Summary
הפרוטוקול הנוכחי מתאר השגת הקשר לחץ-נפח באמצעות קצב טרנס-וושט, המשמש כלי רב ערך בהערכת תפקוד דיאסטולי במודלים עכבריים של אי ספיקת לב.
Abstract
אי ספיקת לב עם מקטע פליטה שמור (HFpEF) הוא מצב המאופיין בתפקוד דיאסטולי וחוסר סובלנות לפעילות גופנית. בעוד שניתן להשתמש בבדיקות המודינמיות או MRI ללחץ גופני כדי לזהות תפקוד דיאסטולי לקוי ולאבחן HFpEF בבני אדם, שיטות כאלה מוגבלות במחקר בסיסי באמצעות מודלים של עכברים. מבחן אימון הליכון משמש בדרך כלל למטרה זו בעכברים, אך תוצאותיו יכולות להיות מושפעות ממשקל הגוף, כוח שרירי השלד והמצב המנטלי. במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול קצב פרוזדורים כדי לזהות שינויים תלויי דופק (HR) בביצועים דיאסטוליים ולאמת את התועלת שלו במודל עכבר של HFpEF. השיטה כוללת הרדמה, אינטובציה וביצוע ניתוח לולאת נפח לחץ (PV) במקביל לקצב פרוזדורים. בעבודה זו הוכנס צנתר הולכה בגישה אפית של החדר השמאלי, וצנתר קצב פרוזדורים הוכנס לוושט. לולאות PV בסיסיות נאספו לפני שהדופק הואט עם ivabradine. לולאות PV נאספו ונותחו במרווחים של HR הנעים בין 400 פעימות לדקה עד 700 פעימות לדקה באמצעות קצב פרוזדורים. באמצעות פרוטוקול זה, הדגמנו בבירור ליקוי דיאסטולי תלוי HR במודל HFpEF המושרה מטבולית. הן קבוע זמן ההרפיה (Tau) והן יחסי הלחץ-נפח הדיאסטולי הסופי (EDPVR) החמירו ככל שהדופק גדל בהשוואה לעכברי ביקורת. לסיכום, פרוטוקול מבוקר קצב פרוזדורים זה שימושי לאיתור הפרעות לב תלויות HR. הוא מספק דרך חדשה לחקור את המנגנונים הבסיסיים של תפקוד דיאסטולי במודלים של עכברי HFpEF ועשוי לסייע בפיתוח טיפולים חדשים למצב זה.
Introduction
אי ספיקת לב מהווה גורם מוביל לאשפוזים ומוות ברחבי העולם, ואי ספיקת לב עם מקטע פליטה משומר (HFpEF) מהווה כ-50% מכלל האבחנות של אי ספיקת לב. HFpEF מאופיין בתפקוד דיאסטולי לקוי וסובלנות גופנית לקויה, ואת ההפרעות ההמודינמיות הקשורות, כגון תפקוד דיאסטולי, ניתן לזהות בבירור באמצעות בדיקות המודינמיות לחוצות פעילות גופנית או סריקות MRI 1,2.
במודלים ניסיוניים, לעומת זאת, השיטות הזמינות להערכת הפרעות פיזיולוגיות הקשורות ל- HFpEF מוגבלות 3,4. בדיקת התעמלות הליכון (TMT) משמשת לקביעת זמן ומרחק ריצה, אשר עשויים לשקף המודינמיקה לבבית במאמץ גופני; עם זאת, שיטה זו רגישה להפרעות ממשתנים חיצוניים כגון משקל הגוף, כוח שרירי השלד והמצב המנטלי.
כדי לעקוף מגבלות אלה, פיתחנו פרוטוקול קצב פרוזדורים המזהה שינויים עדינים אך מכריעים בביצועים דיאסטוליים בהתבסס על קצב הלב (HR) ותיקפנו את התועלת שלו במודל עכבר של HFpEF5. מספר גורמים פיזיולוגיים תורמים לתפקוד הלב הקשור לפעילות גופנית, כולל תגובת העצב הסימפתטי והקטכולאמין, הרחבת כלי הדם ההיקפיים, תגובת האנדותל וקצב הלב6. בין אלה, עם זאת, הקשר HR-לחץ (המכונה גם אפקט Bowditch) ידוע כקובע קריטי של תכונות פיזיולוגיות לב 7,8,9.
הפרוטוקול כולל ביצוע ניתוח קונבנציונלי של נפח לחץ בנקודת ההתחלה כדי להעריך את הפונקציה הסיסטולית והדיאסטולית, כולל פרמטרים כגון קצב התפתחות הלחץ (dp/dt), יחסי לחץ-נפח סיסטולי סופי (ESPVR) ויחסי לחץ-נפח קצה דיאסטולי (EDPVR). עם זאת, יש לציין כי פרמטרים אלה מושפעים HR, אשר יכול להשתנות בין בעלי חיים בשל הבדלים בקצב הלב הפנימי שלהם. בנוסף, יש לקחת בחשבון גם את השפעות ההרדמה על משאבי אנוש. כדי להתמודד עם זה, HR היה סטנדרטי על ידי מתן קצב פרוזדורים במקביל עם ivabradine, ומדידות פרמטרים לבביים בוצעו בקצב לב מצטבר. יש לציין כי תגובת הלב תלוית HR הבדילה עכברי HFpEF מעכברי קבוצת הביקורת, בעוד שלא נצפו הבדלים משמעותיים במדידות לולאת PV הבסיסית (באמצעות קצב הלב הפנימי)5.
בעוד פרוטוקול קצב זה עשוי להיראות מסובך יחסית, שיעור ההצלחה שלו עולה על 90% כאשר הוא מובן היטב. פרוטוקול זה יספק דרך שימושית לחקור את המנגנונים הבסיסיים של תפקוד דיאסטולי במודלים של עכברי HFpEF ויעזור בפיתוח טיפולים חדשים למצב זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פרוטוקול זה של בעלי חיים אושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים ופעל בהתאם לתקנות לניסויים בבעלי חיים ופעילויות קשורות באוניברסיטת טוקיו. במחקר הנוכחי נעשה שימוש בעכברי C57/Bl6J זכרים בני 8-12 שבועות. בעלי החיים התקבלו ממקור מסחרי (ראו טבלת חומרים). מודל של HFpEF הוקם על ידי מתן דיאטה עתירת שומן במשך 15 שבועות בשילוב עם NG-nitro-L-arginine methyl ester, כפי שתואר קודם10.
1. תכשירי קטטר וכיול לחץ/נפח
- מניחים צנתר מוליך במי מלח רגילים, ומחברים אותו למודול המורכב מ-PowerLab 8/35 ומיחידת נפח לחץ (מודול MPVS, ראה טבלת חומרים).
- כיול אלקטרוני של הלחץ והנפח באמצעות הקלטה של לחץ קבוע מראש (0 מ"מ כספית ו- 100 מ"מ כספית) ופרמטרי נפח (אלה משתנים בין מודולי MPVS) במודול MPVS 3,11 (ראה גם הוראות היצרן).
2. הכנת בעל חיים לצנתור
- הרדמה והנשמה
- יש לבצע זריקה תוך צפקית של 5 מ"ג/ק"ג אטומידאט ו-500 מ"ג/ק"ג אורתן (ראו טבלת חומרים) 5-10 דקות לפני אינטובציה.
הערה: אורתאן, למרות יעילותו כחומר הרדמה במחקרים בבעלי חיים, חשוד כמסרטן בבני אדם. לכן, כאשר אורתן נחוץ להשגת מטרות הניסוי ואין די בחומרים חלופיים, יש לטפל בו בזהירות. אמצעי הגנה מתאימים, כגון לבישת כפפות ומסכות ושימוש במכסה אדים במהלך ההכנה, הם חובה. כחלופה אפשרית, קטמין (80 מ"ג / ק"ג, ip) עשוי להיות מועסק. - הניחו את העכבר בתא הרדמה שהיה רווי בעבר באיזופלורן 2%, והעבירו את בעל החיים לכרית חימום שחוממה מראש ונשמרה בין 38°C ל-40°C עם השראת ההרדמה.
- יש לגלח את אזור הניתוח. לאחר מכן, לחטא את אתר הניתוח עם שלושה סיבובים לסירוגין של betadine ואלכוהול.
- בצע חתך אופקי (1-2 ס"מ) בצוואר, הבלו את שריר קנה הנשימה, ולחשוף את קנה הנשימה. מעבירים תפר משי כירורגי 2-0 מתחת לקנה הנשימה, מרימים אותו ומבצעים חתך קטן (1-2 מ"מ) כדי לפתוח אותו.
- הכניסו צינור אנדוטרכאלי לקנה הנשימה, וחברו אותו למכונת הנשמה המספקת תערובת של 100% חמצן ו-2% איזופלורן (מופחת ל-0.5% עד 1% מאוחר יותר).
- יש לבצע זריקה תוך צפקית של 5 מ"ג/ק"ג אטומידאט ו-500 מ"ג/ק"ג אורתן (ראו טבלת חומרים) 5-10 דקות לפני אינטובציה.
- החדרת צנתר ורידי מרכזי (CV) והזרקת נוזלים
- אתר את הווריד הצווארי הפנימי מתחת לשריר sternocleidomastoid3.
- הכנס את הצנתר הוורידי המרכזי, המורכב מצינורית סילסטית PE-10 (ראה טבלת חומרים) המחוברת למחט 30 גרם, לתוך וריד הצוואר.
- יש לתת עירוי בולוס של 5-6 מיקרוליטר/גרם של משקל גוף של 10% אלבומין/NaCl במשך 3 דקות, ואחריו קצב עירוי קבוע של 5-10 מיקרוליטר/דקה.
הערה: שלב זה חיוני למניעת לחץ דם נמוך הנובע מהרחבת כלי הדם ההיקפיים הנגרמת על ידי ההרדמה. וריד הצוואר הפנימי ממוקם בין שריר הסטרנוקלידומסטואיד לעורק התרדמה, והוא נראה בצבע כהה יותר מהעורק.
3. הליך כירורגי לצנתור חדר שמאל (גישת חזה פתוח)
- לגלח את האזור הכירורגי של העכבר המורדם. לאחר מכן, לחטא את אתר הניתוח עם שלושה סיבובים לסירוגין של betadine ואלכוהול.
- אשר את עומק ההרדמה על ידי ביצוע צביטת בוהן. לאחר מכן, לבצע חתך אופקי (2-3 ס"מ) מתחת לתהליך xiphoid, ולהפריד את העור מקיר החזה באמצעות מספריים קהה.
- חותכים את דופן בית החזה לרוחב משני הצדדים באמצעות צריבה חשמלית (ראה טבלת חומרים).
- לחשוף את הלב על ידי חיתוך דרך הסרעפת, ולהסיר את קרום הלב בעדינות מהלב באמצעות מלקחיים.
- יש להחדיר מחט 27 גרם לקודקוד החדר השמאלי (LV), ולהחדיר לאחור קטטר מוליך לתוך ה-LV דרך חור הנקב.
- כוונן את מיקום הצנתר כך שתתקבל לולאת לחץ-נפח בצורת ריבוע.
- ודא שהקטטר אינו בא במגע עם השריר הפפילרי כאשר מתרחשים שינויים בתנאי העמסה על ידי בדיקת צורת לולאת ה- PV במהלך חסימת הווריד הנבוב התחתון (IVC).
הערה: חשיפה נאותה ללב מקלה על ההליך ומסייעת לקבל תצוגה ברורה.
4. הקלטת נתוני לולאת PV וקביעת יחסי לחץ-נפח קצה-סיסטולי (ESPVR) ויחסי לחץ-נפח קצה דיאסטולי (EDPVR)
הערה: הפחתת הטעינה מראש על-ידי חסימת IVC מאפשרת לקבוע את ESPVR ו-EDPVR.
- הקלט ונתח את לולאת נפח הלחץ הבסיסית (PV) באמצעות תוכנת LabChart (ראה טבלת חומרים), PowerLab ומודול MPVS לאחר ייצוב אות (5-10 דקות לאחר קנולציה).
- בצע חסימת IVC על ידי דחיסת IVC עם מלקחיים, ורשום את לולאת PV במשך לפחות 20 מחזורי לב במהלך חסימת IVC. קבע את ESPVR על ידי התאמת קו רגרסיה ליניארי דרך נקודות הקצה הסיסטוליות של לולאת ה- PV וה- EDPVR על ידי התאמת קו עקלקל דרך הנקודות הדיאסטוליות הסופיות של לולאת ה- PV באמצעות תוכנת LabChart.
הערה: יש להפסיק את מכונת ההנשמה במהלך חסימת IVC כדי למנוע ממצאים בתנועת הריאות. חומר משותק כמו פנקורוניום (0.5-1 מ"ג / ק"ג) עשוי להיות מועיל כאשר תנועת הריאות מוגזמת ויש להשתמש בו רק לאחר אישור מטוס הרדמה יציב.
5. קצב טרנס-וושט
- הכנס צנתר אלקטרודה טטרה-פולרי 2-Fr לוושט, חבר את הצנתר לממריץ דופק (ראה טבלת חומרים), וקבע את סף לכידת הפרוזדורים (בדרך כלל, משרעת הגירוי היא 3 mA, ורוחב הדופק הוא 1 ms).
- האט את הדופק מתחת ל-400 פעימות לדקה באמצעות 20 מ"ג/ק"ג איבאברדין (ראה טבלת חומרים) הניתנים תוך צפקית.
- לאחר הייצוב, רכשו 20 מחזורי לב רצופים של לולאות PV בקצב שונה מ-400 פעימות לדקה עד 700 פעימות לדקה, עם תוספת של 100 פעימות לדקה; לרכוש את המחזורים מעל 5 דקות בכל קצב קצב.
6. כיול מי מלח וכיול זרימת אבי העורקים
- יש להשבית את מכונת ההנשמה, ולתת 5-10 מיקרוליטר של תמיסת מלח היפרטונית דרך הווריד דרך צנתר CV.
- תעד את התנודות בלחץ ובנפח במהלך הזרקת המלח, וחשב את ערך ה- VP באמצעות PowerLab 3,11.
- חזור על כיול המלח כדי לשפר את הדיוק ואת יכולת השחזור.
- סובב את העכבר לצדו השמאלי כדי לא להפריע לאות עוצמת הקול.
- בצע כריתת בית החזה הצידית בין Th3 ל-Th5 לכיוון עמוד השדרה, וחתך בעדינות חלק קטן מאבי העורקים היורד בעזרת מלקחיים.
- הניחו בדיקת זרימת כלי דם (ראו טבלת חומרים) מעל אבי העורקים כדי למדוד את תפוקת הלב.
הערה: החישוב המדויק של הנפח המוחלט דורש שימוש בשני סוגים של כיול: כיול מי מלח וכיול זרימת אבי העורקים. חשוב להכיר את הסיכונים הפוטנציאליים הקשורים לעירוי מלח היפרטוני אצל נבדקים בבעלי חיים, שכן העמסת מלח מוגזמת עלולה לגרום לירידה בהתכווצות.
7. המתת חסד
- לאחר המחקר, יש להרדים את העכברים תחת מנת יתר של חומר הרדמה באמצעות פריקת צוואר הרחם.
הערה: כדי להבטיח הפסקה מוחלטת של תפקוד חיוני, משתמשים בשיטה משנית של המתת חסד, כגון exsanguination תחת הרדמה עם קצירת רקמת הלב לאחר מכן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
נתוני לולאת PV הבסיסית מוצגים באיור 1 ובטבלה 1. בתחילת המחקר (בהיעדר קצב), לא היו הבדלים משמעותיים בפרמטרים דיאסטוליים כגון קבוע זמן ההרפיה (Tau), קצב השינוי המינימלי בלחץ (dP/dt min) ו-EDPVR בין עכברי הבקרה לעכברי HFpEF. אולם עכברי HFpEF הפגינו לחץ דם גבוה יותר ואלסטיות עורקים (Ea), כפי שמוצג באיור 1, והדגימו לולאת PV טיפוסית בצורת הר במהלך סיסטולה חדרית. יש להבדיל זאת מזינוק שנגרם על-ידי מגע ישיר של שריר החדר במתמר הלחץ (איור 2). חשוב לציין שבאמצעות שימוש בקצב פרוזדורים ניתן היה להבחין בבירור בין התפקוד הדיאסטולי בין עכברי הביקורת לבין עכברי HFpEF5 (איור 3 ואיור 4). בקבוצת הביקורת, הן ה-Tau והן ה-EDPVR השתפרו ככל שקצב הקצב עלה, בעוד שבקבוצת HFpEF, גם ה-Tau וגם ה-EDPVR החמירו ככל שהדופק גדל עם קצב פרוזדורים.
איור 1: יחסי לחץ-נפח מייצגים בנקודת ההתחלה בהיעדר קצב, המתוארים בצילום מסך. התוצאות הראו כי עכברי HFpEF הפגינו אלסטיות עורקים ולחץ חדרי גבוהים יותר בהשוואה לעכברי הביקורת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: תמונה מייצגת של לולאת PV בצורת ספייק. סוג זה של צורת לולאת PV הוא תוצאה של דחיסה ישירה של מתמר הלחץ על ידי שריר החדר (מוצג על ידי ראש החץ הכתום) ויש להוציא אותו מהניתוח כדי לשמור על דיוק בתוצאות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: תרשים מייצג הממחיש את ההבדלים בפרמטרים המודינמיים בתגובה לקצב פרוזדורים בין עכברי מודל אי ספיקת לב עם מקטע פליטה שמור (HFpEF) לבין עכברי הביקורת. התרשים מבחין בבירור בין שתי הקבוצות, כאשר HR נע בין 400 פעימות לדקה ל -700 פעימות לדקה. קיצורים: LVP = לחץ החדר השמאלי; dP/dt = הנגזרת הראשונה של LVP; EDPVR = יחסי לחץ-נפח דיאסטוליים סופיים; LVV = נפח החדר השמאלי; טאו = זמן הרפיה קבוע. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: התגובה ההמודינמית של הפרמטרים הדיאסטוליים מניתוח לולאת לחץ-נפח המתוארת במונחים של קצב הלב (HR). בעכברי מודל HFpEF, התפקוד הדיאסטולי (Tau ו- EDPVR) הידרדר ככל שקצב הלב עלה במהלך קצב פרוזדורים. ניתוח ANOVA הדו-כיווני הראה השפעה עיקרית משמעותית של HFpEF (F = 28.95, p < 0.001) ו- HR (F = 3.035, p = 0.08644) על EDPVR, כמו גם אפקט אינטראקציה משמעותי בין הקבוצה לקצב הלב (F = 3.938, p = 0.02454). עבור טאו, הייתה השפעה משמעותית של קבוצה (F = 25.56, p < 0.001) ו- HR (F = 0.1088, p = 0.7425), כמו גם אפקט אינטראקציה משמעותי בין הקבוצה לקצב הלב (F = 3.461, p = 0.03759 ). הנתונים מוצגים כממוצע ± שגיאת תקן. n = 6 עכברים/קבוצה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: המחשה מייצגת של הליך כיול מי מלח. עירוי של מי מלח היפרטוניים משנה את המוליכות החשמלית של הדם, ובכך מאפשר חישוב של רכיב האות המיוחס לרקמת הלב שמסביב. לחץ הדם צריך להישאר יציב במהלך הזריקה, עם עלייה קלה בנפח (מוצג בחץ הכתום). קיצורים: LVP = לחץ החדר השמאלי; LVV = נפח החדר השמאלי לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: המחשה מייצגת של המיקום הנכון של צנתר הקצב הטרנס-וושט. המיקום הנכון של צנתר הקצב הטרנס-וושט מאפשר קצב QRS צר. החיצים הכחולים מתארים קצב סינוס רגיל, והחצים האדומים מראים את קצב הפרוזדורים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: תמונה מייצגת של משרעת גירוי שהותאמה באופן שגוי בקצב פרוזדורים, וכתוצאה מכך לולאת נפח לחץ מעוותת. עוצמת הגירוי גרמה לתוצרי תנועה לא רצויים באות המוליך, המתואר כלולאת PV עם קו רועד (מסומן על ידי החיצים). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
| שליטה (n = 10) | HFpEF (n = 10) | ערך P | |
| CO (מיקרוליטר/דקה) | 12436.8 ± 938.4 | 10923.5 ± 1032.7 | 0.2897 |
| SV (μL) | 38 ± 1.85 | 23.0 ± 1.88 | 0.2515 |
| Ved (μl) | 60.5 ± 3.45 | 54.7 ± 1.32 | 0.4242 |
| Pes (mmHg) | 95.8 ± 3.56 | 109.3 ± 1.74 | 0.00032* |
| פד (mmHg) | 6.16 ± 1.53 | 6.95 ± 1.22 | 0.6889 |
| HR (פעימה/דקה) | 532.2 ± 20.8 | 534.0 ± 13.9 | 0.9505 |
| EF (%) | 107 ± 2.95 | 63.68 ± 2.37 | 0.4718 |
| Ea (mmHg/μL) | 4.02 ± 0.30 | 5.90 ± 0.72 | 0.03224* |
| dP/dt מקסימום (mmHg/s) | 10812.1 ± 1042.9 | 9481.1 ± 262.02 | 0.2444 |
| dP/dt מינימום (mmHg/s) | -9540.7 ± 748.9 | -9003.9 ± 320.0 | 0.5177 |
| טאו (ms) | 7.30 ± 0.50 | 8.02 ± 0.39 | 0.268 |
| ESPVR (mmHg/μL) | 3.41 ± 0.51 | 4.69 ± 0.41 | 0.09147 |
| EDPVR (mmHg/μL) | 0.096 ± 0.0061 | 0.103 ± 0.013 | 0.6103 |
טבלה 1: פרמטרים בסיסיים של הלב בעכברי הבקרה ובעכברי HFpEF. הנתונים מוצגים כממוצע ± שגיאת תקן; *p < 0.05 לעומת בקרה על ידי T-test.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אנו מציגים מתודולוגיה להערכת יחסי לחץ-נפח עם יישום של קצב טרנס-וושט. אי סבילות לפעילות גופנית היא אחד המאפיינים העיקריים של HFpEF, אך אין טכניקות זמינות להערכת תפקוד הלב בעכברים במהלך פעילות גופנית. פרוטוקול הקצב שלנו מציע כלי רב ערך לאיתור תפקוד דיאסטולי, שאולי לא נראה לעין בתנאי מנוחה.
כדי להשיג לולאת PV באיכות מדויקת ועקבית, יש לבצע בקפדנות את השלבים הבאים 3,4,5,7,8,11,12,13,14: (1) יש להרדים את בעלי החיים בזהירות, ולשמור על טמפרטורת גוף עקבית של 37-37.5 מעלות צלזיוס באמצעות כרית חימום; (2) יש להנחיל את בעלי החיים כראוי, ולשלוט ביעילות על האוורור; (3) יש להבטיח את מיקומה התקין של הגישה לעירוי; (4) צנתר ההולכה חייב להיות ממוקם כראוי בתוך ה-LV; (5) יש למקם את הצנתר הטרנס-ושט באופן מושכל, ולהבטיח קצב מתאים; 6) מערכת איסוף הנתונים חייבת להיות מחוברת בזהירות, ויש להתאים את ערכי הרווח והקיזוז בהתאם; (7) יש לכייל את אותות ההולכה באמצעות מי מלח היפרטוניים; (8) יש לוודא מדידה נאותה של זרימת אבי העורקים באמצעות בדיקת זרימה; (9) יש לפקח ברציפות על רווחתם של בעלי החיים לאורך כל ההליך כדי למזער כל חפץ הנגרם על ידי לחץ או תנועה.
מיטוב מינון ההרדמה הוא חיוני להשגת לולאת PV ניתנת לשחזור ואיכותית בעכברים. בדרך כלל, מינון של 800 מ"ג / ק"ג של אורתן ו 5-10 מ"ג / ק"ג של אטומידאט מנוהל. עם זאת, במקרים של אי ספיקת לב פתולוגית, מומלץ לנהל מינון נמוך יותר של הרדמה. במהלך ההליך, חיוני לשמור על טמפרטורת גוף חמה של 37-38 מעלות צלזיוס על ידי הנחת בעדינות את החיה המורדמת על כרית חימום. זה חשוב במיוחד עבור עכברים מכיוון שירידה בטמפרטורת הגוף יכולה לגרום לירידה משמעותית בדופק. בנוסף, חשיפה נאותה של הלב היא חיונית כדי לקבל תצוגה ברורה ולהקל על ההליך. במקרים מסוימים, חיתוך הצלעות ה-12 עד ה-11 יכול לסייע בחשיפת הלב.
תהליך האינטובציה צריך להתבצע בזהירות כדי למנוע נזק לעורקי התרדמה ולעצבים התועים ליד קנה הנשימה. יש להתאים את הגדרת מכונת ההנשמה בהתאם למשקל הגוף של בעל החיים באמצעות הנוסחאות המסופקות3:
נפח גאות ושפל (Vt, mL) = 6.2 × W1.01 (W = משקל גוף, ק"ג)
קצב נשימה (RR, min−1) = 53.5 × W−0.26
לדוגמה, Vt = 149.4 μL, RR = 140/min בעכבר של 25 גרם.
לפני הקנולציה, הצנתר הוורידי (עם מחט 30 גרם) חייב להיות מוכן במלואו עם 10% אלבומין ולהחדיר לתוך הווריד בזווית רדודה כדי למנוע קריעה של דפנות הווריד השבירות. המיקום הנכון של צנתר ההולכה בתוך החדר השמאלי (LV) הוא בעל חשיבות עליונה להשגת תוצאות מדויקות. הצנתר צריך להיות מיושר עם ציר האורך LV, כאשר כל האלקטרודות ממוקמות בין מערכת זרימת LV לבין הגבול האנדוקרדיאלי האפיקאלי. יש לקבל לולאת PV יציבה ללא חריצים לאורך כל ההליך, כולל במהלך חסימה תוך ורידית, כיול מלח היפרטוני וקצב טרנס-ושט. בכיול מי מלח, לחצי ה-LV צריכים להיות יציבים במהלך הזרקת המלח ההיפרטונית, והפעימות במהלך שלב השטיפה הראשוני של אותות נפח עולה משמשות (איור 5). יש להיזהר שלא להזריק כמויות של מי מלח היפרטוניים הגבוהים מ-20 מיקרוליטר מכיוון שמלח היפרטוני יכול בקלות לדכא את תפקוד הלב על ידי עומס נפח. יש לוודא שצנתר הקצב המוחדר דרך הוושט נמצא במיקום הנכון באמצעות לכידת פרוזדורים (איור 6), ומשרעת הגירוי צריכה להיות מותאמת כראוי (בדרך כלל 3 mA, עם רוחב פולס של 1ms). גירוי חזק יותר ישפיע על צנתר ההולכה ויגרום ללולאת PV בצורת רעד (איור 7).
חישוב מדויק של הנפח המוחלט דורש שימוש בשני סוגי כיול: כיול מי מלח וכיול זרימת אבי העורקים. טכניקת צנתר ההולכה מחייבת הערכה של קיזוז המוליכות המקבילית (Vp) כדי להסביר את המוליכות הנמדדת לא רק ממאגר הדם בתוך חלל החדר אלא גם מהמבנים הסובבים אותו. הערכה זו יכולה להתבצע באמצעות מתן עירוי בולוס מלח היפרטוני. כיול זרימת אבי העורקים מאפשר מדידה ישירה של זרימת אבי העורקים, שבתורה מאפשרת לקבוע את נפח הקו המוחלט. עם זאת, יש לציין כי כיול זה מספק רק את נפח השבץ המוחלט ולא את נפח החדר המוחלט. כדי לקבל את נפח החדר המוחלט, יש לבצע הן כיול מלוחים והן כיול אבי העורקים.
ישנן כמה מגבלות לשיטה זו. ראשית, נעשה שימוש בגישה טרנסאפית בעת החדרת צנתר ההולכה. כדי לגשת לקודקוד LV, יש להסיר את קרום הלב. זה יכול להשפיע על הפרמטרים הדיאסטוליים, במיוחד ברפואת ילדים. שנית, חלק מהדם עלול ללכת לאיבוד במהלך זמן ההליך הארוך, מה שעלול להשפיע גם על הפרמטרים התפקודיים של הלב, אך ניתן להימנע מבעיות אלה על ידי הגברת הבקיאות בהליכים. ראוי לציין כי מודל HFpEF המשמש בפרוטוקול זה אינו משכפל לחלוטין HFpEF אנושי, שהיא תסמונת עם מספר פנוטיפים בהתאם לתחלואה הנלווית הקשורה, כגון השמנת יתר, סוכרת, יתר לחץ דם, פרפור פרוזדורים או אי ספיקת איברים מרובים. אין מודל עכברים זמין המחקה את כל התחלואה הנלווית הזו. מודל עכברי HFpEF בעל מכה כפולה, לעומת זאת, רלוונטי ביותר ל- HFpEF אנושי עם תחלואה נלווית מטבולית10. הרקע הגנטי של העכברים עלול להשפיע על התפקוד הדיאסטולי. בעוד שעכברי C57BL/6J דווחו כבעלי תגובות דיפרנציאליות ללחץ קרדיווסקולרי ופנוטיפ מחלה שעשוי להיות קל יותר בהשוואה לעכברי C57BL/6N, פרוטוקול זה זיהה ליקוי דיאסטולי במודל שתי פגיעות אפילו ברקע C57BL/6J5, מה שעשוי להיות קשה עם שיטות אחרות המשמשות בדרך כלל בעכברים.
כתב יד זה נועד לספק הדרכה לביצוע הליכי לולאת PV הקשורים לקצב ביעילות, אשר יכולים להיות מועילים בהערכת תפקוד הלב הקשור ל- HR וקידום המחקר על אי ספיקת לב.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענקי מחקר מקרן פוקודה לטכנולוגיה רפואית (ל- E.T. ו- G. N.) ומענק המחקר המדעי JSPS KAKENHI 21K08047 (ל- E.T).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-0 silk suture, sterlie | Alfresa Pharma Corporation, Osaka, Japan | 62-9965-57 | Surgical Supplies |
| 2-Fr tetrapolar electrode catheter | Fukuda Denshi, Japan and UNIQUE MEDICAL, Japan | custom-made | Surgical Supplies |
| Albumin Bovine Serum | Nacalai Tesque, Inc., Kyoto, Japan | 01859-47 | Miscellaneous |
| C57/BI6J mouse | Jackson Laboratory | animals | |
| Conductance catheter | Millar Instruments, Houston, TX | PVR 1035 | |
| Electrical cautery, Electrocautery Knife Kit | ellman-Japan,Osaka, Japan | 1-1861-21 | Surgical Supplies |
| Etomidate | Tokyo Chemical Industory Co., Ltd., Tokyo Japan | E0897 | Anesthetic |
| Grass Instrument S44G Square Pulse Stimulator | Astro-Med, West Warwick, RI | Pacing equipment | |
| Isoflurane | Viatris Inc., Tokyo, Japan | 8803998 | Anesthetic |
| Ivabradine | Tokyo Chemical Industory Co., Ltd., Tokyo Japan | I0847 | Miscellaneous |
| LabChart software | ADInstruments, Sydney, Australia | LabChart 7 | Hemodynamic equipment |
| MPVS Ultra | Millar Instruments, Houston, TX | PL3516B49 | Hemodynamic equipment |
| Pancronium bromide | Sigma Aldrich Co., St. Louis, MO | 15500-66-0 | Anesthetic |
| PE10 polyethylene tube | Bio Research Center Co. Ltd., Tokyo, Japan | 62101010 | Surgical Supplies |
| PowerLab 8/35 | ADInstruments, Sydney, Australia | PL3508/P | Hemodynamic equipment |
| PVR 1035 | Millar Instruments, Houston, TX | 842-0002 | Hemodynamic equipment |
| Urethane (Ethyl Carbamate) | Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan | 050-05821 | Anesthetic |
| Vascular Flow Probe | Transonic, Ithaca, NY | MA1PRB | Surgical Supplies |
References
- Backhaus, S. J. Exercise stress real-time cardiac magnetic resonance imaging for noninvasive characterization of heart failure with preserved ejection fraction. Circulation. 143 (15), 1484-1498 (2021).
- Borlaug, B. A., Nishimura, R. A., Sorajja, P., Lam, C. S. P., Redfield, M. M. Exercise hemodynamics enhance diagnosis of early heart failure with preserved ejection fraction. Circulation. Heart Failure. 3 (5), 588-595 (2010).
- Pacher, P., Nagayama, T., Mukhopadhyay, P., Bátkai, S., David, A. Measurement of cardiac function using pressure-volume conductance catheter technique in mice and rats. Nature Protocols. 3 (9), 1422-1434 (2008).
- Cingolani, O. H., Kass, D. A. Pressure-volume relation analysis of mouse ventricular function. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 301 (6), 2198-2206 (2011).
- Numata, G., et al. A pacing-controlled protocol for frequency-diastolic relations distinguishes diastolic dysfunction specific to a mouse HFpEF model. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 323 (3), H523-H527 (2022).
- Piña, I. L., et al.
- Georgakopoulos, D., Kass, D. A. Minimal force-frequency modulation of inotropy and relaxation of in situ murine heart. Journal of Physiology. 534 (2), 535-545 (2001).
- Takimoto, E., et al. Frequency- and afterload-dependent cardiac modulation in vivo by troponin I with constitutively active protein kinase A phosphorylation sites. Circulation Research. 94 (4), 496-504 (2004).
- Meyer, M., Lewinter, M. M. Heart rate and heart failure with preserved ejection fraction: Time to slow β-blocker use? Circulation. Heart Failure. 12 (8), 006213 (2019).
- Schiattarella, G. G., et al. Nitrosative stress drives heart failure with preserved ejection fraction. Nature. 568 (7752), 351-356 (2019).
- Abraham, D., Mao, L. Cardiac pressure-volume loop analysis using conductance catheters in mice. Journal of Visualized Experiments. (103), e52942 (2015).
- Zhang, B., Davis, J. P., Ziolo, M. T. Cardiac catheterization in mice to measure the pressure volume relationship: Investigating the Bowditch effect. Journal of Visualized Experiments. (100), e52618 (2015).
- Townsend, D. W. Measuring pressure volume loops in the mouse. Journal of Visualized Experiments. (111), e53810 (2016).
- Georgakopoulos, D., Kass, D. A. Estimation of parallel conductance by dual-frequency conductance catheter in mice. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 279 (1), H47 (2000).
