Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

نسخة واحدة من تنقية الكروماتين لموضع الجين في Saccharomyces cerevisiae

Published: November 17, 2023 doi: 10.3791/65460
Automatic Translation
1, 1
1Institute of Epigenetics and Stem Cells, Helmholtz Zentrum München

Summary

يقدم هذا البروتوكول طريقة عزل الكروماتين الخاصة بالموقع بناء على إعادة التركيب الخاصة بالموقع لتنقية موضع جين أحادي النسخة مهم في سياق الكروماتين الأصلي من الخميرة الناشئة ، Saccharomyces cerevisiae.

Abstract

الوحدة التنظيمية الأساسية للكروماتين حقيقي النواة هي جسيم النواة الأساسي (NCP) ، والذي يشتمل على الحمض النووي ملفوف ~ 1.7 مرة حول أوكتامير هستون. يعرف الكروماتين بأنه كيان NCPs والعديد من مجمعات البروتين الأخرى ، بما في ذلك عوامل النسخ وإعادة تشكيل الكروماتين وتعديل الإنزيمات. لا يزال من غير الواضح كيف يتم تنظيم تفاعلات البروتين والحمض النووي هذه على مستوى مواقع جينومية محددة خلال مراحل مختلفة من دورة الخلية. ويرجع ذلك أساسا إلى القيود التقنية الحالية ، والتي تجعل من الصعب الحصول على قياسات دقيقة لمثل هذه التفاعلات الديناميكية. هنا ، نصف طريقة محسنة تجمع بين إعادة التركيب الخاصة بالموقع وبروتوكول تنقية تقارب فعال أحادي الخطوة لعزل موضع جين أحادي النسخة مهم في حالة الكروماتين الأصلية. تسمح هذه الطريقة بالتخصيب القوي للموضع المستهدف على الكروماتين الجينومي ، مما يجعل هذه التقنية استراتيجية فعالة لتحديد وقياس تفاعلات البروتين بطريقة غير متحيزة ومنهجية ، على سبيل المثال عن طريق قياس الطيف الكتلي. بالإضافة إلى هذه التحليلات التركيبية ، من المحتمل أن يعكس الكروماتين الأصلي المنقى بهذه الطريقة الوضع في الجسم الحي فيما يتعلق بتحديد موضع النيوكليوسوم وتعديلات الهستون ، وبالتالي فهو قابل لمزيد من التحليلات الهيكلية والكيميائية الحيوية للكروماتين المشتق من أي موضع جينومي تقريبا في الخميرة.

Introduction

إن التنظيم الديناميكي للجينومات حقيقية النواة في الكروماتين يضغط الحمض النووي ليتناسب مع حدود النواة مع ضمان ديناميكيات كافية للتعبير الجيني وإمكانية الوصول إلى العوامل التنظيمية. جزئيا ، يتم التوسط في هذا التنوع بواسطة النيوكليوسوم ، الوحدة الأساسية للكروماتين ، والتي تضم جسيما أساسيا يحتوي على 147 نقطة أساس من الحمض النووي ملفوفة ~ 1.7 مرة حول أوكتامير هيستون1. النيوكليوسوم هو هيكل ديناميكي للغاية فيما يتعلق بتكوينه ، مع العديد من متغيرات الهستون وتعديلات ما بعد الترجمة (PTMs) على ذيول هيستون N- و C-terminal. علاوة على ذلك ، يتفاعل الكروماتين حقيقي النواة مع العديد من المكونات الأساسية الأخرى ، مثل عوامل النسخ ، وآلات معالجة الحمض النووي والحمض النووي الريبي ، والبروتينات المعمارية ، والإنزيمات المشاركة في إعادة تشكيل الكروماتين وتعديله ، وجزيئات الحمض النووي الريبي المرتبطة بالكروماتين. تتطلب جميع هذه الأجهزة الحاسمة المشاركة في النسخ والتكرار والإصلاح الوصول إلى الكروماتين ، والذي يعمل كركيزة طبيعية لهذه العمليات. وبالتالي ، فإن فهم الآليات الجزيئية الكامنة وراء معاملات الحمض النووي هذه يتطلب تعريفا دقيقا للتغيرات الجماعية في بنية الكروماتين في المناطق الجينومية المحددة حيث تتلاقى هذه الأجهزة وتسهل التفاعلات البيولوجية.

على الرغم من تحديد العديد من عوامل الكروماتين من خلال دراسات الوراثة والتفاعل بين البروتين والبروتين ، فإن إجراء تحليلات مباشرة وغير متحيزة وشاملة لتفاعلات الكروماتين في مواقع جينومية معينة ظل يمثل عقبة كبيرة 2,3. في البداية ، يمكن فقط عزل المناطق الوفيرة للغاية من الجينوم (أي المواقع المتكررة) أو البلازميدات متعددة النسخ بكميات كافية ونقاء لتحديد مطياف الكتلة للبروتينات المرتبطة4،5،6،7. بدأت سلسلة من الأساليب الجديدة القائمة على التهجين المباشر لمجسات الالتقاط إلى الحمض النووي المصبوغ بالكروماتين ، أو البيوتينيل القريب باستخدام نظام CRISPR-dCas9 ، أو ربط بروتينات المحولات الخاصة بالتسلسل بموضع الاهتمام في كشف بروتين المواقع أحادية النسخة من جينومات الخميرة والثدييات8،9،10. ومع ذلك ، تتطلب كل هذه الطرق تشابك الفورمالديهايد لتحقيق الاستقرار في تفاعلات البروتين والحمض النووي وصوتنة لإذابة الكروماتين للتنقية اللاحقة. معا ، يستبعد كلا التلاعب إمكانية إجراء دراسات هيكلية ووظيفية لاحقة للكروماتين المنقى.

للتغلب على هذه القيود ، ابتكرنا سابقا منهجية تستخدم إعادة التركيب الخاصة بالموقع لاستخراج المجالات الكروموسومية المستهدفة من الخميرة11,12. في جوهرها ، فإن المنطقة الجينومية ذات الأهمية محاطة بمواقع التعرف (RS) ل R-recombinase الخاص بالموقع من Zygosaccharomyces rouxi مع دمج مجموعة من ثلاثة مواقع ربط الحمض النووي في نفس الوقت لبروتين LexA الخامع للنسخ بدائي النواة (LexA) داخل نفس المنطقة. تحتوي خلايا الخميرة على شريط تعبير للتعبير المتزامن ل R-recombinase وبروتين LexA مدمج في علامة تنقية التقارب الترادفي (TAP). بعد تحريض R-recombinase ، يقوم الإنزيم بكفاءة باستئصال المنطقة المستهدفة من الكروموسوم في شكل مجال كروماتين دائري. يمكن تنقية هذا المجال عبر بروتين محول LexA-TAP ، الذي يرتبط بمواقع ربط الحمض النووي LexA ، بالإضافة إلى دعم التقارب. تم استخدام هذه الطريقة مؤخرا لعزل مجالات الكروماتين المتميزة التي تحتوي على أصول تكرار مختارة لكروموسوم الخميرة III13.

تتمثل إحدى المزايا الرئيسية لهذا النهج خارج الجسم الحي في أنه يسمح بإجراء تحليلات وظيفية للمادة المعزولة. على سبيل المثال ، يمكن إخضاع مجالات أصل النسخ المتماثل المنقاة بهذه الطريقة لمقايسات النسخ المتماثل في المختبر لتقييم كفاءة إطلاق الأصل في أنبوب اختبار من قوالب الكروماتين المجمعة الأصلية في الجسم الحي . في نهاية المطاف ، قد يسمح التوصيف الكيميائي الحيوي والوظيفي للمادة المعزولة بإعادة تكوين العمليات النووية باستخدام البروتينات النقية جنبا إلى جنب مع قالب الكروماتين الأصلي. باختصار ، تفتح هذه المنهجية طريقا مثيرا في أبحاث الكروماتين ، حيث سيكون من الممكن متابعة التغيرات التركيبية والهيكلية الجماعية للكروماتين لمنطقة جينومية معينة تخضع لمعاملة كروموسومية معينة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل المتعلقة بجميع المواد والأدوات المستخدمة في هذا البروتوكول. انظر الجدول 1 للحصول على قائمة بالحلول والمخازن المؤقتة والوسائط المستخدمة.

1. بناء سلالة الخميرة المؤتلفة

  1. لبناء سلالة خميرة مختصة بإعادة التركيب ، قم بتحويل البلازميد K238 المهضوم SbfI إلى سلالة خميرة مع مواقع ربط LexA متكاملة ومواقع إعادة تركيب RS في موضع الاهتمام13,14.
    ملاحظة: يحتوي جزء تقييد SbfI المحول على شريط التعبير المطلوب للتعبير التأسيسي لبروتين الاندماج LexA-TAP و R-recombinase مع تسلسلات متماثلة لكروموسوم الخميرة I للتكامل الجيني لكاسيت التعبير عن طريق إعادة التركيب المتماثل (الشكل 1).
  2. لبناء سلالة تحكم ، خذ سلالة خميرة متساوية المنشأ تفتقر إلى مواقع ربط RS و LexA المتكاملة ، وقم بتحويلها باستخدام بلازميد K238 المهضوم SbfI في ظل نفس الظروف المستخدمة في السلالة المختصة بإعادة التركيب.
  3. حدد خلايا الخميرة المختصة بناء على علامة اختيار LEU2 على ألواح أجار SCD-LEU14.

2. اقتران الأجسام المضادة IgG بالخرز المغناطيسي المنشط بالإيبوكسي

ملاحظة: قم بإقران الأجسام المضادة IgG للخرز المغناطيسي المنشط بالإيبوكسي وفقا للبروتوكولالمنشور التالي 11.

  1. تعليق 300 ملغ من الخرز المنشط الايبوكسي في 10 مل من الأسيتون 50٪ (300 ملغ يتوافق مع ~ 5.1 × 1010 حبات) في أنبوب مخروطي 50 مل. يهز بقوة على خلاط دوامة.
  2. جهاز طرد مركزي الأنبوب الذي يحتوي على الخرز عند 820 × جم و 4 درجات مئوية لمدة 2 دقيقة. إزالة الطاف.
  3. اغسل الخرزات 3x مع 20 مل من محلول فوسفات الصوديوم 0.1 متر (درجة الحموضة 7.4). قم بإزالة المادة الطافية بعد كل خطوة غسيل عن طريق الطرد المركزي كما هو موضح في الخطوة 2.2.
  4. الخرزات في 16 مل من محلول فوسفات الصوديوم 0.1 متر (درجة الحموضة 7.4) ، وقم بتدويرها برفق في فرن التهجين لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  5. قم بإذابة الأرنب IgGs (100 مجم) في 7 مل من dH2O (التركيز النهائي: 14 مجم / مل).
  6. أجهزة الطرد المركزي تعليق IgG عند 13000 × جم و 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق لتوضيح التعليق.
  7. نقل 3.5 مل من المادة الطافية (المقابلة ل 50 ملغ من IgGs الأرانب) إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مل.
  8. قم بتخفيف محلول IgG ب 9.85 مل من 0.1 M من فوسفات الصوديوم العازلة (الرقم الهيدروجيني 7.4) ، متبوعا بإضافة 6.65 مل من 3 M كبريتات الأمونيوم في 0.1 M فوسفات الصوديوم (درجة الحموضة 7.4) تحت الخلط اللطيف.
    ملاحظة: تجنب إضافة كبريتات الأمونيوم بسرعة إلى المحلول لأن التركيز المحلي العالي للملح سيؤدي إلى ترسيب IgGs للأرانب.
  9. قم بطرد محلول IgG عند 820 × جم و 4 درجات مئوية لمدة 3 دقائق ، وأضف المادة الطافية الناتجة إلى تعليق الخرزة المغناطيسية.
  10. احتضان الأنبوب طوال الليل أو على الأقل لمدة 18 ساعة عند 30 درجة مئوية مع دوران لطيف في فرن التهجين.
  11. قم بإزالة المادة الطافية كما هو موضح في الخطوة 2.2.
  12. اغسل الخرزات ب 20 مل من 100 مللي مول من الجلايسين-حمض الهيدروكلوريك (درجة الحموضة 2.5). قم بإزالة المحلول بسرعة كما هو موضح في الخطوة 2.2 لتجنب تمسخ عديد الببتيدات IgG.
  13. اغسل الخرزات مرة واحدة باستخدام 20 مل من 10 مللي متر Tris-HCl (درجة الحموضة 8.8). نضح المادة الطافية كما هو موضح في الخطوة 2.2.
  14. أضف 20 مل من محلول ثلاثي إيثيل أمين 0.1 متر لمدة 5-10 دقائق تحت دوران لطيف لتعطيل مجموعات الإيبوكسي التفاعلية المتبقية. قم بإزالة المادة الطافية كما هو موضح في الخطوة 2.2.
  15. اغسل الخرزات 4x مع 20 مل من PBS (درجة الحموضة 7.4) لمدة 5 دقائق مع دوران لطيف. قم بإزالة المادة الطافية كما هو موضح في الخطوة 2.2 بعد كل خطوة غسيل.
  16. اغسل الخرزات 2x مع 20 مل من PBS (درجة الحموضة 7.4) مع 0.5٪ Triton X-100 (w / v) لمدة 5 دقائق و 15 دقيقة لكل منهما تحت دوران لطيف في فرن التهجين. قم بإزالة المادة الطافية كما هو موضح في الخطوة 2.2.
  17. الخرزات في حجم نهائي قدره 16 مل من PBS (درجة الحموضة 7.4) مع 0.02٪ أزيد الصوديوم (w / v). يخزن في شكل 1 مل من القسمة على حرارة 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.

3. زراعة خلايا الخميرة والحصاد

  1. تلقيح سلالات الخميرة المختصة وإعادة تركيبها من ألواح YPD في 5 مل من وسط YPR ، واحتضانها طوال الليل عند 30 درجة مئوية و 200 دورة في الدقيقة.
  2. تلقيح 2 مل من هذه المزرعة في 100 مل من وسط YPR ، واحتضانها طوال الليل عند 30 درجة مئوية و 200 دورة في الدقيقة.
  3. لكل سلالة ، قم بتوزيع 1800 مل من وسط YP المعقم و 200 مل من محلول رافينوز المعقم (20٪ وزن / حجم) في كل من قارورتين من 5 لتر Erlenmeyer (4 لتر من وسط الاستزراع في المجموع لكل سلالة ، مقسمة إلى قارورين).
  4. تلقيح خلايا الخميرة النامية عند OD600 0.2 في وسطها الخاص ، واحتضانها كما هو موضح في الخطوة 3.1 لمدة 6 ساعات تقريبا أو حتى تصل الخلايا إلى OD600 المطلوب من 1.0. لضمان النمو الطبيعي للخلايا ، خالية من أي تلوث ، تحقق من OD على فترات 2 ساعة.
  5. أضف 200 مل من الجالاكتوز (20٪ وزن / حجم) للحث على إعادة التركيب الخاصة بالموقع.
  6. أضف 110 ميكرولتر (50 نانوغرام / مل) من YMFA (في نفس الوقت مع الجالاكتوز ، الخطوة 3.5) لإيقاف الخلايا في المرحلة G1 ، واحتضانها لمدة 2 ساعة.
    ملاحظة: تعتمد إضافة YMFA إلى الخلايا على الظروف التجريبية والسؤال البيولوجي الذي يجب معالجته. على وجه التحديد ، في هذه التجربة ، يتم القبض على الخلايا في المرحلة G1 للحصول على مجموعة خلايا متجانسة ذات أصول تكرار مرخصة. في هذه العملية ، يرتبط المركب قبل النسخ المتماثل بالأصول في المرحلة G1 قبل بدء تكرار الحمض النووي في المرحلة S.
  7. انقل تعليق الخلية إلى دلاء أجهزة طرد مركزي سعة 1 لتر ، وأجهزة طرد مركزي عند 6000 × جم و 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق. تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق كريات الخلية بحجم إجمالي يتراوح بين 10 و 15 مل من dH2O.
  8. أغلق حقنة سعة 25 مل بسدادة Luer ، وضعها داخل أنبوب مخروطي سعة 50 مل مملوء بالماء. نقل تعليق الخلية إلى مجموعة المحقنة ، وأجهزة الطرد المركزي عند 2397 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المادة الطافية.
  9. قم بإزالة سدادة Luer من المحقنة ، وقم ببثق الخلايا إلى نيتروجين سائل لتشكيل "معكرونة" للخلية.
    ملاحظة: يوفر استخدام 4 لتر من وسط الاستزراع وزنا رطبا لكريات الخلايا النهائية من 7-10 جم.
  10. انقل السباغيتي الخلوية المجمدة إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل ، واحفظه في درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى الاستخدام مرة أخرى.

4. تنقية موضع الكروماتين

ملاحظة: انظر الشكل 2 للحصول على نظرة عامة تخطيطية للخطوات المتضمنة في بروتوكول تنقية الكروماتين الخاص بالموضع.

  1. قم بتبريد مطحنة القهوة التجارية عن طريق طحن 30-50 جم من الثلج الجاف عن طريق هز مطحنة القهوة بقوة 2x لمدة 30 ثانية في كل مرة. بمجرد أن يبرد ، تخلص من مسحوق الثلج الجاف.
  2. امزج 3 جم من معكرونة خلايا الخميرة المجمدة مع ~ 30-50 جم من الثلج الجاف في مطحنة القهوة المبردة مسبقا.
  3. أغلق التقاطع بين الغطاء والمطحنة باستخدام بارافيلم لمنع فقدان مسحوق خلايا الخميرة أثناء الطحن.
  4. طحن مزيج الثلج الجاف بخلايا الخميرة 10x لمدة 30 ثانية في كل مرة ، مع فترات 30 ثانية بين كل جولة (تقدير الوقت الإجمالي: ~ 10 دقائق). لتجنب التصاق الثلج الجاف ومسحوق الخلايا بجدران مطحنة القهوة ، اضغط على جوانب مطحنة القهوة باستمرار أثناء الطحن.
  5. انقل مسحوق الثلج الجاف بخلايا الخميرة الناتج إلى دورق بلاستيكي باستخدام ملعقة نظيفة وجافة.
  6. احتفظ بالأكواب الزجاجية في درجة حرارة الغرفة لتبخر الثلج الجاف.
  7. بمجرد أن يتبخر الثلج الجاف ، أضف 2.25 مل من المخزن المؤقت MB مع 1x مثبطات الأنزيم البروتيني والفوسفاتيز (750 ميكرولتر / جم من خلايا الخميرة) إلى مسحوق خلية الخميرة.
  8. ماصة خليط الخلية العازلة بقوة لضمان التعليق الكامل للخلايا مع المخزن المؤقت ، ونقلها إلى أنبوب مخروطي 15 مل.
  9. خذ عينات لتحليل الحمض النووي (0.1٪) والبروتين (0.05٪) من معلق الخلية الناتج (مستخلصات الخلايا الخام [CCE]). يخزن في درجة حرارة -20 درجة مئوية حتى تتم المعالجة الإضافية (الموصوفة في القسم 7).
  10. انقل معلق الخلية إلى أنابيب تفاعل منخفضة الارتباط سعة 2 مل ، وأجهزة طرد مركزي عند 21130 × جم لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية لفصل حطام الخلية عن الخلية الخام المحللة.
  11. اجمع المواد الطافية من جميع الأنابيب في أنبوب مخروطي واحد سعة 15 مل.
  12. خذ عينات من المادة الطافية (الإدخال [IN]) للحمض النووي (0.1٪) وتحليل البروتين (0.05٪). يخزن في درجة حرارة -20 درجة مئوية حتى تتم المعالجة الإضافية (الموصوفة في القسم 7).
  13. قم بموازنة 500 ميكرولتر من ملاط الخرزة المغناطيسية المقترنة ب IgG (لكل سلالة خميرة) عن طريق غسل 2x ب 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت MB البارد مع 1x مثبطات الأنزيم البروتيني والفوسفاتيز لمدة 5 دقائق لكل منهما عند 4 درجات مئوية عند الدوران عند 20 دورة في الدقيقة. تخلص من المادة الطافية من الخرز باستخدام رف مغناطيسي بعد كل خطوة غسيل.
  14. احتضان الحبيبات المغناطيسية المقترنة ب IgG في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت MB البارد مع مثبطات الأنزيم البروتيني والفوسفاتيز 1x لمدة 1 ساعة عند 4 درجات مئوية عند الدوران عند 20 دورة في الدقيقة. تخلص من المادة الطافية من الخرز باستخدام رف مغناطيسي.
  15. امزج ملاط الخرزة المغناطيسية المتوازن مع محلول الخلية ، واحتضانه بالدوران عند 20 دورة في الدقيقة لمدة 2 ساعة عند 4 درجات مئوية.
  16. انقل معلق محللات خلية الخرزة المغناطيسية الكامل إلى أنابيب تفاعل منخفضة الربط.
  17. افصل الحبيبات المغناطيسية ، التي تحمل الآن حلقات الكروماتين ذات الأهمية ، عن الخلية المحللة باستخدام رف مغناطيسي.
  18. انقل التدفق المتبقي (FT) من كل أنبوب إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 15 مل ، وأخذ عينات لتحليل الحمض النووي (0.1٪) والبروتين (0.05٪). يخزن في درجة حرارة -20 درجة مئوية حتى تتم المعالجة الإضافية (الموصوفة في القسم 7).
  19. قم بتعليق الخرزات المغناطيسية من كل أنبوب في 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت MB البارد ، وقم بتجميع الخرزات في أنبوب تفاعل واحد. اغسل 5 مرات لمدة 10 دقائق لكل منها ب 750 ميكرولتر من المخزن المؤقت البارد MB مع 1x بروتياز ومثبطات الفوسفاتيز عند 4 درجات مئوية عند الدوران عند 20 دورة في الدقيقة. قم بإجراء الغسيل النهائي باستخدام 750 ميكرولتر من المخزن المؤقت البارد MB بدون مثبطات الأنزيم البروتيني والفوسفاتيز.
  20. الخرزات في 40 ميكرولتر من المخزن المؤقت MB البارد بدون مثبطات الأنزيم البروتيني والفوسفاتيز.
    ملاحظة: يمكن تعديل الحجم النهائي للشطف وفقا لتطبيق المصب المتوقع. عادة ما يعمل شطف TEV بكفاءة في نطاق 100-300 ميكرولتر.

5. الشطف بوساطة البروتياز TEV

  1. لتحرير معقدات حلقة الكروماتين LexA-CBP من الخرز ، احتضن الحبيبات ب 2 ميكرولتر من البروتياز TEV المؤتلف 6x الموسوم طوال الليل عند 4 درجات مئوية و 450 دورة في الدقيقة في خلاط حراري.
  2. افصل الخرزات عن الشطف النهائي باستخدام رف مغناطيسي. انقل الشطف ، الذي يحتوي على حلقات كروماتين مشقوقة ، إلى أنبوب تفاعل جديد سعة 1.5 mL.
  3. احتفظ بالأنابيب على رف مغناطيسي مرة أخرى لفصل أي خرز متبقي عن الشطف النهائي.
  4. أعد تعليق الخرزات (TB) في 750 ميكرولتر من محلول التيار المتردد البارد ، وأخذ عينات لتحليل الحمض النووي (0.1٪) والبروتين (0.05٪). يخزن في درجة حرارة -20 درجة مئوية حتى تتم المعالجة الإضافية (الموصوفة في القسم 7).
  5. من الشطف النهائي (TE) ، خذ عينات لتحليل الحمض النووي (0.5٪) والبروتين (0.25٪). يخزن في درجة حرارة -20 درجة مئوية حتى تتم المعالجة الإضافية (الموصوفة في القسم 7).
    ملاحظة: نظرا لانخفاض حجم الشطف النهائي ، يتم زيادة النسبة المئوية للعينات التي تم جمعها لتحليل الحمض النووي والبروتين للحصول على تمثيل أفضل لمحتوى البروتين والحمض النووي أثناء التحليل.

6. الشطف تمسخ

  1. اغسل الخرزات 2x في 750 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتيار المتردد البارد لمدة 20 دقيقة في كل مرة عند 4 درجات مئوية عند الدوران عند 20 دورة في الدقيقة.
  2. لاستخراج معقدات LexA-chromatin المتبقية ، قم بإجراء شطف تمسخ بإضافة 500 ميكرولتر من 0.5M NH4OH إلى الخرز ، واحتضانها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  3. افصل الخرزات عن التعليق باستخدام رف مغناطيسي ، وانقل الشطف إلى أنبوب تفاعل منخفض الربط.
  4. احتضان الخرز مرة أخرى كما في الخطوة 6.2 لاستعادة الحد الأقصى لمواضع الكروماتين في الشحم.
  5. افصل الخرزات عن التعليق باستخدام رف مغناطيسي ، وقم بتجميع الشطف الناتج في نفس الأنبوب الذي يحتوي على الشطف من الخطوة 6.3.
  6. أعد تعليق الخرزات (DB) في 750 ميكرولتر من dH2O ، وأخذ عينات لتحليل الحمض النووي (0.1٪) والبروتين (0.05٪).
  7. من الشطف النهائي (DE) ، خذ عينات لتحليل الحمض النووي (0.5٪) والبروتين (0.25٪).

7. تحليل الحمض النووي والبروتين

  1. تحليل الحمض النووي
    1. إعداد العينة
      1. إلى عينات الحمض النووي ، أضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت IRN ، وقم بزيادة الحجم باستخدام dH2O إلى الحجم النهائي البالغ 200 ميكرولتر.
      2. أضف 1 نانوغرام من الحمض النووي البلازميد K071.
      3. أضف 1 ميكرولتر من RNAse A (10 مجم / مل) ، واحتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
      4. أضف 5 ميكرولتر من البروتيناز K (10 مجم / مل) و 10 ميكرولتر من SDS (20٪) ، واحتضان لمدة 1 ساعة عند 56 درجة مئوية.
      5. أضف 200 ميكرولتر من كحول الفينول / الكلوروفورم / الأيزوبروبيل (25:24: 1) ، ودوامة جيدا 2x لمدة 10 ثوان في كل مرة.
      6. أجهزة الطرد المركزي العينات عند 21130 × جم لمدة 7 دقائق لفصل المرحلتين العضوية والمائية.
      7. انقل المادة الطافية إلى أنابيب جديدة سعة 1.5 مل تحتوي على 1.5 ميكرولتر من الجليكوجين (5 مجم / مل) و 2.5 × 100٪ إيثانول.
      8. احتضان الأنابيب عند -20 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 2 ساعة وبحد أقصى بين عشية وضحاها لترسيب الحمض النووي.
      9. أجهزة الطرد المركزي عند 21130 × جم ، 4 درجات مئوية لمدة 45 دقيقة. تخلص من المادة الطافية.
      10. أضف 150 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 70٪ دون تعليق حبيبات الحمض النووي ، وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى عند 21130 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق.
      11. جفف كريات الحمض النووي في درجة حرارة الغرفة لمدة 10-15 دقيقة ، وأعد تعليقها في 40 ميكرولتر من dH2O.
      12. قم بإجراء هضم إنزيم القطع لخطي الحمض النووي المعزول في الخطوة 7.1.1.11 باستخدام نوكلياز تقييد HpaI. للحصول على مزيج تفاعل 50 ميكرولتر ، احتضان 40 ميكرولتر من الحمض النووي المعزول + 2 ميكرولتر من إنزيم HpaI + 5 ميكرولتر من محلول إنزيم التقييد + 3 ميكرولتر من dH2O طوال الليل عند 37 درجة مئوية.
    2. تحليل qPCR
      1. قم بتخفيف الحمض النووي المهضوم المقيد بنسبة 1: 5 (10 ميكرولتر من الحمض النووي المهضوم المقيد الذي تم الحصول عليه من الخطوة 7.1.1.12 في 40 ميكرولتر من dH2O).
      2. استخدم أزواج التمهيدي المصممة لمنطقة ARS316 و PDC1 والحمض النووي البلازميد السنبلة.
      3. قم بتشغيل qPCR باستخدام البرنامج الوارد في الجدول 2.
      4. تحليل نتائج qPCR عن طريق القياس الكمي النسبي باستخدام منطقة ARS316 والحمض النووي البلازميد السنبلي كأهداف و PDC1 (أو أي جين أو منطقة جينومية أخرى) كموضع مرجعي.
      5. قم بتقييم النسبة المئوية لاستعادة موضع ARS316 على PDC1 عن طريق تطبيع قيم القياس الكمي النسبي الأولي ARS316 و PDC1 من خلال النسبة المئوية لحجم الكسر المأخوذ لكل عينة. على سبيل المثال ، اضرب 0.1٪ للتدفق بعامل 1,000 و 0.5٪ ل TEV يسحب بعامل 200.
      6. تطبيع نسب استرداد ARS316 و PDC1 مع قيم القياس الكمي النسبي للحمض النووي البلازميد المرتفع.
      7. تقييم إثراء موضع ARS316 على الكروماتين الكلي من خلال تقييم القيم المستهدفة / المرجعية للتقدير الكمي النسبي التي تم الحصول عليها باستخدام المعادلة (1).
        Equation 1(1)
    3. تحليل اللطخة الجنوبية
      1. إلى 20 ميكرولتر من عينة الحمض النووي المهضومة بالإنزيم ، أضف 5 ميكرولتر من صبغة تحميل الهلام.
      2. قم بتشغيل العينات في هلام أغاروز 1٪ عند 110 فولت لمدة ~ 3 ساعات.
      3. انقل الجل إلى صينية ، وانقعه في محلول إزالة التطهير مع رج لطيف لمدة 20 دقيقة.
      4. شطف الجل مع dH2O ، ونقعها في محلول تمسخ لمدة 15 دقيقة مع الهز. تخلص من محلول التمسخ.
      5. انقع الجل في محلول تمسخ لمدة 15 دقيقة مع رج لطيف.
      6. اشطف الجل ب dH2O ، واغسله 2x لمدة 15 دقيقة في كل مرة باستخدام المخزن المؤقت للنقل مع رج لطيف.
      7. املأ صينية ب 1-1.5 لتر من المخزن المؤقت للنقل ، وضعها على منصة ثابتة.
      8. اقطع قطعة طويلة من ورق Whatman ، وضعها على المنصة بحيث يتم نقع طرفي الورق في المخزن المؤقت للنقل.
      9. قطع شريط واحد من غشاء النايلون الإيجابي وأربعة شرائط من ورقة Whatman تساوي حجم الجل.
      10. ضع قطعتين من ورق Whatman منقوعة في المخزن المؤقت للنقل على المنصة.
      11. ضع الجل ووجهه لأسفل فوق قطع ورق Whatman.
      12. في الجزء العلوي من الجل ، ضع غشاء النايلون الموجب ، متبوعا بالقطعتين المتبقيتين من ورق Whatman المنقوع في محلول النقل. تأكد من إبقاء المكدس رطبا باستخدام المخزن المؤقت للنقل.
      13. قم بإزالة أي فقاعات هواء محاصرة عن طريق دحرجتها باستخدام قضيب زجاجي.
      14. ضع كومة من المناشف الورقية فوق المكدس المجمع ، متبوعا بجسم 0.5 كجم (على سبيل المثال ، زجاجة زجاجية).
      15. اترك التجميع لنقله طوال الليل في درجة حرارة الغرفة.
      16. بعد النقل ، تقوم الأشعة فوق البنفسجية بربط الغشاء بإجمالي إنتاج طاقة يبلغ 1200 جول / سم2.
      17. للكشف عن موضع ARS316 ، قم بإجراء تهجين اللطخة الجنوبية باستخدام مجسات مشعة تم تصنيعها باستخدام نظام وضع العلامات على الحمض النووي المشار إليه.
        ملاحظة: قم بتنفيذ جميع الخطوات فيما بعد على الجليد حتى يذكر خلاف ذلك.
      18. في أنبوب تفاعل منخفض الارتباط ، قم بتخفيف 25-40 نانوغرام من جزء PCR (مسبار) في 19 ميكرولتر من dH2O ، واحتضانه عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. تبرد على الفور على الجليد.
      19. أضف 1 ميكرولتر لكل من 500 ميكرومتر dCTP و 500 ميكرومتر dGTP و 500 ميكرومتر dTTP إلى الأنبوب.
      20. أضف 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت الذي يحتوي على سداسيات النوكليوتيدات العشوائية المرفقة مع المجموعة.
      21. أضف 5 ميكرولتر من النوكليوتيدات الموسومة إشعاعيا [α-32P] dATP إلى الأنبوب. نفذ جميع الخطوات التي تتضمن المواد الموسومة إشعاعيا في بيئة واقية معتمدة من النشاط الإشعاعي.
      22. أضف 1 ميكرولتر من جزء Klenow ، واحتضانه عند 37 درجة مئوية على خلاط حراري لمدة 15 دقيقة لتخليق الحمض النووي أحادي الشريط.
      23. أضف 5 ميكرولتر من المخزن المؤقت لإيقاف التفاعل.
      24. جهاز طرد مركزي عمود استبعاد الحجم لمدة 2 دقيقة عند 1500 × جم لإزالة المخزن المؤقت للتخزين. تخلص من التدفق ، وضع العمود في أنبوب جديد.
      25. مرر خليط المسبار عبر العمود لإزالة النيوكليوتيدات المشعة غير المدمجة. جهاز طرد مركزي لمدة 30 ثانية عند 1500 × جم لجمع المسبار.
      26. أضف 150 ميكرولتر من الحمض النووي للحيوانات المنوية لسمك السلمون (1: 100) لمنع الارتباط غير المحدد للمسبار بالغشاء.
      27. احتضن خليط المسبار على حرارة 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لتشويه الحمض النووي المزدوج الذي تقطعت به السبل.
      28. قم بالتجميد المفاجئ على الجليد لبضع ثوان ، وأجهزة الطرد المركزي لبضع ثوان عند 500 × جم لإسقاط قطرات الماء المكثفة على الغطاء.
      29. اغسل لفترة وجيزة غشاء اللطخة الجنوبي باستخدام المخزن المؤقت للتهجين لمدة 5-10 دقائق مع الدوران.
      30. قم بتهجين الغشاء مسبقا باستخدام مخزن التهجين لمدة 1 ساعة عند 55 درجة مئوية مع الدوران. تخلص من المخزن المؤقت للتهجين.
      31. أضف 15 مل من محلول التهجين الطازج (تم تسخينه مسبقا عند 55 درجة مئوية) إلى الغشاء مع المسبار المحضر. احتضان الغشاء بين عشية وضحاها عند 55 درجة مئوية مع الدوران.
      32. قم بإجراء غسلات ما بعد التهجين 2x لمدة 15 دقيقة لكل منهما باستخدام 0.3x SSC ، 0.1٪ SDS عند 55 درجة مئوية مع الدوران.
      33. قم بإجراء غسلات ما بعد التهجين 2x لمدة 15 دقيقة لكل منهما باستخدام 0.1x SSC ، 0.1٪ SDS عند 55 درجة مئوية مع الدوران.
      34. قم بإجراء غسلات ما بعد التهجين 2x لمدة 15 دقيقة لكل منهما باستخدام 0.1x SSC ، 1.5٪ SDS عند 55 درجة مئوية مع الدوران.
      35. قم بإزالة الغشاء من أنبوب التهجين ، وتعريض الغشاء لشاشة تصوير الفوسفور لمدة تصل إلى 3 أيام للحصول على البصمات المشعة على الفيلم.
      36. الحصول على صور للفيلم باستخدام نظام المسح الضوئي بالليزر للفسفرة.
  2. تحليل البروتين
    1. إعداد العينة
      1. اضبط جميع عينات البروتين على أحجامها النهائية (200 ميكرولتر ، 100 ميكرولتر ، 100 ميكرولتر ، 20 ميكرولتر ، و 20 ميكرولتر لاستخراج الخلايا الخام ، والمدخلات ، والتدفق ، والخرز ، وعينات الشطف ، على التوالي) عن طريق إضافة 1 ميكرولتر من β-mercaptoethanol ، ومخزن عينة PAGE LDS (1x) ، و dH2O.
      2. قم بتشويه العينات عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    2. تحليل اللطخة الغربية
      ملاحظة: قم بإجراء SDS-PAGE والنشاف الغربي باستخدام البروتوكولات القياسية15,16.
      1. قم بتحميل 15 ميكرولتر من كل عينة في كل بئر من جل SDS-PAGE مقاس 1.5 مم.
      2. إجراء تلطيخ مناعي للبقع باستخدام الأجسام المضادة PAP (1: 2,000) و LexA (1: 1,000) مع الحضانة الليلية عند 4 درجات مئوية. تمييع في 5٪ الحليب الجاف / محلول PBST.
        ملاحظة: بعد تحليل PAP ، يمكن تجريد اللطخة باستخدام بروتوكول تجريد خفيف17 قبل تلطيخ المناعة بالجسم المضاد الثاني LexA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم تنقية مجال الكروماتين ARS316 ~ 1.4 كيلو بايت بواسطة بروتين محول LexA-TAP المعبر عنه بشكل أساسي. لتكون بمثابة عنصر تحكم سلبي ، أجرينا عمليات تنقية باستخدام سلالة متساوية المنشأ تعبر عن LexA-TAP ولكنها لا تحتوي على مواقع ربط RS و LexA مدمجة. يوضح الشكل 3 نتائج تحليل الحمض النووي من تجربة تنقية قياسية أجريت على كل من السيطرة والسلالة المختصة بإعادة التركيب التي تستهدف موضع ARS316. بعد عزل الحمض النووي وهضم إنزيم التقييد لخطية جزيئات الحمض النووي الدائرية ، تم إجراء تحليل qPCR لتقييم كفاءة تنقية موضع هدف ARS316 على موضع التحكم الجينومي غير ذي الصلة PDC1.

علاوة على ذلك ، تم تحديد كمية إثراء موضع ARS316 على الكروماتين الكلي (الشكل 3 أ ، ب). لم تظهر سلالة التحكم السلبية أي استرداد لمواقع ARS316 أو PDC1 في أي من الكسور باستثناء مستخلص الخلية الخام والمدخلات والتدفق ، مما يشير إلى أنه لا يمكن ملاحظة أي تخصيب محدد في TEV وتغيير طبيعة الاستنشاق. في المقابل ، تم استنفاد موضع ARS316 كميا في التدفق في سلالة إعادة التركيب ويمكن استعادته على الخرز بعد شطف TEV وفي الشطف الذي تغير طبيعة المكان. بعد شطف TEV ، أظهرت الحبيبات نسبة استرداد أعلى من موضع ARS316 حيث لم تكن كفاءة انقسام TEV 100٪. أدى ذلك إلى بقاء جزء صغير من حلقات الكروماتين مرتبطا بالخرز. يمكن تحسين كفاءة انقسام الأنزيم البروتيني TEV عن طريق زيادة حجم الشطف فوق 100 ميكرولتر. في المقابل ، أظهر الشطف المتمسخ استعادة 80٪ -90٪ لموضع ARS316 في سلالة إعادة التركيب (الشكل 3 أ) ، المقابلة للإثراء العالي لجزيئات ARS316 عند أخذ حجم جينوم الخميرة في الاعتبار (الشكل 3 ب).

بالإضافة إلى ذلك ، تم إجراء اللطخة الجنوبية للتحقق من صحة نتائج qPCR. نظرا لحساسيته العالية ، يمكنه اكتشاف تركيزات أقل نسبيا من الحمض النووي المستهدف ، مما يسمح بالتحليل الكمي للعينات. أكدت النتائج التي تم الحصول عليها من تحليل اللطخة الجنوبية باستخدام المسبار المسمى إشعاعيا التخصيب النوعي لموضع ARS316 في الكسور التي تم جمعها من سلالة إعادة التركيب ولكن ليس في أجزاء سلالة التحكم (الشكل 3C). في سلالة إعادة التركيب ، لوحظ إثراء أعلى لموضع ARS316 بناء على شدة الإشارة في حبات TEV وعينات شطف التمسخ ، بما يتوافق مع نتائج qPCR. وبالمثل ، فإن الإشارات الضعيفة التي لوحظت في عينات الشطف والتمسخ TEV تتوافق مع التخصيب المنخفض الملحوظ لموضع ARS316 في هذه الكسور (الشكل 3C).

كما تم تقييم كفاءة الانقسام والسحب في LexA-TAP من خلال تحليل اللطخة الغربية. يحتوي بروتين LexA-TAP على وزن جزيئي ~ 80 كيلو دالتون (الشكل 4 أ). في كل من سلالات إعادة التركيب والسيطرة ، تم إجراء تحليل اللطخة الغربية باستخدام الجسم المضاد PAP ، والذي يستهدف البروتين A moiety من LexA-TAP في عينات التنقية. كما هو متوقع ، أظهرت النتائج استنفادا شبه كامل ل LexA-TAP في التدفق ، مع ملاحظة الانتعاش في كسور الخرزة والشطف النهائية (الشكل 4B [i]). يكتشف الجسم المضاد PAP أيضا جزء صغير من البروتين A من ~ 15 كيلو دالتون الذي يبقى على الخرز بعد شطف TEV. تم تجريد نفس اللطخة الغربية وتطوينها بجسم مضاد ضد مجموعة LexA من LexA-TAP (الشكل 4B [ii]) ، مما يدل على نتائج تكميلية (الشكل 4B [ii]). يشير النطاق القوي عند ~ 50 كيلو دالتون في كلتا اللطختين إلى سلسلة IgG الثقيلة المقترنة بالخرز المغناطيسي ، والتي تهجن مع اتحادات الأجسام المضادة الأولية / الثانوية (الشكل 4B [ii]).

Figure 1
الشكل 1: مخططات بناء سلالة فطر الخميرة. يتم تحويل سلالة خميرة معدلة مع LexA متكامل ومواقع إعادة التركيب على الكروموسوم III باستخدام بلازميد (K238) مع أشرطة تعبير للتعبير التأسيسي لبروتين الاندماج LexA-TAP باستخدام مروج TEF2 وكاسيت التعبير المستحث بالجالاكتوز لتعبير R recombinase (RecR) باستخدام محفز GAL10. يتم تحويل البلازميد خطيا بواسطة هضم تقييد SbfI ، وبالتالي إنشاء أذرع إعادة تركيب متماثلة لدمج كاسيت التعبير في موقع بين الجينات على الكروموسوم I. يتم اختيار الخلايا المختصة بناء على علامة اختيار LEU2 على وسط النمو الذي يفتقر إلى الليوسين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: تنقية موضع الكروماتين ARS316 من خميرة الخميرة Saccharomyces cerevisiae. يتم استئصال موضع ARS316 في شكل حلقات كروماتين من موقعه الجيني في خلايا الخميرة عن طريق إعادة التركيب الخاص بالموقع الناجم عن الجالاكتوز. يتم عزل حلقات الكروماتين هذه من مستخلص الخلايا الخام باستخدام علامة تقارب LexA-TAP المرتبطة بالخرز المغناطيسي المقترن ب IgG. يمكن إطلاق حلقات الكروماتين من الخرز بطريقتين: أ) الانقسام بوساطة البروتياز TEV ، أو ب) شطف التمسخ باستخدام محلول الأمونيوم. يمثل السهم المنقط إمكانية إجراء شطف تمسخ بعد الشطف بوساطة البروتياز TEV لتحرير حلقات الكروماتين المتبقية المرتبطة بالخرز ، حيث أن كفاءة انقسام البروتياز TEV ليست 100٪. تمثل المربعات المحددة العينات التي تم الحصول عليها في خطوات مختلفة من التنقية لتحليل البروتين والحمض النووي. الاختصار: RS = مواقع إعادة التركيب. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: تحليل الحمض النووي (DNA) لتقييم تنقية موضع ARS316. (أ) رسم بياني بالأعمدة يوضح تنقية موضع ARS316 ومنطقة غير ذات صلة ، PDC1 ، في سلسلة من عينات الحمض النووي التي تم جمعها أثناء تنقية موضع الكروماتين ARS316 من سلالة خميرة إعادة التركيب. (ب) رسم بياني بالأعمدة يوضح إثراء موضع ARS316 على الكروماتين الكلي في سلسلة من عينات الحمض النووي التي تم جمعها أثناء تنقية موضع الكروماتين ARS316 من سلالات خميرة التحكم وإعادة التركيب. (ج) صورة لطخة جنوبية تظهر إثراء موضع ARS316 في سلسلة من عينات الحمض النووي التي تم جمعها أثناء تنقية موضع الكروماتين ARS316 من سلالات خميرة التحكم وإعادة التركيب. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: تحليل البروتين لتقييم كفاءة السحب والانقسام LexA-TAP. (أ) رسم كاريكاتوري يمثل مجالات البروتين المختلفة لبروتين الاندماج LexA-TAP ، إلى جانب حجم كل مجال. (ب) صور اللطخة الغربية التي تظهر تلطيخا مناعيا ضد (i) PAP و (ii) LexA في سلسلة من عينات البروتين التي تم جمعها أثناء تنقية موضع الكروماتين ARS316 من سلالات خميرة التحكم وإعادة التركيب. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: مخطط تدفق يسلط الضوء على التطبيقات النهائية المحتملة لمجالات الكروماتين المنقاة باستخدام تنقية تقارب LexA-TAP. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الجدول 1: قائمة بالحلول والوسائط المستخدمة في هذا البروتوكول. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 2: برنامج تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

لا يزال تحديد العوامل ومشهد الكروماتين لمنطقة جينومية مستهدفة محددة يشكل تحديا كبيرا في أبحاث الكروماتين18. يصف هذا البروتوكول نظاما فعالا لاستئصال وتنقية مجالات الكروماتين المميزة على وجه التحديد من كروموسومات الخميرة. على حد علمنا ، فإن نقاء وإنتاجية هذا التنقية أحادية الخطوة يتغلبان على العديد من قيود طرق تنقية الكروماتين الخاصة بالموقع ، مما يسمح بتحقيق إثراء عال جدا للمواقع المستهدفة مقارنة بالمناطق الجينومية الأخرى غير ذات الصلة.

نظرا لخطوة الاستئصال الإضافية باستخدام R-recombinase الخاص بالموقع ، هناك ميزة أخرى تتمثل في أنه يمكن للمرء أن يحدد بالضبط المنطقة الجينومية التي يتم تنقيتها اعتمادا على الموقع الدقيق لمواقع إعادة التركيب في الجينوم. في المقابل ، تعتمد الطرق الأخرى على قص الحمض النووي عن طريق الصوتنة ، مما يؤدي إلى أطوال جزيئات غير متجانسة. هذا التباين يجعل هذه الأساليب أقل دقة من حيث تنقية موضع هدف محدد جيدا.

أخيرا ، تستخدم استراتيجية التنقية هذه الظروف المحلية دون تضمين روابط متشابكة كيميائية مثل الفورمالديهايد. وبالتالي ، فإن المواد المعزولة التي تم الحصول عليها من خلال هذا النهج قابلة للتحليلات الهيكلية والوظيفية. تتمثل الخطوة الحاسمة في بروتوكول التنقية في كفاءة شطف TEV ، والتي تعتمد بشدة على العديد من المعلمات ، بما في ذلك نشاط بروتياز TEV ، وظروف التفاعل ، وأحجام التفاعل. بالنسبة للتجربة الموضحة ، تم ضبط حجم الشطف على الحد الأدنى ، مما أثر على كفاءة الشطف. ومع ذلك ، فإن زيادة حجم وكمية البروتياز TEV يمكن أن يحسن بشكل كبير من كفاءة الشفط. على الرغم من كفاءته المنخفضة ، فإن شطف TEV ينتج عنه انقسام محدد للغاية واستعادة مجالات الكروماتين المطلوبة. وبالمقارنة ، فإن الشطف المتمسخ له كفاءة شطف تزيد عن 90٪ ولكنه قد يزيل بعض جزيئات الحمض النووي أو البروتين غير المحددة من الخرزات. لذلك ، تعتمد طريقة الاختيار على التطبيق النهائي المطلوب للمادة المعزولة. على سبيل المثال ، ثبت أن تغيير طبيعة الشطف يسمح بتحديد مطياف الكتلة لعوامل الكروماتين المرتبطة ، في حين يفضل شطف TEV الأصلي للمقايسات الوظيفية النهائية مثل النسخ في المختبر أو مقايسات النسخ المتماثل. يلخص الشكل 5 التطبيقات النهائية المحتملة لبروتوكول التنقية الموصوف. باختصار ، يعالج هذا سير العمل المحسن والطريقة عالية الكفاءة لدراسة تكوين الكروماتين للمواقع المفردة تحديا طويل الأمد في أبحاث الكروماتين.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgments

تم دعم العمل في مختبر S.H. من قبل DFG من خلال SFB1064 (معرف المشروع 213249687) ، ومجلس البحوث الأوروبي (ERC Start Grant 852798 ConflictResolution) ، و Helmholtz Gesellschaft.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Yeast strains
Control Strain: MATa; ura3Δ0; leu2Δ0; his3Δ1; met15Δ0; bar1::kanMX4; Chr I 212kb::LEU2 pTEF2-LEXA-TAP pGAL1-10 RecR Section 1, see references 13 and 14
Recombination Strain: MATa; ura3Δ0; leu2Δ0; his3Δ1; met15Δ0; bar1::kanMX4; RS_LEXA_NS-3_ARS316_NS+3_RS; Chr I 212kb::LEU2 pTEF2-LEXA-TAP pGAL1-10 RecR Section 1, see reference 13 and 14
Plasmid
K238 plasmid Section 1, see reference 13
Storage: Store at -20 °C
K071 Spike-in plasmid DNA Section 7.1, see reference 13
Storage: Store at -20 °C
Reagents
Acetone Carl Roth 5025.1 Section 2
Storage: Store at room temperature
Ammonium acetate (NH4Ac) Sigma Aldrich A7262 Section 6 and 7.1
Storage: Store at room temperature
Ammonium solution (NH4OH) 25% Merck Millipore 533003 Section 6
Storage: Store at room temperature
Ammonium sulfate Santa Cruz Sc-29085 Section 2
Storage: Store at room temperature
Bacto agar BD (VWR) 90000-760 Section 3
Storage: Store at room temperature
Bacto peptone BD (VWR) 211820 Section 3
Storage: Store at room temperature
β-Mercaptoethanol Sigma Aldrich 07604 Section 7.2
Storage: Store at 4 °C
Chemiluminescent substrate kit ThermoFisher 34580 Section 7.2
Storage: Store at 4 °C
Di-Sodium Hydrogen phosphate dodecahydrate Merck 1.06579.1000 Section 2 and 7.1
Storage: Store at room temperature
Dithiothreitol (DTT) ThermoFisher 15508013 Section 4
Storage: Store at 4 °C
Ethanol Merck 100983 Section 7.1
Storage: Store at room temperature
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma Aldrich ED Section 7.1
Storage: Store at room temperature
Galactose (20% (w/v) stock) Sigma Aldrich G0625-1KG  /  5KG Section 3
Storage: Store at room temperature
Gel loading dye (6x) BioLabs B7024A Section 7.1
Storage: Store at -20 °C
Glusose Sigma-Aldrich G8270 Section
Storage: Store at room temperature
Glycine Carl Roth .0079.4 Section 2
Storage: Store at room temperature
Glycogen (5 mg/mL) Invitrogen AM9510 Section 7.1
Storage: Store at -20 °C
Hydrochloric acid (HCl) PanReac AppliChem 182109.1211 Section 2, 4 and 7.1
Storage: Store at room temperature
Magnesium Acetate (MgAc) Bernd Kraft 15274.2600/C035 Section 4
Storage: Store at room temperature
Magnesium chloride (MgCl2) Sigma Aldrich M8266 Section 6
Storage: Store at room temperature
Nu PAGE LDS sample buffer (4x) Invitrogen 2399549 Section 7.2
Storage: Store at room temperature
Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1 v/v) Invitrogen 15593-031 Section 7.1
Storage: Store at 4 °C
Potassium chloride (KCl) Sigma P9541 Section 4
Storage: Store at room temperature
Radioactively labeled α-32P dATP (3,000 Ci/mmol, 10 mCi/mL) Hartmann Analytic SRP-203 Section 7.1
Storage: Store at 4 °C
RadPrime labeling system ThermoFisher 18428-011 Section 7.1
Storage: Store at -20 °C
Raffinose (20% (w/v) stock) SERVA 34140.03 Section 3
Storage: Store at room temperature
Sodium chloride (NaCl) Merck K53710504142 Section 7.1
Storage: Store at room temperature
Sodium citrate (Na3C6H5O7) Sigma-Aldrich 71402 Section 7.1
Storage: Store at room temperature
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma Aldrich S5881 Section 7.1
Storage: Store at room temperature
Sodium n-dodecyl sulfate (SDS) (5% stock (w/v) ) Alfa Aesar A11183 Section 7.1
Storage: Store at room temperature
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich 71496 Section 2 and 7.1
Storage: Store at room temperature
Sodium azide Santa Cruz Biotechnology sc-208393 Section 2
Storage: Store at -20 °C
 Triethylamine Sigma Aldrich 90340 Section 2
Storage: Store at room temperature
Tris base Chem Cruz SC-3715B Section 2 and 4
Storage: Store at room temperature
Triton X-100 Sigma Aldrich X100 Section 2 and 4
Storage: Store at room temperature
Tween-20 Bernd Kraft 18014332 Section 4
Storage: Store at room temperature
Yeast extract BD (VWR) 212720 Section 3
Storage: Store at room temperature
Yeast mating factor alpha (1 µg/mL stock )  Biomol Y2016.5 Section 3
Storage: Store at -20 °C
Yeast Synthetic Drop-out medium Supplements without LEUCINE Sigma Aldrich Y1376 Section 1, see reference 14
Enzymes
HpaI restriction enzyme (5,000 U/mL) NEB R0105S Section 7.1
Storage: Store at -20 °C
Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100x) ThermoFisher Scientific 78446 Section 4
Storage: Store at4 °C
Proteinase K (10 mg/mL) SERVA 33756 Section 7.1
Storage: Store at -20 °C
RNase A (10 mg/mL)  ThermoFisher EN0531 Section 7.1
Storage: Store at -20 °C
TEV protease (10000 U/µL) NEB P8112S Section 5
Storage: Store at -20 °C
Materials
BcMag Epoxy-Activated Magnetic Beads Bioclone Inc. FC-102 Section 2
Storage: Store at 4 °C
Dry ice Section 4
Low-binding centrifuge tubes 2.0 mL Eppendorf 22431102 Section 4
Microspin G-25 Columns Cytiva 27-5325-01 Section 7.1
Storage: Store at room temperature
Parafilm Merck P7793 Section 4
Positive nylon membrane Biozol 11MEMP0001 Section 7.1
Storage: Store at room temperature
PVDF transfer membrane Immobilon-Merck Millipore IPVH00010 Section 7.2
Storage: Store at room temperature
SDS-PAGE gel 4-12% bis-tris (15 well, 1.5 mm) Invitrogen  NP0336BOX Section 7.2
Storage: Store at 4 °C
Syringe (25 mL) with luer fitting Henke Sass Wolf 4200-000V0 Section 3
Whatman paper (Grade 3MM CHR Cellulose Western Blotting Paper Sheet) Cytiva 3030-917 Section 7.1
Storage: Store at room temperature
Antibodies
Anti-LexA, rabbit polyclonal IgG, DNA binding region antibody Merck Millipore 06-719 Section 7.2
Storage: Store at -20 °C
Goat Anti-Rabbit IgG (H+L), Horseradish peroxidase conjugate Invitrogen G21234 Section 7.2
Storage: Store at -20 °C
Peroxidase Anti-Peroxidase (PAP) antibody produced in rabbit for the detection of TAP-tagged proteins Sigma Aldrich P1291-500UL Section 7.2
Storage: Store at -20 °C
Rabbit IgG antibodies Sigma I5006-100MG Section 2
Storage: Store at 4 °C
Primers (10 µM)
ARS316: fwd 5'- CGGCATTATCGTACACAACCT, rev 5'- GTTCTTCGTTGCCTACATTTTCT Section 7.1
K071 Spike-in plasmid DNA: fwd: 5'-TTTTCGCTGCTTGTCCTTTT, rev 5'- CATTTTCGTCCTCCCAACAT Section 7.1
PCR fragment from yeast genomic DNA as a template  for ARS316 amplification (for southern blot): fwd 5’- AAATTCTGCCCTTGATTCGT                                                  rev 5’- TTTGTTTATCTCATCACTAAT Section 7.1
PDC1: fwd 5'- CATGATCAGATGGGGCTTCA, rev 5'-ACCGGTGGTAGCGACTCTGT Section 7.1
Equipment
Coffee grinder Gastroback 42601 Section 4
Dewar flask NAL GENE 4150-2000 Section 3
DynaMag TM-2 magnetic rack Invitrogen 12321D Section 4, 5 and 6
Hybridization oven Hybaid Mini10 Ri418 Section 2
Microcentrifuge Eppendorf 5424R Section 4 and 7.1
UV-crosslinker Analytikjena 95-0174-02 Section 7.1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kornberg, R. D., Lorch, Y. Twenty-five years of the nucleosome, fundamental particle of the eukaryote chromosome. Cell. 98 (3), 285-294 (1999).
  2. Gauchier, M., van Mierlo, G., Vermeulen, M., Déjardin, J. Purification and enrichment of specific chromatin loci. Nature Methods. 17 (4), 380-389 (2020).
  3. Korthout, T., et al. Decoding the chromatin proteome of a single genomic locus by DNA sequencing. PLoS Biology. 16 (7), e2005542 (2018).
  4. Antão, J. M., Mason, J. M., Déjardin, J., Kingston, R. E. Protein landscape at Drosophila melanogaster telomere-associated sequence repeats. Molecular and Cellular Biology. 32 (12), 2170-2182 (2012).
  5. Déjardin, J., Kingston, R. E. Purification of proteins associated with specific genomic loci. Cell. 136 (1), 175-186 (2009).
  6. Ide, S., Dejardin, J. End-targeting proteomics of isolated chromatin segments of a mammalian ribosomal RNA gene promoter. Nature Communications. 6, 6674 (2015).
  7. Unnikrishnan, A., Gafken, P. R., Tsukiyama, T. Dynamic changes in histone acetylation regulate origins of DNA replication. Nature Structural & Molecular Biology. 17 (4), 430 (2010).
  8. Buxton, K. E., et al. Elucidating protein-DNA interactions in human alphoid chromatin via hybridization capture and mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 16 (9), 3433-3442 (2017).
  9. Kennedy-Darling, J., et al. Discovery of chromatin-associated proteins via sequence-specific capture and mass spectrometric protein identification in Saccharomyces cerevisiae. Journal of Proteome Research. 13 (8), 3810-3825 (2014).
  10. Liu, S. J., et al. CRISPRi-based genome-scale identification of functional long noncoding RNA loci in human cells. Science. 355, 7111 (2017).
  11. Hamperl, S., et al. Purification of specific chromatin domains from single-copy gene loci in Saccharomyces cerevisiae. Functional Analysis of DNA and Chromatin. 1094, 329-341 (2014).
  12. Hamperl, S., et al. Compositional and structural analysis of selected chromosomal domains from Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 42 (1), 2 (2014).
  13. Weiβ, M. Single-copy locus proteomics of early- and late-firing DNA replication origins identifies a role of Ask1/DASH complex in replication timing control. Cell Reports. 42 (2), 112045 (2023).
  14. Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nature Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).
  15. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  16. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  17. Western blot membrane stripping for restaining protocol. Abcam. , Available from: https://www.abcam.com/protocols/western-blot-membrane-stripping-for-restaining-protocol (2023).
  18. Vermeulen, M., Déjardin, J. Locus-specific chromatin isolation. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 21 (5), 249-250 (2020).

Tags

هذا الشهر في JoVE ، العدد 201 ، الكروماتين الأصلي ، تنقية التقارب بخطوة واحدة ، إعادة التركيب الخاصة بالموقع ، تعديلات الهستون ، البروتينات الخاصة بالموقع ، الكيمياء الحيوية للكروماتين
نسخة واحدة من تنقية الكروماتين لموضع الجين في <em>Saccharomyces cerevisiae</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sajid, A., Hamperl, S. Single-Copy… More

Sajid, A., Hamperl, S. Single-Copy Gene Locus Chromatin Purification in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (201), e65460, doi:10.3791/65460 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter