Summary
Degenerativa ögonsjukdomar som påverkar ögats retinala pigmentepitelskikt har monogent och polygent ursprung. Flera sjukdomsmodeller och en mjukvaruapplikation, LipidUNet, har utvecklats för att studera sjukdomsmekanismer, liksom potentiella terapeutiska ingrepp.
Abstract
Retinal pigmentepitel (RPE) är ett monolager av sexkantiga celler som ligger på baksidan av ögat. Det ger näring och stöd till fotoreceptorer och koroidala kapillärer, utför fagocytos av fotoreceptor yttre segment (POS) och utsöndrar cytokiner på ett polariserat sätt för att upprätthålla homeostas i den yttre näthinnan. Dysfunktionell RPE, orsakad av mutationer, åldrande och miljöfaktorer, resulterar i degenerering av andra näthinnelager och orsakar synförlust. En kännetecknande fenotypisk egenskap hos degenererande RPE är intra- och subcellulära lipidrika avlagringar. Dessa avlagringar är en vanlig fenotyp över olika retinala degenerativa sjukdomar. För att reproducera lipidinsättningsfenotypen av monogena retinala degenerationer in vitro genererades inducerad pluripotent stamcellshärledd RPE (iRPE) från patienternas fibroblaster. Cellinjer genererade från patienter med Stargardt och sen debut retinal degeneration (L-ORD) sjukdom matades med POS i 7 dagar för att replikera RPE fysiologisk funktion, vilket orsakade POS-fagocytosinducerad patologi vid dessa sjukdomar. För att generera en modell för åldersrelaterad makuladegeneration (AMD), en polygen sjukdom associerad med alternativ komplementaktivering, utmanades iRPE med alternativa komplementanafylatoxiner. De intra- och subcellulära lipidavlagringarna karakteriserades med användning av Nilröd, bor-dipyrrometen (BODIPY) och apolipoprotein E (APOE). För att kvantifiera tätheten av lipidavlagringar utvecklades en maskininlärningsbaserad programvara, LipidUNet. Programvaran tränades på projektionsbilder med maximal intensitet av iRPE på odlingsytor. I framtiden kommer det att tränas för att analysera tredimensionella (3D) bilder och kvantifiera volymen av lipiddroppar. Programvaran LipidUNet kommer att vara en värdefull resurs för att upptäcka läkemedel som minskar lipidackumulering i sjukdomsmodeller.
Introduction
Retinal pigmentepitel (RPE) är ett monolager av celler som ligger på baksidan av ögat intill retinala fotoreceptorer. RPE spelar en viktig roll för att upprätthålla korrekt syn genom att ge metaboliskt och strukturellt stöd till fotoreceptorerna. Friska RPE-celler kännetecknas av en distinkt hexagonal morfologi. De är förbundna med snäva korsningar, vilket gör att RPE kan fungera som en barriär mellan choriocapillaris belägen på dess basala sida och fotoreceptorer belägna apikalt. För att upprätthålla näthinnans ekosystem transporterar RPE viktiga metaboliter, t.ex. glukos, till fotoreceptorer på ett sätt som minimerar glukosförbrukningen i RPE1. På grund av denna begränsning är RPE beroende av andra metaboliter för att upprätthålla sina metaboliska behov, inklusive fettsyror, som RPE omvandlar till ketoner genom β-oxidation2. Med tanke på RPE: s benägenhet att använda fettsyror, som sannolikt återvinns från fotoreceptor yttre segment (POS) matsmältning, som energikälla, leder skadliga förändringar i lipidbearbetningsvägarna i RPE ofta till eller är inblandade i både monogena och polygena degenerativa näthinnesjukdomar3.
Åldersrelaterad makuladegeneration (AMD), en polygen degenerativ ögonsjukdom som orsakar RPE-degeneration, har också kopplats till avvikande autofagi och lipidmetabolism i RPE-monolagret. Misslyckandet av ett dysfunktionellt RPE-monolager att bearbeta POS och utföra andra kritiska funktioner leder till extracellulära (sub-RPE) avlagringar som kallas basala linjära avlagringar (BLinD) som ligger mellan RPE och Bruchs membran - ett kännetecken för AMD-patologier. Huvudkomponenter i BLinD inkluderar lipoproteiner, varav den vanligaste är apolipoprotein E (APOE)4. Ansamling av tunna lager av BLinD kan leda till mjuk drusen, vilket erkänns som ett kliniskt symptom på AMD 5,6.
Flera grupper har visat att stamcellshärledda in vitro-sjukdomsmodeller som orsakar RPE-dysfunktion har sub-RPE-lipidackumulering 7,8,9. Hallam et al. (2017) genererade inducerad pluripotent stamcellshärledd RPE (iRPE) från patienter med hög risk för AMD på grund av en polymorfism av CFH-genen. iRPE visade drusenackumulering, som markeras av APOE, och högrisk-RPE ackumulerade större insättningar än iRPE genererade från lågriskpatienter10.
För att skapa en in vitro-modell som rekapitulerar cellulära kännetecken för AMD, såsom lipiddroppar och drusenavsättning, etablerades iRPE-linjer genererade från patientblodprover med hjälp av ett tidigare publicerat utvecklingsstyrt protokoll11. iRPE utsattes för komplementkompetent humant serum (CC-HS), en lösning innehållande anafylatoxiner som efterliknar en möjlig orsak till AMD: ökad alternativ komplementsignalering8. Den resulterande cellulära och subcellulära avsättningen av lipidavlagringar mättes med användning av vanliga lipid- och lipoproteinmarkörer, APOE, Nile Red och BODIPY. Genom dessa markörer visades att aktiverad komplementsignalering via CC-HS förvärrade lipidackumuleringen i iRPE-celler8.
För att utveckla en sjukdomsmodell för en monogen retinal degenerativ sjukdom utvecklades iRPE-linjer från patienter med Stargardts sjukdom, en sjukdom som orsakas av mutationer i ABCA4-genen i RPE. Det har tidigare visats att när ABCA4 slås ut ackumuleras A2E-lipofuscin, en intracellulär avlagring som är känd för att innehålla höga nivåer av fosfolipider och ljusberoende lipidperoxidationsprodukter, inuti RPE12. ABCA4-knockoutlinjer utvecklades tillsammans med patientlinjerna, och båda utsattes för POS-utfodring. Stargardt iRPE demonstrerade POS-fagocytosinducerad patologi och uppvisade ökad lipidackumulering kvantifierad genom BODIPY-färgning. RPE härrörande från ABCA4 KO iPSC utsattes för CC-HS-behandling; kvantifiering av BODIPY-signalen visade en defekt i lipidhantering även i Stargardts sjukdomsmodell9.
Med tanke på förekomsten av dessa sjukdomar och behovet av effektiva terapier, tillsammans med de relevanta sjukdomsmodeller som beskrivs ovan, finns det ett behov av att fastställa robusta metoder för att kvantifiera effekten av potentiella behandlingar. För att kvantifiera lipidavlagringar på ett sätt som är objektivt, automatiserat och standardiserat skapades en maskininlärningsbaserad programvara, LipidUNet, så att lipidavsättning snabbt och effektivt kan identifieras med hjälp av de vanliga markörerna Nile Red, BODIPY och APOE när den paras ihop med maskanalysverktyg. Den sammanfattande statistiken som erhållits med hjälp av denna analyspipeline kan sedan analyseras och visas grafiskt, vilket möjliggör enkel jämförelse av behandlingsförhållanden. Schemat för protokollet visas i figur 1.
Figur 1: Schematisk beskrivning av protokollet: RPE-celler odlas på en platta med 96 brunnar och utmanas med aktivt humant serum eller renade bovina yttre segment för att modellera olika typer av retinala degenerationer in vitro. RPE-celler fixeras och färgas för lipoproteinavlagringar med Nile Red, BODIPY och APOE. Ett konfokalmikroskop används för att förvärva Z-staplar av fluorescerande märkta lipidpartiklar, som därefter bearbetas till 2D-maximala intensitetsprojektioner. En maskininlärningsalgoritm tränades för att känna igen och korrekt segmentera lipoproteinpartiklar. Sammanfattande tabeller som innehåller partikelantal och olika formmått genereras och kan användas för efterföljande plottning och statistisk analys. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Protocol
Alla protokollsteg följer de riktlinjer som anges av NIH: s etiska kommitté för mänsklig forskning. Stamcellsarbete och insamling av patientprover godkändes av Combined NeuroScience Institutional Review Board (CNS IRB) under Office of Human Research Protection (OHRP), NIH, enligt 45 CFR 46-riktlinjer från den amerikanska regeringen. Patientprover samlades in med CNS IRB-godkänd samtyckesblankett i enlighet med kriterierna i Helsingforsdeklarationen under protokollnummer NCT01432847 (https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01432847?cond=NCT01432847&draw=2&rank=1).
1. iRPE-generering
- Generera iRPE från patientens blodhärledda iPSC enligt det publicerade protokollet av Sharma et al., 202211 (figur 2 och figur 3).
Figur 2: Schematisk bild av iRPE-differentiering och mognad. För att generera iRPE följdes ett etablerat differentieringsprotokoll och cellerna fick mogna i 5 veckor. Den resulterande cellkulturen fungerar som en in vitro-modell som kan manipuleras med olika behandlingar för att efterlikna RPE-dysfunktion i sjukdomar som AMD och Stargardts sjukdom. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Representativa bilder av lyckad och misslyckad RPE-differentiering och mognad. Två ljusfältsbilder med 10x förstoring av TJP1 RPE visas vid dag 42 i iRPE-protokollet. (A) Framgångsrik differentiering och mognad kommer att visa sammanflytande RPE med pigmentering och polygonal morfologi. (B) Misslyckad differentiering och mognad kommer att visa kluster av döende celler, som visas här. Klicka här för att se en större version av denna figur.
2. Förberedelse av RPE-underhållsmedier (RPE-MM)
- Tina N2-tillskottet vid 4 °C över natten. Tina alla andra reagens vid rumstemperatur (RT).
- Under sterila förhållanden, tillsätt de reagenser som förtecknas i tabell 1 vid de angivna utspädningsfaktorerna, enligt det protokoll som fastställts av Sharma et al., 202211.
- Blanda mediet väl och filtrera det med en 0,22 μm filtreringsenhet.
OBS: Media är lämpligt för användning inom 2 veckor om det förvaras vid 4 °C.
3. Sådd med 96-brunnsplatta
- Tina en alikvot av vitronektin vid rumstemperatur i 3-5 minuter eller tills isen är helt smält.
- Späd vitronektinet med 1x Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (DPBS) för att erhålla önskad arbetslösning med en spädning på 1:200 (vitronektin: DPBS). För en platta med 96 brunnar, täck varje brunn med 200 μL av arbetslösningen.
- Kombinera upptinad ROCK-hämmare (Y-27632-dihydroklorid) med RPE-MM i en spädning på 1:1000 för att uppnå en slutlig koncentration på 10 μM. Detta är pläteringsmediet för RPE-celler.
- Tina injektionsflaskan med iRPE med hjälp av ett automatiserat cellupptiningssystem och överför iRPE-cellsuspensionen till ett 50 ml rör.
- Späd cellsuspensionen med pläteringsmediet i spädning 1:10. Centrifugera röret vid 400 x g i 5 minuter.
- Aspirera försiktigt supernatanten och suspendera cellerna i 10 ml av pl av pl.
- Blanda 400 μl av pl av pl pl av den återsuspenderade celllösningen för cellräkning. Använd denna alikvot för att bestämma cellsuspensionens livsdugliga cellkoncentration med hjälp av en cellviabilitetsräknare.
- Späd cellsuspensionen med pläteringsmediet till en slutlig koncentration på 60 000 celler/ml.
- Aspirera vitronektinbeläggningslösningen helt från 96-brunnsplattan och fördela 200 μL av cellsuspensionen i varje brunn. Det kommer att finnas ungefär 12 000 celler / brunn eller ~ 200 celler / mm2.
- Inkubera de uppsådda cellplattorna i 48 timmar vid 37 °C och 5 %CO2. Efter 48 timmar, byt media till RPE-MM utan ROCK-hämmare tillägg. Byt media var 2-3: e dag under 5-veckors mognadsperioden.
4. Modeller för in vitro-sjukdom
- Komplement kompetent human serumbehandling (CC-HS)
- Tina humant komplementkompetent serum vid 4 °C över natten.
- Bered CC-HS och komplettera inkompetent humant serum (CI-HS).
- För att bereda 5% CC-HS-media, blanda det tinade komplementkompetenta humana serumet med RPE-MM i en spädning på 1:20. Filtrera lösningen genom ett 0,22 μm mediafilter före användning.
- För att bereda 5 % komplement till inkompetent humant serum (CI-HS) media, värm först CC-HS i ett 57 °C vattenbad i 30 minuter och blanda sedan med odlingsmediet i spädning 1:20. Filtrera lösningen genom ett 0,22 μm mediafilter före användning.
- Serum behandlar cellerna med 200 μl av antingen 5% CC-HS eller 5% CI-HS media för en total inkubationstid på 48 timmar, uppfriskande media efter 24 timmar.
- Tvätta cellerna med 1x DPBS och fixera dem med 4% paraformaldehyd i 20 minuter vid RT. Tvätta en gång till med 1x DPBS och förvara proverna vid 4 °C, nedsänkt i 200 μL DPBS.
- VALFRITT: Om så önskas, lysera cellerna från plattan så att endast sub-RPE lipidavsättning visas.
- För att lysera cellerna och lämna endast lipidavlagringar, ta bort mediet och tillsätt 200 μL avjoniserat vatten till varje brunn.
- Inkubera i 10-15 min, pipettera upp och ner tills cellerna har avlägsnats. Tvätta en gång till med 200 μL avjoniserat vatten och fixera omedelbart cellerna med 4% paraformaldehyd.
- Bekräfta cellborttagningseffekten med kärnfärgning med Hoechst. Tillsätt Hoechst vid spädning 1:2000 till en 1x DPBS-lösning innehållande 1 % bovint serumalbumin (BSA), 0,5 % Tween 20 och 0,5 % Triton-X 100. Inkubera vid rumstemperatur i 1 timme i mörker. Tvätta därefter med 1x DPBS.
- Behandling med fotoreceptor yttre segment (POS) på iRPE
- POS-förberedelse
- Ta bort POS-pelletsröret från -80 ° C lagring och tina över natten vid 4 ° C i en täckt ishink.
- Förbered POS-tvättbuffert genom att blanda 10 g sackaros i 40 ml dubbelavjoniseradH2O(ddH2O).
- Värm blandningen vid 40-50 °C under försiktig omrörning i 15 min. Tillsätt 840 mg natriumbikarbonat till blandningen och rör om under uppvärmning i 10 minuter.
- Justera den totala volymen av POS-tvättbufferten till 100 ml med ddH2O och justera lösningens pH till 8,3 med 1 N HCl eller 1 N NaOH, efter behov. Filtrera tvättlösningen med ett 0,22 μm filter.
OBS: Protokollet kan pausas här; POS-tvättbufferten kan förvaras vid 4 °C över natten. - När den har tinats, suspendera pelleten i 15 ml POS-tvättbuffert. Var försiktig under pelletsupphängningar för att säkerställa POS-integritet. Centrifugera POS-upphängningen vid 600 x g vid 4 °C i 20 minuter och aspirera sedan supernatanten.
- Återsuspendera POS-pelleten i 10 ml av POS-tvättbufferten.
- Ta bort en alikvot på 100 μL av POS + POS-tvättbufferten (POS-lösningen) och späd i 400 μL 1x DPBS. Sprid 50 μL av den utspädda POS-lösningen på en blodagarplatta och en agarosplatta för att kontrollera bakterie- och svampföroreningar. Bered positiva kontroller för var och en av dem och inkubera alla plattor i 48 timmar vid 37 °C.
- Utför en qPCR-analys genom att tillsätta 1 μL POS-lösning till detektionsbrunnen för att testa för mykoplasma. För att förstärka DNA-fragment, utför 40 cykler av denaturering (95 ° C, 15 s) och glödgning och förlängning (60 ° C, 1 min). Framåt- och bakåtprimrarna för detektering av mykoplasma i POS-provet är följande:
Framåt primer: GGA TTA GAT ACC CTG GTA GTC CAC G
Omvänd primer: CGT CAA TTC CTT TAA GTT TCA CTC TTG GC - Mät POS-koncentrationen med hjälp av en cellanalysator och alikvot efter behov. För en brunn med 96 brunnsplattor med RPE-celler är 3 x 106 POS tillräcklig. Det önskade förhållandet är 10 POS / RPE-cell. Förvara alikvoterna vid 80 °C för framtida användning.
- Tillägg av POS till celler
- Tina injektionsflaskor med POS i ett isbad.
- Blanda den beräknade mängden beredd POS med RPE-MM och behandla cellerna med POS en gång dagligen i 7 dagar.
OBS: Förbered POS-lösningen färsk dagligen. - Tvätta cellerna med 1x DPBS och fixera dem sedan med 4% paraformaldehyd i 20 minuter vid RT. Tvätta med DPBS en gång till och förvara proverna vid 4 °C, nedsänkt i 200 μL DPBS.
- POS-förberedelse
5. Färgning för sub-RPE-avlagringar
- Nilrött färgningsprotokoll
- Efter PFA-fixering, tvätta proverna 3 gånger med 1x DPBS.
OBS: Om det inte används omedelbart kan protokollet pausas här, men proverna måste förvaras i en 1x DPBS + 0,02% natriumazidlösning vid 4 ° C. - För beredning av Nile Red stamlösning, lös Nile Red pulver i aceton vid 3 mg / ml koncentration. Inkubera i 15 minuter vid rumstemperatur med periodisk blandning. Filtrera lösningarna med ett 0,22 μm filter en eller två gånger beroende på vilken fällningsnivå som finns kvar i lösningen.
OBS: Skydda stamlösningen från ljus. - För att förbereda arbetslösningen, späd stamlösningen i ett förhållande av 1:500 i 1x DPBS. Tillsätt 200 μl av arbetslösningen till provet i 30 minuter vid rumstemperatur i en skakapparat och skydda den mot ljus.
- Tvätta 3 gånger med 1x PBS och förvara proverna vid 4 °C, nedsänkt i 200 μL DPBS.
OBS: Om du utför ett experiment på transwells istället för en 96-brunnsplatta, kan prover monteras på en bild med monteringsmedia, täckas med ett glastäckglas och förseglas med transparent nagellack. Försiktighet bör iakttas för att montera provet med cellerna uppåt.
- Efter PFA-fixering, tvätta proverna 3 gånger med 1x DPBS.
- BODIPY färgningsprotokoll
- För stamlösning, lös BODIPY i vattenfri dimetylsulfoxid (DMSO) så att stamkoncentrationen blir 3,8 mM.
- För PFA-fasta prover, späd BODIPY-stammen vid 1:300 i 1x DPBS. Tillsätt 200 μL till cellerna och inkubera över natten på en vippa vid RT.
- Tvätta 3 gånger med 1x DPBS och förvara proverna vid 4 °C, nedsänkt i 200 μL DPBS.
OBS: Om du utför ett experiment på transwells istället för en 96-brunnsplatta, kan prover monteras på en bild med monteringsmedia, täckas med ett glastäckglas och förseglas med transparent nagellack. Försiktighet bör iakttas för att montera provet med cellerna uppåt.
- APOE immunfärgningsprotokoll
- Kombinera 1x DPBS med 1% bovint serumalbumin (BSA), 0,5% Tween 20 och 0,5% Triton-X 100 för att skapa en buffertlösning.
- För PFA-fasta prover, blockera och permeabilisera provet i 200 μL buffertlösning i 1 h vid RT.
- Tillsätt APOE:s primära antikropp utspädd vid 1:100 i buffertlösningen och inkubera över natten vid RT.
- Följande dag, tvätta proverna 3 gånger med 1x DPBS.
- Tillsätt en sekundär antikropp vid spädning 1:1000 i buffertlösningen och tillsätt 200 μl lösning till cellerna i 1 timme vid rumstemperatur.
- Tvätta 3 gånger med 1x DPBS och förvara proverna vid 4 °C, nedsänkt i 200 μL DPBS.
OBS: Om du utför ett experiment på transwells istället för en 96-brunnsplatta kan prover monteras på en bild med monteringsmedia (Fluoromount), täckas med ett glastäckglas och förseglas med transparent nagellack. Försiktighet bör iakttas för att montera provet med cellerna uppåt.
6. Bildautomatisering och bearbetning
- Automatiserad bildskanning
OBS: Zeiss LSM 800 inverterat konfokalt skanningsmikroskop och ZEN 3.2 (blå utgåva) programvara användes i denna studie. Se till att plattan med 96 brunnar värms upp till RT i minst 60 minuter före avbildning för att undvika brännplansdrift under skanningen på grund av en förändring i mediets brytningsindex med temperaturförändring.- Använd ett konfokalmikroskop och ett 40x-objektiv, skapa en skanningsprofil med lämpliga fluorescerande kanaler för lipidmarkören som används och eventuella ytterligare antikroppar.
- Använd kryssrutan Paneler för att konfigurera bildautomatisering. För att kalibrera 96-brunnsplattan, se till att rätt provbärarmätningar anges och väljs. Klicka sedan på knappen Kalibrera för att kalibrera plattan enligt instruktionerna, vilket kräver att du använder 10x-objektivet.
- Välj vyn Avancerade inställningar för att välja lämpliga brunnar och lägga till 3 olika avbildningspunkter nära mitten av brunnen med hjälp av funktionen Positioner . Detta kan göras manuellt under underfliken Position eller slumpmässigt med hjälp av fliken Positionsinställningar och välja Inställningar efter operatör. Upprepa för alla brunnar med samma färgning.
- För optimal fokusering och Z-stackpositionering under automatisering, gå till fliken Fokusstrategi för att välja Använd fokusyta / Z-värden definierade av panelinställningar. Alternativa metoder kan använda andra fokusstrategier, men vi rekommenderar att du använder den här inställningen för de mest konsekventa resultaten.
- Under fliken Paneler klickar du på Verifiera positioner och ställer in det centrala Z-planet manuellt för varje position. Inställningarna på underfliken Alternativ kommer att ordna förvärv av bilder, så kontrollera detta innan du börjar bilden. Om du vill hämta bilder i den ordning positionerna valdes avmarkerar du kryssrutorna Panelområden/positioner och Bärbrunnar/behållare . Välj Dela scener i separata filer för enkel bildbehandling.
- Se till att fliken Z-Stack är inställd på Center, att ett intervall matas in i användarens inställningar och att knappen Optimal är markerad för att ställa in segmentintervallet.
- När du har optimerat flikarna Förvärvsläge, Kanaler, Fokusstrategi, Z-Stack och Paneler startar du experimentet.
- Bildbehandling
- Använd en batchbildbehandlingsmetod och skapa maximala projektioner av varje Z-stack med metoden Extended Depth of Focus .
- Använd en gruppbildbehandlingsmetod och exportera maximalt antal projektionsfiler som 16-bitars TIFF-bilder. Ställ in komprimeringen på Ingen och se till att originaldata är markerat. Den resulterande bilden bör vara en maximal projektionsgråskala TIFF för endast den fluorescenskanal på vilken lipidmarkören uttrycks.
7. Segmentering och kvantifiering
OBS: LipidUNet-programmet tränades på 40x bilder från en 96-brunnsplatta. Det rekommenderas starkt att använda bilder som erhållits med ett 40x-mål.
- Installera LipidUNet-programvaran. LipidUNet kan laddas ned från följande GitHub lagringsplats: https://github.com/RPEGoogleMap/LipidUNet
- Identifiera TIFF-bilderna som representerar antingen Nile Red, Bodipy eller APOE och flytta dem till en mapp med namnet imgs i en katalog med namnet Nile_Red, Bodipy eller APOE, beroende på vilken metod som används.
OBS: Exakta namnkonventioner måste användas för LipidUNet-programmet för att känna igen katalogerna. - Öppna LipidUNet-programvaran (bild 4).
- På fliken Predict i programvaran väljer du relevant katalog (Nile_Red, Bodipy eller APOE) genom att klicka på ellipsen och navigera till den namngivna katalogen. Bekräfta att LipidUNet-programmet har identifierat bilderna korrekt genom att kontrollera klassposten.
- Välj ett sannolikhetströskelvärde för algoritmen mellan 0,01 och 0,99. Ett högre värde eliminerar fler falska positiva identifieringar men kan orsaka fler falska negativa resultat, och lägre värden kan introducera fler falska positiva resultat samtidigt som fler falska negativa resultat elimineras. Värdet 0,65 är standard och rekommenderas.
- Klicka på Förutsäg.
OBS: Programvaran itererar automatiskt genom alla bilder och skapar en ny mapp som heter predicted_masks i den valda katalogen. - Använd ett maskanalysverktyg för att iterera genom de genererade maskerna och tillhandahålla ett kvantitativt antal av de tröskelbaserade lipidavlagringarna från maskbilderna.
- Analysera genererade räkningsdata för att jämföra behandlingsförhållanden.
Figur 4: Användargränssnitt för LipidUNet. LipidUNet-programvaran har olika sektioner att välja för träningsdatakatalogen, där bilder av lipidavlagringar har identifierats korrekt; katalogen modellvikter, som skapas från träningsdata; och förutsägelsedatakatalogen där användaren ska mata in sina bilder för segmentering. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Representative Results
Detta protokoll ger ett arbetsflöde för att identifiera lipidavlagringar färgade av Nile Red, BODIPY och APOE. Den utvecklade programvaran kan automatiskt identifiera och kvantifiera lipidavlagringar och fungerar bäst när det beskrivna protokollet är optimerat. Inkluderat är exempel på framgångsrikt differentierad RPE (figur 3A) och dåligt differentierad RPE (figur 3B), eftersom kvaliteten på cellmodellen i hög grad påverkar kvaliteten på korrekt bildsegmentering.
Två av de tre markörer som beskrivs i protokollet, Nile Red och BODIPY, identifieras som små cirkulära punkter som är tydligt ljusa i fluorescerande bilder (figur 5 och figur 6). En "positiv" bild från protokollet skulle vara en lämplig identifiering av dessa distinkta fyndigheter (figur 5A-D och figur 5E-H). Ett "negativt" resultat skulle visa felaktig segmentering av bilden genom att missta bakgrundsfluorescens som en avlagring, antingen på grund av svag färgning (figur 6A-C och figur 6D-F) eller på grund av hög bakgrundsintensitet (figur 6G-I).
APOE-avlagringar har en mängd olika storlekar och former, som verkar mer ovala eller oregelbundna snarare än de cirkulära avlagringarna av Nile Red och BODIPY. Dessa avlagringar är också mindre punkterade och signalintensiteten kan skilja sig mellan avlagringar på grund av variationer i permeabiliseringen av provet. Korrekt identifiering kommer att identifiera varje insättning, inklusive de som är mindre mättade (figur 5I-L), medan felaktig segmentering inte kommer att plocka upp dessa insättningar (figur 6J-L). Därför är det viktigt att optimera färgnings- och avbildningsmetoder för att undvika drastisk variation. Ett sätt att göra detta är genom att ägna noggrann uppmärksamhet åt provpermeabiliseringsstegen under immunfärgning. För att optimera fluorescerande signaler kan celler lyseras före fixering och immunfärgning för APOE, vilket resulterar i jämn mättnad och bättre segmentering av APOE-avlagringarna.
Förutsatt finns också segmenterade bilder av celler mogna på en annan odlingsplattform än en 96-brunnsplatta. LipidUNet-programvaran kördes på bilder av celler odlade på en transwell, och medan lipidavlagringarna är tröskeln, så är också porerna i transwellmembranet (figur 6M-O). På grund av likheten i form och storlek kommer LipidUNet-programvaran i sin nuvarande form att maskera både lipidavlagringar och transwellporer urskillningslöst.
Figur 5: Representativa resultat. (A,E,I) 96-väl pläterad RPE är färgad med Hoechst nukleär färgning (blå) och antingen Nile Red (magenta), BODIPY (grön) eller APOE (orange) och är de maximala intensitetsprojektionerna för en Z-stack. (B,F,J) Gråskalan matar in bilder för LipidUNet-programvaran efter bildbehandling. (C,G,K) Masker genererade av LipidUNet, där alla avlagringar identifieras korrekt. (D,H,L) Konturerna av varje maskerad partikel är numrerade. Dessa etiketter gör det möjligt att ansluta varje partikel i bilden till en post i spreadheet med rådata. (AD) visar Nile Red-färgning, och programvaran kan känna igen avlagringarna mot bakgrunden exakt trots en svagare signal. (E-H) visar en stark kontrast mellan BODIPY-signalen och bakgrunden, vilket är idealiskt. LipidUNet identifierar korrekt varje insättning i bilden. (I-L) visar en stark APOE-signal och representerar variationen i signalmättnad som ofta ses med denna fläck. Ändå kan bildsegmentering identifiera gränserna för varje APOE-insättning. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Suboptimala resultat. (A, D, G, J, M) 96-välpläterad RPE är färgade med Hoechst kärnfärgning (blå) och antingen Nile Red (magenta), BODIPY (grön) eller APOE (orange) och är de maximala intensitetsprojektionerna för en Z-stack. (B,E,H,K,N) Gråskalan matar in bilder för LipidUNet-programvaran efter bildbehandling. (C,F,I,L,O) Felaktiga masker som genereras av LipidUNet. Röda cirklar indikerar var programvaran felaktigt har identifierat en lipidavlagring. (A–C) Nile Red bearbetning är felaktig eftersom programvaran har identifierat bakgrundsfärgningen som en insättning. Detta kan hända oftare när det finns hög bakgrund men få lipidavlagringar i bilden. Två exempel på BODIPY-färgning visas: en bild av dålig kvalitet på grund av (D-F) svag BODIPY-färgning och (G - I) en stark BODIPY-signal med hög bakgrund. I båda fallen kan programvaran inte skilja små, cirkulära lipidavlagringar från bakgrundscirkulärringen som omger kärnan. Även om färgning och avbildning bör optimeras för att undvika dessa fel, är den senaste versionen av LipidUNet till stor del förbättrad för dessa bilder. (J–L) Felaktig APOE-segmentering. Eftersom insättningarna är mer varierande i storlek och mättnad av signalen har programvaran svårt att känna igen vissa insättningar. (M-O) RPE sådd på en transwell och färgad med Nile Red. En skiva av Z-stacken visas här med både Nile Red lipidavlagringar och transwell porer. Programvaran kan inte skilja mellan de två, vilket visas av den röda cirkeln som innehåller transwellporer och den gröna pilen som pekar på Nile Red-avlagringar. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: Jämförelse av maskverktyg. (A,B,C) 96-väl pläterad RPE med varierande mängder lipidavsättning identifieras med Nilröd (röd). Bilderna maskeras med tre olika vanliga maskeringsmetoder, Find Maxima, Max Entropy och Renyi Entropy, och jämförs med den LipidUNet-genererade masken. Den ursprungliga bilden åtföljs av en manuell räkning av lipidavlagringarna, medan maskerna visar de förutsagda räkningarna med varje segmenteringsmetod. Den genomsnittliga felprocenten beräknades för varje segmenteringsmetod med hjälp av följande formel: medelvärde[(|Förutspått antal - manuellt antal|/manuellt antal) x 100]. Den LipidUNet-genererade masken identifierar mer exakt lipidavlagringar över bilder med variabel deponering jämfört med andra maskeringsmetoder (Genomsnittlig felfrekvens: 23% LipidUnet, 1164% Find Maxima, 851% Max Entropy, 203% Renyi Entropy). Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Komponent | Kattnummer | Lager Conc. | Slutlig konc. | Ml |
| MEM alfa | 12571-063 | NA | 500 | |
| N2-tillägg | 17502-048 | NA | 1% | 5 |
| Värmeinaktiverad FBS | SH30071.03 | NA | 5% | 25 |
| NMEM NEAA | 11140-050 | 10 mM | 0,01 mM | 5 |
| Natriumpyruvat | 11360-070 | 100 mM | 1mM | 5 |
| Penicillin-streptomycin | 15140-122 | 10000u/ml | 100U/ml | 5 |
| Taurin | T4571 | 50mg/ml | 250ug / ml | 2.5 |
| Hydrokortison | H6909 | 18,1 mg/L | 20ug/L | 0.553 |
| T3 | T5516 | 20ug/L | 0.013ug / L | 0.33 |
| Total volym, ml | 548.383 | |||
Tabell 1: RPE-MM-reagenssammansättning. En förteckning över reagenser och optimala koncentrationer för RPE-MM.
Discussion
Detta protokoll tillhandahåller en metod för att effektivt märka, avbilda och kvantifiera lipidavlagringar i monogena och polygena in vitro-sjukdomsmodeller för degenerativa ögonsjukdomar. Den AI-baserade programvaran, LipidUNet, kan appliceras på tre vanliga lipidmarkörer, APOE, Nile Red och BODIPY, och ger en snabb, automatisk analysmetod som gör att kvantifieringen kan vara standard och opartisk.
Den huvudsakliga begränsningen för LipidUNet är det faktum att träningsdatamängden för AI var begränsad till 40x förstoringsbilder av celler odlade i en 96-brunnsplatta. Som ett resultat av träningsbilduppsättningen är LipidUNet i sin nuvarande form begränsad till att analysera 40x förstoringsbilder. Programvaran kan användas för att analysera 40x bilder av celler odlade på andra odlingsytor förutom en 96-brunnsplatta, men försiktighet bör vidtas för att undersöka de genererade utdatamaskerna för att verifiera korrekt tröskel av programvaran. Fler bilduppsättningar (vid olika förstoringar) kommer att behövas för att utöka omfattningen av vilka prover / bilder den kan analysera.
Protokollet har flera kritiska steg. I lipidmarkörsteget bör användaren bekräfta att deras valda märkningsförening (BODIPY, APOE, Nile Red) har märkt sitt prov effektivt. Mogna RPE-celler är ofta kraftigt pigmenterade, vilket kan försämra den fluorescerande signalen om antikroppsimmunfärgning. När fluorescenssignalen är svag eller när det finns för mycket bakgrundsfärgning kan LipidUNet inte urskilja lipiddroppar exakt. Av liknande skäl måste korrekt valda förvärvsinställningar för protokollets automatiska bildsteg användas. Om de förvärvade bilderna är av dålig kvalitet kommer LipidUNet att kämpa för att korrekt maskera bilder och därför kommer kvantifieringen att vara felaktig (figur 6A-L). Slutligen är efterbehandling av bilderna ett viktigt steg, eftersom LipidUNet har specifika krav för att programvaran ska fungera.
Jämfört med arbetsflöden för lipidanalys som använder manuell tröskel eller tekniker som involverar automatisk tröskel i programvara som Fiji, erbjuder LipidUNet en opartisk och pålitlig segmentering över bilder med variabel lipidavsättning, vilket återspeglas av en liten felfrekvens vid identifiering av lipidpartiklar (figur 7). Programvaran möjliggör användarinmatning av ytterligare träningsbilder, vilket möjliggör analys av bilduppsättningar utöver de som använder ett 40x förstoringsmål eller till och med de som använder en annan lipidmarkör, som beskrivs i protokollet. I framtiden kommer programvaran att tränas för att analysera 3D-bilder så att kvantifiering av lipidavsättningsvolymen är möjlig. Degenerativa ögonsjukdomar som implicerar lipidavsättning som en viktig bidragsgivare till patologi är vanliga, och fall förutspås öka när den äldre befolkningen expanderar13. Noggranna sjukdomsmodeller och effektiva analysverktyg, som vi har beskrivit i detta protokoll, kommer att möjliggöra utveckling av nya terapeutiska ingrepp.
Disclosures
Inga avslöjanden.
Acknowledgments
Vi tackar National Eye Institute (NEI) histologikärna för användningen av Zeiss konfokalsystem. Detta arbete stöddes av NEI IRP-medel (bidragsnummer ZIA EY000533-04).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm Steriflip filter system | EMD Millipore | SCGP00525 | |
| 1x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-144 | |
| 3,3',5-Triiodo-L-thyronine | Sigma | T5516 | |
| Albumin Bovine, Fraction V | MP Biomedical | 160069 | |
| Alexa Fluor 555 rabbit anti-goat IgG (H+L) | Invitrogen | A21431 | APOE secondary antibody |
| APOE primary antibody | Millipore Sigma | AB947 | |
| BODIPY 493/503 | Invitrogen | D3922 | Protect from light |
| Complement competent human serum | Millipore Sigma | S1-LITER | |
| CTS N2 Supplement | Life Technologies | A13707-01 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30071.03 | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | Slide mounting media |
| Glass Cover Slips #1 1/2 22 mm x 22 mm | Electron Microscopy Sciences | 72204-01 | |
| Glass Microscope Slide 25 mm x 75 mm- 1.2 mm Thick | Electron Microscopy Sciences | 71870-01 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0396 | |
| MEM Alpha | Life Technologies | 12571-063 | |
| MEM non-essential Amino Acids | Life Technologies | 11140 | |
| Nile Red | Sigma | 72485-100MG | Protect from light |
| Paraformaldehyde 16% Solution, EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Penicillin-Strep | Life Technologies | 15140-148 | |
| Phosphate Buffered Saline 10x | Gibco | 70011-044 | |
| Rod Outer Segments (OS) | InVision Bioresources | 98740 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | |
| Sodium Pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S1888 | |
| SYBR Green Master Mix | Bio-Rad | 1725274 | |
| Taurine | Sigma | T0625 | |
| Triton X-100 | Sigma | 9002-93-1 | |
| Tween 20 Ultrapure | Affymetrix | 9005-64-5 | |
| Vitronectin | Life Technologies | A14701SA | |
| Y-27632 dihydrochloride | R&D Systems | 1254 |
References
- Kanow, M. A., et al. Biochemical adaptations of the retina and retinal pigment epithelium support a metabolic ecosystem in the vertebrate eye. eLife. 6, e28899 (2017).
- Adijanto, J., et al. The retinal pigment epithelium utilizes fatty acids for ketogenesis. The Journal of Biological Chemistry. 289 (30), 20570-20582 (2014).
- Farnoodian, M., et al. Cell-autonomous lipid-handling defects in Stargardt iPSC-derived retinal pigment epithelium cells. Stem Cell Reports. 17 (11), 2438-2450 (2022).
- Curcio, C. A. Soft drusen in age-related macular degeneration: Biology and targeting via the oil spill strategies. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (4), AMD160-AMD181 (2018).
- Cankova, Z., Huang, J. D., Kruth, H. S., Johnson, M. Passage of low-density lipoproteins through Bruch's membrane and choroid. Experimental Eye Research. 93 (6), 947-955 (2011).
- Curcio, C. A., et al. Esterified and unesterified cholesterol in drusen and basal deposits of eyes with age-related maculopathy. Experimental Eye Research. 81 (6), 731-741 (2005).
- Miyagishima, K. J., et al. AMPK modulation ameliorates dominant disease phenotypes of CTRP5 variant in retinal degeneration. Communications Biology. 4 (1), 1360 (2021).
- Sharma, R., et al. Epithelial phenotype restoring drugs suppress macular degeneration phenotypes in an iPSC model. Nature Communications. 12 (1), 7293 (2021).
- Farnoodian, M., et al. Cell-autonomous lipid-handling defects in Stargardt iPSC-derived retinal pigment epithelium cells. Stem Cell Reports. 17 (11), 2438-2450 (2022).
- Hallam, D., et al. An induced pluripotent stem cell patient specific model of complement factor H (Y402H) polymorphism displays characteristic features of age-related macular degeneration and indicates a beneficial role for UV light exposure. Stem Cells (Dayton, Ohio). 35 (11), 2305-2320 (2017).
- Sharma, R., Bose, D., Montford, J., Ortolan, D., Bharti, K. Triphasic developmentally guided protocol to generate retinal pigment epithelium from induced pluripotent stem cells. STAR Protocols. 3 (3), 101582 (2022).
- Issa, P. C., Barnard, A. R., Herrmann, P., Washington, I., MacLaren, R. E. Rescue of the Stargardt phenotype in Abca4 knockout mice through inhibition of vitamin A dimerization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (27), 8415-8420 (2015).
- GBD 2019 Blindness and Vision Impairment Collaborators. Blindness and Vision Impairment Collaborators. Causes of blindness and vision impairment in 2020 and trends over 30 years, and prevalence of avoidable blindness in relation to VISION 2020: the Right to Sight: an analysis for the Global Burden of Disease Study. Lancet Global Health. 9 (2), e144-e160 (2021).
