga komponenter, såsom transkriptionsfaktorer, DNA- och RNA-bearbetningsmaskiner, arkitektoniska proteiner, enzymer som är involverade i kromatinremodellering och modifiering och RNA-molekyler associerade med kromatin. Dessa viktiga maskiner som är involverade i transkription, replikering och reparation kräver alla tillgång till kromatin, som fungerar som det naturliga substratet för dessa processer. Följaktligen kräver förståelsen av de molekylära mekanismerna bakom dessa DNA-transaktioner en exakt definition av de kollektiva förändringarna i kromatinstrukturen vid de specifika genomiska regioner där dessa maskiner konvergerar och underlättar biologiska reaktioner.
Trots identifieringen av många kromatinfaktorer genom genetik och protein-proteininteraktionsstudier har det förblivit ett betydande hinder att utföra direkta, opartiska och omfattande analyser av kromatininteraktioner på särskilda genomiska platser 2,3. Initialt kunde endast mycket rikligt förekommande regioner i genomet (dvs. repetitiva loci) eller multi-copy plasmider isoleras i tillräcklig mängd och renhet för masspektrometrisk identifiering av de associerade proteinerna 4,5,6,7. En serie nya tillvägagångssätt baserade på direkt hybridisering av infångningsprober till kromatiniserat DNA, proximitetsbiotinylering med hjälp av CRISPR-dCas9-systemet eller bindning av sekvensspecifika adapterproteiner till den intressanta platsen har börjat nysta upp proteomet hos enstaka kopieloci från jäst- och däggdjursgenom 8,9,10. Emellertid, alla dessa metoder kräver formaldehyd tvärbindning för att stabilisera protein-DNA-interaktioner och ultraljudsbehandling för att solubilisera kromatinet för efterföljande rening. Tillsammans utesluter båda manipulationerna möjligheten till efterföljande strukturella och funktionella studier av det renade kromatinet.
För att övervinna dessa begränsningar har vi tidigare utarbetat en metod som använder platsspecifik rekombination för att extrahera riktade kromosomala domäner från jäst11,12. I huvudsak är den genomiska regionen av intresse omgiven av igenkänningsställen (RS) för det platsspecifika R-rekombinas från Zygosaccharomyces rouxi samtidigt som den innehåller en grupp av tre DNA-bindningsställen för det prokaryota transkriptionsrepressorproteinet LexA (LexA) inom samma region. Jästcellerna innehåller en expressionskassett för samtidig expression av R-rekombinas och ett LexA-protein smält till en tandem affinity purification (TAP)-tagg. Efter induktion av R-rekombinas avlägsnar enzymet effektivt målområdet från kromosomen i form av en cirkulär kromatindomän. Denna domän kan renas via LexA-TAP-adapterproteinet, som binder till LexA-DNA-bindningsställena, samt till ett affinitetsstöd. Denna metod har nyligen använts för att isolera distinkta kromatindomäner som innehåller utvalda replikationsursprung för jästkromosom III13.
En stor fördel med denna ex vivo-metod är att den möjliggör funktionella analyser av det isolerade materialet. Till exempel kan replikationsursprungsdomäner som renats med denna metod utsättas för in vitro-replikationsanalyser för att bedöma effektiviteten av ursprungsavfyrning i ett provrör från nativa in vivo-monterade kromatinmallar. I slutändan kan den biokemiska och funktionella karakteriseringen av det isolerade materialet möjliggöra rekonstituering av kärnprocesser med hjälp av renade proteiner tillsammans med den nativa kromatinmallen. Sammanfattningsvis öppnar denna metodik en spännande väg inom kromatinforskningen, eftersom det kommer att vara möjligt att följa de kollektiva sammansättnings- och strukturella kromatinförändringarna i en specifik genomisk region som genomgår en viss kromosomtransaktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Se materialtabellen för detaljer relaterade till alla material och instrument som används i detta protokoll. Se tabell 1 för en lista över de lösningar, buffertar och media som används.
1. Rekombinant jäststamkonstruktion
- För att konstruera en rekombinationskompetent jäststam, transformera SbfI-uppspjälkad plasmid K238 till en jäststam med integrerade LexA-bindningsställen och RS-rekombinationsställen på platsen av intresse13,14.
Anmärkning: Det transformerade SbfI-restriktionsfragmentet innehåller den uttryckskassett som krävs för konstitutivt uttryck av LexA-TAP-fusionsproteinet och R-rekombinas tillsammans med homologa sekvenser av jästkromosom I för genomisk integration av expressionskassetten genom homolog rekombination (figur 1). - För att konstruera en kontrollstam, ta en isogen jäststam som saknar integrerade RS- och LexA-bindningsställen och transformera den med SbfI-smält K238-plasmid under samma förhållanden som används för den rekombinationskompetenta stammen.
- Välj de behöriga jästcellerna baserat på markören för LEU2-urval på SCD-LEU-agarplattorna14.
2. Koppling av IgG-antikroppar till epoxiaktiverade magnetiska pärlor
OBS: Koppla IgG-antikroppar till epoxiaktiverade magnetiska pärlor enligt följande publicerade protokoll11.
- Häng upp 300 mg epoxiaktiverade kulor i 10 ml 50 % aceton (300 mg motsvarar ~5,1 × 1010 kulor) i ett 50 ml koniskt rör. Skaka kraftigt på en virvelmixer.
- Centrifugera röret med kulorna vid 820 × g och 4 °C i 2 min. Ta bort supernatanten.
- Tvätta pärlorna 3 gånger med 20 ml 0,1 M natriumfosfatbuffert (pH 7,4). Avlägsna supernatanten efter varje tvättsteg genom centrifugering enligt beskrivningen i steg 2.2.
- Häng upp pärlorna i 16 ml 0,1 M natriumfosfatbuffert (pH 7,4) och rotera försiktigt i en hybridiseringsugn i 5 minuter i rumstemperatur.
- Lös upp kanin-IgG (100 mg) i 7 ml dH2O (slutlig koncentration: 14 mg/ml).
- Centrifugera IgG-suspensionen vid 13 000 × g och 4 °C i 10 minuter för att klargöra suspensionen.
- Överför 3,5 ml av supernatanten (motsvarande 50 mg kanin-IgG) till ett nytt 50 ml koniskt rör.
- Späd IgG-lösningen med 9,85 ml 0,1 M natriumfosfatbuffert (pH 7,4), följt av droppvis tillsats av 6,65 ml 3 M ammoniumsulfat i 0,1 M natriumfosfat (pH 7,4) under försiktig blandning.
OBS: Undvik att tillsätta ammoniumsulfat snabbt till lösningen eftersom en hög lokal koncentration av saltet kommer att orsaka utfällning av kanin-IgG. - Centrifugera IgG-lösningen vid 820 × g och 4 °C i 3 minuter och tillsätt supernatanten till den magnetiska pärlsuspensionen.
- Inkubera röret över natten eller minst 18 timmar vid 30 °C med försiktig rotation i en hybridiseringsugn.
- Ta bort supernatanten enligt beskrivningen i steg 2.2.
- Tvätta pärlorna med 20 ml 100 mM glycin-HCl (pH 2,5). Avlägsna lösningen snabbt enligt beskrivningen i steg 2.2 för att undvika denaturering av IgG-polypeptiderna.
- Tvätta pärlorna en gång med 20 ml 10 mM Tris-HCl (pH 8,8). Aspirera supernatanten enligt beskrivningen i steg 2.2.
- Tillsätt 20 ml 0,1 M trietylaminlösning i 5-10 minuter under försiktig rotation för att inaktivera de kvarvarande reaktiva epoxigrupperna. Ta bort supernatanten enligt beskrivningen i steg 2.2.
- Tvätta pärlorna 4 gånger med 20 ml PBS (pH 7,4) i 5 minuter med försiktig rotation. Ta bort supernatanten enligt beskrivningen i steg 2.2 efter varje tvättsteg.
- Tvätta pärlorna 2x med 20 ml PBS (pH 7,4) med 0,5 % Triton X-100 (w/v) i 5 minuter och 15 min vardera under försiktig rotation i en hybridiseringsugn. Ta bort supernatanten enligt beskrivningen i steg 2.2.
- Häng upp pärlorna i en slutlig volym på 16 ml PBS (pH 7,4) med 0,02 % natriumazid (w/v). Förvaras som 1 ml alikvoter vid 4 °C fram till användning.
3. Odling och skörd av jästceller
- Inokulera kontroll- och rekombinationskompetenta jäststammar från YPD-plattor i 5 ml YPR-medium och inkubera över natten vid 30 °C och 200 rpm.
- Inokulera 2 ml av denna kultur i 100 ml YPR-medium och inkubera över natten vid 30 °C och 200 rpm.
- För varje stam doseras 1 800 ml autoklaverat YP-medium och 200 ml autoklaverad raffinoslösning (20 % vikt/volym) i var och en av de två 5 l Erlenmeyerkolvarna (totalt 4 l odlingsmedium för varje stam, uppdelat i två kolvar).
- Inokulera de växande jästcellerna vid OD600 0,2 i deras respektive medium och inkubera enligt beskrivningen i steg 3.1 i cirka 6 timmar eller tills cellerna når önskad OD600 på 1,0. För att säkerställa normal tillväxt av cellerna, fria från föroreningar, kontrollera OD med 2 timmars intervall.
- Tillsätt 200 ml galaktos (20 % vikt/volym) för att inducera platsspecifik rekombination.
- Tillsätt 110 μL (50 ng/ml) YMFA (samtidigt med galaktosen, steg 3.5) för att stoppa cellerna i G1-fasen och inkubera i 2 timmar.
OBS: Tillsatsen av YMFA till cellerna beror på de experimentella förhållandena och den biologiska frågan som ska behandlas. Exakt, för detta experiment stoppas cellerna i G1-fasen för att erhålla en homogen cellpopulation med licensierat replikationsursprung; i denna process binder det pre-replikativa komplexet till ursprunget i G1-fasen innan DNA-replikationen initieras i S-fasen. - Överför cellsuspensionen till 1 l centrifughinkar och centrifugera vid 6 000 × g och 4 °C i 10 minuter. Kassera supernatanten och återsuspendera cellpelletsen i en total volym av 10-15 ml dH2O.
- Förslut en 25 ml spruta med en Luer-plugg och placera den i ett 50 ml koniskt rör fyllt med vatten. Överför cellsuspensionen till sprutenheten och centrifugera vid 2 397 × g i 10 minuter vid rumstemperatur. Kassera supernatanten.
- Ta bort Luer-pluggen från sprutan och extrudera cellerna i flytande kväve för att bilda cellspagetti.
OBS: Användning av 4 L odlingsmedium ger en våtvikt av slutcellspellets på 7-10 g. - Överför den frysta cellspaghettin till ett 50 ml koniskt rör och förvara vid −80 °C tills vidare användning.
4. Rening av kromatinlokus
OBS: Se figur 2 för en schematisk översikt över de steg som ingår i detta lokusspecifika kromatinreningsprotokoll.
- Kyl ner en kommersiell kaffekvarn genom att mala 30-50 g torris genom att skaka kaffekvarnen kraftigt 2x i 30 s varje gång. När det har svalnat, kassera torrispulvret.
- Blanda 3 g fryst jästcellsspaghetti med ~30-50 g torris i den förkylda kaffekvarnen.
- Täta korsningen mellan locket och kvarnen med parafilm för att förhindra förlust av jästcellpulver under fräsning.
- Mal jästcell-torrisblandningen 10 gånger i 30 s varje gång, med 30 s intervall mellan varje omgång (total tidsuppskattning: ~10 min). För att undvika att torrisen och cellpulvret fastnar på kaffekvarnens väggar, knacka på kaffekvarnens sidor kontinuerligt under malningen.
- Överför det resulterande jästcell-torrispulvret till en plastbägare med en ren och torr spatel.
- Förvara bägarna i rumstemperatur för att avdunsta torrisen.
- När torrisen har avdunstat, tillsätt 2,25 ml MB-buffert med 1x proteas- och fosfatashämmare (750 μL/g jästceller) till jästcellpulvret.
- Pipettera cell-buffertblandningen kraftigt för att säkerställa fullständig suspension av cellerna med bufferten och överför till ett 15 ml koniskt rör.
- Ta prover för analys av DNA (0,1 %) och protein (0,05 %) från den resulterande cellsuspensionen (råcellextrakt [CCE]). Förvaras vid −20 °C tills vidare bearbetning (beskrivs i avsnitt 7).
- Överför cellsuspensionen till lågbindande 2 ml reaktionsrör och centrifugera vid 21 130 × g i 30 minuter vid 4 °C för att separera cellresterna från råcelllysatet.
- Slå ihop supernatanterna från alla rör till ett 15 ml koniskt rör.
- Ta prover från supernatanten (ingång [IN]) för DNA-analys (0,1 %) och proteinanalys (0,05 %). Förvaras vid −20 °C tills vidare bearbetning (beskrivs i avsnitt 7).
- Utjämna 500 μl IgG-kopplad magnetisk pärlslam (för varje jäststam) genom att tvätta 2 x med 500 μl kall MB-buffert med 1x proteas- och fosfatashämmare i 5 minuter vardera vid 4 °C vid rotation vid 20 varv per minut. Kassera supernatanten från pärlorna med hjälp av ett magnetiskt ställ efter varje tvättsteg.
- Inkubera de IgG-kopplade magnetiska kulorna i 500 μl kall MB-buffert med 1x proteas- och fosfatashämmare i 1 timme vid 4 °C vid rotation vid 20 varv/min. Kasta supernatanten från pärlorna med hjälp av ett magnetiskt ställ.
- Blanda den jämviktade magnetpärlslammet med celllysatet och inkubera med 20 varv per minut i 2 timmar vid 4 °C.
- Överför hela den magnetiska pärlcellslysatsuspensionen till lågbindande reaktionsrör.
- Separera de magnetiska pärlorna, som nu bär kromatinringarna av intresse, från celllysatet med hjälp av ett magnetiskt ställ.
- Överför det återstående genomflödet (FT) från varje rör till ett nytt 15 ml koniskt rör och ta prover för DNA- (0,1 %) och proteinanalys (0,05 %). Förvaras vid −20 °C tills vidare bearbetning (beskrivs i avsnitt 7).
- Häng upp de magnetiska pärlorna från varje rör i 300 μL kall MB-buffert och slå samman pärlorna i ett reaktionsrör. Tvätta 5 gånger vardera i 10 minuter med 750 μL kall MB-buffert med 1x proteas- och fosfatashämmare vid 4 °C vid rotation vid 20 rpm. Utför sluttvätten med 750 μL kall MB-buffert utan proteas- och fosfatashämmare.
- Suspendera kulorna i 40 μL kall MB-buffert utan proteas- och fosfatashämmare.
OBS: Den slutliga volymen av eluat kan justeras i enlighet med dess förväntade nedströmsapplikation. TEV-elueringen fungerar vanligtvis effektivt inom intervallet 100-300 μL.
5. TEV-proteasmedierad eluering
- För att frigöra LexA-CBP-kromatinringkomplex från pärlorna, inkubera pärlorna med 2 μL 6x His-märkt rekombinant TEV-proteas över natten vid 4 °C och 450 rpm i en termomixer.
- Separera pärlorna från det slutliga eluatet med hjälp av ett magnetiskt ställ. Överför eluatet, som innehåller klyvda kromatinringar, till ett nytt 1,5 ml reaktionsrör.
- Förvara rören på ett magnetiskt ställ igen för att separera eventuella kvarvarande pärlor från det slutliga eluatet.
- Återsuspendera kulorna (TB) i 750 μl kall AC-buffert och ta prover för analys av DNA (0,1 %) och protein (0,05 %). Förvaras vid −20 °C tills vidare bearbetning (beskrivs i avsnitt 7).
- Från det slutliga eluatet (TE), ta prover för DNA-analys (0,5 %) och protein (0,25 %). Förvaras vid −20 °C tills vidare bearbetning (beskrivs i avsnitt 7).
OBS: På grund av den låga volymen av det slutliga eluatet ökas andelen av proverna som samlas in för DNA- och proteinanalys för att få en bättre representation av deras protein- och DNA-innehåll under analysen.
6. Eliutering av denaturering
- Tvätta pärlorna 2 gånger i 750 μL kall AC-buffert i 20 minuter varje gång vid 4 °C vid rotation vid 20 rpm.
- För att extrahera de återstående bundna LexA-kromatinkomplexen, utför denatureringeluering genom att tillsätta 500 μL 0,5M NH4OH till pärlorna och inkubera i 30 minuter vid rumstemperatur.
- Separera pärlorna från suspensionen med hjälp av ett magnetställ och överför eluatet till ett lågbindande reaktionsrör.
- Inkubera kulorna igen som i steg 6.2 för att återvinna det maximala kromatinlokus i eluatet.
- Separera pärlorna från suspensionen med hjälp av ett magnetställ och slå samman det resulterande eluatet i samma rör som innehåller eluatet från steg 6.3.
- Återsuspendera kulorna (DB) i 750 μL dH2O och ta prover för DNA-analys (0,1 %) och protein (0,05 %).
- Från det slutliga eluatet (DE), ta prover för DNA-analys (0,5 %) och protein (0,25 %).
7. DNA- och proteinanalys
- DNA-analys
- Beredning av prover
- Tillsätt 100 μL IRN-buffert till DNA-proverna och öka volymen med dH2O till en slutlig volym på 200 μL.
- Tillsätt 1 ng K071 spike-in plasmid-DNA.
- Tillsätt 1 μl RNAs A (10 mg/ml) och inkubera vid 37 °C i 1 timme.
- Tillsätt 5 μl proteinas K (10 mg/ml) och 10 μl SDS (20 %) och inkubera i 1 timme vid 56 °C.
- Tillsätt 200 μL fenol/kloroform/isopropylalkohol (25:24:1) och virvla noggrant 2x i 10 s varje gång.
- Centrifugera proverna vid 21 130 × g i 7 minuter för att separera de organiska faserna och vattenfaserna.
- Överför supernatanten till nya 1,5 ml rör som innehåller 1,5 μL glykogen (5 mg/ml) och 2,5 x 100 % etanol.
- Inkubera rören vid −20 °C i minst 2 timmar och högst över natten för att fälla ut DNA:t.
- Centrifugera vid 21 130 × g, 4 °C i 45 min. Kassera supernatanten.
- Tillsätt 150 μl 70 % etanol utan att återsuspendera DNA-pelleten och centrifugera igen vid 21 130 × g vid 4 °C i 10 minuter.
- Torka DNA-pelletsen i rumstemperatur i 10-15 minuter och återsuspendera i 40 μL dH2O.
- Utför restriktionsenzymdigestion för att linjärisera DNA isolerat i steg 7.1.1.11 med HpaI-restriktionsendonukleas. För en 50 μl reaktionsblandning, inkubera 40 μl isolerat DNA + 2 μl HpaI-enzym + 5 μl restriktionsenzymbuffert + 3 μLdH2O över natten vid 37 °C.
- qPCR-analys
- Späd det restriktionsspända DNA:t i förhållandet 1:5 (10 μl av det restriktionsspjälkade DNA som erhållits från steg 7.1.1.12 i 40 μl dH2O).
- Använd primerpar som är utformade för ARS316-regionen, PDC1 och spik-in plasmid-DNA.
- Kör qPCR med programmet i tabell 2.
- Analysera qPCR-resultaten genom relativ kvantifiering med hjälp av ARS316-regionen och spike-in plasmid-DNA som mål och PDC1 (eller någon annan gen eller genomisk region) som referenslokus.
- Bedöm ARS316-lokusåtervinningsprocententage över PDC1 genom att normalisera ARS316 och PDC1 primer relativa kvantifieringsvärden med procententage av fraktionsvolymen som tagits för varje sample. Multiplicera till exempel 0,1 % för genomströmningen med en faktor på 1 000 och 0,5 % för TEV-eluatet med en faktor på 200.
- Normalisera ARS316- och PDC1-återhämtningsprocenten med de relativa kvantifieringsvärdena för spike-in-plasmid-DNA.
- Bedöm anrikningen av ARS316-lokuset över det totala kromatinet genom att utvärdera de erhållna relativa kvantifieringsmålen/referensvärdena med hjälp av ekvation (1).
Nej (1)
- Analys av Southern blot
- Tillsätt 5 μL gelladdningsfärgämne till 20 μl restriktionsenzymuppsmält DNA-prov.
- Kör proverna i en 1% agarosgel vid 110 V i ~3 timmar.
- Överför gelen till en bricka och blötlägg den i avurineringslösning genom att skaka försiktigt i 20 minuter.
- Skölj gelen med dH2O och blötlägg den i denatureringslösning i 15 minuter under skakning. Kassera denatureringslösningen.
- Blötlägg gelen i denatureringslösning i 15 minuter med lätt skakning.
- Skölj gelen med dH2O och tvätta den 2 gånger i 15 minuter varje gång med överföringsbufferten med lätt skakning.
- Fyll en bricka med 1-1,5 L överföringsbuffert och placera den på ett stabilt underlag.
- Klipp en lång bit Whatman-papper och placera det på plattformen på ett sådant sätt att de två ändarna av papperet blötläggs i överföringsbufferten.
- Klipp en remsa positivt nylonmembran och fyra remsor Whatman-papper som är lika stora som gelen.
- Placera två bitar Whatman-papper indränkta i överföringsbufferten på plattformen.
- Lägg gelen med framsidan nedåt ovanpå bitarna av Whatman-papper.
- Ovanpå gelen placerar du det positiva nylonmembranet, följt av de återstående två bitarna Whatman-papper indränkta i överföringsbuffert. Se till att hålla stacken våt med överföringsbufferten.
- Ta bort eventuella instängda luftbubblor genom att rulla av dem med en glasstav.
- Lägg en bunt pappershanddukar ovanpå den monterade stapeln, följt av ett föremål på 0.5 kg (t.ex. en glasflaska).
- Lämna enheten för överföring över natten i rumstemperatur.
- Efter överföringen UV-tvärbinder membranet med en total energiproduktion på 1 200 J/cm2.
- För detektion av ARS316-lokuset, utför southern blot-hybridisering med hjälp av radioaktiva sonder syntetiserade med hjälp av det refererade DNA-märkningssystemet.
OBS: Utför alla steg hädanefter på is tills annat anges. - Späd 25–40 ng PCR-fragment (sond) i 19 μl dH2O i ett lågbindande reaktionsrör och inkubera vid 95 °C i 5 minuter. Kyl omedelbart på is.
- Tillsätt 1 μL vardera av 500 μM dCTP, 500 μM dGTP och 500 μM dTTP till röret.
- Tillsätt 20 μl av den buffert som innehåller slumpmässiga nukleotidhexamerer som medföljer satsen.
- Tillsätt 5 μL av den radioaktivt märkta nukleotiden [α-32P] dATP till röret. Utför alla steg som involverar radioaktivt märkt material under en radioaktivitetsgodkänd skyddsmiljö.
- Tillsätt 1 μl Klenow-fragment och inkubera vid 37 °C på en termomixer i 15 minuter för enkelsträngad DNA-syntes.
- Tillsätt 5 μl stoppbuffert för att stoppa reaktionen.
- Centrifugera en storleksuteslutningskolonn i 2 minuter vid 1 500 × g för att ta bort lagringsbufferten. Kassera flödet genom och placera kolonnen i ett nytt rör.
- För sondblandningen genom kolonnen för att avlägsna icke-inkorporerade radioaktiva nukleotider. Centrifugera i 30 s vid 1 500 × g för att samla upp sonden.
- Tillsätt 150 μL laxspermie-DNA (1:100) för att blockera sondens icke-specifika bindning till membranet.
- Inkubera sondblandningen vid 95 °C i 5 minuter för att denaturera det dubbelsträngade DNA:t.
- Snap-frys på is i några sekunder och centrifugera i några sekunder vid 500 × g för att få ner vattendropparna kondenserade på locket.
- Tvätta Southern blot-membranet kort med hybridiseringsbufferten i 5-10 minuter med rotation.
- Förhybridisera membranet med hybridiseringsbufferten i 1 timme vid 55 °C med rotation. Ignorera hybridiseringsbufferten.
- Tillsätt 15 ml färsk hybridiseringsbuffert (förvärmd vid 55 °C) till membranet tillsammans med den förberedda sonden. Inkubera membranet över natten vid 55 °C med rotation.
- Utför tvättar efter hybridisering 2x i 15 minuter vardera med 0,3x SSC, 0,1% SDS vid 55 °C med rotation.
- Utför tvättar efter hybridisering 2x i 15 minuter vardera med 0,1x SSC, 0,1% SDS vid 55 °C med rotation.
- Utför tvättar efter hybridisering 2x i 15 minuter vardera med 0,1x SSC, 1,5% SDS vid 55 °C med rotation.
- Ta bort membranet från hybridiseringsröret och exponera membranet för en fosforimagerskärm i upp till 3 dagar för att erhålla de radioaktiva avtrycken på filmen.
- Ta bilder av filmen med hjälp av ett laserskanningssystem för fosforbild.
- Beredning av prover
- Analys av proteiner
- Beredning av prover
- Justera alla proteinprover till deras slutliga volymer (200 μL, 100 μL, 100 μL, 20 μL och 20 μL för råcellsextrakt, input, genomströmning, pärlor respektive eluatprover) genom att tillsätta 1 μL β-merkaptoetanol, PAGE LDS-provbuffert (1x) och dH2O.
- Denaturera proverna vid 95 °C i 5 minuter.
- Western blot-analys
OBS: Utför SDS-PAGE och western blotting med standardprotokoll15,16.- Fyll på 15 μl av varje prov i varje brunn med en 1,5 mm SDS-PAGE-gel.
- Utför immunfärgning av blotet med PAP (1:2 000) och LexA (1:1 000) antikroppar med inkubation över natten vid 4 °C. Späd i 5 % torrmjölk/PBST-lösning.
OBS: Efter PAP-analys kan bloten avlägsnas med hjälp av ett milt strippningsprotokoll17 före immunfärgning med den andra LexA-antikroppen.
- Beredning av prover
Nej (1)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Reningen av ~1,4 kb ARS316-kromatindomänen medierades av det konstitutivt uttryckta LexA-TAP-adapterproteinet. För att fungera som en negativ kontroll genomförde vi reningar med hjälp av en isogen stam som uttrycker LexA-TAP men som inte innehåller integrerade RS- och LexA-bindningsställen. Figur 3 illustrerar DNA-analysresultatet från ett standardreningsexperiment utfört på både kontroll- och en rekombinationskompetent stam som riktar sig mot ARS316-lokuset. Efter DNA-isolering och restriktionsenzymnedbrytning för att linjärisera de cirkulära DNA-molekylerna, utfördes qPCR-analys för att bedöma reningseffektiviteten hos ARS316-mållokuset över det obesläktade genomiska kontrolllokuset PDC1.
Dessutom kvantifierades anrikningen av ARS316-lokuset över det totala kromatinet (Figur 3A,B). Den negativa kontrollstammen visade ingen återhämtning av ARS316- eller PDC1-lokus i någon av fraktionerna förutom råcellsextraktet, inmatningen och genomflödet, vilket tyder på att ingen specifik anrikning kunde observeras i TEV och denaturerande elueringar. Däremot var ARS316-lokuset kvantitativt utarmat i genomströmningen i rekombinationstöjningen och kunde återvinnas på kulorna efter TEV-eluering och i denatureringselueringen. Efter TEV-eluering visade kulorna en högre återvinningsprocent av ARS316-lokuset eftersom TEV-klyvningseffektiviteten inte var 100 %. Detta resulterade i att en bråkdel av kromatinringarna förblev bundna till kulorna. TEV-proteasklyvningseffektiviteten kan förbättras genom att öka elueringsvolymen över 100 μL. Däremot visade denatureringselueringen 80%-90% återhämtning av ARS316-lokuset i rekombinationsstammen (Figur 3A), vilket motsvarar den höga anrikningen av ARS316-molekyler när man tar hänsyn till storleken på jästgenomet (Figur 3B).
Southern blot utfördes dessutom för att validera qPCR-resultaten. På grund av sin höga känslighet kan den detektera relativt lägre koncentrationer av mål-DNA, vilket möjliggör kvantitativ analys av proverna. Resultaten från southern blot-analysen med hjälp av radioaktivt märkt sond bekräftade den specifika anrikningen av ARS316-lokuset i de fraktioner som samlats in från rekombinationstöjningen men inte i kontrolltöjningsfraktionerna (figur 3C). I rekombinationstöjningen observerades högre anrikning av ARS316-lokuset baserat på signalintensiteten i TEV-pärlorna och denatureringselueringsproverna, i överensstämmelse med qPCR-resultaten. På samma sätt överensstämmer de svaga signalerna som observerats i proverna av TEV-eluerings- och denatureringspärlor med den observerade låga anrikningen av ARS316-lokus i dessa fraktioner (figur 3C).
LexA-TAP-klyvnings- och pulldown-effektiviteten bedömdes också genom western blot-analys. LexA-TAP-proteinet har en molekylvikt på ~80 kDa (figur 4A). I både rekombinations- och kontrollstammarna utfördes western blot-analys med hjälp av PAP-antikroppen, som riktar sig mot proteinet A-delen av LexA-TAP i reningsproverna. Som förväntat visade resultaten en nästan total utarmning av LexA-TAP i genomflödet, med återhämtning observerad i de slutliga pärl- och elueringsfraktionerna (figur 4B[i]). PAP-antikroppen detekterar också det lilla proteinet A-fragment på ~15 kDa som finns kvar på kulorna efter TEV-eluering. Samma western blot strippades och immunfärgades med en antikropp mot LexA-delen av LexA-TAP (Figur 4B[ii]), vilket visade kompletterande resultat (Figur 4B[ii]). Det starka bandet vid ~50 kDa i båda fläckarna indikerar den tunga IgG-kedjan kopplad till de magnetiska pärlorna, som korshybridiserar med de primära/sekundära antikroppskonjugaten (figur 4B[ii]).
Figur 1: Scheman över jäststamskonstruktion. En modifierad jäststam med integrerade LexA- och rekombinationsställen på kromosom III transformeras med en plasmid (K238) med expressionskassetter för det konstitutiva uttrycket av LexA-TAP-fusionsproteinet med hjälp av TEF2-promotorn och den galaktosinducerbara expressionskassetten för R-rekombinasuttryck (RecR) med hjälp av en GAL10-promotor. Plasmiden linjäriseras genom Sbfi-restriktionsnedbrytning, vilket skapar homologa rekombinationsarmar för integration av expressionskassetten i en intergen plats på kromosom I. Kompetenta celler väljs ut baserat på LEU2-selektionsmarkören på det odlingsmedium som saknar leucin. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Rening av ARS316-kromatinlokus från jästen Saccharomyces cerevisiae. ARS316-lokuset avlägsnas i form av kromatinringar från dess genomiska plats i jästceller genom galaktosinducerad platsspecifik rekombination. Dessa kromatinringar isoleras från råcellsextraktet med hjälp av LexA-TAP-affinitetstaggen bunden till IgG-kopplade magnetiska pärlor. Kromatinringar kan frigöras från pärlorna med två metoder: i) TEV-proteasmedierad klyvning, eller ii) denatureringeluering med ammoniumlösning. Den streckade pilen representerar möjligheten att utföra denatureringeluering efter TEV-proteasmedierad eluering för att frigöra de återstående pärlbundna kromatinringarna, eftersom TEV-proteasklyvningseffektiviteten inte är 100 %. Rutorna i konturerna representerar de prover som erhållits i olika steg av reningen för protein- och DNA-analyser. Förkortning: RS = rekombinationsplatser. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: DNA-analys för att utvärdera ARS316-lokusreningen. (A) Stapeldiagram som visar reningen av ARS316-lokuset och en obesläktad region, PDC1, i en serie DNA-prover som samlats in under ARS316-kromatinlokusrening från rekombinationsjäststammen. (B) Stapeldiagram som visar anrikningen av ARS316-lokus över totalt kromatin i en serie DNA-prover som samlats in under ARS316-kromatinlokusrening från kontroll- och rekombinationsjäststammar. (C) Southern blot-bild som visar anrikningen av ARS316-lokuset i en serie DNA-prover som samlats in under ARS316-kromatinlokusrening från kontroll- och rekombinationsjäststammar. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Proteinanalys för att utvärdera LexA-TAP:s neddragnings- och klyvningseffektivitet. (A) Tecknad film som representerar de olika proteindomänerna i LexA-TAP-fusionsproteinet, tillsammans med storleken på varje domän. (B) Western blot-bilder som visar immunfärgning mot (i) PAP och (ii) LexA i en serie proteinprover som samlats in under ARS316-rening av kromatinlokus från kontroll- och rekombinationsjäststammar. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Flödesdiagram som visar de potentiella nedströmstillämpningarna av kromatindomäner som renats med LexA-TAP-affinitetsrening. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Tabell 1: En lista över de lösningar och media som används i det här protokollet. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tabell 2: Kvantitativt PCR-program. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Identifieringen av faktorer och kromatinlandskap i en specifik målgenomisk region fortsätter att utgöra en stor utmaning inom kromatinforskningen18. Detta protokoll beskriver ett effektivt system för att specifikt punktbeskatta och rena distinkta kromatindomäner från jästkromosomer. Såvitt vi vet övervinner renheten och utbytet av denna enstegsrening många av begränsningarna hos lokusspecifika kromatinreningsmetoder, vilket gör det möjligt att uppnå mycket hög anrikning av de riktade loci jämfört med andra obesläktade genomiska regioner.
På grund av det extra excisionsteget med platsspecifikt R-rekombinas är en annan fördel att man exakt kan bestämma vilken genomisk region som renas beroende på den exakta platsen för rekombinationsställena i genomet. Däremot är andra metoder beroende av skjuvning av DNA genom ultraljudsbehandling, vilket resulterar i heterogena molekyllängder; Denna heterogenitet gör dessa metoder mindre exakta när det gäller rening av ett väldefinierat mållokus.
Slutligen använder denna reningsstrategi naturliga förhållanden utan att inkludera kemiska tvärbindare som formaldehyd. Således är det isolerade materialet som erhålls med detta tillvägagångssätt mottagligt för strukturella och funktionella analyser. Ett kritiskt steg i reningsprotokollet är effektiviteten hos TEV-elueringen, som i hög grad beror på flera parametrar, inklusive aktiviteten hos TEV-proteaset, reaktionsförhållandena och reaktionsvolymerna. För det visade experimentet sattes elueringsvolymen till ett minimum, vilket påverkade elueringseffektiviteten. En ökning av volymen och mängden TEV-proteas kan dock avsevärt förbättra elueringseffektiviteten. Trots att TEV-elueringen har låg effektivitet ger den mycket specifik klyvning och återhämtning av de önskade kromatindomänerna. Som jämförelse har denatureringeluering en elueringseffektivitet på mer än 90 % men kan eluera vissa icke-specifika DNA- eller proteinmolekyler från pärlorna. Därför beror valet av metod på den önskade nedströmsappliceringen av det isolerade materialet. Till exempel har denaturerande eluering visat sig möjliggöra masspektrometrisk identifiering av de associerade kromatinfaktorerna, medan nativt TEV-eluering är att föredra för nedströms funktionella analyser såsom in vitro-transkriptions- eller replikationsanalyser. Figur 5 sammanfattar de potentiella nedströmstillämpningarna av det beskrivna reningsprotokollet. Sammanfattningsvis adresserar detta förbättrade arbetsflöde och mycket effektiva metod för att studera kromatinsammansättningen i single loci en långvarig utmaning inom kromatinforskningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att redovisa.
Acknowledgments
Arbetet i SH-laboratoriet stöddes av DFG genom SFB1064 (projekt-ID 213249687), Europeiska forskningsrådet (ERC Starting Grant 852798 ConflictResolution) och Helmholtz Gesellschaft.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast strains | |||
| Control Strain: MATa; ura3Δ0; leu2Δ0; his3Δ1; met15Δ0; bar1::kanMX4; Chr I 212kb::LEU2 pTEF2-LEXA-TAP pGAL1-10 RecR | Section 1, see references 13 and 14 | ||
| Recombination Strain: MATa; ura3Δ0; leu2Δ0; his3Δ1; met15Δ0; bar1::kanMX4; RS_LEXA_NS-3_ARS316_NS+3_RS; Chr I 212kb::LEU2 pTEF2-LEXA-TAP pGAL1-10 RecR | Section 1, see reference 13 and 14 | ||
| Plasmid | |||
| K238 plasmid | Section 1, see reference 13 Storage: Store at -20 °C |
||
| K071 Spike-in plasmid DNA | Section 7.1, see reference 13 Storage: Store at -20 °C |
||
| Reagents | |||
| Acetone | Carl Roth | 5025.1 | Section 2 Storage: Store at room temperature |
| Ammonium acetate (NH4Ac) | Sigma Aldrich | A7262 | Section 6 and 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Ammonium solution (NH4OH) 25% | Merck Millipore | 533003 | Section 6 Storage: Store at room temperature |
| Ammonium sulfate | Santa Cruz | Sc-29085 | Section 2 Storage: Store at room temperature |
| Bacto agar | BD (VWR) | 90000-760 | Section 3 Storage: Store at room temperature |
| Bacto peptone | BD (VWR) | 211820 | Section 3 Storage: Store at room temperature |
| β-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | 07604 | Section 7.2 Storage: Store at 4 °C |
| Chemiluminescent substrate kit | ThermoFisher | 34580 | Section 7.2 Storage: Store at 4 °C |
| Di-Sodium Hydrogen phosphate dodecahydrate | Merck | 1.06579.1000 | Section 2 and 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Dithiothreitol (DTT) | ThermoFisher | 15508013 | Section 4 Storage: Store at 4 °C |
| Ethanol | Merck | 100983 | Section 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | ED | Section 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Galactose (20% (w/v) stock) | Sigma Aldrich | G0625-1KG / 5KG | Section 3 Storage: Store at room temperature |
| Gel loading dye (6x) | BioLabs | B7024A | Section 7.1 Storage: Store at -20 °C |
| Glusose | Sigma-Aldrich | G8270 | Section Storage: Store at room temperature |
| Glycine | Carl Roth | .0079.4 | Section 2 Storage: Store at room temperature |
| Glycogen (5 mg/mL) | Invitrogen | AM9510 | Section 7.1 Storage: Store at -20 °C |
| Hydrochloric acid (HCl) | PanReac AppliChem | 182109.1211 | Section 2, 4 and 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Magnesium Acetate (MgAc) | Bernd Kraft | 15274.2600/C035 | Section 4 Storage: Store at room temperature |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma Aldrich | M8266 | Section 6 Storage: Store at room temperature |
| Nu PAGE LDS sample buffer (4x) | Invitrogen | 2399549 | Section 7.2 Storage: Store at room temperature |
| Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1 v/v) | Invitrogen | 15593-031 | Section 7.1 Storage: Store at 4 °C |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9541 | Section 4 Storage: Store at room temperature |
| Radioactively labeled α-32P dATP (3,000 Ci/mmol, 10 mCi/mL) | Hartmann Analytic | SRP-203 | Section 7.1 Storage: Store at 4 °C |
| RadPrime labeling system | ThermoFisher | 18428-011 | Section 7.1 Storage: Store at -20 °C |
| Raffinose (20% (w/v) stock) | SERVA | 34140.03 | Section 3 Storage: Store at room temperature |
| Sodium chloride (NaCl) | Merck | K53710504142 | Section 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Sodium citrate (Na3C6H5O7) | Sigma-Aldrich | 71402 | Section 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma Aldrich | S5881 | Section 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Sodium n-dodecyl sulfate (SDS) (5% stock (w/v) ) | Alfa Aesar | A11183 | Section 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | 71496 | Section 2 and 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Sodium azide | Santa Cruz Biotechnology | sc-208393 | Section 2 Storage: Store at -20 °C |
| Triethylamine | Sigma Aldrich | 90340 | Section 2 Storage: Store at room temperature |
| Tris base | Chem Cruz | SC-3715B | Section 2 and 4 Storage: Store at room temperature |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | Section 2 and 4 Storage: Store at room temperature |
| Tween-20 | Bernd Kraft | 18014332 | Section 4 Storage: Store at room temperature |
| Yeast extract | BD (VWR) | 212720 | Section 3 Storage: Store at room temperature |
| Yeast mating factor alpha (1 µg/mL stock ) | Biomol | Y2016.5 | Section 3 Storage: Store at -20 °C |
| Yeast Synthetic Drop-out medium Supplements without LEUCINE | Sigma Aldrich | Y1376 | Section 1, see reference 14 |
| Enzymes | |||
| HpaI restriction enzyme (5,000 U/mL) | NEB | R0105S | Section 7.1 Storage: Store at -20 °C |
| Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100x) | ThermoFisher Scientific | 78446 | Section 4 Storage: Store at4 °C |
| Proteinase K (10 mg/mL) | SERVA | 33756 | Section 7.1 Storage: Store at -20 °C |
| RNase A (10 mg/mL) | ThermoFisher | EN0531 | Section 7.1 Storage: Store at -20 °C |
| TEV protease (10000 U/µL) | NEB | P8112S | Section 5 Storage: Store at -20 °C |
| Materials | |||
| BcMag Epoxy-Activated Magnetic Beads | Bioclone Inc. | FC-102 | Section 2 Storage: Store at 4 °C |
| Dry ice | Section 4 | ||
| Low-binding centrifuge tubes 2.0 mL | Eppendorf | 22431102 | Section 4 |
| Microspin G-25 Columns | Cytiva | 27-5325-01 | Section 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Parafilm | Merck | P7793 | Section 4 |
| Positive nylon membrane | Biozol | 11MEMP0001 | Section 7.1 Storage: Store at room temperature |
| PVDF transfer membrane | Immobilon-Merck Millipore | IPVH00010 | Section 7.2 Storage: Store at room temperature |
| SDS-PAGE gel 4-12% bis-tris (15 well, 1.5 mm) | Invitrogen | NP0336BOX | Section 7.2 Storage: Store at 4 °C |
| Syringe (25 mL) with luer fitting | Henke Sass Wolf | 4200-000V0 | Section 3 |
| Whatman paper (Grade 3MM CHR Cellulose Western Blotting Paper Sheet) | Cytiva | 3030-917 | Section 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Antibodies | |||
| Anti-LexA, rabbit polyclonal IgG, DNA binding region antibody | Merck Millipore | 06-719 | Section 7.2 Storage: Store at -20 °C |
| Goat Anti-Rabbit IgG (H+L), Horseradish peroxidase conjugate | Invitrogen | G21234 | Section 7.2 Storage: Store at -20 °C |
| Peroxidase Anti-Peroxidase (PAP) antibody produced in rabbit for the detection of TAP-tagged proteins | Sigma Aldrich | P1291-500UL | Section 7.2 Storage: Store at -20 °C |
| Rabbit IgG antibodies | Sigma | I5006-100MG | Section 2 Storage: Store at 4 °C |
| Primers (10 µM) | |||
| ARS316: fwd 5'- CGGCATTATCGTACACAACCT, rev 5'- GTTCTTCGTTGCCTACATTTTCT | Section 7.1 | ||
| K071 Spike-in plasmid DNA: fwd: 5'-TTTTCGCTGCTTGTCCTTTT, rev 5'- CATTTTCGTCCTCCCAACAT | Section 7.1 | ||
| PCR fragment from yeast genomic DNA as a template for ARS316 amplification (for southern blot): fwd 5’- AAATTCTGCCCTTGATTCGT rev 5’- TTTGTTTATCTCATCACTAAT | Section 7.1 | ||
| PDC1: fwd 5'- CATGATCAGATGGGGCTTCA, rev 5'-ACCGGTGGTAGCGACTCTGT | Section 7.1 | ||
| Equipment | |||
| Coffee grinder | Gastroback | 42601 | Section 4 |
| Dewar flask | NAL GENE | 4150-2000 | Section 3 |
| DynaMag TM-2 magnetic rack | Invitrogen | 12321D | Section 4, 5 and 6 |
| Hybridization oven | Hybaid Mini10 | Ri418 | Section 2 |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424R | Section 4 and 7.1 |
| UV-crosslinker | Analytikjena | 95-0174-02 | Section 7.1 |
References
- Kornberg, R. D., Lorch, Y. Twenty-five years of the nucleosome, fundamental particle of the eukaryote chromosome. Cell. 98 (3), 285-294 (1999).
- Gauchier, M., van Mierlo, G., Vermeulen, M., Déjardin, J. Purification and enrichment of specific chromatin loci. Nature Methods. 17 (4), 380-389 (2020).
- Korthout, T., et al. Decoding the chromatin proteome of a single genomic locus by DNA sequencing. PLoS Biology. 16 (7), e2005542 (2018).
- Antão, J. M., Mason, J. M., Déjardin, J., Kingston, R. E. Protein landscape at Drosophila melanogaster telomere-associated sequence repeats. Molecular and Cellular Biology. 32 (12), 2170-2182 (2012).
- Déjardin, J., Kingston, R. E. Purification of proteins associated with specific genomic loci. Cell. 136 (1), 175-186 (2009).
- Ide, S., Dejardin, J. End-targeting proteomics of isolated chromatin segments of a mammalian ribosomal RNA gene promoter. Nature Communications. 6, 6674 (2015).
- Unnikrishnan, A., Gafken, P. R., Tsukiyama, T. Dynamic changes in histone acetylation regulate origins of DNA replication. Nature Structural & Molecular Biology. 17 (4), 430 (2010).
- Buxton, K. E., et al. Elucidating protein-DNA interactions in human alphoid chromatin via hybridization capture and mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 16 (9), 3433-3442 (2017).
- Kennedy-Darling, J., et al. Discovery of chromatin-associated proteins via sequence-specific capture and mass spectrometric protein identification in Saccharomyces cerevisiae. Journal of Proteome Research. 13 (8), 3810-3825 (2014).
- Liu, S. J., et al. CRISPRi-based genome-scale identification of functional long noncoding RNA loci in human cells. Science. 355, 7111 (2017).
- Hamperl, S., et al. Purification of specific chromatin domains from single-copy gene loci in Saccharomyces cerevisiae. Functional Analysis of DNA and Chromatin. 1094, 329-341 (2014).
- Hamperl, S., et al. Compositional and structural analysis of selected chromosomal domains from Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 42 (1), 2 (2014).
- Weiβ, M. Single-copy locus proteomics of early- and late-firing DNA replication origins identifies a role of Ask1/DASH complex in replication timing control. Cell Reports. 42 (2), 112045 (2023).
- Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nature Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Western blot membrane stripping for restaining protocol. Abcam. , Available from: https://www.abcam.com/protocols/western-blot-membrane-stripping-for-restaining-protocol (2023).
- Vermeulen, M., Déjardin, J.
