Summary
Degenerative øyesykdommer som påvirker retinalpigmentepitellaget i øyet har monogen og polygen opprinnelse. Flere sykdomsmodeller og en programvare, LipidUNet, er utviklet for å studere sykdomsmekanismer, samt potensielle terapeutiske inngrep.
Abstract
Retinalpigmentepitelet (RPE) er et monolag av sekskantede celler plassert på baksiden av øyet. Det gir næring og støtte til fotoreceptorer og koroidale kapillærer, utfører fagocytose av fotoreceptor ytre segmenter (POS), og utskiller cytokiner på en polarisert måte for å opprettholde homeostasen til ytre netthinnen. Dysfunksjonell RPE, forårsaket av mutasjoner, aldring og miljøfaktorer, resulterer i degenerasjon av andre retinale lag og forårsaker synstap. Et kjennetegn fenotypisk trekk ved degenererende RPE er intra- og subcellulære lipidrike avsetninger. Disse forekomstene er en vanlig fenotype på tvers av forskjellige retinale degenerative sykdommer. For å reprodusere lipidavsetningsfenotypen av monogene retinale degenerasjoner in vitro, ble indusert pluripotent stamcelleavledet RPE (iRPE) generert fra pasientens fibroblaster. Cellelinjer generert fra pasienter med Stargardt og Late-onset retinal degenerasjon (L-ORD) sykdom ble matet med POS i 7 dager for å replikere RPE fysiologisk funksjon, noe som forårsaket POS fagocytose-indusert patologi i disse sykdommene. For å generere en modell for aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD), en polygen sykdom assosiert med alternativ komplementaktivering, ble iRPE utfordret med alternative komplementanafylatoksiner. De intra- og subcellulære lipidavsetningene ble karakterisert ved bruk av Nilrød, bor-dipyrrometen (BODIPY) og apolipoprotein E (APOE). For å kvantifisere tettheten av lipidavsetninger ble det utviklet en maskinlæringsbasert programvare, LipidUNet. Programvaren ble trent på projeksjonsbilder av iRPE med maksimal intensitet på kulturoverflater. I fremtiden vil det bli trent til å analysere tredimensjonale (3D) bilder og kvantifisere volumet av lipiddråper. LipidUNet-programvaren vil være en verdifull ressurs for å oppdage stoffer som reduserer lipidakkumulering i sykdomsmodeller.
Introduction
Retinalpigmentepitelet (RPE) er et monolag av celler som ligger på baksiden av øyet ved siden av retinale fotoreceptorer. RPE spiller en viktig rolle i å opprettholde riktig visjon ved å gi metabolsk og strukturell støtte til fotoreceptorene. Sunne RPE-celler er preget av en distinkt sekskantet morfologi. De er forbundet med tette veikryss, som gjør at RPE kan fungere som en barriere mellom choriocapillaris plassert på basalsiden og fotoreceptorer plassert apikal. For å opprettholde retinaløkosystemet transporterer RPE nøkkelmetabolitter, for eksempel glukose, til fotoreceptorer på en måte som minimerer glukoseforbruket i RPE1. På grunn av denne begrensningen er RPE avhengig av andre metabolitter for å opprettholde sine metabolske behov, inkludert fettsyrer, som RPE konverterer til ketoner gjennom β-oksidasjon2. Gitt tilbøyelighet til RPE til å utnytte fettsyrer, som sannsynligvis resirkuleres fra fotoreceptor ytre segment (POS) fordøyelse, som energikilde, fører skadelige endringer i lipidbehandlingsveiene i RPE ofte til eller er involvert i både monogene og polygene degenerative retinale sykdommer3.
Aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD), en polygen degenerativ øyesykdom som forårsaker RPE-degenerasjon, har også vært knyttet til avvikende autofagi og lipidmetabolisme i RPE-monolaget. Svikt i et dysfunksjonelt RPE-monolag for å behandle POS og utføre andre kritiske funksjoner fører til ekstracellulære (sub-RPE) avsetninger kalt basale lineære avsetninger (BLinD) plassert mellom RPE og Bruchs membran - et kjennetegn ved AMD-patologier. Hovedkomponenter i BLinD inkluderer lipoproteiner, hvorav den mest tallrike er apolipoprotein E (APOE)4. Akkumulering av tynne lag av BLinD kan føre til myk drusen, som er anerkjent som et klinisk symptom på AMD 5,6.
Flere grupper har vist at stamcelleavledede in vitro sykdomsmodeller som forårsaker RPE-dysfunksjon har sub-RPE lipidakkumulering 7,8,9. Hallam et al. (2017) genererte indusert pluripotent stamcelleavledet RPE (iRPE) fra pasienter med høy risiko for AMD på grunn av en polymorfisme av CFH-genet. iRPE viste drusenakkumulering, som markert ved APOE, og høyrisiko-RPE akkumulerte større forekomster enn iRPE generert fra lavrisikopasienter10.
For å lage en in vitro-modell som rekapitulerer cellulære kjennetegn ved AMD, som lipiddråper og drusenavsetning, ble iRPE-linjer generert fra pasientblodprøver etablert ved hjelp av en tidligere publisert utviklingsstyrt protokoll11. iRPE ble utsatt for komplementkompetent humant serum (CC-HS), en løsning som inneholder anafylatoksiner som etterligner en mulig årsak til AMD: økt alternativ komplementsignalering8. Den resulterende cellulære og subcellulære avsetningen av lipidavsetninger ble målt ved bruk av vanlige lipid- og lipoproteinmarkører, APOE, Nile Red og BODIPY. Gjennom disse markørene ble det vist at aktivert komplementsignalering via CC-HS forverret lipidakkumulering i iRPE-celler8.
For å utvikle en sykdomsmodell for en monogen retinal degenerativ sykdom, ble iRPE-linjer utviklet fra pasienter med Stargardt sykdom, en sykdom forårsaket av mutasjoner til ABCA4-genet i RPE. Det har tidligere blitt vist at når ABCA4 slås ut, akkumuleres A2E lipofuscin, et intracellulært innskudd kjent for å inneholde høye nivåer av fosfolipider og lysavhengige lipidperoksidasjonsprodukter, inne i RPE12. ABCA4 knockoutlinjer ble utviklet langs pasientlinjene, og begge ble utsatt for POS-fôring. Stargardt iRPE demonstrerte POS-fagocytose-indusert patologi, og viste økt lipidakkumulering kvantifisert ved BODIPY-farging. RPE avledet fra ABCA4 KO iPSCs ble utsatt for CC-HS-behandling; kvantifisering av BODIPY-signalet viste en defekt i lipidhåndtering i Stargardts sykdomsmodell også9.
Gitt utbredelsen av disse sykdommene og behovet for effektive terapier, sammen med de relevante sykdomsmodellene beskrevet ovenfor, er det behov for å etablere robuste metoder for å kvantifisere effekten av potensielle behandlinger. For å kvantifisere lipidavsetninger på en måte som er objektiv, automatisert og standardisert, ble en maskinlæringsbasert programvare, LipidUNet, opprettet slik at lipidavsetning, når den ble parret med maskeanalyseverktøy, raskt og effektivt kan identifiseres ved hjelp av de vanlige markørene Nile Red, BODYPY og APOE. Sammendragsstatistikken som er oppnådd ved hjelp av denne analyserørledningen, kan deretter analyseres og vises grafisk, noe som gjør det enkelt å sammenligne behandlingsbetingelser. Skjemaet til protokollen er vist i figur 1.
Figur 1: Skjematisk av protokollen: RPE-celler dyrkes på en 96-brønnsplate og utfordres med aktivt humant serum eller renset ytre segmenter av storfe for å modellere forskjellige typer retinal degenerasjoner in vitro. RPE-celler er faste og farget for lipoproteinavsetninger med Nile Red, BODYPY og APOE. Et konfokalmikroskop brukes til å skaffe Z-stabler av fluorescerende merkede lipidpartikler, som deretter behandles til 2D maksimal intensitetsprojeksjoner. En maskinlæringsalgoritme ble trent til å gjenkjenne og korrekt segmentere lipoproteinpartikler. Sammendragstabeller som inneholder partikkelantall og ulike formberegninger genereres og kan brukes til senere plotting og statistisk analyse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Protocol
Alle protokolltrinn følger retningslinjene fastsatt av NIHs komité for human forskningsetikk. Stamcellearbeid og pasientprøveinnsamling ble godkjent av Combined NeuroScience Institutional Review Board (CNS IRB) under Office of Human Research Protection (OHRP), NIH, i henhold til 45 CFR 46 retningslinjer fra den amerikanske regjeringen. Pasientprøver ble samlet inn ved hjelp av CNS IRB-godkjent samtykkeskjema i henhold til kriteriene satt av Helsinkideklarasjonen under protokollnummer NCT01432847 (https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01432847?cond=NCT01432847&draw=2&rank=1).
1. iRPE generasjon
- Generer iRPE fra pasientblodavledet iPSC etter publisert protokoll av Sharma et al., 202211 (figur 2 og figur 3).
Figur 2: Skjematisk fremstilling av iRPE-differensiering og modning. For å generere iRPE ble en etablert differensieringsprotokoll fulgt, og cellene fikk modnes i 5 uker. Den resulterende cellekulturen fungerer som en in vitro-modell som kan manipuleres med ulike behandlinger for å etterligne RPE-dysfunksjon i sykdommer som AMD og Stargardt sykdom. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Representative bilder av vellykket og mislykket RPE-differensiering og modning. To lysfeltbilder ved 10x forstørrelse av TJP1 RPE vises på dag 42 av iRPE-protokollen. (A) Vellykket differensiering og modning vil vise konfluent RPE med pigmentering og polygonal morfologi. (B) Mislykket differensiering og modning vil vise klynger av døende celler, som vist her. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
2. RPE vedlikeholdsmedier (RPE-MM) forberedelse
- Tine N2-tilskuddet ved 4 °C over natten. Tine alle andre reagenser ved romtemperatur (RT).
- Under sterile forhold, legg til reagensene oppført i tabell 1 ved de oppførte fortynningsfaktorene, i henhold til protokollen etablert av Sharma et al., 202211.
- Bland mediet godt og filtrer det med en 0,22 μm filtreringsenhet.
MERK: Media er egnet for bruk innen 2 uker hvis de oppbevares ved 4 °C.
3. 96-brønns platesåing
- Tine en alikot av vitronectin ved RT i 3-5 min eller til isen er helt smeltet.
- Fortynn vitronectin med 1x Dulbeccos fosfatbufrede saltvann (DPBS) for å oppnå ønsket arbeidsløsning ved bruk av en 1:200 fortynning (vitronectin: DPBS). For en 96-brønnsplate, belegg hver brønn med 200 μL av arbeidsløsningen.
- Kombiner tint ROCK-hemmer (Y-27632 dihydroklorid) med RPE-MM ved en 1:1000 fortynning for å oppnå en endelig konsentrasjon på 10 μM. Dette er pletteringsmediet for RPE-celler.
- Tine iRPE-hetteglasset ved hjelp av et automatisert celletinesystem og overfør iRPE-cellesuspensjonen til en 50 ml slange med slanger.
- Fortynn cellesuspensjonen med pletteringsmediet ved en fortynning på 1:10. Sentrifuger røret ved 400 x g i 5 minutter.
- Aspirer supernatanten forsiktig og resuspender cellene i 10 ml av pletteringsmediet.
- Bland 400 mikrol av pletteringsmediet med 100 mikrol av den resuspenderte celleoppløsningen for celletelling. Bruk denne alikoten til å bestemme den levedyktige cellekonsentrasjonen av cellesuspensjonen ved hjelp av en cellelevedyktighetsteller.
- Fortynn cellesuspensjonen med pletteringsmediet til en endelig konsentrasjon på 60 000 celler/ml.
- Aspirer vitronectinbeleggløsningen helt fra 96-brønnplaten og dispenser 200 μL av cellesuspensjonen i hver brønn. Det vil være omtrent 12.000 celler / brønn eller ~ 200 celler / mm2.
- Inkuber de sådde celleplatene i 48 timer ved 37 °C og 5 % CO2. Etter 48 timer, bytt media til RPE-MM uten ROCK inhibitor supplement. Bytt media hver 2-3 dag i løpet av 5-ukers modningsperioden.
4. In vitro sykdomsmodeller
- Komplementær kompetent human serum (CC-HS) behandling
- Tin komplementkompetent serum ved 4 °C over natten.
- Forbered CC-HS og utfyll inkompetente humane serummedier (CI-HS).
- For å tilberede 5 % CC-HS-medier, bland det tinte komplementkompetente humane serumet med RPE-MM ved en fortynning på 1:20. Filtrer oppløsningen gjennom et 0,22 μm mediefilter før bruk.
- For å forberede 5 % komplementære medier for inkompetent humant serum (CI-HS), må du først varme inaktivere CC-HS i et vannbad på 57 °C i 30 minutter og deretter blandes med dyrkningsmediet ved en fortynning på 1:20. Filtrer oppløsningen gjennom et 0,22 μm mediefilter før bruk.
- Serum behandler cellene med 200 μL av enten 5% CC-HS eller 5% CI-HS media for en total inkubasjonstid på 48 timer, forfriskende media etter 24 timer.
- Vask cellene med 1x DPBS og fiks dem med 4% paraformaldehyd i 20 minutter ved RT. Vask en gang til med 1x DPBS og oppbevar prøvene ved 4 °C, nedsenket i 200 μL DPBS.
- VALGFRITT: Hvis ønskelig, lyse cellene fra platen for å vise bare sub-RPE lipidavsetning.
- For å lyse cellene og la bare lipidavsetninger, fjern mediet og tilsett 200 μL avionisert vann til hver brønn.
- Inkuber i 10-15 min, pipett opp og ned til cellene er fjernet. Vask igjen med 200 μL avionisert vann og fest umiddelbart cellene med 4% paraformaldehyd.
- Bekreft cellefjerningseffekten med kjernefysisk farging ved hjelp av Hoechst. Tilsett Hoechst ved 1:2000 fortynning til en 1x DPBS-løsning inneholdende 1% bovint serumalbumin (BSA), 0,5% Tween 20 og 0,5% Triton-X 100. Inkuber ved RT i 1 time i mørket. Deretter vasker du med 1x DPBS.
- Behandling av fotoreseptor ytre segment (POS) på iRPE
- POS-forberedelse
- Fjern POS-pelletsrøret fra -80 °C og tine over natten ved 4 °C i en tildekket isbøtte.
- Forbered POS-vaskebuffer ved å blande 10 g sukrose i 40 ml dobbeltavionisertH2O(ddH2O).
- Varm blandingen ved 40-50 °C under omrøring forsiktig i 15 minutter. Tilsett 840 mg natriumbikarbonat til blandingen og rør under oppvarming i 10 minutter.
- Juster det totale volumet av POS-vaskebufferen til 100 ml med ddH2O og juster pH i løsningen til 8,3 med 1 N HCl eller 1 N NaOH, etter behov. Filtrer vaskeoppløsningen med et 0,22 μm filter.
MERK: Protokollen kan settes på pause her; POS-vaskebufferen kan lagres ved 4 °C over natten. - Når den er tint, suspender pelleten i 15 ml POS vaskebuffer. Vær forsiktig under pelletssuspensjoner for å sikre POS-integritet. Sentrifuger POS-suspensjonen ved 600 x g ved 4 °C i 20 minutter og aspirer deretter supernatanten.
- Suspender POS-pelleten på nytt i 10 ml av POS-vaskebufferen.
- Fjern en 100 μL alikot av POS + POS-vaskebufferen (POS-løsning) og fortynn i 400 μL 1x DPBS. Spred 50 μL av den fortynnede POS-løsningen på en blodagarplate og en agaroseplate for å kontrollere for bakterielle og soppforurensninger. Forbered positive kontroller for hver og inkuber alle platene i 48 timer ved 37 °C.
- Utfør en qPCR-analyse ved å legge til 1 μL POS-løsning til deteksjonsbrønnen for å teste for mykoplasma. For å amplifisere DNA-fragmenter, utfør 40 sykluser med denaturering (95 ° C, 15 s), og glødning og forlengelse (60 ° C, 1 min). De fremre og bakre primere for påvisning av mykoplasma i POS-prøven er som følger:
Forward primer: GGA TTA GAT ACC CTG GTA GTC CAC G
Omvendt primer: CGT CAA TTC CTT TAA GTT TCA CTC TTG GC - Mål POS-konsentrasjon ved hjelp av en celleanalysator og aliquot etter behov. For en brønn med 96 brønnplater med RPE-celler er 3 x 106 POS tilstrekkelig. Det ønskede forholdet er 10 POS / RPE-celle. Oppbevar alikotene ved 80 °C for fremtidig bruk.
- Tillegg av POS til celler
- Tine hetteglass med POS i et isbad.
- Bland den beregnede mengden forberedt POS med RPE-MM og behandle cellene med POS en gang daglig i 7 dager.
NOTAT: Forbered POS-løsningen fersk daglig. - Vask cellene med 1x DPBS og fikser dem deretter med 4% paraformaldehyd i 20 minutter ved RT. Vask med DPBS en gang til og oppbevar prøver ved 4 °C, nedsenket i 200 μL DPBS.
- POS-forberedelse
5. Farging for sub-RPE innskudd
- Nilen rød farget protokoll
- Etter PFA-fiksering, vask prøvene 3 ganger med 1x DPBS.
MERK: Hvis den ikke brukes umiddelbart, kan protokollen settes på pause her, men prøver må lagres i en 1x DPBS + 0,02% natriumazidoppløsning ved 4 °C. - For å fremstille Nilens røde stamløsning, oppløs Nilrødt pulver i aceton ved 3 mg/ml konsentrasjon. Inkuber i 15 min ved RT med periodisk blanding. Filtrer løsningene med et 0,22 μm filter en eller to ganger, avhengig av nivået av bunnfall som er igjen i løsningen.
MERK: Beskytt stamløsningen mot lys. - For å forberede arbeidsløsningen, fortynn stamoppløsningen i forholdet 1:500 i 1x DPBS. Legg 200 μL av arbeidsløsningen til prøven i 30 minutter ved RT på en shaker og beskytt den mot lys.
- Vask 3 ganger med 1x PBS og oppbevar prøvene ved 4 °C, nedsenket i 200 μl DPBS.
MERK: Hvis du utfører et eksperiment på transbrønner i stedet for en 96-brønnsplate, kan prøvene monteres på et lysbilde med monteringsmedier, dekkes med et glassdeksel og forsegles med gjennomsiktig neglelakk. Det må utvises forsiktighet for å montere prøven med cellene vendt opp.
- Etter PFA-fiksering, vask prøvene 3 ganger med 1x DPBS.
- BODIPY farging protokoll
- For stamløsning oppløses BODIPY i vannfritt dimetylsulfoksid (DMSO) for å oppnå en stamkonsentrasjon på 3,8 mM.
- For PFA-faste prøver, fortynn BODIPY-lager på 1:300 i 1x DPBS. Tilsett 200 μL til celler og inkuber over natten på en rocker ved RT.
- Vask 3 ganger med 1x DPBS og oppbevar prøvene ved 4 °C, nedsenket i 200 μl DPBS.
MERK: Hvis du utfører et eksperiment på transbrønner i stedet for en 96-brønnsplate, kan prøvene monteres på et lysbilde med monteringsmedier, dekkes med et glassdeksel og forsegles med gjennomsiktig neglelakk. Det må utvises forsiktighet for å montere prøven med cellene vendt opp.
- APOE immunostaining protokoll
- Kombiner 1x DPBS med 1% bovint serumalbumin (BSA), 0,5% Tween 20 og 0,5% Triton-X 100 for å lage en bufferløsning.
- For PFA-faste prøver, blokker og permeabiliser prøven i 200 μL av bufferløsningen i 1 time ved RT.
- Tilsett APOE primært antistoff fortynnet ved 1:100 i bufferløsningen og inkuber over natten ved RT.
- Neste dag, vask prøvene 3 ganger med 1x DPBS.
- Legg til et sekundært antistoff ved 1:1000 fortynning i bufferløsningen og tilsett 200 μL av løsningen til cellene i 1 time ved RT.
- Vask 3 ganger med 1x DPBS og oppbevar prøver ved 4 °C, nedsenket i 200 μl DPBS.
MERK: Hvis du utfører et eksperiment på transbrønner i stedet for en 96-brønnsplate, kan prøvene monteres på et lysbilde med monteringsmedier (Fluoromount), dekkes med et glassdeksel og forsegles med gjennomsiktig neglelakk. Det må utvises forsiktighet for å montere prøven med cellene vendt opp.
6. Bildeautomatisering og behandling
- Automatisert bildeskanning
MERK: Zeiss LSM 800 invertert konfokal skanningsmikroskop og ZEN 3.2 (blå utgave) programvare ble brukt i denne studien. Forsikre deg om at 96-brønnsplaten varmes opp til RT i minst 60 minutter før avbildning for å unngå fokalplandrift under skanningen på grunn av endring i brytningsindeksen til mediet med temperaturendring.- Ved hjelp av et konfokalmikroskop og et 40x objektiv, opprett en skanneprofil med passende fluorescerende kanaler for lipidmarkøren som brukes og eventuelle ekstra antistoffer.
- Bruk avmerkingsboksen Fliser til å konfigurere bildeautomatisering. For å kalibrere 96-brønnsplaten, sørg for at de riktige prøvebærermålingene legges inn og velges. Klikk deretter på Kalibrer-knappen for å kalibrere platen i henhold til instruksjonene, noe som krever bruk av 10x-målet.
- Velg visningen Avansert oppsett for å velge passende brønner og legge til 3 forskjellige bildepunkter nær midten av brønnen ved hjelp av funksjonen Posisjoner . Dette kan gjøres manuelt under underfanen Posisjon eller tilfeldig ved å bruke kategorien Posisjonsoppsett og velge Oppsett etter transportør. Gjenta for alle brønnene med samme farging.
- For optimal fokusering og Z-stack-posisjonering under automatisering, gå til kategorien Fokusstrategi for å velge Bruk fokusoverflate/Z-verdier definert av flisoppsett. Alternative metoder kan bruke andre fokusstrategier, men det anbefales å bruke denne innstillingen for å få de mest konsekvente resultatene.
- Klikk Kontroller posisjoner under kategorien Fliser, og angi det sentrale Z-planet manuelt for hver posisjon. Innstillingene i underfanen Alternativer vil bestille anskaffelse av bilder, så sjekk dette før du begynner å bilde. Hvis du vil hente bilder i den rekkefølgen posisjonene ble valgt, fjerner du merket for Flisområder/-posisjoner og Bærerbrønner/containere. Velg Del scener i separate filer for enkel bildebehandling.
- Kontroller at Z-Stack-fanen er satt til Midtstilt, at et område er lagt inn i brukerens innstillinger, og at Optimal-knappen er valgt for å angi stykkeintervallet.
- Når du har optimalisert fanene Anskaffelsesmodus, Kanaler, Fokusstrategi, Z-Stack og Fliser, starter du eksperimentet.
- Bildebehandling
- Ved hjelp av en batchavbildningsmetode kan du lage maksimale projeksjoner av hver Z-stakk med metoden Utvidet dybdeskarphet .
- Bruk en batchbildebehandlingsmetode til å eksportere de maksimale projeksjonsfilene som 16-biters TIFF-bilder. Sett komprimeringen til Ingen og kontroller at det er merket av for Originale data . Det resulterende bildet skal være en maksimal projeksjonsgråskala TIFF av bare fluorescenskanalen som lipidmarkøren uttrykkes på.
7. Segmentering og kvantifisering
MERK: LipidUNet-programmet ble trent på 40x bilder fra en 96-brønnsplate. Det anbefales sterkt å bruke bilder som ble oppnådd ved hjelp av et 40x-mål.
- Installer LipidUNet-programvaren. LipidUNet kan lastes ned fra følgende GitHub-depot: https://github.com/RPEGoogleMap/LipidUNet
- Identifiser TIFF-bildene som representerer enten Nile Red, Bodupy eller APOE, og flytt dem til en mappe som heter imgs i en katalog som heter enten Nile_Red, Bodipy, eller APOE, avhengig av metoden som brukes.
MERK: Nøyaktige navnekonvensjoner må brukes for at LipidUNet-programmet skal gjenkjenne katalogene. - Åpne LipidUNet-programvaren (figur 4).
- I kategorien Predict i programvaren velger du den aktuelle katalogen (Nile_Red, Bodipy , eller APOE) ved å klikke på ellipsen og navigere til den navngitte katalogen. Bekreft at LipidUNet-programmet har identifisert bildene riktig ved å sjekke klasseoppføringen.
- Velg en sannsynlighetsterskel for algoritmen mellom 0,01 og 0,99. En høyere verdi vil eliminere flere falske positiver, men kan føre til flere falske negativer, og lavere verdier kan introdusere flere falske positiver samtidig som flere falske negativer elimineres. En verdi på 0,65 er standard og anbefales.
- Klikk på Forutsi.
MERK: Programvaren vil iterere gjennom alle bildene automatisk og opprette en ny mappe kalt predicted_masks i den valgte katalogen. - Bruk et maskeanalyseverktøy til å gjenta gjennom de genererte maskene og gi et kvantitativt antall terskellipidavleiringer fra maskebildene.
- Analyser de genererte telledataene for å sammenligne behandlingsbetingelser.
Figur 4: LipidUNet brukergrensesnitt. LipidUNet-programvaren har forskjellige seksjoner å velge for treningsdatakatalogen, der bilder av lipidavleiringer er identifisert riktig; modellvektkatalogen, som er produsert fra treningsdataene; og prediksjonsdatakatalogen der brukeren vil legge inn bildene sine for segmentering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Representative Results
Denne protokollen gir en arbeidsflyt for å identifisere lipidavleiringer farget av Nile Red, BODYPY og APOE. Den utviklede programvaren kan automatisk identifisere og kvantifisere lipidavsetninger og fungerer best når protokollen som er skissert er optimalisert. Inkludert er eksempler på vellykket differensiert RPE (figur 3A) og dårlig differensiert RPE (figur 3B), da kvaliteten på cellemodellen i stor grad påvirker kvaliteten på riktig bildesegmentering.
To av de tre markørene beskrevet i protokollen, Nilrød og BODIPY, er identifisert som små sirkulære punkter som er tydelig lyse i fluorescerende bilder (figur 5 og figur 6). Et "positivt" bilde fra protokollen ville være en passende identifikasjon av disse distinkte forekomstene (figur 5A-D og figur 5E-H). Et "negativt" resultat vil vise feil segmentering av bildet ved å feiltolke bakgrunnsfluorescens som et avleiring, enten på grunn av svak farging (figur 6A-C og figur 6D-F) eller på grunn av høy bakgrunnsintensitet (figur 6G-I).
APOE-forekomster har en rekke størrelser og former, og virker mer ovale eller uregelmessige i stedet for de sirkulære forekomstene av Nilen rød og BODIPY. Disse forekomstene er også mindre punkterte, og signalintensiteten kan variere mellom avleiringer på grunn av variasjoner i permeabiliseringen av prøven. Korrekt identifisering vil identifisere hvert innskudd, inkludert de som er mindre mettet (figur 5I-L), mens feil segmentering ikke vil plukke opp disse forekomstene (figur 6J-L). Derfor er det viktig å optimalisere farge- og avbildningsmetoder for å unngå drastisk variasjon. En måte å gjøre dette på er å være nøye med prøvepermeabiliseringstrinnene mens du immunfarging. For å optimalisere fluorescerende signal, kan celler lyseres før fiksering og immunfarging for APOE, noe som resulterer i jevn metning og bedre segmentering av APOE-innskuddene.
Forutsatt er også segmenterte bilder av celler modnet på en annen kulturplattform enn en 96-brønnplate. LipidUNet-programvaren ble kjørt på bilder av celler dyrket på en transbrønn, og mens lipidavleiringene er terske, er også porene i transbrønnmembranen (figur 6M-O). På grunn av likheten i form og størrelse, vil LipidUNet-programvaren i sin nåværende form maskere både lipidavleiringene og transwellporene ukritisk.
Figur 5: Representative resultater. (A,E,I) 96-godt belagt RPE er farget med Hoechst kjernefysisk farging (blå) og enten Nilrød (magenta), BODIPY (grønn) eller APOE (oransje) og er de maksimale intensitetsprojeksjonene til en Z-stabel. (B,F,J) Gråtoneinndatabildene for LipidUNet-programvaren etter bildebehandling. (C,G,K) Masker generert av LipidUNet, hvor alle forekomster er identifisert riktig. (D,H,L) Omriss av hver maskerte partikkel er nummerert. Disse etikettene gjør det mulig å koble hver partikkel i bildet til en oppføring i spreadheet med rådataene. (AD) viser Nile Red farging, og programvaren er i stand til å gjenkjenne innskuddene mot bakgrunnen nøyaktig til tross for et svakere signal. (E-H) viser en sterk kontrast mellom BODIPY-signalet og bakgrunnen, noe som er ideelt. LipidUNet identifiserer korrekt hvert innskudd i bildet. (I-L) viser et sterkt APOE-signal og representerer variasjonen i signalmetning som ofte ses med denne flekken. Ikke desto mindre er bildesegmentering i stand til å identifisere grensene for hvert APOE-innskudd. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Suboptimale resultater. (A, D, G, J, M) 96-godt belagt RPE er farget med Hoechst kjernefysisk farging (blå) og enten Nilen rød (magenta), BODIPY (grønn) eller APOE (oransje) og er de maksimale intensitetsprojeksjonene til en Z-stabel. (B,E,H,K,N) Gråtoneinndatabildene for LipidUNet-programvaren etter bildebehandling. (C,F,I,L,O) Feil masker generert av LipidUNet. Røde sirkler indikerer hvor programvaren feilaktig har identifisert et lipidinnskudd. (AC) Nile Red-behandlingen er feil fordi programvaren har identifisert bakgrunnsfargingen som et innskudd. Dette kan skje oftere når det er høy bakgrunn, men få lipidavleiringer i bildet. To eksempler på BODIPY-farging vises: et bilde av dårlig kvalitet på grunn av (D-F) svak BODIPY-farging og (G - I) et sterkt BODIPY-signal med høy bakgrunn. I begge tilfeller er programvaren ikke i stand til å skille små, sirkulære lipidavleiringer fra bakgrunnssirkelringen som omgir kjernen. Mens farging og avbildning bør optimaliseres for å unngå disse feilene, er den nyeste versjonen av LipidUNet i stor grad forbedret for disse bildene. (J-L) Feil APOE-segmentering. Siden innskuddene er mer variable i størrelse og metning av signal, har programvaren problemer med å gjenkjenne noen innskudd. (VG Nett) RPE frøet på en transwell og farget med Nile Red. En bit av Z-stakken er vist her med både Nilrøde lipidavleiringer og transwellporer. Programvaren er ikke i stand til å skille mellom de to, som vist ved den røde sirkelen som inneholder transwell porer og den grønne pilen som peker på Nile Red innskudd. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Sammenligning av maskeverktøy. (A,B,C) 96-godt belagt RPE med variable mengder lipidavsetning er identifisert med Nilrød (rød). Bildene maskeres ved hjelp av tre forskjellige vanlige maskeringsmetoder, Find Maxima, Max Entropy og Renyi Entropy, og sammenlignes med den LipidUNet-genererte masken. Det opprinnelige bildet er ledsaget av en manuell telling av lipidavsetningene, mens maskene viser de forutsagte tellingene ved hver segmenteringsmetode. Den gjennomsnittlige feilraten ble beregnet for hver segmenteringsmetode ved hjelp av følgende formel: gjennomsnitt[(|Forventet antall - manuell telling | / manuell telling) x 100]. Den LipidUNet-genererte masken identifiserer lipidavleiringer mer nøyaktig på tvers av bilder med variabel avsetning sammenlignet med andre maskeringsmetoder (Gjennomsnittlige feilrater: 23% LipidUnet, 1164% Finn Maxima, 851% Max Entropi, 203% Renyi Entropi). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Komponent | Katt nummer | Lager Conc. | Avsluttende Conc. | Ml |
| MEM alfa | 12571-063 | NA | 500 | |
| N2 supplement | 17502-048 | NA | 1% | 5 |
| Varme inaktivert FBS | SH30071.03 | NA | 5% | 25 |
| NMEM NEAA | 11140-050 | 10mM | 0,01 mM | 5 |
| Natriumpyruvat | 11360-070 | 100mM | 1 mM | 5 |
| Penicillin-streptomycin | 15140-122 | 10000u/ml | 100U/ml | 5 |
| Taurine | T4571 | 50 mg/ml | 250 ug/ml | 2.5 |
| Hydrocortisone | H6909 | 18,1 mg/l | 20ug/L | 0.553 |
| T3 | T5516 | 20ug/L | 0,013 ug/l | 0.33 |
| Totalt volum, ml | 548.383 | |||
Tabell 1: RPE-MM reagenssammensetning. En liste over reagenser og optimale konsentrasjoner for RPE-MM.
Discussion
Denne protokollen gir en metode for effektivt å merke, avbilde og kvantifisere lipidavsetninger i monogene og polygene in vitro sykdomsmodeller for degenerative øyesykdommer. Den AI-baserte programvaren, LipidUNet, kan brukes på tre vanlige lipidmarkører, APOE, Nile Red og BODIPY, og gir en rask, automatisk metode for analyse som gjør at kvantifisering kan være standard og objektiv.
Hovedbegrensningen til LipidUNet er det faktum at treningsdatasettet for AI var begrenset til 40x forstørrelsesbilder av celler dyrket i en 96-brønnsplate. Som et resultat av treningsbildesettet er LipidUNet, i sin nåværende form, begrenset til å analysere 40x forstørrelsesbilder. Programvaren kan brukes til å analysere 40x bilder av celler dyrket på andre kulturflater i tillegg til en 96 brønnplate, men det bør utvises forsiktighet for å undersøke de genererte utgangsmaskene for å verifisere nøyaktig terskel av programvaren. Flere bildesett (ved forskjellige forstørrelser) vil være nødvendig for å utvide omfanget av hvilke prøver / bilder den kan analysere.
Protokollen har flere kritiske trinn. I lipidmarkørtrinnet bør brukeren bekrefte at deres valgte merkeforbindelse (BODIPY, APOE, Nile Red) har merket prøven effektivt. Eldre RPE-celler er ofte sterkt pigmenterte, noe som kan svekke det fluorescerende signalet om antistoffimmunfarging. Når fluorescenssignalet er svakt eller når det er for mye bakgrunnsfarging, kan LipidUNet ikke skille lipiddråper nøyaktig. Av en lignende grunn må riktig valgte innsamlingsinnstillinger for det automatiske bildebehandlingstrinnet i protokollen brukes. Hvis bildene som er anskaffet er av dårlig kvalitet, vil LipidUNet slite med å maskere bilder riktig, og derfor vil kvantifiseringen være unøyaktig (figur 6A-L). Til slutt er etterbehandling av bildene et viktig skritt, da LipidUNet har spesifikke krav til at programvaren skal fungere.
Sammenlignet med arbeidsflyter for lipidanalyse som bruker manuell terskelverdi, eller teknikker som involverer automatisk terskel i programvare som Fiji, tilbyr LipidUNet en objektiv og pålitelig segmentering på tvers av bilder med variabel lipidavsetning, noe som gjenspeiles av en liten feilrate i identifiseringen av lipidpartikler (figur 7). Programvaren tillater brukeroppføring av ekstra treningsbilder, noe som muliggjør analyse av bildesett utover de som bruker et 40x forstørrelsesmål eller til og med de som bruker en annen lipidmarkør, som beskrevet i protokollen. I fremtiden vil programvaren bli trent til å analysere 3D-bilder slik at kvantifisering av lipidavsetningsvolum er mulig. Degenerative øyesykdommer som impliserer lipidavsetning som en stor bidragsyter til patologi er utbredt, og tilfeller forventes å øke etter hvert som den eldre befolkningen vokser13. Nøyaktige sykdomsmodeller og effektive analyseverktøy, som vi har skissert i denne protokollen, vil muliggjøre utvikling av nye terapeutiske intervensjoner.
Disclosures
Ingen avsløringer.
Acknowledgments
Vi takker National Eye Institute (NEI) histologikjerne for bruken av Zeiss konfokale system. Dette arbeidet ble støttet av NEI IRP-midler (tilskuddsnummer ZIA EY000533-04).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm Steriflip filter system | EMD Millipore | SCGP00525 | |
| 1x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-144 | |
| 3,3',5-Triiodo-L-thyronine | Sigma | T5516 | |
| Albumin Bovine, Fraction V | MP Biomedical | 160069 | |
| Alexa Fluor 555 rabbit anti-goat IgG (H+L) | Invitrogen | A21431 | APOE secondary antibody |
| APOE primary antibody | Millipore Sigma | AB947 | |
| BODIPY 493/503 | Invitrogen | D3922 | Protect from light |
| Complement competent human serum | Millipore Sigma | S1-LITER | |
| CTS N2 Supplement | Life Technologies | A13707-01 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30071.03 | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | Slide mounting media |
| Glass Cover Slips #1 1/2 22 mm x 22 mm | Electron Microscopy Sciences | 72204-01 | |
| Glass Microscope Slide 25 mm x 75 mm- 1.2 mm Thick | Electron Microscopy Sciences | 71870-01 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0396 | |
| MEM Alpha | Life Technologies | 12571-063 | |
| MEM non-essential Amino Acids | Life Technologies | 11140 | |
| Nile Red | Sigma | 72485-100MG | Protect from light |
| Paraformaldehyde 16% Solution, EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Penicillin-Strep | Life Technologies | 15140-148 | |
| Phosphate Buffered Saline 10x | Gibco | 70011-044 | |
| Rod Outer Segments (OS) | InVision Bioresources | 98740 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | |
| Sodium Pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S1888 | |
| SYBR Green Master Mix | Bio-Rad | 1725274 | |
| Taurine | Sigma | T0625 | |
| Triton X-100 | Sigma | 9002-93-1 | |
| Tween 20 Ultrapure | Affymetrix | 9005-64-5 | |
| Vitronectin | Life Technologies | A14701SA | |
| Y-27632 dihydrochloride | R&D Systems | 1254 |
References
- Kanow, M. A., et al. Biochemical adaptations of the retina and retinal pigment epithelium support a metabolic ecosystem in the vertebrate eye. eLife. 6, e28899 (2017).
- Adijanto, J., et al. The retinal pigment epithelium utilizes fatty acids for ketogenesis. The Journal of Biological Chemistry. 289 (30), 20570-20582 (2014).
- Farnoodian, M., et al. Cell-autonomous lipid-handling defects in Stargardt iPSC-derived retinal pigment epithelium cells. Stem Cell Reports. 17 (11), 2438-2450 (2022).
- Curcio, C. A. Soft drusen in age-related macular degeneration: Biology and targeting via the oil spill strategies. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (4), AMD160-AMD181 (2018).
- Cankova, Z., Huang, J. D., Kruth, H. S., Johnson, M. Passage of low-density lipoproteins through Bruch's membrane and choroid. Experimental Eye Research. 93 (6), 947-955 (2011).
- Curcio, C. A., et al. Esterified and unesterified cholesterol in drusen and basal deposits of eyes with age-related maculopathy. Experimental Eye Research. 81 (6), 731-741 (2005).
- Miyagishima, K. J., et al. AMPK modulation ameliorates dominant disease phenotypes of CTRP5 variant in retinal degeneration. Communications Biology. 4 (1), 1360 (2021).
- Sharma, R., et al. Epithelial phenotype restoring drugs suppress macular degeneration phenotypes in an iPSC model. Nature Communications. 12 (1), 7293 (2021).
- Farnoodian, M., et al. Cell-autonomous lipid-handling defects in Stargardt iPSC-derived retinal pigment epithelium cells. Stem Cell Reports. 17 (11), 2438-2450 (2022).
- Hallam, D., et al. An induced pluripotent stem cell patient specific model of complement factor H (Y402H) polymorphism displays characteristic features of age-related macular degeneration and indicates a beneficial role for UV light exposure. Stem Cells (Dayton, Ohio). 35 (11), 2305-2320 (2017).
- Sharma, R., Bose, D., Montford, J., Ortolan, D., Bharti, K. Triphasic developmentally guided protocol to generate retinal pigment epithelium from induced pluripotent stem cells. STAR Protocols. 3 (3), 101582 (2022).
- Issa, P. C., Barnard, A. R., Herrmann, P., Washington, I., MacLaren, R. E. Rescue of the Stargardt phenotype in Abca4 knockout mice through inhibition of vitamin A dimerization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (27), 8415-8420 (2015).
- GBD 2019 Blindness and Vision Impairment Collaborators. Blindness and Vision Impairment Collaborators. Causes of blindness and vision impairment in 2020 and trends over 30 years, and prevalence of avoidable blindness in relation to VISION 2020: the Right to Sight: an analysis for the Global Burden of Disease Study. Lancet Global Health. 9 (2), e144-e160 (2021).
