Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Enkelt-kopi gen locus kromatin oprensning i Saccharomyces cerevisiae

Published: November 17, 2023 doi: 10.3791/65460
Automatic Translation
1, 1
1Institute of Epigenetics and Stem Cells, Helmholtz Zentrum München

Summary

Denne protokol præsenterer en locus-specifik kromatinisoleringsmetode baseret på stedspecifik rekombination for at rense et enkeltkopi-gensted af interesse i dets oprindelige kromatinkontekst fra spirende gær, Saccharomyces cerevisiae.

Abstract

Den grundlæggende organisatoriske enhed af eukaryot kromatin er nukleosomkernepartiklen (NCP), som omfatter DNA indpakket ~ 1,7 gange omkring en histonoctammer. Kromatin defineres som enheden af NCP'er og adskillige andre proteinkomplekser, herunder transkriptionsfaktorer, kromatinremodellering og modificerende enzymer. Det er stadig uklart, hvordan disse protein-DNA-interaktioner orkestreres på niveauet af specifikke genomiske loci under forskellige stadier af cellecyklussen. Dette skyldes hovedsageligt de nuværende tekniske begrænsninger, som gør det udfordrende at opnå præcise målinger af sådanne dynamiske interaktioner. Her beskriver vi en forbedret metode, der kombinerer stedspecifik rekombination med en effektiv enkelttrins affinitetsrensningsprotokol for at isolere et enkeltkopi-gen-locus af interesse i dets oprindelige kromatintilstand. Metoden muliggør robust berigelse af målstedet over genomisk kromatin, hvilket gør denne teknik til en effektiv strategi til identifikation og kvantificering af proteininteraktioner på en upartisk og systematisk måde, for eksempel ved massespektrometri. Ud over sådanne sammensætningsanalyser afspejler naturligt chromatin renset ved denne metode sandsynligvis in vivo-situationen med hensyn til nukleosompositionering og histonmodifikationer og kan derfor underkastes yderligere strukturelle og biokemiske analyser af kromatin afledt af praktisk talt ethvert genomisk locus i gær.

Introduction

Den dynamiske organisering af eukaryote genomer i kromatin komprimerer DNA'et, så det passer inden for kernens grænser, samtidig med at der sikres tilstrækkelig dynamik til genekspression og tilgængelighed for regulatoriske faktorer. Til dels medieres denne alsidighed af nukleosomet, den grundlæggende enhed af kromatin, som omfatter en kernepartikel med 147 bp DNA indpakket ~ 1,7 gange omkring histonoctammeren1. Nukleosomet er en meget dynamisk struktur med hensyn til dets sammensætning med adskillige histonvarianter og posttranslationelle modifikationer (PTM'er) på de N- og C-terminale histonhaler. Desuden interagerer eukaryot kromatin med en lang række andre væsentlige komponenter, såsom transkriptionsfaktorer, DNA- og RNA-behandlingsmaskiner, arkitektoniske proteiner, enzymer involveret i kromatinremodellering og modifikation og RNA-molekyler forbundet med kromatin. Disse vigtige maskiner, der er involveret i transkription, replikation og reparation, kræver alle adgang til kromatin, som fungerer som det naturlige substrat for disse processer. Følgelig kræver forståelsen af de molekylære mekanismer, der ligger til grund for disse DNA-transaktioner, en præcis definition af de kollektive ændringer i kromatinstrukturen i de specifikke genomiske regioner, hvor disse maskiner konvergerer og letter biologiske reaktioner.

På trods af identifikation af adskillige kromatinfaktorer gennem genetik og protein-protein-interaktionsundersøgelser er udførelse af direkte, upartiske og omfattende analyser af kromatininteraktioner på bestemte genomiske steder forblevet en betydelig hindring 2,3. Indledningsvis kunne kun meget rigelige områder af genomet (dvs. gentagne loci) eller multikopiplasmider isoleres i tilstrækkelige mængder og renhed til massespektrometrisk identifikation af de associerede proteiner 4,5,6,7. En række nye tilgange baseret på direkte hybridisering af indfangningssonder til kromatiniseret DNA, nærhedsbiotinylering ved hjælp af CRISPR-dCas9-systemet eller binding af sekvensspecifikke adapterproteiner til det interessante sted er begyndt at optrævle proteomet af enkeltkopi-loci fra gær- og pattedyrgenomer 8,9,10. Imidlertid kræver alle disse metoder formaldehydtværbinding for at stabilisere protein-DNA-interaktionerne og sonikering for at opløse kromatinet til efterfølgende oprensning. Sammen udelukker begge manipulationer muligheden for efterfølgende strukturelle og funktionelle undersøgelser af det rensede kromatin.

For at overvinde disse begrænsninger har vi tidligere udtænkt en metode, der anvender stedspecifik rekombination til at udtrække målrettede kromosomale domæner fra gær 11,12. I det væsentlige er det genomiske område af interesse omgivet af genkendelsessteder (RS) for den stedspecifikke R-rekombinase fra Zygosaccharomyces rouxi, samtidig med at den inkorporerer en gruppe af tre DNA-bindingssteder for det prokaryote transkriptionelle repressor LexA-protein (LexA) inden for samme region. Gærcellerne indeholder en ekspressionskassette til samtidig ekspression af R-rekombinase og et LexA-protein smeltet sammen med et tandemaffinitetsrensningsmærke (TAP). Efter induktionen af R-rekombinase udskærer enzymet effektivt målområdet fra kromosomet i form af et cirkulært kromatindomæne. Dette domæne kan renses via LexA-TAP-adapterproteinet, som binder til LexA DNA-bindingsstederne såvel som til en affinitetsstøtte. Denne metode er for nylig blevet brugt til at isolere forskellige kromatindomæner, der indeholder udvalgte replikationsoprindelser af gærkromosom III13.

En stor fordel ved denne ex vivo-tilgang er, at den giver mulighed for funktionelle analyser af det isolerede materiale. For eksempel kan replikationsoprindelsesdomæner, der er renset med denne metode, underkastes in vitro-replikationsassays for at vurdere effektiviteten af oprindelsesaffyring i et reagensglas fra native in vivo-samlede kromatinskabeloner. I sidste ende kan den biokemiske og funktionelle karakterisering af det isolerede materiale tillade rekonstitution af nukleare processer ved anvendelse af rensede proteiner sammen med den oprindelige kromatinskabelon. Sammenfattende åbner denne metode en spændende vej inden for kromatinforskning, da det vil være muligt at følge de kollektive sammensætnings- og strukturelle kromatinændringer i en bestemt genomisk region, der gennemgår en bestemt kromosomtransaktion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Se materialefortegnelsen for detaljer vedrørende alle de materialer og instrumenter, der anvendes i denne protokol. Se tabel 1 for en liste over de anvendte opløsninger, buffere og medier.

1. Rekombinant gærstammekonstruktion

  1. For at konstruere en rekombinationskompetent gærstamme omdannes SbfI-fordøjet plasmid K238 til en gærstamme med integrerede LexA-bindingssteder og RS-rekombinationssteder på interessestedet13,14.
    BEMÆRK: Det transformerede SbfI-restriktionsfragment indeholder den krævede ekspressionskassette til konstitutiv ekspression af LexA-TAP-fusionsproteinet og R-rekombinase, sammen med homologe sekvenser af gærkromosom I til genomisk integration af ekspresssekassetten ved homolog rekombination (figur 1).
  2. For at konstruere en kontrolstamme skal du tage en isogen gærstamme, der mangler integrerede RS- og LexA-bindingssteder, og omdanne den med SbfI-fordøjet K238-plasmid under de samme betingelser som anvendt til den rekombinationskompetente stamme.
  3. Vælg de kompetente gærceller baseret på LEU2-selektionsmarkøren på SCD-LEU agarplader14.

2. Kobling af IgG-antistoffer til epoxyaktiverede magnetiske perler

BEMÆRK: Par IgG-antistoffer mod epoxyaktiverede magnetiske perler i henhold til følgende offentliggjorte protokol11.

  1. Suspender 300 mg epoxyaktiverede perler i 10 ml 50% acetone (300 mg svarer til ~5,1 × 1010 perler) i et 50 ml konisk rør. Ryst kraftigt på en hvirvelblander.
  2. Glasset med perlerne centrifugeres ved 820 × g og 4 °C i 2 min. Supernatanten fjernes.
  3. Vask perlerne 3x med 20 ml 0,1 M natriumphosphatbuffer (pH 7,4). Supernatanten fjernes efter hvert vasketrin ved centrifugering som beskrevet i trin 2.2.
  4. Suspender perlerne i 16 ml 0,1 M natriumphosphatbuffer (pH 7,4), og drej forsigtigt i en hybridiseringsovn i 5 minutter ved stuetemperatur.
  5. Opløs kaninens IgG'er (100 mg) i 7 ml dH2O (slutkoncentration: 14 mg / ml).
  6. IgG-suspensionen centrifugeres ved 13.000 × g og 4 °C i 10 minutter for at klarlægge suspensionen.
  7. 3,5 ml supernatant (svarende til 50 mg kanin-IgG'er) overføres til et nyt 50 ml konisk rør.
  8. Fortynd IgG-opløsningen med 9,85 ml 0,1 M natriumphosphatbuffer (pH 7,4) efterfulgt af dråbevis tilsætning af 6,65 ml 3 M ammoniumsulfat i 0,1 M natriumphosphat (pH 7,4) under forsigtig blanding.
    BEMÆRK: Undgå at tilføje ammoniumsulfat hurtigt til opløsningen, da en høj lokal koncentration af saltet vil forårsage udfældning af kaninens IgG'er.
  9. IgG-opløsningen centrifugeres ved 820 × g og 4 °C i 3 minutter, og den deraf følgende supernatant tilsættes magnetisk perlesuspension.
  10. Røret inkuberes natten over eller i det mindste i 18 timer ved 30 °C med forsigtig rotation i en hybridiseringsovn.
  11. Supernatanten fjernes som beskrevet i trin 2.2.
  12. Vask perlerne med 20 ml 100 mM glycin-HCI (pH 2,5). Opløsningen fjernes hurtigt som beskrevet i trin 2.2 for at undgå denaturering af IgG-polypeptiderne.
  13. Puds perlerne én gang med 20 ml 10 mM Tris-HCl (pH 8,8). Opsug supernatanten som beskrevet i trin 2.2.
  14. Tilsæt 20 ml 0,1 M triethylaminopløsning i 5-10 minutter under forsigtig rotation for at inaktivere de resterende reaktive epoxygrupper. Supernatanten fjernes som beskrevet i trin 2.2.
  15. Vask perlerne 4x med 20 ml PBS (pH 7,4) i 5 min med forsigtig rotation. Efter hvert vasketrin fjernes supernatanten som beskrevet i trin 2.2.
  16. Vask perlerne 2x med 20 ml PBS (pH 7,4) med 0,5% Triton X-100 (w/v) i 5 min og 15 min hver under forsigtig rotation i en hybridiseringsovn. Supernatanten fjernes som beskrevet i trin 2.2.
  17. Svøm perlerne i et slutvolumen på 16 ml PBS (pH 7,4) med 0,02% natriumazid (w/v). Opbevares som 1 ml alikvoter ved 4 °C indtil brug.

3. Gærcellekultur og høst

  1. Inokulere kontrol- og rekombinationskompetente gærstammer fra YPD-plader i 5 ml YPR-medium og inkuberes natten over ved 30 °C og 200 omdr./min.
  2. 2 ml af denne kultur podes til 100 ml YPR-medium, og der inkuberes natten over ved 30 °C og 200 omdr./min.
  3. For hver stamme fordeles 1.800 ml autoklaveret YP-substrat og 200 ml autoklaveret raffinoseopløsning (20 % w/v) i hver af to 5 L Erlenmeyerkolber (4 L dyrkningsmedium i alt for hver stamme, fordelt på to kolber).
  4. De voksende gærceller podes ved OD600 0,2 i deres respektive substrat og inkuberes som beskrevet i trin 3.1 i ca. 6 timer, eller indtil cellerne når den ønskede OD600 på 1,0. For at sikre normal vækst af cellerne, fri for forurening, kontroller OD med 2 timers mellemrum.
  5. Tilsæt 200 ml galactose (20% w/v) for at inducere stedspecifik rekombination.
  6. Der tilsættes 110 μL (50 ng/ml) YMFA (samtidig med galactosen, trin 3.5) for at standse cellerne i G1-fasen og inkubere i 2 timer.
    BEMÆRK: Tilsætningen af KFUM til cellerne afhænger af de eksperimentelle betingelser og biologiske spørgsmål, der skal behandles. Netop til dette eksperiment arresteres cellerne i G1-fasen for at opnå en homogen cellepopulation med licenseret replikationsoprindelse; i denne proces binder det præreplikative kompleks til oprindelsen i G1-fasen før initieringen af DNA-replikation i S-fasen.
  7. Cellesuspensionen overføres til 1 liter centrifugespande, og centrifugeres ved 6.000 × g og 4 °C i 10 minutter. Supernatanten kasseres, og cellepillerne resuspenderes i et samlet volumen på 10-15 mldH2O.
  8. Forsegl en 25 ml sprøjte med en Luer-prop, og læg den i et 50 ml konisk rør fyldt med vand. Overfør cellesuspensionen til sprøjteenheden, og centrifuger ved 2.397 × g i 10 minutter ved stuetemperatur. Supernatanten kasseres.
  9. Fjern Luer-proppen fra sprøjten, og ekstruder cellerne til flydende nitrogen for at danne celle "spaghetti".
    BEMÆRK: Brug af 4 L dyrkningsmedium giver en vådvægt af slutcellepiller på 7-10 g.
  10. Overfør den frosne cellespaghetti til et 50 ml konisk rør, og opbevar ved -80 °C indtil yderligere brug.

4. Oprensning af kromatin locus

BEMÆRK: Se figur 2 for en skematisk oversigt over de trin, der er involveret i denne locus-specifikke kromatinrensningsprotokol.

  1. Køl en kommerciel kaffekværn ned ved at male 30-50 g tøris ved kraftigt at ryste kaffekværnen 2x i 30 s hver gang. Når tørispulveret er afkølet, kasseres det.
  2. Bland 3 g frossen gærcellespaghetti med ~30-50 g tøris i den forkølede kaffekværn.
  3. Forsegl krydset mellem hætten og kværnen med parafilm for at forhindre tab af gærcellepulver under fræsning.
  4. Fræs gærcelle-tørisblandingen 10x i 30 s hver gang, med 30 s intervaller mellem hver runde (samlet tidsestimat: ~ 10 min). For at undgå, at tøris og cellepulver klæber til kaffekværnens vægge, skal du banke kontinuerligt på siderne af kaffekværnen under fræsningen.
  5. Det resulterende gærcelletørispulver overføres til et plastbægerglas ved hjælp af en ren og tør spatel.
  6. Opbevar bægerglassene ved stuetemperatur for at fordampe tørisen.
  7. Når tørisen er fordampet, tilsættes 2,25 ml MB buffer med 1x protease- og fosfatasehæmmere (750 μL/g gærceller) til gærcellepulveret.
  8. Cellebufferblandingen pipetteres kraftigt for at sikre fuldstændig suspension af cellerne med bufferen, og overføres til et 15 ml konisk rør.
  9. Udtag prøver til DNA (0,1%) og protein (0,05%) analyse fra den resulterende cellesuspension (råcelleekstrakter [CCE]). Opbevares ved -20 °C indtil videre behandling (beskrevet i punkt 7).
  10. Cellesuspensionen overføres til lavbindende 2 ml reaktionsrør, og centrifugeres ved 21.130 × g i 30 minutter ved 4 °C for at adskille celleaffaldet fra råcellelysatet.
  11. Supernatanterne fra alle reagensglassene samles i et konisk glas på 15 ml.
  12. Der udtages prøver fra supernatanten (input [IN]) til DNA (0,1%) og proteinanalyse (0,05%). Opbevares ved -20 °C indtil videre behandling (beskrevet i punkt 7).
  13. 500 μL IgG-koblet magnetisk perleopslæmning (for hver gærstamme) udlignes ved vask 2x med 500 μL kold MB buffer med 1x protease- og fosfatasehæmmere i 5 minutter hver ved 4 °C ved rotation ved 20 omdr./min. Supernatanten kasseres af perlerne ved hjælp af et magnetstativ efter hvert vasketrin.
  14. De IgG-koblede magnetperler inkuberes i 500 μL kold MB buffer med 1x protease- og fosfatasehæmmere i 1 time ved 4 °C ved rotation ved 20 omdr./min. Supernatanten kasseres fra perlerne ved hjælp af en magnetrist.
  15. Den ækvilibrerede magnetiske perleopslæmning blandes med cellelysatet og inkuberes med rotation ved 20 rpm i 2 timer ved 4 °C.
  16. Overfør den komplette magnetiske perlecellelysatsuspension til lavbindende reaktionsrør.
  17. Adskil de magnetiske perler, der nu bærer kromatinringene af interesse, fra cellelysatet ved hjælp af et magnetisk stativ.
  18. Overfør den resterende gennemstrømning (FT) fra hvert rør til et frisk 15 ml konisk rør, og tag prøver til DNA (0,1%) og protein (0,05%) analyse. Opbevares ved -20 °C indtil videre behandling (beskrevet i punkt 7).
  19. Suspender de magnetiske perler fra hvert rør i 300 μL kold MB buffer, og saml perlerne i et reaktionsrør. Der vaskes 5x i 10 minutter hver med 750 μL kold MB buffer med 1x protease- og fosfatasehæmmere ved 4 °C ved rotation ved 20 omdr./min. Udfør den endelige vask med 750 μL kold MB buffer uden protease- og fosfatasehæmmere.
  20. Smør perlerne i 40 μL kold MB buffer uden protease- og fosfatasehæmmere.
    BEMÆRK: Den endelige mængde eluat kan justeres i henhold til den forventede downstream-anvendelse. TEV-elueringen fungerer normalt effektivt inden for området 100-300 μL.

5. TEV-proteasemedieret eluering

  1. For at frigive LexA-CBP-kromatinringkomplekser fra perlerne inkuberes perlerne med 2 μL 6x His-mærket rekombinant TEV-protease natten over ved 4 °C og 450 omdr./min. i en termomixer.
  2. Adskil perlerne fra det endelige eluat ved hjælp af et magnetisk stativ. Eluatet, der indeholder spaltede kromatinringe, overføres til et nyt 1,5 ml reaktionsrør.
  3. Opbevar rørene på et magnetisk stativ igen for at adskille eventuelle resterende perler fra det endelige eluat.
  4. Resuspender perlerne (TB) i 750 μL kold AC-buffer, og tag prøver til DNA (0,1%) og protein (0,05%) analyse. Opbevares ved -20 °C indtil videre behandling (beskrevet i punkt 7).
  5. Fra det endelige eluat (TE) skal du tage prøver til DNA (0,5%) og protein (0,25%) analyse. Opbevares ved -20 °C indtil videre behandling (beskrevet i punkt 7).
    BEMÆRK: På grund af det lave volumen af det endelige eluat øges procentdelen af prøverne indsamlet til DNA- og proteinanalyse for at opnå en bedre repræsentation af deres protein- og DNA-indhold under analysen.

6. Denaturering eluering

  1. Vask perlerne 2x i 750 μL kold AC-buffer i 20 min hver gang ved 4 °C ved rotation ved 20 omdr./min.
  2. For at ekstrahere de resterende bundne LexA-kromatinkomplekser udføres denatureringeluering ved at tilsætte 500 μL 0,5MNH4OHtil perlerne og inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur.
  3. Adskil perlerne fra suspensionen ved hjælp af et magnetstativ, og overfør eluatet til et lavbindende reaktionsrør.
  4. Perlerne inkuberes igen som i trin 6.2 for at genvinde de maksimale kromatin loci i eluatet.
  5. Perlerne adskilles fra suspensionen ved hjælp af et magnetstativ, og det resulterende eluat samles i det samme rør, der indeholder eluatet fra trin 6.3.
  6. Resuspender perlerne (DB) i 750 μL dH2O, og tag prøver til DNA (0,1%) og protein (0,05%) analyse.
  7. Fra det endelige eluat (DE) skal du tage prøver til DNA (0,5%) og protein (0,25%) analyse.

7. DNA- og proteinanalyse

  1. DNA-analyse
    1. Forberedelse af prøver
      1. Til DNA-prøverne tilsættes 100 μL IRN-buffer, og volumenet øges meddH2Otil et slutvolumen på 200 μL.
      2. Tilsæt 1 ng K071 spike-in plasmid-DNA.
      3. Der tilsættes 1 μL RNAse A (10 mg/ml), og der inkuberes ved 37 °C i 1 time.
      4. Der tilsættes 5 μL proteinase K (10 mg/ml) og 10 μL SDS (20 %), og der inkuberes i 1 time ved 56 °C.
      5. Der tilsættes 200 μL phenol/chloroform/isopropylalkohol (25:24:1) og hvirvel grundigt 2x i 10 sek. hver gang.
      6. Prøverne centrifugeres ved 21.130 × g i 7 minutter for at adskille den organiske og den vandige fase.
      7. Supernatanten overføres til nye 1,5 ml reagensglas indeholdende 1,5 μL glykogen (5 mg/ml) og 2,5x 100% ethanol.
      8. Rekuber glassene ved -20 °C i mindst 2 timer og højst natten over for at udfælde DNA'et.
      9. Der centrifugeres ved 21.130 × g, 4 °C i 45 minutter. Supernatanten kasseres.
      10. Der tilsættes 150 μL 70% ethanol uden resuspendering af DNA-pelleten, og der centrifugeres igen ved 21.130 × g ved 4 °C i 10 minutter.
      11. DNA-pillerne tørres ved stuetemperatur i 10-15 min, og resuspenderes i 40 μLdH2O.
      12. Udfør restriktionsenzymfordøjelse for at linearisere DNA'et isoleret i trin 7.1.1.11 med HpaI-restriktionsendonuklease. For en 50 μL reaktionsblanding inkuberes 40 μL isoleret DNA + 2 μL HpaI-enzym + 5 μL restriktionsenzymbuffer + 3 μLdH2Onatten over ved 37 °C.
    2. qPCR-analyse
      1. Det restriktionsfordøjede DNA fortyndes i forholdet 1:5 (10 μL af det restriktionsfordøjede DNA opnået fra trin 7.1.1.12 i 40 μLdH2O).
      2. Brug primerpar designet til ARS316-regionen, PDC1 og spike-in plasmid-DNA.
      3. Kør qPCR ved hjælp af programmet i tabel 2.
      4. Analyser qPCR-resultaterne ved relativ kvantificering ved hjælp af ARS316-regionen og spike-in plasmid-DNA som mål og PDC1 (eller ethvert andet gen eller genomisk region) som referencested.
      5. Vurder ARS316 locus genvindingsprocenten over PDC1 ved at normalisere ARS316 og PDC1 primer relative kvantificeringsværdier med procentdelen af brøkvolumenet taget for hver prøve. For eksempel ganges 0,1% for gennemstrømningen med en faktor på 1.000 og 0,5% for TEV-eluatet med en faktor på 200.
      6. Normaliser ARS316- og PDC1-genoprettelsesprocenterne med spike-in-plasmid-DNA-relative kvantificeringsværdier.
      7. Vurder berigelsen af ARS316-locus over det samlede kromatin ved at evaluere det opnåede relative kvantificeringsmål/referenceværdier ved hjælp af ligning (1).
        Equation 1(1)
    3. Southern blot-analyse
      1. Til 20 μL restriktionsenzymfordøjet DNA-prøve tilsættes 5 μL gelbelastende farvestof.
      2. Kør prøverne i en 1% agarosegel ved 110 V i ~3 timer.
      3. Overfør gelen til en bakke, og blød den i depurinationsopløsning med forsigtig omrystning i 20 min.
      4. Skyl gelen med dH2O, og blød den i denatureringsopløsning i 15 minutter med omrystning. Kassér denatureringsopløsningen.
      5. Blødgør gelen i denatureringsopløsning i 15 min med forsigtig omrystning.
      6. Skyl gelen med dH2O, og vask den 2x i 15 min hver gang med overførselsbufferen under forsigtig omrystning.
      7. Fyld en bakke med 1-1,5 L overførselsbuffer, og læg den på en stabil platform.
      8. Klip et langt stykke Whatman-papir, og læg det på platformen på en sådan måde, at de to ender af papiret gennemblødes i overførselsbufferen.
      9. Skær en strimmel positiv nylonmembran og fire strimler Whatman-papir svarende til gelens størrelse.
      10. Placer to stykker Whatman-papir gennemblødt i overførselsbufferen på platformen.
      11. Placer gelen med forsiden nedad oven på stykkerne af Whatman-papir.
      12. Oven på gelen placeres den positive nylonmembran efterfulgt af de resterende to stykker Whatman-papir gennemblødt i overførselsbuffer. Sørg for at holde stakken våd med overførselsbufferen.
      13. Fjern eventuelle fangede luftbobler ved at rulle dem af med en glasstang.
      14. Læg en stak køkkenrulle oven på den samlede stak, efterfulgt af en 0,5 kg genstand (f.eks. En glasflaske).
      15. Lad enheden stå til overførsel natten over ved stuetemperatur.
      16. Efter overførsel UV-tværbinder membranen med en samlet energieffekt på 1.200 J/cm2.
      17. Til påvisning af ARS316-locus udføres sydlig blothybridisering ved hjælp af radioaktive sonder syntetiseret ved hjælp af det refererede DNA-mærkningssystem.
        BEMÆRK: Udfør alle trin herefter på is, indtil andet er nævnt.
      18. I et lavbindende reaktionsrør fortyndes 25-40 ng PCR-fragment (sonde) i 19 μLdH2O, og der inkuberes ved 95 °C i 5 minutter. Afkøles straks på is.
      19. Der tilsættes 1 μL hver på 500 μM dCTP, 500 μM dGTP og 500 μM dTTP til røret.
      20. Der tilsættes 20 μL af bufferen indeholdende tilfældige nukleotidhexamerer, der følger med sættet.
      21. Der tilsættes 5 μL af det radioaktivt mærkede nukleotid [α-32P] dATP til røret. Udfør alle trin, der involverer radioaktivt mærket materiale under et radioaktivitetsgodkendt beskyttelsesmiljø.
      22. Der tilsættes 1 μL Klenow-fragment, og der inkuberes ved 37 °C på en termomixer i 15 minutter til enkeltstrenget DNA-syntese.
      23. Der tilsættes 5 μL stopbuffer for at stoppe reaktionen.
      24. Centrifuger en størrelsesudelukkelseskolonne i 2 minutter ved 1.500 × g for at fjerne opbevaringsbufferen. Kassér gennemløbet, og anbring søjlen i et nyt rør.
      25. Før sondeblandingen gennem søjlen for at fjerne ikke-inkorporerede radioaktive nukleotider. Der centrifugeres i 30 s ved 1.500 × g for at opsamle sonden.
      26. Der tilsættes 150 μL laksesæd-DNA (1:100) for at blokere sondens uspecifikke binding til membranen.
      27. Sondeblandingen inkuberes ved 95 °C i 5 minutter for at denaturere det dobbeltstrengede DNA.
      28. Snapfryses på is i et par sekunder, og centrifuger i et par sekunder ved 500 × g for at bringe vanddråberne kondenseret på låget ned.
      29. Vask kort den sydlige blotmembran med hybridiseringsbufferen i 5-10 minutter med rotation.
      30. Forhybridiser membranen med hybridiseringsbufferen i 1 time ved 55 °C med rotation. Kassér hybridiseringsbufferen.
      31. Tilsæt 15 ml frisk hybridiseringsbuffer (forvarmet til 55 °C) til membranen sammen med den forberedte sonde. Membranen inkuberes natten over ved 55 °C med rotation.
      32. Udfør posthybridiseringsvaske 2x i 15 minutter hver med 0,3x SSC, 0,1% SDS ved 55 °C med rotation.
      33. Udfør posthybridiseringsvaske 2x i 15 minutter hver med 0,1x SSC, 0,1% SDS ved 55 °C med rotation.
      34. Udfør efterhybridiseringsvaske 2x i 15 minutter hver med 0,1x SSC, 1,5% SDS ved 55 °C med rotation.
      35. Fjern membranen fra hybridiseringsrøret, og udsæt membranen for en phosphorimagerskærm i op til 3 dage for at opnå de radioaktive aftryk på filmen.
      36. Få billeder af filmen ved hjælp af et fosforbilleddannende laserscanningssystem.
  2. Proteinanalyse
    1. Forberedelse af prøver
      1. Alle proteinprøverne justeres til deres endelige volumen (200 μL, 100 μL, 100 μL, 20 μL og 20 μL for henholdsvis råcelleekstrakt, input, gennemstrømning, perler og eluatprøver) ved at tilsætte 1 μL β-mercaptoethanol, PAGE LDS-prøvebuffer (1x) og dH2O.
      2. Denaturer prøverne ved 95 °C i 5 min.
    2. Western blot-analyse
      BEMÆRK: Udfør SDS-PAGE og western blotting ved hjælp af standardprotokollerne15,16.
      1. Læg 15 μL af hver prøve i hvert hul i en 1,5 mm SDS-PAGE gel.
      2. Der udføres immunfarvning af blottet ved hjælp af PAP (1:2.000) og LexA (1:1.000) antistoffer med inkubation natten over ved 4 °C. Fortynd i 5% tørmælk/PBST-opløsning.
        BEMÆRK: Efter PAP-analyse kan blottet fjernes ved hjælp af en mild strippeprotokol17 før immunfarvning med det andet LexA-antistof.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Oprensningen af ~1,4 kb ARS316-kromatindomænet blev medieret af det konstitutivt udtrykte LexA-TAP-adapterprotein. For at fungere som en negativ kontrol udførte vi oprensninger ved hjælp af en isogen stamme, der udtrykker LexA-TAP, men ikke indeholder integrerede RS- og LexA-bindingssteder. Figur 3 illustrerer DNA-analyseresultatet fra et standardrensningseksperiment udført på både kontrol- og en rekombinationskompetent stamme rettet mod ARS316-locus. Efter DNA-isolering og restriktionsenzymfordøjelse for at linearisere de cirkulære DNA-molekyler blev qPCR-analyse udført for at vurdere rensningseffektiviteten af ARS316-målstedet over det ikke-relaterede genomiske kontrolsted PDC1.

Desuden blev berigelsen af ARS316-locus over det samlede kromatin kvantificeret (figur 3A, B). Den negative kontrolstamme viste ingen genvinding af ARS316 eller PDC1 loci i nogen af fraktionerne bortset fra råcelleekstraktet, input og gennemstrømning, hvilket tyder på, at der ikke kunne observeres nogen specifik berigelse i TEV og denaturerende elueringer. I modsætning hertil blev ARS316-locus kvantitativt udtømt i gennemstrømningen i rekombinationsstammen og kunne genvindes på perlerne efter TEV-eluering og i denatureringselueringen. Efter TEV-eluering viste perlerne en højere genvindingsprocent af ARS316-locus, da TEV-spaltningseffektiviteten ikke var 100%. Dette resulterede i, at en brøkdel af kromatinringe forblev bundet til perlerne. TEV proteasespaltningseffektiviteten kan forbedres ved at øge elueringsvolumen til over 100 μL. I modsætning hertil viste denatureringselueringen 80% -90% genopretning af ARS316-locus i rekombinationsstammen (figur 3A), svarende til den høje berigelse af ARS316-molekyler, når der tages højde for størrelsen af gærgenomet (figur 3B).

Southern blot blev desuden udført for at validere qPCR-resultaterne. På grund af sin høje følsomhed kan den detektere relativt lavere koncentrationer af mål-DNA, hvilket muliggør kvantitativ analyse af prøverne. Resultaterne opnået fra den sydlige blotanalyse ved hjælp af radioaktivt mærket sonde bekræftede den specifikke berigelse af ARS316-locus i fraktionerne indsamlet fra rekombinationsstammen, men ikke i kontrolstammefraktionerne (figur 3C). I rekombinationsstammen blev der observeret højere berigelse af ARS316-locus baseret på signalintensiteten i TEV-perlerne og denatureringselueringsprøverne i overensstemmelse med qPCR-resultaterne. Tilsvarende er de svage signaler, der observeres i TEV-eluerings- og denatureringsperleprøverne, i overensstemmelse med den observerede lave berigelse af ARS316-locus i disse fraktioner (figur 3C).

LexA-TAP-spaltnings- og pulldown-effektiviteten blev også vurderet ved western blot-analyse. LexA-TAP-proteinet har en molekylvægt på ~80 kDa (figur 4A). I både rekombinations- og kontrolstammerne blev western blot-analysen udført under anvendelse af PAP-antistoffet, som er målrettet mod proteinet A-delen af LexA-TAP i oprensningsprøverne. Som forventet viste resultaterne næsten total udtømning af LexA-TAP i gennemstrømningen, med genopretning observeret i de endelige perle- og elueringsfraktioner (figur 4B[i]). PAP-antistoffet detekterer også det lille protein A-fragment på ~ 15 kDa, der forbliver på perlerne efter TEV-eluering. Den samme vestlige plet blev strippet og immunfarvet med et antistof mod LexA-delen af LexA-TAP (figur 4B [ii]), hvilket viser komplementære resultater (figur 4B [ii]). Det stærke bånd ved ~ 50 kDa i begge blots indikerer den tunge IgG-kæde koblet til de magnetiske perler, som krydshybridiserer med de primære / sekundære antistofkonjugater (figur 4B [ii]).

Figure 1
Figur 1: Skemaer over gærstammekonstruktion. En modificeret gærstamme med integrerede LexA- og rekombinationssteder på kromosom III transformeres med et plasmid (K238) med ekspressionskassetter til den konstitutive ekspression af LexA-TAP-fusionsproteinet under anvendelse af TEF2-promotoren og den galactoseinducerbare ekspressionskassette til R-rekombinaseekspression (RecR) ved anvendelse af en GAL10-promotor. Plasmidet er lineariseret ved SbfI-restriktionsfordøjelse og derved skaber homologe rekombinationsarme til integration af ekspressionskassetten i en intergen placering på kromosom I. Kompetente celler vælges ud fra LEU2-selektionsmarkøren på vækstmediet, der mangler leucin. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Oprensning af ARS316-kromatinlocus fra gæren Saccharomyces cerevisiae. ARS316-locus udskæres i form af kromatinringe fra dets genomiske placering i gærceller ved galactose-induceret stedspecifik rekombination. Disse kromatinringe isoleres fra råcelleekstraktet ved hjælp af LexA-TAP-affinitetsmærket bundet til IgG-koblede magnetiske perler. Kromatinringe kan frigives fra perlerne ved to metoder: i) TEV-proteasemedieret spaltning eller ii) denatureringeluering ved anvendelse af ammoniumopløsning. Den stiplede pil repræsenterer muligheden for at udføre denatureringeluering efter TEV-proteasemedieret eluering for at frigive de resterende perlebundne kromatinringe, da TEV-proteasespaltningseffektiviteten ikke er 100%. De skitserede kasser repræsenterer de prøver, der er opnået på forskellige trin i oprensningen til protein- og DNA-analyser. Forkortelse: RS = rekombinationssteder. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: DNA-analyse til evaluering af ARS316 locus oprensning. (A) Søjlediagram, der viser oprensningen af ARS316-locus og en ikke-relateret region, PDC1, i en række DNA-prøver indsamlet under ARS316-kromatin locus-oprensning fra rekombinationsgærstammen. (B) Søjlediagram, der viser berigelsen af ARS316-locus over total kromatin i en række DNA-prøver indsamlet under ARS316-kromatin locus-oprensning fra kontrol- og rekombinationsgærstammer. (C) Southern blot-billede, der viser berigelsen af ARS316-locus i en række DNA-prøver indsamlet under ARS316-kromatinlocusoprensning fra kontrol- og rekombinationsgærstammer. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Proteinanalyse til evaluering af LexA-TAP pull-down og spaltningseffektivitet. (A) Tegneserie, der repræsenterer de forskellige proteindomæner i LexA-TAP-fusionsproteinet sammen med størrelsen på hvert domæne. (B) Western blot-billeder, der viser immunfarvning mod (i) PAP og (ii) LexA i en række proteinprøver indsamlet under ARS316-kromatin locusoprensning fra kontrol- og rekombinationsgærstammer. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Flowdiagram, der fremhæver de potentielle downstream-anvendelser af kromatindomæner renset ved hjælp af LexA-TAP-affinitetsrensning. Klik her for at se en større version af denne figur.

Tabel 1: En liste over de løsninger og medier, der anvendes i denne protokol. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 2: Kvantitativt PCR-program. Klik her for at downloade denne tabel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Identificeringen af faktorer og kromatinlandskab i en specifik målgenomregion udgør fortsat en stor udfordring inden for kromatinforskning18. Denne protokol beskriver et effektivt system til specifikt at punktafgifter og rense forskellige kromatindomæner fra gærkromosomer. Så vidt vi ved, overvinder renheden og udbyttet af denne enkelttrinsoprensning mange af begrænsningerne ved locusspecifikke kromatinrensningsmetoder, hvilket muliggør opnåelse af meget høj berigelse af de målrettede loci sammenlignet med andre ikke-relaterede genomiske regioner.

På grund af det ekstra excisionstrin ved hjælp af stedspecifik R-rekombinase, er en anden fordel, at man nøjagtigt kan bestemme, hvilken genomisk region der renses afhængigt af den nøjagtige placering af rekombinationsstederne i genomet. I modsætning hertil er andre metoder afhængige af klipning af DNA'et ved sonikering, hvilket resulterer i heterogene molekylelængder; Denne heterogenitet gør disse metoder mindre præcise med hensyn til rensning af et veldefineret målsted.

Endelig udnytter denne rensningsstrategi indfødte forhold uden inkludering af kemiske tværbindere som formaldehyd. Det isolerede materiale, der opnås ved denne fremgangsmåde, kan således underkastes strukturelle og funktionelle analyser. Et kritisk trin i rensningsprotokollen er effektiviteten af TEV-elueringen, som stærkt afhænger af flere parametre, herunder TEV-proteasens aktivitet, reaktionsbetingelserne og reaktionsvolumenerne. For det viste eksperiment blev elueringsvolumenet indstillet til et minimum, hvilket påvirkede elueringseffektiviteten. En forøgelse af mængden og mængden af TEV-protease kan imidlertid forbedre elueringseffektiviteten betydeligt. På trods af lav effektivitet giver TEV-eluering meget specifik spaltning og genopretning af de ønskede kromatindomæner. Til sammenligning har denatureringeluering en elueringseffektivitet på mere end 90%, men kan eluere nogle ikke-specifikke DNA- eller proteinmolekyler fra perlerne. Derfor afhænger den valgte metode af den ønskede downstream-anvendelse af det isolerede materiale. For eksempel er denatureringseluering blevet påvist at muliggøre massespektrometrisk identifikation af de associerede kromatinfaktorer, mens native TEV-eluering foretrækkes til downstream-funktionelle assays såsom in vitro-transkriptions- eller replikationsassays. Figur 5 opsummerer de potentielle downstream-anvendelser af den beskrevne rensningsprotokol. Sammenfattende adresserer denne forbedrede arbejdsgang og yderst effektive metode til at studere kromatinsammensætningen af enkelte loci en langvarig udfordring inden for kromatinforskning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.

Acknowledgments

Arbejdet i S.H.-laboratoriet blev støttet af DFG gennem SFB1064 (projekt-ID 213249687), Det Europæiske Forskningsråd (ERC Starting Grant 852798 ConflictResolution) og Helmholtz Gesellschaft.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Yeast strains
Control Strain: MATa; ura3Δ0; leu2Δ0; his3Δ1; met15Δ0; bar1::kanMX4; Chr I 212kb::LEU2 pTEF2-LEXA-TAP pGAL1-10 RecR Section 1, see references 13 and 14
Recombination Strain: MATa; ura3Δ0; leu2Δ0; his3Δ1; met15Δ0; bar1::kanMX4; RS_LEXA_NS-3_ARS316_NS+3_RS; Chr I 212kb::LEU2 pTEF2-LEXA-TAP pGAL1-10 RecR Section 1, see reference 13 and 14
Plasmid
K238 plasmid Section 1, see reference 13
Storage: Store at -20 °C
K071 Spike-in plasmid DNA Section 7.1, see reference 13
Storage: Store at -20 °C
Reagents
Acetone Carl Roth 5025.1 Section 2
Storage: Store at room temperature
Ammonium acetate (NH4Ac) Sigma Aldrich A7262 Section 6 and 7.1
Storage: Store at room temperature
Ammonium solution (NH4OH) 25% Merck Millipore 533003 Section 6
Storage: Store at room temperature
Ammonium sulfate Santa Cruz Sc-29085 Section 2
Storage: Store at room temperature
Bacto agar BD (VWR) 90000-760 Section 3
Storage: Store at room temperature
Bacto peptone BD (VWR) 211820 Section 3
Storage: Store at room temperature
β-Mercaptoethanol Sigma Aldrich 07604 Section 7.2
Storage: Store at 4 °C
Chemiluminescent substrate kit ThermoFisher 34580 Section 7.2
Storage: Store at 4 °C
Di-Sodium Hydrogen phosphate dodecahydrate Merck 1.06579.1000 Section 2 and 7.1
Storage: Store at room temperature
Dithiothreitol (DTT) ThermoFisher 15508013 Section 4
Storage: Store at 4 °C
Ethanol Merck 100983 Section 7.1
Storage: Store at room temperature
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma Aldrich ED Section 7.1
Storage: Store at room temperature
Galactose (20% (w/v) stock) Sigma Aldrich G0625-1KG  /  5KG Section 3
Storage: Store at room temperature
Gel loading dye (6x) BioLabs B7024A Section 7.1
Storage: Store at -20 °C
Glusose Sigma-Aldrich G8270 Section
Storage: Store at room temperature
Glycine Carl Roth .0079.4 Section 2
Storage: Store at room temperature
Glycogen (5 mg/mL) Invitrogen AM9510 Section 7.1
Storage: Store at -20 °C
Hydrochloric acid (HCl) PanReac AppliChem 182109.1211 Section 2, 4 and 7.1
Storage: Store at room temperature
Magnesium Acetate (MgAc) Bernd Kraft 15274.2600/C035 Section 4
Storage: Store at room temperature
Magnesium chloride (MgCl2) Sigma Aldrich M8266 Section 6
Storage: Store at room temperature
Nu PAGE LDS sample buffer (4x) Invitrogen 2399549 Section 7.2
Storage: Store at room temperature
Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1 v/v) Invitrogen 15593-031 Section 7.1
Storage: Store at 4 °C
Potassium chloride (KCl) Sigma P9541 Section 4
Storage: Store at room temperature
Radioactively labeled α-32P dATP (3,000 Ci/mmol, 10 mCi/mL) Hartmann Analytic SRP-203 Section 7.1
Storage: Store at 4 °C
RadPrime labeling system ThermoFisher 18428-011 Section 7.1
Storage: Store at -20 °C
Raffinose (20% (w/v) stock) SERVA 34140.03 Section 3
Storage: Store at room temperature
Sodium chloride (NaCl) Merck K53710504142 Section 7.1
Storage: Store at room temperature
Sodium citrate (Na3C6H5O7) Sigma-Aldrich 71402 Section 7.1
Storage: Store at room temperature
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma Aldrich S5881 Section 7.1
Storage: Store at room temperature
Sodium n-dodecyl sulfate (SDS) (5% stock (w/v) ) Alfa Aesar A11183 Section 7.1
Storage: Store at room temperature
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich 71496 Section 2 and 7.1
Storage: Store at room temperature
Sodium azide Santa Cruz Biotechnology sc-208393 Section 2
Storage: Store at -20 °C
 Triethylamine Sigma Aldrich 90340 Section 2
Storage: Store at room temperature
Tris base Chem Cruz SC-3715B Section 2 and 4
Storage: Store at room temperature
Triton X-100 Sigma Aldrich X100 Section 2 and 4
Storage: Store at room temperature
Tween-20 Bernd Kraft 18014332 Section 4
Storage: Store at room temperature
Yeast extract BD (VWR) 212720 Section 3
Storage: Store at room temperature
Yeast mating factor alpha (1 µg/mL stock )  Biomol Y2016.5 Section 3
Storage: Store at -20 °C
Yeast Synthetic Drop-out medium Supplements without LEUCINE Sigma Aldrich Y1376 Section 1, see reference 14
Enzymes
HpaI restriction enzyme (5,000 U/mL) NEB R0105S Section 7.1
Storage: Store at -20 °C
Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100x) ThermoFisher Scientific 78446 Section 4
Storage: Store at4 °C
Proteinase K (10 mg/mL) SERVA 33756 Section 7.1
Storage: Store at -20 °C
RNase A (10 mg/mL)  ThermoFisher EN0531 Section 7.1
Storage: Store at -20 °C
TEV protease (10000 U/µL) NEB P8112S Section 5
Storage: Store at -20 °C
Materials
BcMag Epoxy-Activated Magnetic Beads Bioclone Inc. FC-102 Section 2
Storage: Store at 4 °C
Dry ice Section 4
Low-binding centrifuge tubes 2.0 mL Eppendorf 22431102 Section 4
Microspin G-25 Columns Cytiva 27-5325-01 Section 7.1
Storage: Store at room temperature
Parafilm Merck P7793 Section 4
Positive nylon membrane Biozol 11MEMP0001 Section 7.1
Storage: Store at room temperature
PVDF transfer membrane Immobilon-Merck Millipore IPVH00010 Section 7.2
Storage: Store at room temperature
SDS-PAGE gel 4-12% bis-tris (15 well, 1.5 mm) Invitrogen  NP0336BOX Section 7.2
Storage: Store at 4 °C
Syringe (25 mL) with luer fitting Henke Sass Wolf 4200-000V0 Section 3
Whatman paper (Grade 3MM CHR Cellulose Western Blotting Paper Sheet) Cytiva 3030-917 Section 7.1
Storage: Store at room temperature
Antibodies
Anti-LexA, rabbit polyclonal IgG, DNA binding region antibody Merck Millipore 06-719 Section 7.2
Storage: Store at -20 °C
Goat Anti-Rabbit IgG (H+L), Horseradish peroxidase conjugate Invitrogen G21234 Section 7.2
Storage: Store at -20 °C
Peroxidase Anti-Peroxidase (PAP) antibody produced in rabbit for the detection of TAP-tagged proteins Sigma Aldrich P1291-500UL Section 7.2
Storage: Store at -20 °C
Rabbit IgG antibodies Sigma I5006-100MG Section 2
Storage: Store at 4 °C
Primers (10 µM)
ARS316: fwd 5'- CGGCATTATCGTACACAACCT, rev 5'- GTTCTTCGTTGCCTACATTTTCT Section 7.1
K071 Spike-in plasmid DNA: fwd: 5'-TTTTCGCTGCTTGTCCTTTT, rev 5'- CATTTTCGTCCTCCCAACAT Section 7.1
PCR fragment from yeast genomic DNA as a template  for ARS316 amplification (for southern blot): fwd 5’- AAATTCTGCCCTTGATTCGT                                                  rev 5’- TTTGTTTATCTCATCACTAAT Section 7.1
PDC1: fwd 5'- CATGATCAGATGGGGCTTCA, rev 5'-ACCGGTGGTAGCGACTCTGT Section 7.1
Equipment
Coffee grinder Gastroback 42601 Section 4
Dewar flask NAL GENE 4150-2000 Section 3
DynaMag TM-2 magnetic rack Invitrogen 12321D Section 4, 5 and 6
Hybridization oven Hybaid Mini10 Ri418 Section 2
Microcentrifuge Eppendorf 5424R Section 4 and 7.1
UV-crosslinker Analytikjena 95-0174-02 Section 7.1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kornberg, R. D., Lorch, Y. Twenty-five years of the nucleosome, fundamental particle of the eukaryote chromosome. Cell. 98 (3), 285-294 (1999).
  2. Gauchier, M., van Mierlo, G., Vermeulen, M., Déjardin, J. Purification and enrichment of specific chromatin loci. Nature Methods. 17 (4), 380-389 (2020).
  3. Korthout, T., et al. Decoding the chromatin proteome of a single genomic locus by DNA sequencing. PLoS Biology. 16 (7), e2005542 (2018).
  4. Antão, J. M., Mason, J. M., Déjardin, J., Kingston, R. E. Protein landscape at Drosophila melanogaster telomere-associated sequence repeats. Molecular and Cellular Biology. 32 (12), 2170-2182 (2012).
  5. Déjardin, J., Kingston, R. E. Purification of proteins associated with specific genomic loci. Cell. 136 (1), 175-186 (2009).
  6. Ide, S., Dejardin, J. End-targeting proteomics of isolated chromatin segments of a mammalian ribosomal RNA gene promoter. Nature Communications. 6, 6674 (2015).
  7. Unnikrishnan, A., Gafken, P. R., Tsukiyama, T. Dynamic changes in histone acetylation regulate origins of DNA replication. Nature Structural & Molecular Biology. 17 (4), 430 (2010).
  8. Buxton, K. E., et al. Elucidating protein-DNA interactions in human alphoid chromatin via hybridization capture and mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 16 (9), 3433-3442 (2017).
  9. Kennedy-Darling, J., et al. Discovery of chromatin-associated proteins via sequence-specific capture and mass spectrometric protein identification in Saccharomyces cerevisiae. Journal of Proteome Research. 13 (8), 3810-3825 (2014).
  10. Liu, S. J., et al. CRISPRi-based genome-scale identification of functional long noncoding RNA loci in human cells. Science. 355, 7111 (2017).
  11. Hamperl, S., et al. Purification of specific chromatin domains from single-copy gene loci in Saccharomyces cerevisiae. Functional Analysis of DNA and Chromatin. 1094, 329-341 (2014).
  12. Hamperl, S., et al. Compositional and structural analysis of selected chromosomal domains from Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 42 (1), 2 (2014).
  13. Weiβ, M. Single-copy locus proteomics of early- and late-firing DNA replication origins identifies a role of Ask1/DASH complex in replication timing control. Cell Reports. 42 (2), 112045 (2023).
  14. Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nature Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).
  15. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  16. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  17. Western blot membrane stripping for restaining protocol. Abcam. , Available from: https://www.abcam.com/protocols/western-blot-membrane-stripping-for-restaining-protocol (2023).
  18. Vermeulen, M., Déjardin, J. Locus-specific chromatin isolation. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 21 (5), 249-250 (2020).

Tags

Denne måned i JoVE udgave 201 Indfødt kromatin enkelttrins affinitetsoprensning stedspecifik rekombination histonmodifikationer locus-specifik proteomics kromatinbiokemi
Enkelt-kopi gen locus kromatin oprensning i <em>Saccharomyces cerevisiae</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sajid, A., Hamperl, S. Single-Copy… More

Sajid, A., Hamperl, S. Single-Copy Gene Locus Chromatin Purification in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (201), e65460, doi:10.3791/65460 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter