Summary
Degenerative øjensygdomme, der påvirker øjets retinale pigmentepitellag, har monogen og polygen oprindelse. Flere sygdomsmodeller og en softwareapplikation, LipidUNet, er blevet udviklet til at studere sygdomsmekanismer såvel som potentielle terapeutiske interventioner.
Abstract
Det retinale pigmentepitel (RPE) er et monolag af sekskantede celler placeret bag på øjet. Det giver næring og støtte til fotoreceptorer og choroidale kapillærer, udfører fagocytose af fotoreceptor ydre segmenter (POS) og udskiller cytokiner på en polariseret måde for at opretholde homeostase af den ydre nethinden. Dysfunktionel RPE, forårsaget af mutationer, aldring og miljømæssige faktorer, resulterer i degeneration af andre retinale lag og forårsager synstab. Et kendetegnende fænotypisk træk ved degenererende RPE er intra- og subcellulære lipidrige aflejringer. Disse aflejringer er en fælles fænotype på tværs af forskellige retinale degenerative sygdomme. For at reproducere lipidaflejringsfænotypen af monogene retinale degenerationer in vitro blev induceret pluripotent stamcelleafledt RPE (iRPE) genereret fra patienternes fibroblaster. Cellelinjer genereret fra patienter med Stargardt og sent indsættende retinal degeneration (L-ORD) sygdom blev fodret med POS i 7 dage for at replikere RPE fysiologisk funktion, hvilket forårsagede POS fagocytose-induceret patologi i disse sygdomme. For at generere en model for aldersrelateret makuladegeneration (AMD), en polygen sygdom forbundet med alternativ komplementaktivering, blev iRPE udfordret med alternative komplementanafylatoksiner. De intra- og subcellulære lipidaflejringer blev karakteriseret ved anvendelse af Nile Red, bor-dipyrromethen (BODIPY) og apolipoprotein E (APOE). For at kvantificere tætheden af lipidaflejringer blev der udviklet en maskinlæringsbaseret software, LipidUNet. Softwaren blev trænet på projektionsbilleder med maksimal intensitet af iRPE på kulturoverflader. I fremtiden vil det blive uddannet til at analysere tredimensionelle (3D) billeder og kvantificere mængden af lipiddråber. LipidUNet-softwaren vil være en værdifuld ressource til at opdage lægemidler, der reducerer lipidakkumulering i sygdomsmodeller.
Introduction
Det retinale pigmentepitel (RPE) er et monolag af celler placeret bag i øjet ved siden af retinale fotoreceptorer. RPE spiller en afgørende rolle i at opretholde korrekt syn ved at yde metabolisk og strukturel støtte til fotoreceptorerne. Sunde RPE-celler er kendetegnet ved en tydelig sekskantet morfologi. De er forbundet med stramme kryds, som gør det muligt for RPE at fungere som en barriere mellem choriocapillaris placeret på dens basale side og fotoreceptorer placeret apikal. For at opretholde det retinale økosystem transporterer RPE nøglemetabolitter, f.eks. glukose, til fotoreceptorer på en måde, der minimerer glukoseforbruget i RPE1. På grund af denne begrænsning afhænger RPE af andre metabolitter for at opretholde deres metaboliske behov, herunder fedtsyrer, som RPE omdanner til ketoner gennem β-oxidation2. I betragtning af RPE's tilbøjelighed til at udnytte fedtsyrer, som sandsynligvis genbruges fra fotoreceptorens ydre segment (POS) fordøjelse, som energikilde, fører skadelige ændringer i lipidbehandlingsvejene i RPE ofte til eller er impliceret i både monogene og polygene degenerative nethindesygdomme3.
Aldersrelateret makuladegeneration (AMD), en polygen degenerativ øjensygdom, der forårsager RPE-degeneration, har også været forbundet med afvigende autofagi og lipidmetabolisme i RPE-monolaget. Fejlen i et dysfunktionelt RPE-monolag til at behandle POS og udføre andre kritiske funktioner fører til ekstracellulære (sub-RPE) aflejringer kaldet basale lineære aflejringer (BLinD) placeret mellem RPE og Bruchs membran - et kendetegn ved AMD-patologier. Hovedkomponenter i BLinD omfatter lipoproteiner, hvoraf den mest rigelige er apolipoprotein E (APOE)4. Akkumulering af tynde lag BLinD kan føre til blød drusen, som anerkendes som et klinisk symptom på AMD 5,6.
Flere grupper har vist, at stamcelleafledte in vitro-sygdomsmodeller, der forårsager RPE-dysfunktion, har sub-RPE lipidakkumulering 7,8,9. Hallam et al. (2017) genererede induceret pluripotent stamcelleafledt RPE (iRPE) fra patienter med høj risiko for AMD på grund af en polymorfisme af CFH-genet. iRPE viste drusen-akkumulering, som markeret af APOE, og højrisiko-RPE akkumulerede større aflejringer end iRPE genereret fra lavrisikopatienter10.
For at skabe en in vitro-model , der rekapitulerer cellulære kendetegn ved AMD, såsom lipiddråber og drusenaflejring, blev iRPE-linjer genereret fra patientblodprøver etableret ved hjælp af en tidligere offentliggjort udviklingsstyret protokol11. iRPE blev udsat for komplementkompetent humant serum (CC-HS), en opløsning indeholdende anafylatoksiner, der efterligner en mulig årsag til AMD: øget alternativ komplementsignalering8. Den resulterende cellulære og subcellulære aflejring af lipidaflejringer blev målt ved hjælp af almindeligt anvendte lipid- og lipoproteinmarkører, APOE, Nile Red og BODIPY. Gennem disse markører blev det vist, at aktiveret komplementsignalering via CC-HS forværrede lipidakkumulering i iRPE-celler8.
For at udvikle en sygdomsmodel for en monogen retinal degenerativ sygdom blev iRPE-linjer udviklet fra patienter med Stargardts sygdom, en sygdom forårsaget af mutationer til ABCA4-genet i RPE. Det har tidligere vist sig, at når ABCA4 slås ud, akkumuleres A2E lipofuscin, en intracellulær aflejring, der vides at indeholde høje niveauer af fosfolipider og lysafhængige lipidperoxideringsprodukter, inde i RPE12. ABCA4 knockout-linjer blev udviklet sammen med patientlinjerne, og begge blev udsat for POS-fodring. Stargardt iRPE demonstrerede POS-fagocytose-induceret patologi og udviste øget lipidakkumulering kvantificeret ved BODIPY-farvning. RPE afledt af ABCA4 KO iPSC'er blev udsat for CC-HS-behandling; kvantificering af BODIPY signalet viste også en defekt i lipidhåndtering i Stargardt sygdomsmodellen9.
I betragtning af forekomsten af disse sygdomme og behovet for effektiv behandling sammen med de relevante sygdomsmodeller, der er beskrevet ovenfor, er der behov for at fastlægge solide metoder til kvantificering af effektiviteten af potentielle behandlinger. For at kvantificere lipidaflejringer på en måde, der er objektiv, automatiseret og standardiseret, blev der oprettet en maskinlæringsbaseret software, LipidUNet, så lipidaflejring, når den parres med maskeanalyseværktøjer, hurtigt og effektivt kan identificeres ved hjælp af de almindelige markører Nile Red, BODIPY og APOE. De sammenfattende statistikker, der opnås ved hjælp af denne analysepipeline, kan derefter analyseres og vises grafisk, hvilket giver mulighed for nem sammenligning af behandlingsbetingelser. Protokollens skema er vist i figur 1.
Figur 1: Skematisk protokol: RPE-celler dyrkes på en 96-brønds plade og udfordres med aktivt humant serum eller oprensede ydre kvægsegmenter til at modellere forskellige typer retinale degenerationer in vitro. RPE-celler fikseres og farves til lipoproteinaflejringer med Nile Red, BODIPY og APOE. Et konfokalmikroskop bruges til at erhverve Z-stakke af fluorescerende mærkede lipidpartikler, som efterfølgende behandles til 2D maksimale intensitetsfremskrivninger. En maskinlæringsalgoritme blev trænet til at genkende og korrekt segmentere lipoproteinpartikler. Oversigtstabeller, der indeholder partikelantal og forskellige formmålinger, genereres og kan bruges til efterfølgende plotning og statistisk analyse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Protocol
Alle protokoltrin overholder retningslinjerne fra NIHs menneskelige forskningsetiske komité. Stamcellearbejde og indsamling af patientprøver blev godkendt af Combined NeuroScience Institutional Review Board (CNS IRB) under Office of Human Research Protection (OHRP), NIH, i henhold til 45 CFR 46 retningslinjer fra den amerikanske regering. Patientprøver blev indsamlet ved hjælp af CNS IRB-godkendt samtykkeformular i overensstemmelse med kriterierne i Helsingforserklæringen under protokolnummer NCT01432847 (https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01432847?cond=NCT01432847&draw=2&rank=1).
1. iRPE-generering
- Generer iRPE fra patientens blodafledte iPSC efter den offentliggjorte protokol af Sharma et al., 202211 (figur 2 og figur 3).
Figur 2: Skematisk oversigt over iRPE-differentiering og modning. For at generere iRPE blev en etableret differentieringsprotokol fulgt, og cellerne fik lov til at modnes i 5 uger. Den resulterende cellekultur fungerer som en in vitro-model , der kan manipuleres med forskellige behandlinger for at efterligne RPE-dysfunktion i sygdomme som AMD og Stargardt sygdom. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Repræsentative billeder af vellykket og mislykket RPE-differentiering og modning. To brightfield-billeder ved 10x forstørrelse af TJP1 RPE vises på dag 42 i iRPE-protokollen. (A) Vellykket differentiering og modning vil vise sammenflydende RPE med pigmentering og polygonal morfologi. (B) Mislykket differentiering og modning vil vise klynger af døende celler, som vist her. Klik her for at se en større version af denne figur.
2. Forberedelse af RPE-vedligeholdelsesmedier (RPE-MM)
- Optø N2-tilskuddet ved 4 °C natten over. Optø alle andre reagenser ved stuetemperatur (RT).
- Under sterile betingelser tilsættes de reagenser, der er anført i tabel 1 , ved de anførte fortyndingsfaktorer i henhold til protokollen fastlagt af Sharma et al., 202211.
- Bland mediet godt, og filtrer det ved hjælp af en 0,22 μm filtreringsenhed.
BEMÆRK: Medier er egnede til brug inden for 2 uger, hvis de opbevares ved 4 °C.
3. 96-brønd pladesåning
- Optø en prøve vitronectin ved RT i 3-5 minutter, eller indtil isen er helt smeltet.
- Fortynd vitronectin med 1x Dulbeccos fosfatbufrede saltvand (DPBS) for at opnå den ønskede arbejdsløsning ved anvendelse af en 1:200 fortynding (vitronectin: DPBS). For en plade med 96 brønde skal du belægge hvert hul med 200 μL af arbejdsløsningen.
- Optøet ROCK-hæmmer (Y-27632-dihydrochlorid) kombineres med RPE-MM ved en fortynding på 1:1000 for at opnå en slutkoncentration på 10 μM. Dette er pletteringsmediet til RPE-celler.
- Optø hætteglasset med iRPE ved hjælp af et automatiseret celleoptøningssystem, og overfør iRPE-cellesuspensionen til et 50 ml rør.
- Fortynd cellesuspensionen med pletteringsmediet ved en 1:10 fortynding. Centrifuger glasset ved 400 x g i 5 min.
- Supernatanten suges forsigtigt og opslæmmes igen i 10 ml af pletteringsmediet.
- 400 μL af pletteringsmediet blandes med 100 μL af den opslæmmede celleopløsning til celletælling. Brug denne prøve til at bestemme den levedygtige cellekoncentration af cellesuspensionen ved hjælp af en cellelevedygtighedstæller.
- Fortynd cellesuspensionen med pletteringsmediet til en slutkoncentration på 60.000 celler/ml.
- Aspiration af vitronectinbelægningsopløsningen fuldstændigt fra 96-brøndpladen og dispenser 200 μL af cellesuspensionen i hver brønd. Der vil være ca. 12.000 celler / brønd eller ~ 200 celler / mm2.
- De frøede celleplader inkuberes i 48 timer ved 37 °C og 5 % CO2. Efter 48 timer ændres mediet til RPE-MM uden ROCK-hæmmertilskud. Skift mediet hver 2-3 dage i løbet af 5-ugers modningsperioden.
4. In vitro sygdomsmodeller
- Suppler kompetent human serum (CC-HS) behandling
- Optø humant komplementært serum ved 4 °C natten over.
- Forbered CC-HS og komplementær inkompetente humane serum (CI-HS) medier.
- For at forberede 5 % CC-HS-medier blandes det optøede komplementkompetente humane serum med RPE-MM ved en 1:20 fortynding. Filtrer opløsningen gennem et 0,22 μm mediefilter før brug.
- For at forberede 5% komplementært inkompetent humant serum (CI-HS) medier skal CC-HS først varmeaktiveres i et 57 °C vandbad i 30 minutter og blandes derefter med kulturmediet ved en 1:20 fortynding. Filtrer opløsningen gennem et 0,22 μm mediefilter før brug.
- Serumbehandle cellerne med 200 μL af enten 5% CC-HS eller 5% CI-HS medier for en total inkubationstid på 48 timer, forfriskende mediet efter 24 timer.
- Vask cellerne med 1x DPBS og fiks dem med 4% paraformaldehyd i 20 minutter ved RT. Vask endnu en gang med 1x DPBS og opbevar prøverne ved 4 °C, nedsænket i 200 μL DPBS.
- VALGFRIT: Hvis det ønskes, skal du lyse cellerne fra pladen for kun at vise sub-RPE lipidaflejring.
- For at lyse cellerne og kun efterlade lipidaflejringer skal du fjerne mediet og tilføje 200 μL deioniseret vand til hver brønd.
- Inkuber i 10-15 min, pipette op og ned, indtil cellerne er fjernet. Vask igen med 200 μL deioniseret vand og fastgør straks cellerne med 4% paraformaldehyd.
- Ved hjælp af Hoechst bekræftes effektiviteten af cellefjernelsen ved kernefarvning. Hoechst ved 1:2000 fortynding tilsættes til en 1x DPBS-opløsning indeholdende 1 % bovint serumalbumin (BSA), 0,5 % Tween 20 og 0,5 % Triton-X 100. Inkuber ved RT i 1 time i mørke. Vask derefter med 1x DPBS.
- Behandling af fotoreceptorens ydre segment (POS) på iRPE
- POS-forberedelse
- Fjern POS-pillerøret fra -80 °C-opbevaring, og tø op natten over ved 4 °C i en overdækket isspand.
- Forbered POS-vaskebuffer ved at blande 10 g saccharose i 40 ml dobbeltdeioniseretH2O(ddH2O).
- Blandingen opvarmes ved 40-50 °C under forsigtig omrøring i 15 min. Tilsæt 840 mg natriumbicarbonat til blandingen og rør under opvarmning i 10 min.
- Den totale mængde POS-vaskebuffer justeres til 100 ml med ddH2O, og opløsningens pH justeres til 8,3 med 1 N HCl eller 1 N NaOH efter behov. Vask opløsningen filtreres med et 0,22 μm filter.
BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her; POS-vaskebufferen kan opbevares ved 4 °C natten over. - Når den er optøet, suspenderes pelleten i 15 ml POS-vaskebuffer. Vær forsigtig under pelletsuspensioner for at sikre POS-integritet. POS-suspensionen centrifugeres ved 600 x g ved 4 °C i 20 minutter, hvorefter supernatanten suges til sig.
- Resuspender POS-pelleten i 10 ml POS-vaskebuffer.
- Fjern en 100 μL alikvote af POS + POS-vaskebufferen (POS-opløsning) og fortynd i 400 μL 1x DPBS. Spred 50 μL af den fortyndede POS-opløsning på en blodagarplade og en agaroseplade for at kontrollere for bakterie- og svampekontaminanter. Der fremstilles positive kontroller for hver plade, og alle plader inkuberes i 48 timer ved 37 °C.
- Udfør et qPCR-assay ved at tilsætte 1 μL POS-opløsning til detektionsbrønden for at teste for mycoplasma. For at forstærke DNA-fragmenter skal du udføre 40 cyklusser med denaturering (95 ° C, 15 s) og udglødning og forlængelse (60 ° C, 1 min). De fremadgående og omvendte primere til påvisning af mycoplasma i POS-prøven er som følger:
Fremad primer: GGA TTA GAT ACC CTG GTA GTC CAC G
Omvendt primer: CGT CAA TTC CTT TAA GTT TCA CTC TTG GC - Mål POS-koncentrationen ved hjælp af en celleanalysator og alikvote efter behov. For en brønd med 96 brøndplader med RPE-celler er 3 x 106 POS tilstrækkelig. Det ønskede forhold er 10 POS / RPE-celle. De delprøver opbevares ved 80 °C til senere brug.
- Tilføjelse af POS til celler
- Optø hætteglas med POS i et isbad.
- Bland den beregnede mængde forberedt POS med RPE-MM og behandl cellerne med POS en gang dagligt i 7 dage.
BEMÆRK: Tilbered POS-opløsning frisk dagligt. - Vask cellerne med 1x DPBS og fastgør dem derefter med 4% paraformaldehyd i 20 minutter ved RT. Vask med DPBS endnu en gang og opbevar prøver ved 4 °C, nedsænket i 200 μL DPBS.
- POS-forberedelse
5. Farvning for sub-RPE-aflejringer
- Nilrød farvningsprotokol
- Efter PFA-fiksering vaskes prøverne 3 gange med 1x DPBS.
BEMÆRK: Hvis protokollen ikke anvendes straks, kan den sættes på pause her, men prøverne skal opbevares i en 1x DPBS + 0,02% natriumazidopløsning ved 4 °C. - For at fremstille Nilens røde stamopløsning opløses Nilens røde pulver i acetone ved 3 mg/ml koncentration. Inkuber i 15 minutter ved RT med periodisk blanding. Opløsningerne filtreres med et 0,22 μm filter en eller to gange afhængigt af det bundfaldsniveau, der er tilbage i opløsningen.
BEMÆRK: Beskyt stamopløsningen mod lys. - For at forberede arbejdsløsningen fortyndes stamopløsningen i et forhold på 1:500 i 1x DPBS. Tilsæt 200 μL af arbejdsløsningen til prøven i 30 minutter ved RT på en ryster og beskyt den mod lys.
- Der vaskes 3 gange med 1x PBS, og prøverne opbevares ved 4 °C, nedsænket i 200 μL DPBS.
BEMÆRK: Hvis der udføres et forsøg på transwells i stedet for en 96-brøndplade, kan prøver monteres på et dias med monteringsmedier, dækkes med en glasdæksel og forsegles med gennemsigtig neglelak. Man skal være omhyggelig med at montere prøven med cellerne opad.
- Efter PFA-fiksering vaskes prøverne 3 gange med 1x DPBS.
- BODIPY farvning protokol
- Til stamopløsning opløses BODIPY i vandfrit dimethylsulfoxid (DMSO) for at opnå en stamkoncentration på 3,8 mM.
- For PFA-faste prøver fortyndes BODIPY-bestanden ved 1:300 i 1x DPBS. Tilsæt 200 μL til celler og inkuber natten over på en vipper ved RT.
- Vask 3 gange med 1x DPBS og opbevar prøverne ved 4 °C, nedsænket i 200 μL DPBS.
BEMÆRK: Hvis der udføres et forsøg på transwells i stedet for en 96-brøndplade, kan prøver monteres på et dias med monteringsmedier, dækkes med en glasdæksel og forsegles med gennemsigtig neglelak. Man skal være omhyggelig med at montere prøven med cellerne opad.
- APOE immunfarvning protokol
- Kombiner 1x DPBS med 1% bovint serumalbumin (BSA), 0,5% Tween 20 og 0,5% Triton-X 100 for at skabe en bufferopløsning.
- For PFA-faste prøver blokeres og permealiseres prøven i 200 μL af bufferopløsningen i 1 time ved RT.
- Der tilsættes APOE primært antistof fortyndet kl. 1:100 i bufferopløsningen og inkuberes natten over ved RT.
- Den følgende dag vaskes prøverne 3 gange med 1x DPBS.
- Der tilsættes et sekundært antistof ved 1:1000 fortynding i bufferopløsningen, og der tilsættes 200 μL af opløsningen til cellerne i 1 time ved RT.
- Vask 3 gange med 1x DPBS og opbevar prøver ved 4 °C, nedsænket i 200 μL DPBS.
BEMÆRK: Hvis der udføres et forsøg på transwells i stedet for en 96-brønds plade, kan prøver monteres på et dias med monteringsmedier (fluormontering), dækket med en glasdæksel og forseglet med gennemsigtig neglelak. Man skal være omhyggelig med at montere prøven med cellerne opad.
6. Billedautomatisering og -behandling
- Automatisk billedscanning
BEMÆRK: Zeiss LSM 800 inverteret konfokal scanningsmikroskop og ZEN 3.2 (blå udgave) software blev brugt i denne undersøgelse. Sørg for, at 96-brøndpladen opvarmes til RT i mindst 60 minutter før billeddannelse for at undgå fokalplandrift under scanningen på grund af en ændring i mediets brydningsindeks med temperaturændring.- Brug et konfokalmikroskop og et 40x mål til at oprette en scanningsprofil med de passende fluorescerende kanaler til den anvendte lipidmarkør og eventuelle yderligere antistoffer.
- Brug afkrydsningsfeltet Fliser til at indstille billedautomatisering. For at kalibrere 96-brøndspladen skal du sikre dig, at de korrekte prøvebærermålinger er indtastet og valgt. Klik derefter på knappen Kalibrer for at kalibrere pladen i henhold til instruktionerne, hvilket kræver, at du bruger 10x-målet.
- Vælg visningen Avanceret opsætning for at vælge passende brønde og tilføje 3 forskellige billedpunkter nær midten af brønden ved hjælp af funktionen Positioner . Dette kan gøres manuelt under underfanen Position eller tilfældigt ved hjælp af fanen Positionsopsætning og vælge Opsætning af transportør. Gentag for alle brønde med samme farvning.
- For optimal fokusering og Z-stack-positionering under automatisering skal du gå til fanen Fokusstrategi for at vælge Brug fokusoverflade/Z-værdier, der er defineret af Feltopsætning. Alternative metoder kan bruge andre fokusstrategier, men det anbefales at bruge denne indstilling for at få de mest ensartede resultater.
- Under fanen Felter skal du klikke på Bekræft positioner og manuelt indstille det centrale Z-plan for hver position. Indstillingerne i underfanen Indstillinger vil bestille erhvervelse af billeder, så tjek dette, før du begynder at billede. Hvis du vil hente billeder i den rækkefølge, positionerne blev valgt, skal du fjerne markeringen i afkrydsningsfelterne Fliseområder/Placeringer og Transportørbrønde/Container . Vælg Opdel scener i separate filer for nem billedbehandling.
- Sørg for, at fanen Z-Stack er indstillet til Centrer, et interval indtastes til brugerens præferencer, og knappen Optimal er valgt for at indstille udsnitsintervallet.
- Når du har optimeret fanerne Anskaffelsestilstand, Kanaler, Fokusstrategi, Z-Stack og Tiles , skal du starte eksperimentet.
- Billedbehandling
- Brug en batchbilledbehandlingsmetode til at oprette maksimale projektioner af hver Z-stak med metoden Extended Depth of Focus .
- Brug en batchbilledbehandlingsmetode til at eksportere de maksimale projektionsfiler som 16-bit TIFF-billeder. Indstil komprimeringen til Ingen , og sørg for, at Originale data er markeret. Det resulterende billede skal være en maksimal projektionsgråskala TIFF for kun den fluorescenskanal, hvorpå lipidmarkøren udtrykkes.
7. Segmentering og kvantificering
BEMÆRK: LipidUNet-programmet blev trænet på 40x billeder fra en 96-brønds plade. Det anbefales stærkt at bruge billeder, der blev opnået ved hjælp af en 40x målsætning.
- Installer LipidUNet-softwaren. LipidUNet kan downloades fra følgende GitHub-lager: https://github.com/RPEGoogleMap/LipidUNet
- Identificer de TIFF-billeder, der repræsenterer enten Nile Red, Bodipy eller APOE, og flyt dem til en mappe med navnet imgs i en mappe med navnet enten Nile_Red, Bodipy eller APOE, afhængigt af den anvendte metode.
BEMÆRK: Nøjagtige navngivningskonventioner skal bruges til LipidUNet-programmet for at genkende mapperne. - Åbn LipidUNet-softwaren (figur 4).
- På fanen Forudsig i softwaren skal du vælge den relevante mappe (Nile_Red, Bodies eller APOE) ved at klikke på ellipsen og navigere til den navngivne mappe. Bekræft, at LipidUNet-programmet har identificeret billederne korrekt ved at kontrollere klasseposten.
- Vælg en sandsynlighedsgrænse for algoritmen mellem 0,01 og 0,99. En højere værdi eliminerer flere falske positiver, men kan forårsage flere falske negativer, og lavere værdier kan introducere flere falske positiver, mens flere falske negativer elimineres. En værdi på 0,65 er standard og anbefales.
- Klik på Forudsig.
BEMÆRK: Softwaren gentager automatisk gennem alle billederne og opretter en ny mappe kaldet predicted_masks i den valgte mappe. - Brug et maskeanalyseværktøj til at gentage gennem de genererede masker og give en kvantitativ optælling af de tærskelede lipidaflejringer fra maskebillederne.
- Analyser de genererede tælledata for at sammenligne behandlingsforholdene.
Figur 4: LipidUNet brugergrænseflade. LipidUNet-softwaren har forskellige sektioner at vælge til træningsdatamappen, hvor billeder af lipidaflejringer er blevet identificeret korrekt; modelvægtmappen, som udarbejdes på grundlag af træningsdataene og forudsigelsesdatamappen, hvor brugeren indtaster deres billeder til segmentering. Klik her for at se en større version af denne figur.
Representative Results
Denne protokol giver en arbejdsgang til at identificere lipidaflejringer farvet af Nile Red, BODIPY og APOE. Den udviklede software kan automatisk identificere og kvantificere lipidaflejringer og fungerer bedst, når den skitserede protokol er optimeret. Inkluderet er eksempler på vellykket differentieret RPE (figur 3A) og dårligt differentieret RPE (figur 3B), da cellemodellens kvalitet i høj grad påvirker kvaliteten af korrekt billedsegmentering.
To af de tre markører, der er beskrevet i protokollen, Nile Red og BODIPY, identificeres som små cirkulære punkter, der er tydeligt lyse i fluorescerende billeder (figur 5 og figur 6). Et "positivt" billede fra protokollen ville være en passende identifikation af disse forskellige forekomster (figur 5A-D og figur 5E-H). Et "negativt" resultat ville vise forkert segmentering af billedet ved at forveksle baggrundsfluorescens som en aflejring, enten på grund af svag farvning (figur 6A-C og figur 6D-F) eller på grund af høj baggrundsintensitet (figur 6G-I).
APOE-aflejringer har forskellige størrelser og former, der fremstår mere ovale eller uregelmæssige snarere end de cirkulære aflejringer af Nile Red og BODIPY. Disse aflejringer er også mindre punkterede, og signalintensiteten kan variere mellem aflejringer på grund af variationer i prøvens permeabilisering. Korrekt identifikation identificerer hver indbetaling, herunder dem, der er mindre mættede (figur 5I-L), mens forkert segmentering ikke opfanger disse indskud (figur 6J-L). Derfor er det vigtigt at optimere farvnings- og billeddannelsesmetoder for at undgå drastisk variation. En måde at gøre dette på er ved at være opmærksom på prøvepermeabiliseringstrinnene under immunfarvning. For at optimere fluorescerende signal kan celler lyseres inden fiksering og immunfarvning for APOE, hvilket resulterer i jævn mætning og bedre segmentering af APOE-aflejringerne.
Forudsat er også segmenterede billeder af celler modnet på en anden kulturplatform end en 96 brøndplade. LipidUNet-softwaren blev kørt på billeder af celler dyrket på en transwell, og mens lipidaflejringerne er tærskelværdige, er porerne i transwellmembranen også (figur 6M-O). På grund af ligheden i form og størrelse vil LipidUNet-softwaren i sin nuværende form maskere både lipidaflejringer og transwellporer uden forskel.
Figur 5: Repræsentative resultater. (A, E, I) 96-godt belagt RPE er farvet med Hoechst-kernefarvning (blå) og enten Nilrød (magenta), BODIPY (grøn) eller APOE (orange) og er de maksimale intensitetsfremskrivninger af en Z-stak. (B, F, J) Gråtoneinputbillederne til LipidUNet-softwaren efter billedbehandling. (C, G, K) Masker genereret af LipidUNet, hvor alle aflejringer er identificeret korrekt. (D,H,L) Konturer af hver maskeret partikel er nummereret. Disse etiketter gør det muligt at forbinde hver partikel i billedet til en post i spreadheet med de rå data. (A-D) viser Nile Red-farvning, og softwaren er i stand til at genkende aflejringerne mod baggrunden nøjagtigt på trods af et svagere signal. (E-H) viser en stærk kontrast mellem BODIPY-signalet og baggrunden, hvilket er ideelt. LipidUNet identificerer korrekt hver indbetaling i billedet. (I-L) viser et stærkt APOE-signal og repræsenterer variationen i signalmætning, der ofte ses med denne plet. Ikke desto mindre er billedsegmentering i stand til at identificere grænserne for hver APOE-indbetaling. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Suboptimale resultater. (A, D, G, J, M) 96-godt belagt RPE er farvet med Hoechst-kernefarvning (blå) og enten Nilrød (magenta), BODIPY (grøn) eller APOE (orange) og er de maksimale intensitetsfremskrivninger af en Z-stak. (B, E, H, K, N) Gråtoneinputbillederne til LipidUNet-softwaren efter billedbehandling. (C,F,I,L,O) De forkerte masker genereret af LipidUNet. Røde cirkler angiver, hvor softwaren fejlagtigt har identificeret en lipidaflejring. (A-C) Nile Red-behandling er forkert, fordi softwaren har identificeret baggrundsfarvningen som et depositum. Dette kan ske oftere, når der er høj baggrund, men få lipidaflejringer i billedet. To eksempler på BODIPY-farvning vises: et billede af dårlig kvalitet på grund af (D-F) svag BODIPY-farvning og (G - I) et stærkt BODIPY-signal med høj baggrund. I begge tilfælde er softwaren ikke i stand til at skelne små, cirkulære lipidaflejringer fra den underliggende cirkulære ring, der omgiver kernen. Mens farvning og billeddannelse skal optimeres for at undgå disse fejl, er den seneste version af LipidUNet stort set forbedret for disse billeder. (J-L) Forkert APOE-segmentering. Da aflejringerne er mere variable i størrelse og mætning af signal, har softwaren svært ved at genkende nogle indskud. (M-O) RPE podet på en transwell og farvet med Nile Red. En skive af Z-stakken er vist her med både Nile Red lipidaflejringer og transwell porer. Softwaren er ikke i stand til at skelne mellem de to, som vist ved den røde cirkel, der indeholder transwellporer og den grønne pil, der peger på Nilrøde aflejringer. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Sammenligning af maskeværktøj. (A, B, C) 96-godt belagt RPE med variable mængder lipidaflejring identificeres med Nile Red (rød). Billederne maskeres ved hjælp af tre forskellige almindelige maskeringsmetoder, Find Maxima, Max Entropy og Renyi Entropy, og sammenlignes med den LipidUNet-genererede maske. Det originale billede ledsages af en manuel optælling af lipidaflejringerne, mens maskerne viser de forudsagte tællinger ved hver segmenteringsmetode. Den gennemsnitlige fejlprocent blev beregnet for hver segmenteringsmetode ved hjælp af følgende formel: middel[(|Forventet antal - manuel optælling|/manuel optælling) x 100]. Den LipidUNet-genererede maske identificerer mere præcist lipidaflejringer på tværs af billeder med variabel aflejring sammenlignet med andre maskeringsmetoder (gennemsnitlige fejlrater: 23% LipidUnet, 1164% Find Maxima, 851% Max Entropi, 203% Renyi Entropi). Klik her for at se en større version af denne figur.
| Komponent | Kat nummer | Lager Conc. | Endelig konc. | Ml |
| MEM alfa | 12571-063 | NA | 500 | |
| N2 supplement | 17502-048 | NA | 1% | 5 |
| Varme inaktiveret FBS | SH30071,03 | NA | 5% | 25 |
| NMEM NEAA | 11140-050 | 10mM | 0,01 mM | 5 |
| Natriumpyruvat | 11360-070 | 100mM | 1mM | 5 |
| Penicillin-streptomycin | 15140-122 | 10000u/ml | 100U/ml | 5 |
| Taurin | T4571 | 50mg/ml | 250ug/ml | 2.5 |
| Hydrocortison | H6909 | 18,1 mg/l | 20ug/L | 0.553 |
| T3 | T5516 | 20ug/L | 0,013ug/L | 0.33 |
| Samlet volumen, ml | 548.383 | |||
Tabel 1: RPE-MM-reagenssammensætning. En liste over reagenser og optimale koncentrationer for RPE-MM.
Discussion
Denne protokol giver en metode til effektivt at mærke, afbilde og kvantificere lipidaflejringer i monogene og polygene in vitro-sygdomsmodeller for degenerative øjensygdomme. Den AI-baserede software, LipidUNet, kan anvendes på tre almindelige lipidmarkører, APOE, Nile Red og BODIPY, og giver en hurtig, automatisk analysemetode, der gør det muligt for kvantificering at være standard og upartisk.
Hovedbegrænsningen ved LipidUNet er det faktum, at træningsdatasættet til AI var begrænset til 40x forstørrelsesbilleder af celler dyrket i en 96-brøndplade. Som et resultat af træningsbilledsættet er LipidUNet i sin nuværende form begrænset til at analysere 40x forstørrelsesbilleder. Softwaren kan bruges til at analysere 40x billeder af celler dyrket på andre kulturoverflader udover en 96 brøndplade, men man skal sørge for at undersøge de genererede outputmasker for at verificere nøjagtig tærskelværdi af softwaren. Flere billedsæt (ved forskellige forstørrelser) vil være nødvendige for at udvide omfanget af, hvilke prøver / billeder det kan analysere.
Protokollen har flere kritiske trin. I lipidmarkørtrinnet skal brugeren bekræfte, at deres valgte mærkningsforbindelse (BODIPY, APOE, Nile Red) har mærket deres prøve effektivt. Modne RPE-celler er ofte stærkt pigmenterede, hvilket kan forringe det fluorescerende signal fra antistofimmunfarvning. Når fluorescenssignalet er svagt, eller når der er for meget baggrundsfarvning, kan LipidUNet ikke skelne lipiddråber nøjagtigt. Af samme grund skal korrekt valgte anskaffelsesindstillinger for protokollens automatiske billeddannelsestrin bruges. Hvis de erhvervede billeder er af dårlig kvalitet, vil LipidUNet kæmpe for korrekt maskering af billeder, og derfor vil kvantificering være unøjagtig (figur 6A-L). Endelig er efterbehandling af billederne et vigtigt skridt, da LipidUNet har specifikke krav til, at softwaren skal fungere.
Sammenlignet med arbejdsgange til lipidanalyse, der bruger manuel tærskelværdi, eller teknikker, der involverer automatisk tærskelværdi i software som Fiji, tilbyder LipidUNet en upartisk og pålidelig segmentering på tværs af billeder med variabel lipidaflejring, hvilket afspejles af en lille fejlrate i identifikationen af lipidpartikler (figur 7). Softwaren giver brugeren mulighed for at indtaste yderligere træningsbilleder, hvilket giver mulighed for analyse af billedsæt ud over dem, der bruger et 40x forstørrelsesmål eller endda dem, der bruger en anden lipidmarkør, som beskrevet i protokollen. I fremtiden vil softwaren blive uddannet til at analysere 3D-billeder, så kvantificering af lipidindskudsvolumen er mulig. Degenerative øjensygdomme, der implicerer lipidaflejring som en stor bidragyder til patologi, er udbredt, og tilfælde forventes at stige, da den ældre befolkning udvides13. Nøjagtige sygdomsmodeller og effektive analyseværktøjer, som vi har skitseret i denne protokol, vil give mulighed for udvikling af nye terapeutiske interventioner.
Disclosures
Ingen oplysninger.
Acknowledgments
Vi takker National Eye Institute (NEI) histologi kerne for brugen af Zeiss konfokale system. Dette arbejde blev støttet af NEI IRP-midler (tilskudsnummer ZIA EY000533-04).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm Steriflip filter system | EMD Millipore | SCGP00525 | |
| 1x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-144 | |
| 3,3',5-Triiodo-L-thyronine | Sigma | T5516 | |
| Albumin Bovine, Fraction V | MP Biomedical | 160069 | |
| Alexa Fluor 555 rabbit anti-goat IgG (H+L) | Invitrogen | A21431 | APOE secondary antibody |
| APOE primary antibody | Millipore Sigma | AB947 | |
| BODIPY 493/503 | Invitrogen | D3922 | Protect from light |
| Complement competent human serum | Millipore Sigma | S1-LITER | |
| CTS N2 Supplement | Life Technologies | A13707-01 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30071.03 | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | Slide mounting media |
| Glass Cover Slips #1 1/2 22 mm x 22 mm | Electron Microscopy Sciences | 72204-01 | |
| Glass Microscope Slide 25 mm x 75 mm- 1.2 mm Thick | Electron Microscopy Sciences | 71870-01 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0396 | |
| MEM Alpha | Life Technologies | 12571-063 | |
| MEM non-essential Amino Acids | Life Technologies | 11140 | |
| Nile Red | Sigma | 72485-100MG | Protect from light |
| Paraformaldehyde 16% Solution, EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Penicillin-Strep | Life Technologies | 15140-148 | |
| Phosphate Buffered Saline 10x | Gibco | 70011-044 | |
| Rod Outer Segments (OS) | InVision Bioresources | 98740 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | |
| Sodium Pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S1888 | |
| SYBR Green Master Mix | Bio-Rad | 1725274 | |
| Taurine | Sigma | T0625 | |
| Triton X-100 | Sigma | 9002-93-1 | |
| Tween 20 Ultrapure | Affymetrix | 9005-64-5 | |
| Vitronectin | Life Technologies | A14701SA | |
| Y-27632 dihydrochloride | R&D Systems | 1254 |
References
- Kanow, M. A., et al. Biochemical adaptations of the retina and retinal pigment epithelium support a metabolic ecosystem in the vertebrate eye. eLife. 6, e28899 (2017).
- Adijanto, J., et al. The retinal pigment epithelium utilizes fatty acids for ketogenesis. The Journal of Biological Chemistry. 289 (30), 20570-20582 (2014).
- Farnoodian, M., et al. Cell-autonomous lipid-handling defects in Stargardt iPSC-derived retinal pigment epithelium cells. Stem Cell Reports. 17 (11), 2438-2450 (2022).
- Curcio, C. A. Soft drusen in age-related macular degeneration: Biology and targeting via the oil spill strategies. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (4), AMD160-AMD181 (2018).
- Cankova, Z., Huang, J. D., Kruth, H. S., Johnson, M. Passage of low-density lipoproteins through Bruch's membrane and choroid. Experimental Eye Research. 93 (6), 947-955 (2011).
- Curcio, C. A., et al. Esterified and unesterified cholesterol in drusen and basal deposits of eyes with age-related maculopathy. Experimental Eye Research. 81 (6), 731-741 (2005).
- Miyagishima, K. J., et al. AMPK modulation ameliorates dominant disease phenotypes of CTRP5 variant in retinal degeneration. Communications Biology. 4 (1), 1360 (2021).
- Sharma, R., et al. Epithelial phenotype restoring drugs suppress macular degeneration phenotypes in an iPSC model. Nature Communications. 12 (1), 7293 (2021).
- Farnoodian, M., et al. Cell-autonomous lipid-handling defects in Stargardt iPSC-derived retinal pigment epithelium cells. Stem Cell Reports. 17 (11), 2438-2450 (2022).
- Hallam, D., et al. An induced pluripotent stem cell patient specific model of complement factor H (Y402H) polymorphism displays characteristic features of age-related macular degeneration and indicates a beneficial role for UV light exposure. Stem Cells (Dayton, Ohio). 35 (11), 2305-2320 (2017).
- Sharma, R., Bose, D., Montford, J., Ortolan, D., Bharti, K. Triphasic developmentally guided protocol to generate retinal pigment epithelium from induced pluripotent stem cells. STAR Protocols. 3 (3), 101582 (2022).
- Issa, P. C., Barnard, A. R., Herrmann, P., Washington, I., MacLaren, R. E. Rescue of the Stargardt phenotype in Abca4 knockout mice through inhibition of vitamin A dimerization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (27), 8415-8420 (2015).
- GBD 2019 Blindness and Vision Impairment Collaborators. Blindness and Vision Impairment Collaborators. Causes of blindness and vision impairment in 2020 and trends over 30 years, and prevalence of avoidable blindness in relation to VISION 2020: the Right to Sight: an analysis for the Global Burden of Disease Study. Lancet Global Health. 9 (2), e144-e160 (2021).
