Summary
Gözün retina pigment epitel tabakasını etkileyen dejeneratif göz hastalıkları monogenik ve poligenik kökenlidir. Çeşitli hastalık modelleri ve bir yazılım uygulaması olan LipidUNet, hastalık mekanizmalarını ve potansiyel terapötik müdahaleleri incelemek için geliştirilmiştir.
Abstract
Retinal pigment epiteli (RPE), gözün arkasında bulunan altıgen hücrelerin tek katmanlıdır. Fotoreseptörlere ve koroidal kılcal damarlara beslenme ve destek sağlar, fotoreseptör dış segmentlerin (POS) fagositozunu gerçekleştirir ve dış retinanın homeostazını korumak için polarize bir şekilde sitokinler salgılar. Mutasyonlar, yaşlanma ve çevresel faktörlerin neden olduğu disfonksiyonel RPE, diğer retina tabakalarının dejenerasyonuna neden olur ve görme kaybına neden olur. Dejenere RPE'nin ayırt edici bir fenotipik özelliği, hücre içi ve hücre altı lipid bakımından zengin birikintilerdir. Bu birikintiler farklı retinal dejeneratif hastalıklar arasında yaygın bir fenotiptir. Monogenik retinal dejenerasyonların lipid depozit fenotipini in vitro olarak çoğaltmak için, hastaların fibroblastlarından indüklenmiş pluripotent kök hücre kaynaklı RPE (iRPE) üretildi. Stargardt ve Geç başlangıçlı retinal dejenerasyon (L-ORD) hastalığı olan hastalardan üretilen hücre hatları, RPE fizyolojik fonksiyonunu çoğaltmak için 7 gün boyunca POS ile beslendi ve bu hastalıklarda POS fagositozuna bağlı patolojiye neden oldu. Alternatif kompleman aktivasyonu ile ilişkili poligenik bir hastalık olan yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD) için bir model oluşturmak için, iRPE alternatif kompleman anafilatoksinleri ile zorlandı. Hücre içi ve hücre altı lipid birikintileri Nil Kırmızısı, bor-dipirometen (BODIPY) ve apolipoprotein E (APOE) kullanılarak karakterize edildi. Lipit birikintilerinin yoğunluğunu ölçmek için, makine öğrenimi tabanlı bir yazılım olan LipidUNet geliştirilmiştir. Yazılım, iRPE'nin kültür yüzeylerindeki maksimum yoğunluklu projeksiyon görüntüleri üzerinde eğitildi. Gelecekte, üç boyutlu (3D) görüntüleri analiz etmek ve lipit damlacıklarının hacmini ölçmek için eğitilecektir. LipidUNet yazılımı, hastalık modellerinde lipit birikimini azaltan ilaçları keşfetmek için değerli bir kaynak olacaktır.
Introduction
Retinal pigment epiteli (RPE), retinal fotoreseptörlere bitişik gözün arkasında bulunan tek katmanlı bir hücredir. RPE, fotoreseptörlere metabolik ve yapısal destek sağlayarak uygun görmenin korunmasında hayati bir rol oynar. Sağlıklı RPE hücreleri farklı bir altıgen morfoloji ile karakterizedir. RPE'nin bazal tarafında bulunan koryokapillaris ile apikal olarak yerleştirilmiş fotoreseptörler arasında bir bariyer görevi görmesini sağlayan sıkı kavşaklarla bağlanırlar. Retinal ekosistemi korumak için RPE, anahtar metabolitleri, örneğin glikozu, RPE1'deki glikoz tüketimini en aza indirecek şekilde fotoreseptörlere taşır. Bu sınırlama nedeniyle, RPE, RPE'nin β-oksidasyon2 yoluyla ketonlara dönüştürdüğü yağ asitleri de dahil olmak üzere metabolik ihtiyaçlarını korumak için diğer metabolitlere bağlıdır. RPE'nin, fotoreseptör dış segment (POS) sindiriminden geri dönüştürülmüş yağ asitlerini bir enerji kaynağı olarak kullanma eğilimi göz önüne alındığında, RPE'deki lipit işleme yollarındaki zararlı değişiklikler genellikle hem monogenik hem de poligenik dejeneratif retinal hastalıklara yol açar veya bunlarla ilişkilidir3.
RPE dejenerasyonuna neden olan poligenik bir dejeneratif göz hastalığı olan yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD), RPE monokatmanındaki anormal otofaji ve lipit metabolizması ile de ilişkilendirilmiştir. İşlevsel olmayan bir RPE tek katmanının POS'u işlemedeki ve diğer kritik işlevleri yerine getirmedeki başarısızlığı, RPE ile Bruch zarı arasında bulunan bazal doğrusal birikintiler (BLinD) adı verilen hücre dışı (alt RPE) birikintilere yol açar - AMD patolojilerinin bir işareti. BLinD'nin başlıca bileşenleri, en bol olanı apolipoprotein E (APOE)4 olan lipoproteinleri içerir. İnce BLinD tabakalarının birikmesi, AMD 5,6'nın klinik bir semptomu olarak kabul edilen yumuşak drusen'e yol açabilir.
Birçok grup, RPE disfonksiyonuna neden olan kök hücre kaynaklı in vitro hastalık modellerinin RPE altı lipid birikimine sahip olduğunu göstermiştir 7,8,9. Hallam ve ark. (2017), CFH geninin polimorfizmi nedeniyle AMD için yüksek risk taşıyan hastalardan indüklenmiş pluripotent kök hücre kaynaklı RPE (iRPE) üretmiştir. iRPE, APOE ile işaretlendiği gibi drusen birikimi gösterdi ve yüksek riskli RPE, düşük riskli hastalardan üretilen iRPE'den daha büyük birikintiler biriktirdi10.
AMD'nin lipid damlacıkları ve drusen birikimi gibi hücresel özelliklerini özetleyen bir in vitro model oluşturmak için, hasta kan örneklerinden üretilen iRPE çizgileri, daha önce yayınlanmış gelişimsel olarak yönlendirilen bir protokol11 kullanılarak oluşturulmuştur. İRPE, AMD'nin olası bir nedenini taklit eden anafilatoksinler içeren bir çözelti olan kompleman yetkin insan serumuna (CC-HS) tabi tutuldu: artmış alternatif kompleman sinyallemesi8. Ortaya çıkan lipid birikintilerinin hücresel ve hücre altı birikimi, yaygın olarak kullanılan lipid ve lipoprotein belirteçleri, APOE, Nil Kırmızısı ve BODIPY kullanılarak ölçüldü. Bu belirteçler aracılığıyla, CC-HS yoluyla aktive edilmiş kompleman sinyalizasyonunun iRPE hücrelerinde lipit birikimini şiddetlendirdiği gösterilmiştir8.
Monogenik retinal dejeneratif bir hastalık için bir hastalık modeli geliştirmek için, RPE'deki ABCA4 genine mutasyonların neden olduğu bir hastalık olan Stargardt hastalığı olan hastalardan iRPE çizgileri geliştirilmiştir. ABCA4 nakavt edildiğinde, yüksek düzeyde fosfolipit ve ışığa bağımlı lipit peroksidasyon ürünleri içerdiği bilinen hücre içi bir tortu olan A2E lipofuscin'in RPE12 içinde biriktiği daha önce gösterilmiştir. Hasta hatlarının yanında ABCA4 nakavt hatları geliştirildi ve her ikisi de POS beslemesine tabi tutuldu. Stargardt iRPE, BODIPY boyaması ile ölçülen artmış lipid birikimi sergileyen POS fagositozuna bağlı patolojiyi gösterdi. ABCA4 KO iPSC'lerden elde edilen RPE, CC-HS tedavisine tabi tutuldu; BODIPY sinyalinin nicelleştirilmesi, Stargardt hastalığı modelinde de lipit kullanımında bir kusur gösterdi9.
Bu hastalıkların prevalansı ve etkili terapötiklere duyulan ihtiyaç göz önüne alındığında, yukarıda açıklanan ilgili hastalık modelleri ile birlikte, potansiyel tedavilerin etkinliğini ölçmek için sağlam yöntemler oluşturmaya ihtiyaç vardır. Lipit birikintilerini nesnel, otomatik ve standartlaştırılmış bir şekilde ölçmek için, makine öğrenimi tabanlı bir yazılım olan LipidUNet, maske analiz araçlarıyla eşleştirildiğinde, lipit birikiminin Nil Kırmızısı, BODIPY ve APOE ortak belirteçleri kullanılarak hızlı ve etkili bir şekilde tanımlanabilmesi için oluşturulmuştur. Bu analiz boru hattı kullanılarak elde edilen özet istatistikler daha sonra analiz edilebilir ve grafiksel olarak görüntülenebilir, böylece tedavi koşullarının kolayca karşılaştırılması sağlanır. Protokolün şeması Şekil 1'de gösterilmiştir.
Şekil 1: Protokolün şeması: RPE hücreleri 96 delikli bir plaka üzerinde yetiştirilir ve farklı retinal dejenerasyon türlerini in vitro olarak modellemek için aktif insan serumu veya saflaştırılmış sığır dış segmentleri ile zorlanır. RPE hücreleri Nil Kırmızısı, BODIPI ve APOE ile lipoprotein birikintileri için sabitlenir ve boyanır. Konfokal mikroskop, daha sonra 2D maksimum yoğunluk projeksiyonlarına işlenen floresan etiketli lipit parçacıklarının Z-yığınlarını elde etmek için kullanılır. Lipoprotein parçacıklarını tanımak ve doğru şekilde segmentlere ayırmak için bir makine öğrenme algoritması eğitildi. Partikül sayımı ve çeşitli şekil metriklerini içeren özet tablolar oluşturulur ve sonraki çizim ve istatistiksel analiz için kullanılabilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Protocol
Tüm protokol adımları, NIH'nin insan araştırma etik komitesi tarafından belirlenen yönergelere uygundur. Kök hücre çalışması ve hasta örneği toplama, ABD Hükümeti'nin 45 CFR 46 kılavuzuna göre, İnsan Araştırmaları Koruma Ofisi (OHRP), NIH altındaki Birleşik Nörobilim Kurumsal İnceleme Kurulu (CNS IRB) tarafından onaylanmıştır. Hasta örnekleri, NCT01432847 (https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01432847?cond=NCT01432847&draw=2&rank=1) protokol numarası altında Helsinki Deklarasyonu tarafından belirlenen kriterlere uygun olarak CNS IRB onaylı onam formu kullanılarak toplanmıştır.
1. iRPE üretimi
- Sharma ve ark., 202211 tarafından yayınlanan protokolü takiben hasta kanından türetilmiş iPSC'den iRPE üretin (Şekil 2 ve Şekil 3).
Şekil 2: iRPE farklılaşması ve olgunlaşmasının şeması. İRPE üretmek için, belirlenmiş bir farklılaşma protokolü izlendi ve hücrelerin 5 hafta boyunca olgunlaşmasına izin verildi. Elde edilen hücre kültürü, AMD ve Stargardt hastalığı gibi hastalıklarda RPE disfonksiyonunu taklit etmek için çeşitli tedavilerle manipüle edilebilen in vitro bir model olarak işlev görür. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Başarılı ve başarısız RPE farklılaşması ve olgunlaşmasının temsili görüntüleri. TJP1 RPE'nin 10x büyütmesinde iki parlak alan görüntüsü, iRPE protokolünün 42. Gününde gösterilir. (A) Başarılı bir farklılaşma ve olgunlaşma, pigmentasyon ve poligonal morfoloji ile uyumlu RPE'yi gösterecektir. (B) Başarısız farklılaşma ve olgunlaşma, burada gösterildiği gibi, ölmekte olan hücre kümelerini gösterecektir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
2. RPE bakım ortamı (RPE-MM) hazırlığı
- N2 takviyesini gece boyunca 4 ° C'de çözün. Diğer tüm reaktifleri oda sıcaklığında (RT) çözün.
- Steril koşullar altında, Sharma ve ark., 202211 tarafından oluşturulan protokole göre, listelenen seyreltme faktörlerine Tablo 1'de listelenen reaktifleri ekleyin.
- Ortamı iyice karıştırın ve 0,22 μm filtreleme ünitesi kullanarak filtreleyin.
NOT: Medya, 4 °C'de saklandığı takdirde 2 hafta içinde kullanıma uygundur.
3. 96 delikli plaka tohumlama
- RT'de bir vitronektin alikotunu 3-5 dakika boyunca veya buz tamamen eriyene kadar çözün.
- 1:200 seyreltme (vitronektin: DPBS) kullanarak istenen çalışma çözeltisini elde etmek için vitronektini 1x Dulbecco'nun fosfat tamponlu salin (DPBS) ile seyreltin. 96 delikli bir plaka için, her bir kuyucuğu 200 μL çalışma çözeltisi ile kaplayın.
- 10 μM'lik nihai konsantrasyon elde etmek için çözülmüş ROCK inhibitörünü (Y-27632 dihidroklorür) RPE-MM ile 1:1000 seyreltmede birleştirin. Bu, RPE hücreleri için kaplama ortamıdır.
- Otomatik bir hücre çözme sistemi kullanarak iRPE şişesini çözün ve iRPE hücre süspansiyonunu 50 mL'lik bir tüpe aktarın.
- Hücre süspansiyonunu kaplama ortamıyla 1:10 seyreltmede seyreltin. Tüpü 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüjleyin.
- Süpernatantı dikkatlice aspire edin ve hücreleri kaplama ortamının 10 mL'sinde yeniden askıya alın.
- Hücre sayımı için 400 μL kaplama ortamını 100 μL yeniden askıya alınmış hücre çözeltisi ile karıştırın. Bir hücre canlılığı sayacı kullanarak hücre süspansiyonunun canlı hücre konsantrasyonunu belirlemek için bu aliquot'u kullanın.
- Hücre süspansiyonunu kaplama ortamı ile 60.000 hücre/mL'lik nihai konsantrasyona kadar seyreltin.
- Vitronektin kaplama çözeltisini 96 delikli plakadan tamamen aspire edin ve hücre süspansiyonunun 200 μL'sini her bir kuyucuğa dağıtın. Kabaca 12.000 hücre / kuyu veya ~ 200 hücre /mm2 olacaktır.
- Tohumlanmış hücre plakalarını 37 ° C'de 48 saat ve% 5 CO2'de inkübe edin. 48 saat sonra, ROCK inhibitörü takviyesi olmadan ortamı RPE-MM olarak değiştirin. 5 haftalık olgunlaşma döneminde medyayı her 2-3 günde bir değiştirin.
4. In vitro hastalık modelleri
- Kompleman yetkin insan serumu (CC-HS) tedavisi
- İnsan tamamlayıcısı yetkin serumu bir gecede 4 ° C'de çözün.
- CC-HS hazırlayın ve yetersiz insan serumu (CI-HS) ortamını tamamlayın.
- %5 CC-HS ortamı hazırlamak için, çözülmüş kompleman yetkin insan serumunu RPE-MM ile 1:20 seyreltmede karıştırın. Kullanmadan önce çözeltiyi 0,22 μm'lik bir ortam filtresinden geçirin.
- %5 oranında yetersiz insan serumu (CI-HS) ortamını tamamlamak için, önce CC-HS'yi 57 °C'lik bir su banyosunda 30 dakika boyunca ısıl olarak etkisiz hale getirin ve ardından 1:20 seyreltmede kültür ortamı ile karıştırın. Kullanmadan önce çözeltiyi 0,22 μm'lik bir ortam filtresinden geçirin.
- Serum, hücreleri 200 μL'lik %5 CC-HS veya %5 CI-HS ortamı ile toplam 48 saatlik bir inkübasyon süresi boyunca tedavi eder ve 24 saat sonra ortamı yeniler.
- Hücreleri 1x DPBS ile yıkayın ve RT'de 20 dakika boyunca% 4 paraformaldehit ile sabitleyin. 1x DPBS ile bir kez daha yıkayın ve numuneleri 200 μL DPBS'ye batırılmış 4 ° C'de saklayın.
- İSTEĞE BAĞLI: İstenirse, sadece alt RPE lipit birikimini göstermek için hücreleri plakadan lize edin.
- Hücreleri lize etmek ve sadece lipit birikintileri bırakmak için, ortamı çıkarın ve her bir kuyucuğa 200 μL deiyonize su ekleyin.
- 10-15 dakika inkübe edin, hücreler çıkarılana kadar yukarı ve aşağı pipet yapın. 200 μL deiyonize su ile bir kez daha yıkayın ve hücreleri% 4 paraformaldehit ile hemen sabitleyin.
- Hoechst kullanarak nükleer boyama ile hücre çıkarma etkinliğini onaylayın. Hoechst'i %1 sığır serum albümini (BSA), %0,5 Tween 20 ve %0,5 Triton-X 100 içeren 1x DPBS çözeltisine 1:2000 seyreltmede ekleyin. RT'de karanlıkta 1 saat boyunca inkübe edin. Daha sonra, 1x DPBS ile yıkayın.
- iRPE'de fotoreseptör dış segment (POS) tedavisi
- POS hazırlığı
- POS pelet tüpünü -80 °C depodan çıkarın ve kapalı bir buz kovasında gece boyunca 4 °C'de çözün.
- 40 mL çift deiyonizeH2O (ddH2O) içinde 10 g sakkaroz karıştırarak POS yıkama tamponu hazırlayın.
- Karışımı 40-50 °C'de ısıtın, sonra 15 dakika hafifçe karıştırın. Karışıma 840 mg sodyum bikarbonat ekleyin ve 10 dakika ısıtırken karıştırın.
- POS yıkama tamponunun toplam hacmini ddH2O ile 100 mL'ye ayarlayın ve çözeltinin pH'ını gerektiğinde 1 N HCl veya 1 N NaOH ile 8,3'e ayarlayın. Yıkama çözeltisini 0,22 μm filtre kullanarak filtreleyin.
NOT: Protokol burada duraklatılabilir; POS yıkama tamponu gece boyunca 4 °C'de saklanabilir. - Çözüldükten sonra, pelet 15 mL POS yıkama tamponunda askıya alın. POS bütünlüğünü sağlamak için pelet süspansiyonları sırasında nazik olun. POS süspansiyonunu 600 x g'de 4 °C'de 20 dakika boyunca santrifüj edin ve ardından süpernatanı aspire edin.
- POS peletini POS yıkama tamponunun 10 mL'sinde tekrar askıya alın.
- POS + POS yıkama tamponunun (POS çözeltisi) 100 μL'lik bir aliquot'unu çıkarın ve 400 μL 1x DPBS'de seyreltin. Bakteriyel ve fungal kirleticileri kontrol etmek için seyreltilmiş POS çözeltisinin 50 μL'sini bir kan agar plakasına ve bir agaroz plakasına yayın. Her biri için pozitif kontroller hazırlayın ve tüm plakaları 37 ° C'de 48 saat boyunca inkübe edin.
- Mikoplazmayı test etmek için tespit kuyucuğuna 1 μL POS çözeltisi ekleyerek bir qPCR testi yapın. DNA parçalarını büyütmek için, 40 döngü denatürasyon (95 ° C, 15 s) ve tavlama ve uzama (60 ° C, 1 dakika) gerçekleştirin. POS örneğinde mikoplazmayı tespit etmek için ileri ve geri primerler aşağıdaki gibidir:
İleri astar: GGA TTA GAT ACC CTG GTA GTC CAC G
Ters astar: CGT CAA TTC CTT TAA GTT TCA CTC TTG GC - POS konsantrasyonunu bir hücre analizörü ve ihtiyaca göre aliquot kullanarak ölçün. RPE hücreli 96 kuyu plakasından oluşan bir kuyu için 3 x 106 POS yeterlidir. İstenilen oran 10 POS/RPE hücredir. Alikotları ileride kullanmak üzere 80 ° C'de saklayın.
- Hücrelere POS eklenmesi
- POS şişelerini bir buz banyosunda çözün.
- Hazırlanan POS'un hesaplanan miktarını RPE-MM ile karıştırın ve hücreleri 7 gün boyunca günde bir kez POS ile tedavi edin.
NOT: POS çözümünü her gün taze olarak hazırlayın. - Hücreleri 1x DPBS ile yıkayın ve daha sonra RT'de 20 dakika boyunca% 4 paraformaldehit ile sabitleyin. DPBS ile bir kez daha yıkayın ve numuneleri 200 μL DPBS'ye batırılmış 4 ° C'de saklayın.
- POS hazırlığı
5. Alt RPE tortuları için boyama
- Nil kırmızısı boyama protokolü
- PFA fiksasyonundan sonra, numuneleri 1x DPBS ile 3 kez yıkayın.
NOT: Hemen kullanılmazsa, protokol burada duraklatılabilir, ancak numuneler 4 ° C'de 1x DPBS +% 0.02 sodyum azid çözeltisinde saklanmalıdır. - Nil Kırmızısı stok çözeltisini hazırlamak için, Nil Kırmızısı tozunu asetonda 3 mg / mL konsantrasyonda çözün. RT'de periyodik karıştırma ile 15 dakika inkübe edin. Çözeltileri, çözeltide kalan çökelti seviyesine bağlı olarak bir veya iki kez 0,22 μm filtre ile filtreleyin.
NOT: Stok çözeltisini ışıktan koruyun. - Çalışma çözümünü hazırlamak için, stok çözeltisini 1x DPBS'de 1:500 oranında seyreltin. Bir çalkalayıcıda RT'de 30 dakika boyunca numuneye 200 μL çalışma çözeltisi ekleyin ve ışıktan koruyun.
- 1x PBS ile 3 kez yıkayın ve numuneleri 200 μL DPBS'ye batırılmış 4 ° C'de saklayın.
NOT: 96 delikli bir plaka yerine transveller üzerinde bir deney yapılıyorsa, numuneler montaj ortamı olan bir slayta monte edilebilir, cam bir kapak kayması ile kaplanabilir ve şeffaf oje ile kapatılabilir. Numuneyi, hücreler yukarı bakacak şekilde monte etmeye özen gösterilmelidir.
- PFA fiksasyonundan sonra, numuneleri 1x DPBS ile 3 kez yıkayın.
- BODIPY boyama protokolü
- Stok çözeltisi için, 3.8 mM'lik bir stok konsantrasyonu elde etmek için BODIPY'yi susuz dimetil sülfoksit (DMSO) içinde çözün.
- PFA sabit numuneleri için, BODIPY stokunu 1x DPBS'de 1:300'de seyreltin. Hücrelere 200 μL ekleyin ve RT'de bir rocker üzerinde gece boyunca inkübe edin.
- 1x DPBS ile 3 kez yıkayın ve numuneleri 200 μL DPBS'ye batırılmış 4 ° C'de saklayın.
NOT: 96 delikli bir plaka yerine transveller üzerinde bir deney yapılıyorsa, numuneler montaj ortamı olan bir slayta monte edilebilir, cam bir kapak kayması ile kaplanabilir ve şeffaf oje ile kapatılabilir. Numuneyi, hücreler yukarı bakacak şekilde monte etmeye özen gösterilmelidir.
- APOE immün boyama protokolü
- Bir tampon çözeltisi oluşturmak için 1x DPBS'yi %1 sığır serum albümini (BSA), %0,5 Tween 20 ve %0,5 Triton-X 100 ile birleştirin.
- PFA sabit numuneleri için, numuneyi RT'de 1 saat boyunca tampon çözeltisinin 200 μL'sinde bloke edin ve geçirgenleştirin.
- Tampon çözeltisine 1:100'de seyreltilmiş APOE primer antikoru ekleyin ve RT'de gece boyunca inkübe edin.
- Ertesi gün, numuneleri 1x DPBS ile 3 kez yıkayın.
- Tampon çözeltisinde 1:1000 seyreltmede ikincil bir antikor ekleyin ve RT'de 1 saat boyunca hücrelere 200 μL çözelti ekleyin.
- 1x DPBS ile 3 kez yıkayın ve numuneleri 200 μL DPBS'ye batırılmış 4 ° C'de saklayın.
NOT: 96 delikli bir plaka yerine transwelller üzerinde bir deney yapılıyorsa, numuneler montaj ortamı (Fluoromount) ile bir slayta monte edilebilir, bir cam kapak kayması ile kaplanabilir ve şeffaf oje ile kapatılabilir. Numuneyi, hücreler yukarı bakacak şekilde monte etmeye özen gösterilmelidir.
6. Görüntü otomasyonu ve işleme
- Otomatik görüntü tarama
NOT: Bu çalışmada Zeiss LSM 800 ters konfokal taramalı mikroskop ve ZEN 3.2 (mavi baskı) yazılımı kullanılmıştır. Ortamın kırılma indisindeki sıcaklık değişiminden kaynaklanan bir değişiklik nedeniyle tarama sırasında odak düzleminin sürüklenmesini önlemek için görüntülemeden önce 96 delikli plakanın RT'ye en az 60 dakika ısıtıldığından emin olun.- Bir konfokal mikroskop ve 40x objektif kullanarak, kullanılan lipit belirteci ve ek antikorlar için uygun floresan kanalları içeren bir tarama profili oluşturun.
- Görüntü otomasyonunu ayarlamak için Kutucuklar onay kutusunu kullanın. 96 delikli plakayı kalibre etmek için doğru numune taşıyıcı ölçümlerinin girildiğinden ve seçildiğinden emin olun. Ardından, plakayı 10x hedefinin kullanılmasını gerektiren talimatlara göre kalibre etmek için Kalibre Et düğmesine tıklayın.
- Uygun kuyucukları seçmek için Gelişmiş Ayarlar görünümünü seçin ve Konumlar işlevini kullanarak kuyucuğun merkezine yakın 3 farklı görüntüleme noktası ekleyin. Bu, Pozisyon alt sekmesi altında manuel olarak veya Pozisyon Ayarları sekmesini kullanarak ve Taşıyıcıya Göre Kurulum seçilerek rastgele yapılabilir. Aynı lekelenmenin tüm kuyucukları için tekrarlayın.
- Otomasyon sırasında optimum odaklama ve Z-yığını konumlandırması için Odak Stratejisi sekmesine giderek Döşeme Kurulumu Tarafından Tanımlanan Netleme Yüzeyi/Z değerlerini kullan'ı seçin. Alternatif yöntemler diğer odak stratejilerini kullanabilir, ancak en tutarlı sonuçlar için bu ayarın kullanılması önerilir.
- Kutucuklar sekmesi altında, Konumları Doğrula'ya tıklayın ve her konum için merkezi Z düzlemini manuel olarak ayarlayın. Seçenekler alt sekmesindeki ayarlar görüntülerin alınmasını sıralayacaktır, bu nedenle görüntüye başlamadan önce bunu kontrol edin. Görüntüleri konumların seçildiği sırayla almak için Kutucuk Bölgeleri/Konumları ve Taşıyıcı Kuyuları/Konteyner onay kutularının seçimini kaldırın. Görüntü işleme kolaylığı için Sahneleri Ayrı Dosyalara Böl'ü seçin.
- Z-Stack sekmesinin Orta olarak ayarlandığından, kullanıcının tercihlerine bir aralık girildiğinden ve dilim aralığını ayarlamak için En İyi düğmesinin seçildiğinden emin olun.
- Edinme Modu, Kanallar, Odak Stratejisi, Z-Stack ve Kutucuklar sekmelerini optimize ettikten sonra denemeyi başlatın.
- Görüntü işleme
- Bir toplu görüntü işleme yöntemi kullanarak, Genişletilmiş Odak Derinliği yöntemiyle her bir Z yığınının maksimum projeksiyonlarını oluşturun.
- Toplu görüntü işleme yöntemi kullanarak, maksimum projeksiyon dosyalarını 16 bit TIFF görüntüleri olarak dışa aktarın. Sıkıştırmayı Yok olarak ayarlayın ve Orijinal Veriler'in işaretli olduğundan emin olun. Elde edilen görüntü, yalnızca lipit belirtecinin ifade edildiği floresan kanalının maksimum projeksiyon gri tonlamalı TIFF'i olmalıdır.
7. Segmentasyon ve nicelleştirme
NOT: LipidUNet programı, 96 delikli bir plakadan 40x görüntü üzerinde eğitilmiştir. 40x objektif kullanılarak elde edilen görüntülerin kullanılması şiddetle tavsiye edilir.
- LipidUNet yazılımını yükleyin. LipidUNet aşağıdaki GitHub deposundan indirilebilir: https://github.com/RPEGoogleMap/LipidUNet
- Nil Kırmızısı, Bodipy veya APOE'yi temsil eden TIFF görüntülerini tanımlayın ve kullanılan yönteme bağlı olarak bunları Nile_Red, Bodipy veya APOE adlı bir dizinde imgs adlı bir klasöre taşıyın.
NOT: LipidUNet programının dizinleri tanıması için tam adlandırma kuralları kullanılmalıdır. - LipidUNet yazılımını açın (Şekil 4).
- Yazılımın Tahmin sekmesinde, üç noktaya tıklayarak ve adlandırılmış dizine giderek ilgili dizini (Nile_Red, Bodipy veya APOE) seçin. LipidUNet programının Sınıf girişini denetleyerek görüntüleri doğru tanımladığını onaylayın.
- Algoritma için 0,01 ile 0,99 arasında bir olasılık eşiği seçin. Daha yüksek bir değer daha fazla yanlış pozitifi ortadan kaldırır, ancak daha fazla yanlış negatife neden olabilir ve daha düşük değerler daha fazla yanlış negatifi ortadan kaldırırken daha fazla yanlış pozitif sonuç verebilir. Varsayılan değer 0,65'tir ve önerilir.
- Tahmin Et'i tıklayın.
NOT: Yazılım, tüm görüntüleri otomatik olarak yineleyecek ve seçilen dizinde predicted_masks adlı yeni bir klasör oluşturacaktır. - Oluşturulan maskeler arasında yineleme yapmak ve maske görüntülerinden eşikli lipit birikintilerinin nicel sayısını sağlamak için bir Maske Analizi aracı kullanın.
- Tedavi koşullarını karşılaştırmak için oluşturulan sayım verilerini analiz edin.
Şekil 4: LipidUNet kullanıcı arayüzü. LipidUNet yazılımı, lipit birikintilerinin görüntülerinin doğru bir şekilde tanımlandığı eğitim veri dizini için seçilecek farklı bölümlere sahiptir; eğitim verilerinden üretilen model ağırlıkları dizini; ve kullanıcının segmentasyon için görüntülerini gireceği tahmin verileri dizini. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Representative Results
Bu protokol, Nil Kırmızısı, BODIPY ve APOE ile boyanmış lipit birikintilerini tanımlamak için bir iş akışı sağlar. Geliştirilen yazılım, lipit birikintilerini otomatik olarak tanımlayabilir ve ölçebilir ve özetlenen protokol optimize edildiğinde en iyi performansı gösterir. Hücre modelinin kalitesi, uygun görüntü segmentasyonunun kalitesini büyük ölçüde etkilediğinden, başarılı bir şekilde farklılaştırılmış RPE (Şekil 3A) ve zayıf farklılaştırılmış RPE (Şekil 3B) örnekleri dahildir.
Protokolde açıklanan üç işaretleyiciden ikisi, Nil Kırmızısı ve BODIPY, floresan görüntülerde belirgin şekilde parlak olan küçük dairesel noktalar olarak tanımlanmıştır (Şekil 5 ve Şekil 6). Protokolden "pozitif" bir görüntü, bu farklı tortuların uygun bir şekilde tanımlanması olacaktır (Şekil 5A-D ve Şekil 5E-H). "Negatif" bir sonuç, zayıf lekelenme (Şekil 6A-C ve Şekil 6D-F) veya yüksek arka plan yoğunluğu (Şekil 6G-I) nedeniyle arka plan floresansını bir tortu olarak yanlış alarak görüntünün yanlış segmentasyonunu gösterecektir.
APOE yatakları, Nil Kırmızısı ve BODIPY'nin dairesel birikintilerinden ziyade daha oval veya düzensiz görünen çeşitli boyut ve şekillere sahiptir. Bu tortular ayrıca daha az noktalıdır ve sinyal yoğunluğu, numunenin geçirgenliğindeki değişiklikler nedeniyle tortular arasında farklılık gösterebilir. Doğru tanımlama, daha az doymuş olanlar da dahil olmak üzere her bir mevduatı tanımlayacaktır (Şekil 5I-L), yanlış segmentasyon ise bu birikintileri almayacaktır (Şekil 6J-L). Bu nedenle, ciddi varyasyonları önlemek için boyama ve görüntüleme yöntemlerini optimize etmek önemlidir. Bunu yapmanın bir yolu, immün boyama sırasında numune geçirgenlik adımlarına dikkat etmektir. Floresan sinyalini optimize etmek için, hücreler APOE için fiksasyon ve immün boyamadan önce lize edilebilir, bu da APOE birikintilerinin eşit doygunluğu ve daha iyi segmentasyonu ile sonuçlanır.
Ayrıca, 96 kuyucuklu bir plaka dışında bir kültür platformunda olgunlaşan hücrelerin bölümlere ayrılmış görüntüleri de sağlanır. LipidUNet yazılımı, bir transwell üzerinde kültürlenmiş hücrelerin görüntüleri üzerinde çalıştırıldı ve lipit birikintileri eşik iken, transwell membranındaki gözenekler de öyledir (Şekil 6M-O). Şekil ve boyuttaki benzerlik nedeniyle, LipidUNet yazılımı mevcut haliyle hem lipit birikintilerini hem de transwell gözeneklerini ayrım gözetmeksizin maskeleyecektir.
Şekil 5: Temsili Sonuçlar. (A,E,I) 96 kuyu kaplamalı RPE, Hoechst nükleer boyama (mavi) ve Nil Kırmızısı (macenta), BODIPY (yeşil) veya APOE (turuncu) ile boyanır ve bir Z-yığınının maksimum yoğunluk projeksiyonlarıdır. (B,F,J) Gri tonlamalı, görüntü işlendikten sonra LipidUNet yazılımı için görüntüleri girer. (C,G,K) Tüm tortuların doğru tanımlandığı LipidUNet tarafından oluşturulan maskeler. (D,H,L) Her maskelenmiş parçacığın ana hatları numaralandırılmıştır. Bu etiketler, görüntüdeki her parçacığı ham verilerle spreadheet'teki bir girişe bağlamaya izin verir. (A-D) Nil Kırmızısı lekelenmesini gösterir ve yazılım daha zayıf bir sinyale rağmen arka plandaki tortuları doğru bir şekilde tanıyabilir. (E-H), BODIDIY sinyali ile arka plan arasında güçlü bir kontrast gösterir ki bu idealdir. LipidUNet, görüntüdeki her birikintiyi doğru bir şekilde tanımlar. (I-L) güçlü bir APOE sinyali gösterir ve bu leke ile sıklıkla görülen sinyal doygunluğunun değişkenliğini temsil eder. Bununla birlikte, görüntü segmentasyonu her bir APOE birikintisinin sınırlarını tanımlayabilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Optimal olmayan sonuçlar. (A,D,G,J,M) 96 iyi kaplanmış RPE, Hoechst nükleer boyama (mavi) ve Nil Kırmızısı (macenta), BODIPY (yeşil) veya APOE (turuncu) ile boyanır ve bir Z-yığınının maksimum yoğunluk projeksiyonlarıdır. (B,E,H,K,N) Gri tonlamalı, görüntü işlendikten sonra LipidUNet yazılımı için görüntüleri girer. (C,F,I,L,O) LipidUNet tarafından oluşturulan yanlış maskeler. Kırmızı daireler, yazılımın bir lipit birikintisini yanlış tanımladığı yeri gösterir. (A-C) Nil Kırmızısı işleme yanlıştır çünkü yazılım arka plan boyamayı bir depozito olarak tanımlamıştır. Bu, görüntüde yüksek arka plan ancak az miktarda lipit birikintisi olduğunda daha sık olabilir. BODIPY boyamasının iki örneği gösterilmiştir: (D-F) zayıf BODIPY boyaması nedeniyle düşük kaliteli bir görüntü ve (G - I) yüksek arka plana sahip güçlü bir BODIPY sinyali. Her iki durumda da, yazılım küçük, dairesel lipit birikintilerini çekirdeği çevreleyen arka plan dairesel halkasından ayırt edemez. Bu hataları önlemek için boyama ve görüntüleme optimize edilmelidir, ancak LipidUNet'in en son sürümü bu görüntüler için büyük ölçüde geliştirilmiştir. (J-L) Yanlış APOE segmentasyonu. Birikintiler sinyal boyutu ve doygunluğu bakımından daha değişken olduğundan, yazılım bazı birikintileri tanımakta zorluk çeker. (M-O) RPE bir transwell üzerine tohumlandı ve Nil Kırmızısı ile boyandı. Z-yığınının bir dilimi burada hem Nil Kırmızısı lipit birikintileri hem de transwell gözenekleri ile gösterilmiştir. Yazılım, transwell gözenekleri içeren kırmızı daire ve Nil Kırmızısı birikintilerine işaret eden yeşil ok ile gösterildiği gibi, ikisi arasında ayrım yapamaz. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: Maske Aracı Karşılaştırması. (A,B,C) Değişken miktarlarda lipit birikimine sahip 96 kuyucuklu RPE, Nil Kırmızısı (kırmızı) ile tanımlanır. Görüntüler, üç farklı yaygın maskeleme yöntemi olan Find Maxima, Max Entropy ve Renyi Entropi kullanılarak maskelenir ve LipidUNet tarafından oluşturulan maske ile karşılaştırılır. Orijinal görüntüye lipit birikintilerinin manuel sayımı eşlik ederken, maskeler her segmentasyon yöntemiyle tahmin edilen sayıları görüntüler. Her segmentasyon yöntemi için ortalama hata oranı, aşağıdaki formül kullanılarak hesaplanmıştır: ortalama[(|Tahmin Edilen Sayım - Manuel Sayım|/Manuel Sayım) x 100]. LipidUNet tarafından oluşturulan maske, diğer maskeleme yöntemlerine kıyasla değişken birikimli görüntülerdeki lipit birikintilerini daha doğru bir şekilde tanımlar (Ortalama hata oranları: %23 LipidUnet, %1164 Find Maxima, %851 Max Entropi, %203 Renyi Entropisi). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
| Parça | Kedi numarası | Stok Kontrolü | Son Conc. | Ml |
| MEM alfa | 12571-063 | NA | 500 | |
| N2 takviyesi | 17502-048 | NA | 1% | 5 |
| Isı Etkin FBS | SH30071.03 | NA | 5% | 25 |
| NMEM NEAA | 11140-050 | 10dk | 0,01 milyon | 5 |
| Sodyum Piruvat | 11360-070 | 100dM | 1 dkM | 5 |
| Penisilin-streptomisin | 15140-122 | 10000u/mL | 100U/mL | 5 |
| Taurin | T4571 | 50mg/mL | 250ug/mL | 2.5 |
| Hidrokortizon | H6909 | 18.1mg / L | 20ug/L | 0.553 |
| T3 | T5516 | 20ug/L | 0,013ug/L | 0.33 |
| Toplam hacim, mL | 548.383 | |||
Tablo 1: RPE-MM reaktif bileşimi. RPE-MM için reaktiflerin ve optimal konsantrasyonların bir listesi.
Discussion
Bu protokol, dejeneratif göz hastalıkları için monogenik ve poligenik in vitro hastalık modellerinde lipit birikintilerini verimli bir şekilde etiketlemek, görüntülemek ve ölçmek için bir yöntem sağlar. AI tabanlı yazılım LipidUNet, üç yaygın lipit belirtecine, APOE, Nil Kırmızısı ve BODIPY'ye uygulanabilir ve nicelemenin standart ve tarafsız olmasını sağlayan analiz için hızlı, otomatik bir yöntem sağlar.
LipidUNet'in ana sınırlaması, AI için eğitim veri kümesinin, 96 delikli bir plakada kültürlenmiş hücrelerin 40x büyütme görüntüleri ile sınırlı olmasıdır. Eğitim görüntü kümesinin bir sonucu olarak, LipidUNet, mevcut haliyle, 40x büyütme görüntülerini analiz etmekle sınırlıdır. Yazılım, 96 kuyucuklu bir plakanın yanı sıra diğer kültür yüzeylerinde kültürlenmiş hücrelerin 40x görüntülerini analiz etmek için kullanılabilir, ancak yazılım tarafından doğru eşiği doğrulamak için üretilen çıktı maskelerini incelemeye özen gösterilmelidir. Hangi örnekleri/görüntüleri analiz edebileceğinin kapsamını genişletmek için daha fazla görüntü kümesine (farklı büyütmelerde) ihtiyaç duyulacaktır.
Protokolün birkaç kritik adımı vardır. Lipit işaretleyici adımında, kullanıcı seçtiği etiketleme bileşiğinin (BODIPY, APOE, Nil Kırmızısı) numunelerini etkili bir şekilde etiketlediğini onaylamalıdır. Olgun RPE hücreleri genellikle ağır pigmentlidir, bu da antikor immünoboyamasının floresan sinyalini bozabilir. Floresan sinyali zayıf olduğunda veya çok fazla arka plan lekelenmesi olduğunda, LipidUNet lipit damlacıklarını doğru bir şekilde ayırt edemez. Benzer bir nedenden ötürü, protokolün otomatik görüntüleme adımı için uygun şekilde seçilmiş alım ayarları kullanılmalıdır. Elde edilen görüntüler düşük kalitedeyse, LipidUNet görüntüleri düzgün bir şekilde maskelemek için mücadele edecek ve bu nedenle niceleme yanlış olacaktır (Şekil 6A-L). Son olarak, LipidUNet'in yazılımın çalışması için özel gereksinimleri olduğu için görüntülerin son işlenmesi önemli bir adımdır.
Manuel eşik oluşturma kullanan lipit analizi iş akışlarıyla veya Fiji gibi yazılımlarda otomatik eşik oluşturmayı içeren tekniklerle karşılaştırıldığında, LipidUNet, lipit parçacıklarının tanımlanmasında küçük bir hata oranıyla yansıtıldığı gibi, değişken lipit birikimine sahip görüntüler arasında tarafsız ve güvenilir bir segmentasyon sunar (Şekil 7). Yazılım, kullanıcının ek eğitim görüntülerinin girişine izin vererek, protokolde belirtildiği gibi 40x büyütme hedefi kullananların veya hatta farklı bir lipit belirteci kullananların ötesinde görüntü kümelerinin analizine izin verir. Gelecekte, yazılım 3D görüntüleri analiz etmek için eğitilecek, böylece lipit birikintisi hacminin ölçülmesi mümkün olacak. Lipid birikimini patolojiye önemli bir katkıda bulunan dejeneratif göz hastalıkları yaygındır ve yaşlı nüfus genişledikçe vakaların artacağı tahmin edilmektedir13. Doğru hastalık modelleri ve etkili analiz araçları, bu protokolde özetlediğimiz gibi, yeni terapötik müdahalelerin geliştirilmesine izin verecektir.
Disclosures
Açıklama yok.
Acknowledgments
Zeiss konfokal sisteminin kullanımı için Ulusal Göz Enstitüsü (NEI) histoloji çekirdeğine teşekkür ederiz. Bu çalışma NEI IRP fonları tarafından desteklenmiştir (hibe numarası ZIA EY000533-04).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm Steriflip filter system | EMD Millipore | SCGP00525 | |
| 1x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-144 | |
| 3,3',5-Triiodo-L-thyronine | Sigma | T5516 | |
| Albumin Bovine, Fraction V | MP Biomedical | 160069 | |
| Alexa Fluor 555 rabbit anti-goat IgG (H+L) | Invitrogen | A21431 | APOE secondary antibody |
| APOE primary antibody | Millipore Sigma | AB947 | |
| BODIPY 493/503 | Invitrogen | D3922 | Protect from light |
| Complement competent human serum | Millipore Sigma | S1-LITER | |
| CTS N2 Supplement | Life Technologies | A13707-01 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30071.03 | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | Slide mounting media |
| Glass Cover Slips #1 1/2 22 mm x 22 mm | Electron Microscopy Sciences | 72204-01 | |
| Glass Microscope Slide 25 mm x 75 mm- 1.2 mm Thick | Electron Microscopy Sciences | 71870-01 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0396 | |
| MEM Alpha | Life Technologies | 12571-063 | |
| MEM non-essential Amino Acids | Life Technologies | 11140 | |
| Nile Red | Sigma | 72485-100MG | Protect from light |
| Paraformaldehyde 16% Solution, EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Penicillin-Strep | Life Technologies | 15140-148 | |
| Phosphate Buffered Saline 10x | Gibco | 70011-044 | |
| Rod Outer Segments (OS) | InVision Bioresources | 98740 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | |
| Sodium Pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S1888 | |
| SYBR Green Master Mix | Bio-Rad | 1725274 | |
| Taurine | Sigma | T0625 | |
| Triton X-100 | Sigma | 9002-93-1 | |
| Tween 20 Ultrapure | Affymetrix | 9005-64-5 | |
| Vitronectin | Life Technologies | A14701SA | |
| Y-27632 dihydrochloride | R&D Systems | 1254 |
References
- Kanow, M. A., et al. Biochemical adaptations of the retina and retinal pigment epithelium support a metabolic ecosystem in the vertebrate eye. eLife. 6, e28899 (2017).
- Adijanto, J., et al. The retinal pigment epithelium utilizes fatty acids for ketogenesis. The Journal of Biological Chemistry. 289 (30), 20570-20582 (2014).
- Farnoodian, M., et al. Cell-autonomous lipid-handling defects in Stargardt iPSC-derived retinal pigment epithelium cells. Stem Cell Reports. 17 (11), 2438-2450 (2022).
- Curcio, C. A. Soft drusen in age-related macular degeneration: Biology and targeting via the oil spill strategies. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (4), AMD160-AMD181 (2018).
- Cankova, Z., Huang, J. D., Kruth, H. S., Johnson, M. Passage of low-density lipoproteins through Bruch's membrane and choroid. Experimental Eye Research. 93 (6), 947-955 (2011).
- Curcio, C. A., et al. Esterified and unesterified cholesterol in drusen and basal deposits of eyes with age-related maculopathy. Experimental Eye Research. 81 (6), 731-741 (2005).
- Miyagishima, K. J., et al. AMPK modulation ameliorates dominant disease phenotypes of CTRP5 variant in retinal degeneration. Communications Biology. 4 (1), 1360 (2021).
- Sharma, R., et al. Epithelial phenotype restoring drugs suppress macular degeneration phenotypes in an iPSC model. Nature Communications. 12 (1), 7293 (2021).
- Farnoodian, M., et al. Cell-autonomous lipid-handling defects in Stargardt iPSC-derived retinal pigment epithelium cells. Stem Cell Reports. 17 (11), 2438-2450 (2022).
- Hallam, D., et al. An induced pluripotent stem cell patient specific model of complement factor H (Y402H) polymorphism displays characteristic features of age-related macular degeneration and indicates a beneficial role for UV light exposure. Stem Cells (Dayton, Ohio). 35 (11), 2305-2320 (2017).
- Sharma, R., Bose, D., Montford, J., Ortolan, D., Bharti, K. Triphasic developmentally guided protocol to generate retinal pigment epithelium from induced pluripotent stem cells. STAR Protocols. 3 (3), 101582 (2022).
- Issa, P. C., Barnard, A. R., Herrmann, P., Washington, I., MacLaren, R. E. Rescue of the Stargardt phenotype in Abca4 knockout mice through inhibition of vitamin A dimerization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (27), 8415-8420 (2015).
- GBD 2019 Blindness and Vision Impairment Collaborators. Blindness and Vision Impairment Collaborators. Causes of blindness and vision impairment in 2020 and trends over 30 years, and prevalence of avoidable blindness in relation to VISION 2020: the Right to Sight: an analysis for the Global Burden of Disease Study. Lancet Global Health. 9 (2), e144-e160 (2021).
