Summary
在这里，我们提出了一种方案，通过基于GMP级可溶解微载体的全封闭系统实现贴壁细胞的大规模制造。人间充质干细胞、HEK293T细胞和Vero细胞的培养经过验证，符合细胞和基因治疗行业的数量要求和质量标准。
Abstract
长期以来，细胞和基因治疗（CGT）行业的研究人员在细胞的高效和大规模扩增方面面临着巨大的挑战。针对二维平面培养系统的主要缺点，我们创新性地开发了一种基于GMP级可溶解多孔微载体的自动化封闭式工业规模细胞生产（ACISCP）平台，用于贴壁细胞的3D培养，包括人间充质干细胞/基质细胞（hMSCs）、HEK293T细胞和Vero细胞。为了实现大规模扩增，使用5 L和15 L搅拌罐生物反应器进行了两级扩增，在9天内产生了1.1 x10 10 hMSCs，整体扩增了128倍。通过完全溶解微载体收获细胞，浓缩，洗涤和配制基于连续流离心机的细胞处理系统，然后与细胞填充系统分装。与2D平面培养相比，从3D培养中收获的hMSCs的质量没有显著差异。我们还将这些可溶解的多孔微载体应用于CGT领域的其他流行细胞类型;具体而言，HEK293T 细胞和 Vero 细胞的峰值细胞密度分别为 1.68 x 10 7 个细胞/mL 和 1.08 x 107 个细胞/mL。本研究提供了一种使用生物工艺工程平台的方案，利用GMP级可溶解微载体和先进的封闭设备的特性来实现贴壁细胞的工业规模生产。
Introduction
在过去的二十年里，CGT行业呈指数级增长。下一代药物的发展有望治疗和治愈许多难治性疾病1.自 2017 年美国食品药品监督管理局 （FDA） 首次批准 CGT 产品 Kymriah 以来，全球 CGT 相关研发持续快速增长，FDA 看到 CGT 的积极研究性新药申请在 2018 年增加到 500 项2。据预测，到 2030 年，美国 CGT 产品的批准数量可能达到 54-74 个2。
虽然CGT研究和创新的快速增长令人兴奋，但实验室研究和工业规模制造之间仍然存在巨大的技术差距，这些技术可以以可承受的成本提供这些有前途的药物，以达到尽可能多的患者。这些临床试验目前采用的流程是在实验室中建立的，用于小规模实验，需要付出巨大的努力来改进和创新CGT制造3。CGT产品有很多种，其中大多数基于活细胞，可以是同种异体的、自体的、工程的或天然的。这些活体药物比小分子实体或生物制剂复杂得多，因此使大规模生产成为一项重大挑战4,5,6。在这项工作中，我们展示了一种广泛应用于CGTs的三种锚定依赖性细胞的大规模细胞生产方案。这些包括用于细胞治疗的人间充质干细胞/基质细胞 （hMSC），以及 HEK293T 细胞和 Vero 细胞，这两种细胞都用于生产病毒，用于最终治疗性细胞产品的基因工程。锚定依赖性细胞通常在平面系统上培养，这需要手动处理。然而，人工培养方法需要大量的劳动力，并且容易受到污染，这可能会影响最终产品的质量。此外，没有在线过程控制，导致批次之间的质量差异很大7.以干细胞疗法为例，拥有超过200种干细胞候选药物，估计每年需要300万亿个hMSC才能满足临床应用需求8。因此，治疗性细胞的大规模生产已成为以如此高的细胞需求进行这些治疗性干预的先决条件9。
为了避免平面系统的挫折，人们已经努力在搅拌罐生物反应器中使用传统的不可溶解微载体10,11,12,13开发大规模制造工艺，但这些工艺存在复杂的制备程序和低细胞收获效率的问题14.最近，我们创新了一种用于干细胞扩增的可溶解微载体，旨在规避从传统不可溶解的商业微载体中收获细胞的挑战15。这种新型的市售GMP级3D可溶解多孔微载体3D TableTrix在大规模细胞生产中显示出巨大的潜力。事实上，基于这些多孔微载体的 3D 培养可以潜在地重建有利的仿生微环境，以促进细胞粘附、增殖、迁移和激活16。微载体的多孔结构和相互连接的孔隙网络可以产生更大的细胞粘附面积，促进氧气、营养物质和代谢物的交换，从而为体外细胞扩增创造最佳底物17。这些 GMP 级 3D 可溶解多孔微载体的高孔隙率使 hMSC 能够大规模扩增，并且细胞完全溶解的能力允许有效收获这些扩增的细胞18。它也是GMP级产品，并已在中国药品审评中心（备案号：F20210000003和F20200000496）19和美国FDA（FDA，USA;药物主文件编号：35481）20。
在这里，我们说明了使用这些可分散和可溶解的多孔微载体进行hMSC、HEK293T细胞和Vero细胞扩增的自动化封闭工业规模细胞生产（ACISCP）系统18。我们成功地实现了 hMSC 从 5 L 生物反应器到 15 L 生物反应器的两层扩增（9 天内累计扩增 128 倍），最终从单批生产中获得高达 1.1 x 1010 个 hMSC。通过完全溶解微载体收获细胞，浓缩，洗涤和配制基于连续流动离心机的细胞处理系统，然后与细胞填充系统分装。此外，我们还评估了hMSC产品的质量，以确认合规性。我们还展示了这些可溶解微载体在扩大生产其他两种类型的锚定细胞（HEK293T 细胞和 Vero 细胞）中的应用，这些电池广泛应用于 CGT 行业。HEK293T细胞的峰值细胞密度达到1.68 x 10 7个细胞/mL，而Vero细胞的峰值密度达到1.08 x 107个细胞/mL。ACISCP系统可以适应培养多种贴壁细胞，并有可能成为一个强大的平台，有助于加速CGT的产业化。
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Protocol
人体脐带购自北京清华长庚医院。所有关于人脐带间充质干细胞 （UCMSCs） 的获取、分离和培养的程序和方案均在知情同意下进行，并经北京清华长庚医院伦理委员会批准（备案号 22035-4-02），程序和方案符合 1964 年赫尔辛基宣言及其后来的修正案或类似的伦理标准。
1. hMSCs、HEK293T细胞和Vero细胞的单层培养
- 根据报告的方法21从沃顿氏果冻中分离原代人UCMSC。使用无血清 （SF） hMSC 培养基分离和生长原代 UCMSC，在第 2 代收获细胞，并作为主细胞库 （MCB） 冷冻保存。
- 在一个 T75 烧瓶中接种 6 x 105 人 UCMSC（优选传代 2 或传代 3 个细胞）（即，2D 平面血管上的接种密度为 8,000 个细胞/cm2），用于单层培养，用 15 mL 完全 SF hMSC 培养基。通过烧瓶的八字形运动确保均匀播种。在37°C下在5%CO2 细胞培养箱中培养至80%-90%汇合度。
- 收获时，倒出细胞培养基，并用 3-5 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 冲洗细胞两次。然后，加入2mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA，并在37°C下孵育1-2分钟，直到大多数细胞变圆并从烧瓶中分离，如在明场倒置显微镜下观察到的那样4倍物镜。加入 3 mL SF hMSC 培养基以终止消化。
- 将细胞悬液转移到 15 mL 锥形离心管中，并以 179 x g 离心 5 分钟。倒出上清液，用PBS冲洗细胞沉淀两次，并重悬于约3-5mL SF hMSC培养基中，以接种到生物反应器中的微载体中。
注意：检查细胞活力，并确保细胞活力>90%。仅在完成生物反应器的所有准备工作后才制备细胞（步骤2.1-3.6）。 - 对于HEK293T细胞和Vero细胞的单层培养，将2 x 10 6-3 x 106个细胞接种到每个T75烧瓶中，并分别用含有10%胎牛血清（FBS）和10%新生牛血清（NBS）的DMEM培养。
- 按照步骤1.3-1.4收获细胞。重悬于含有 10% FBS 的 3-5 mL DMEM 中。
2. 细胞接种前搅拌罐生物反应器的制备
- 在第 -1 天，用流动的去离子 （DI） 水彻底冲洗玻璃容器一次。
- 从顶板上拆下所有不锈钢管和叶轮，将它们浸入去离子水中，并用40kHz和60°C的超声波清洗机超声处理1小时以彻底清洁。
注意：5 L 生物反应器中的第一层扩增和 15 L 生物反应器中的第二层扩增的制备和程序相同。15 L 生物反应器的参数在括号中给出。如果括号中没有给出参数，则这些参数对于 5 L 和 15 L 生物反应器是相同的。 - 仔细检查所有 O 形圈是否完好无损并就位，然后根据制造商的说明将拆卸的部件安装回头板上。
注意： 如有必要，请在组装前更换任何磨损或撕裂的 O 形圈。磨损的O形圈会损害气密性，从而影响容器的无菌性。 - 将 7 L（15 L 生物反应器为 18 L）的 0.5 M NaOH 溶液加入 5 L 容器中，并将装有管子的顶板放置在容器边缘，将管子浸入 NaOH 溶液中。静置12小时或过夜，以去除管子和玻璃容器中的内毒素。
注意： 不要超过 7 L （18 L），因为这是 5 L （15 L） 玻璃容器的最大容积。处理 NaOH 溶液时，请穿戴适当的个人防护设备，因为它具有腐蚀性。 - 取下头板并将 NaOH 溶液倒入适当的废液瓶中。根据实验室安全规定丢弃。用无内毒素去离子水或注射用水彻底冲洗容器、顶板及其部件，以去除残留的碱性。
- 向容器中加入 2 L （5 L） PBS，重新组装所有部件，并根据制造商的说明将头板用螺栓固定在容器的金属框架上。
- 根据制造商的说明，将封闭式系统耗材包安装到头板上的相应不锈钢 （SS） 部件/管/端口上。将所有罗伯特夹在管子上，建议通过夹紧止血剂进行加固。将其中一根管子（末端有一个 0.22 μm 排气过滤器）留在连接到冷凝器的管子上，松开。
注意： 将硅胶管滑到止血器的尖端上，以防止刺穿硅胶管。Clamp 仅夹在硅胶管上，避免夹amp 本套件中包含的 C-flex 管。在冷凝器上留下一根管子，可以在高压灭菌过程中释放压力。 - 在可高压灭菌的 500 mL GL 45 玻璃瓶中制备 250 mL 0.1 M NaOH 溶液，并安装带有两个端口的 GL 45 多端口连接器螺帽。将一根 180 毫米长、0.13 英寸 x 0.25 英寸（内径 x 外径）的硅胶管连接到盖子下侧的一个端口上;长度应该足够长，刚好可以接触到瓶子的底部。
- 将另一根长度比前一根长 500 毫米的硅胶管连接到盖子上侧的同一端口，并将另一端连接到 5 L 容器顶板上的滴水口。将 0.22 μm 排气过滤器连接到螺帽上的另一个端口。
- 按照制造商的说明对 pH 探头进行两点校准。然后，将 pH、溶解氧 （DO） 和活细胞计数探针插入容器中适当的 PG13,5 端口，并拧紧到头板上。
- 根据制造商的说明对完全组装的容器进行气密性检查。保持 0.4 bar ± 0.01 bar 的压力至少 30 分钟。系统通过测试后慢慢释放压力。如果气密性测试失败，请仔细寻找泄漏点，并加固容器组件。
- 用耗材套件在15psi和121°C下高压灭菌完全组装的容器60分钟。高压灭菌后，检查所有通风过滤器，确保它们完好无损且干燥。取出所有止血剂。
注意：湿式排气过滤器无法有效过滤气体，并可能在细胞培养过程中影响容器的无菌性。如果通风过滤器潮湿，请更换它们，然后再次对整个容器进行高压灭菌。 - 将高压灭菌的容器转移到洁净室中，等待其完全冷却至室温。将温度探头插入热电偶套管，并将电机、pH 探头和 DO 探头的电缆从控制器连接到容器上的相应部件。将加热垫紧紧地包裹在容器上。
- 松开罗伯特夹amps 在废气冷凝器、环形分布器、NaOH 滴水进料口和空气覆盖口上的柔性管上。打开控制器，登录，按照厂家说明将 表1 中列出的参数输入系统。在培养过程中的任何时候都不应夹住这些管子。
- 单击 “开始”，然后命名实验以启动生物反应器。让生物反应器在这些设置下运行至少12小时或过夜，使PBS充满氧气，以便稍后对DO探针进行单点校准。
- 在生物反应器控制器上校准泵 1 和泵 2 的液体处理体积速度。在每个泵上分别安装一个 0.13 英寸 x 0.25 英寸的硅胶管，一端浸入一瓶水中，另一端插入测量筒。
- 将泵转速设置为 300 rpm，时间为 1 分钟。注意分配到两个泵的测量筒中的水量。后续步骤将需要这些数字。
- 按照制造商的说明准备 500 mL SF hMSC 培养基，并用一次性 C-Flex EZ Top 容器盖和兼容盖更换细胞培养基瓶盖。在生物安全柜（BSC）内进行盖子更换。
- 将培养基瓶上的出口管焊接到10g预灭菌的MSC微载体瓶上的入口C-flex管上。将管子的一部分安装到生物反应器控制器的泵 1 上，将泵旋转设置为 300 rpm，然后将所有培养基从瓶子泵入微载体瓶中。将这些微载体储存在4°C，直到第0天使用。
注：微载体应在第-1天制备。对于 15 L 生物反应器培养，总共准备四瓶（即 40 g，含 4 x 500 mL SF 培养基）。
3. 在 5 L 搅拌罐生物反应器中接种、培养和收获细胞
- 在第 0 天，按照制造商的说明对生物反应器控制器上的 DO 探针进行单点校准，特别是 100%。搅拌罐式生物反应器现在已准备好进行细胞培养。
- 准备一个 2 L （5 L） 玻璃瓶用于废物收集，将其与带有两个端口的 GL 45 多端口连接器螺帽安装，带有 30 毫米、0.25 英寸 x 0.44 英寸的 C-Flex 管连接到两个端口，并高压灭菌进行灭菌。用管焊机将 C-flex 管从废物瓶的一个端口焊接到生物反应器容器顶板上的收获管。
- 暂时停止生物反应器控制器上的温度、pH 值和 DO 控制，将连接到收获管的硅胶管按正确的液体流动方向安装到蠕动泵 2 上，并将容器中的所有 PBS 完全分配到废液瓶中。将管子从泵中取出，然后密封并断开废液瓶。
注意： 始终松开任何罗伯特夹amps 在每个步骤中涉及液体流动的软管上。Clamp 液体转移完成后，在密封和断开之前。夹具靠近头板侧。除非另有说明，否则所有后续步骤都应执行松开和夹紧。 - 准备 7 L （30 L） 完全 SF hMSC 培养基，并用一次性 C-Flex EZ Top 容器盖和兼容盖更换每个原装瓶盖。将一次性过滤模块焊接到 10 L （50 L） 一次性储物袋上的一个端口上。执行更换平衡计分卡内部盖子的操作。
- 通过将细胞培养基瓶焊接到胶囊过滤器的另一端并使用生物反应器控制器上的泵，过滤并将培养基过滤并转移到储存袋中，一次一瓶。指定为饲料袋。
- 将一个从补料袋的出口焊接到顶板补料管上的 C-flex 管上，并将管子安装到生物反应器控制器上的泵 1 上。将补料袋的另一个出口焊接到放气管上，并将管子安装到生物反应器控制器上的泵 2 上，沿液体流动的正确方向。
注意： 与 C-Flex 管相比，将流体流动管路上的部分（由硅胶管制成）安装在泵上，以获得更好的耐磨性和抗撕裂性。确保管子的安装方向正确。 - 将泵 1 速度设置为 300 rpm，并在将 1 L （5 L） 培养基从进料袋中分配到容器中后停止泵，具体取决于步骤 2.17 中记录的体积分配速度。使用与步骤 2.14 中描述的相同设置再次启动温度、pH 和 DO 控制。
- 密封并断开将饲料袋连接到顶板上的饲料管的管子。将步骤2.18中制备的分散微载体的瓶子中的C-Flex管焊接到进料管上，并将瓶子中的所有内容物泵入容器中。密封并断开微载体悬浮液的空瓶。用75%乙醇对瓶子的整个表面进行消毒，然后放入BSC中用作细胞悬液转移瓶。
注意： 密封和断开一次性附件时，在头板侧留下一根较长的 C-Flex 管，因为以下步骤将在同一根管上执行多个焊接和断开步骤。 - 确保控制器上显示的温度达到37°C的稳定状态，这通常需要大约30分钟，然后按照步骤1.3-1.4继续制备种子细胞。将 2.5 x 108 个 hMSC 重悬于 500 mL SF 培养基中，并转移到先前含有微载体悬浮液的空瓶中。
注：用于 15 L 生物反应器扩增的种子细胞应根据步骤 3.21 制备，目的是在 500 mL 中接种 1.0 x 109 个细胞。 - 将C-Flex管从现在含有细胞悬液的瓶子焊接到顶板上的进料口，并将瓶子中的所有内容物泵入容器中，以开始将细胞接种到微载体中。密封并断开空瓶。将进料口从进料袋重新焊接到顶板上的进料管。
- 通过设置以下参数，调整控制器上的搅拌设置，以允许间歇性搅拌以提高 hMSC 的接种效率：V1 = 35 （30） rpm/5 min;V2 = 0 转/分/25 分钟;循环次数 = 12 （24）;最终搅拌速度 = 35 （30） rpm。
注：如果在培养过程中观察到微载体的不均匀分布或沉淀，则可以将搅拌速度调整为40（35）rpm或45（40）rpm。 - 在培养基置换界面的生物反应器控制器上设置自动培养基补充和交换制度。设置hMSC培养的参数， 如表2所示。
注意： 松开任何罗伯特夹amps 在此阶段涉及液体流动的软管上，尤其是对于进料管和排气管。在整个培养过程中保持这些松开。 - 在所需的时间点 通过 鲁尔连接器连接一次性采样袋，通常每天一次，每次将 10 mL 分装到采样袋中，从而通过采样管取样。将 2-3 mL 样品分装到第一个采样袋中，丢弃，然后每次将实际的 10 mL 样品分装到新的采样袋中。
注意：最初的 2-3 mL 样品可能是从上一个采样时间点留在试管中的液体，可能无法准确代表容器中的状况。在用 75% 乙醇建立或断开连接之前和之后，始终采取额外的无菌措施对鲁尔连接器进行消毒，以采取额外的无菌措施执行这些步骤。 - 将采集的样品转移到 15 mL 锥形离心管中。对样品执行以下测试。
- 取 200 μL 载细胞微载体悬浮液，根据制造商的说明用钙黄绿素-AM/PI 细胞双重染色染色。在荧光显微镜下观察。
- 通过重力沉淀微载体，这通常需要 5-10 分钟。吸出上清液，并按照制造商的说明用血糖仪测试葡萄糖浓度。绘制血糖水平图。
- 将沉淀的载细胞微载体与新鲜制备的3-5mL的1mg / mL消化溶液在37°C下孵育20-30分钟，以完全溶解微载体。用自动荧光细胞分析仪用AO / PI染色后对细胞进行计数。绘制细胞生长曲线。与控制器上生成的实时活细胞生长曲线相关联。
- 在培养的第 4 天或第 5 天，制备 50 mL （200 mL） 30 mg/mL 的消化液。消化液和可溶解微载体之间的工作质量比范围为3：20至5：20。用 0.22 μm 胶囊过滤器进行无菌过滤器，并在 500 mL （2 L） 的 Hank 平衡盐溶液 （HBSS） 中用钙和镁进一步稀释。转移到 3 L 一次性储物袋中。
注意：仅在细胞收获前制备消化溶液。尝试将至少 1.0 x 10 9-1.2 x 109 个单元用于第一层扩展，将至少 1.0 x 1010 个单元用于第二层扩展。如果细胞生长得更快，则在第 4 天收获;如果没有，则在第 5 天收获。不建议超过第 5 天。 - 在控制器上将搅拌速度设置为 0，以使微载体沉降，这通常在 20 分钟内发生。关闭自动培养基交换方案，并停止生物反应器控制器上的温度、pH 值和 DO 控制。在控制器上以 300 rpm 手动启动泵 2，并将上清液分配到进料状态中，以在容器中留下约 1 L （2 L） 的培养悬浮液（使用步骤 2.17 中记录的体积分配速度或从容器主体上的刻度标记测量）。密封并完全断开饲料袋。
- 将步骤3.15中新鲜制备的消化液袋焊接到进料管中，并将所有内容物泵入容器中。以 45 （40） rpm 的转速启动搅拌速度。确保温度控制器仍将温度保持在 37 °C。 微载体将在 40-60 分钟内溶解。用无菌鲁尔锁注射器在30分钟内取1mL样品，随后每5-10分钟取一次样品，在明场显微镜下观察以检查微载体的溶解。
- 微载体溶解后，将一个 3 L 储存袋（两个 3 L 储存袋用于 15 L 生物反应器）焊接到收获管上，并使用泵 2 以 300 rpm 的速度完全泵出细胞悬浮液。制备 1 L （3.5 L） 含有 1% 人血清白蛋白 （HSA） 的生理盐水作为洗涤缓冲液和 500 mL 完全 SF 培养基（500 mL 细胞冻存缓冲液，以 10% 硫酸二甲酯 （DMSO） 和 90% SF 培养基的制剂为例）在单独的一次性储存袋中使用前面步骤中提到的方法和附件用于其他液体转移。
- 打开细胞处理系统，根据制造商的说明将一次性细胞处理套件安装到仪器上，将细胞悬液袋、洗涤缓冲液和SF培养基（冻存缓冲液）焊接到一次性细胞处理套件上，并仔细按照用户界面上显示的所有说明初始化和检查套件的完整性和正确安装。
- 安装完成后，将 表3 中列出的参数输入使用洗涤缓冲液洗涤细胞并在SF培养基（冻存缓冲液）中重悬的参数，以开始洗涤和重悬过程。整个过程将通过几个手动检查点自动执行。
- 按照细胞处理系统的指示，从离心室中取出细胞样品，并根据制造商的说明使用自动细胞分析仪计算细胞密度。将重悬体积调整为密度为 2 x 106 个细胞/mL 或最大总体积为 250 mL。
- 系统将细胞从腔室中吸出后，密封并断开细胞转移袋与一次性细胞处理套件的连接。如有必要，在较大的细胞转移袋/培养基储存袋中使用完全 SF 培养基将细胞密度重新调节至 2 x 106 个细胞/mL。这些将是 15 L 生物反应器中第二层扩增的种子细胞。
4. 细胞配方、填充和完成
- 在从 5 L 生物反应器收获细胞前 1 天开始制备 15 L 生物反应器。完全按照协议第 2 节和第 3 节中的步骤进行操作，括号中指示的 15 L 参数除外。
- 将细胞重悬于 250 mL 冻存缓冲液中，并在系统将细胞从腔室中吸出后，将细胞转移袋与一次性细胞处理试剂盒密封并断开。
- 将 2,000 mL 冻存缓冲液与步骤 4.2 中的 250 mL 重悬细胞一起转移到 3 L 细胞转移袋中。将此转运袋焊接到一次性填充和完成耗材套件上。
注：此处使用的额外体积的冻存缓冲液应根据步骤3.21中获得的计数结果，通过配方规范和总细胞数计算来确定 - 将一次性填充和完成耗材套件组装到电池填充系统中，然后根据制造商的说明打开预冷系统。按照系统上的说明，设置为每袋灌装 20 mL，每批总共 20 袋。密封这些袋子并将其与试剂盒断开，并遵循标准的冷冻保存程序。使用低温储存袋。
- 将一组新的 20 个冷冻保存袋焊接到一次性填充和完成耗材套件上，并重复填充和完成过程，直到所有细胞都等分。按照标准程序冷冻保存这些细胞。
5. 细胞质量的表征
- 从可溶解的微载体中取样收获的hMSC，并使用细胞处理系统通过流式细胞术进行表征，以按照文献18中描述的方法确定细胞身份。
- 解冻冻存的细胞，并在常规 2D 烧瓶或微孔板上重新铺板，以进一步表征细胞特征，包括细胞形态和三谱系分化能力，遵循文献18 中描述的方法。
6. 在搅拌罐式生物反应器中对 G02 微载体进行HEK293T膨胀
- 如步骤2所述准备5L生物反应器。对于HEK293T细胞，用无菌 G02 微载体而不是 W01 培养细胞。培养过程与方案第3部分类似，但某些参数不同，将在以下步骤中详细介绍。在生物反应器中安装一个特殊的灌注管以取代放气管，因为HEK293T细胞的培养需要灌注。
- 与方案第3节中详述的方案不同，在含有10%FBS的DMEM中制备20g G02微载体（即两瓶）用于5L生物反应器，第0天培养体积设置为3.5L（即终浓度约为5.71g / L）。在两瓶 G02 微载体之前将 2 L 培养基分配到容器中，并接种 500 mL 的 1.75 x 109 HEK293T细胞（即，最终密度为 5 x 105 个细胞/mL）。
- 执行搅拌方案和培养基交换方案（基于每天需要交换的培养基量，以每天培养体积，CVD 表示），这与方案第 3 部分不同，详见 表 4。
注意： 手动激活泵 1 和泵 2，以便两者都可以连续泵送以进行灌注。每天根据泵的容积分配速度校准调整泵速以满足灌注速率。通常，这将在个位数范围内。对于HEK293T细胞，使用新鲜培养基作为补料，并将用过的培养基完全丢弃到废液瓶中，这与hMSC不同，hMSCs是循环培养基的。 - 对于 15 L 生物反应器的第二层扩增，使用HEK293T细胞的微珠到微珠转移，而不是像 hMSC 那样完全溶解微载体。具体来说，在达到所需的细胞密度后停止搅拌以沉淀微载体，然后从灌注管中吸出尽可能多的上清液，将剩余悬浮液体积的 3 倍 PBS 送入以洗涤微载体，并重复 3 次。在最后的洗涤中吸出并丢弃尽可能多的PBS。
- 进料 3.5 L 1x 重组胰蛋白酶以将细胞从微载体中分离出来，同时 G02 微载体保持完整。将温度设置为 37 °C，将搅拌速度设置为 60 rpm。当超过80%的细胞分离时，在45分钟内用等量的完全培养基终止分离。
- 直接从收获港转移到准备好的 15 升容器中，用于二级扩展。
7. 搅拌罐式生物反应器中 V01 微载体上的 Vero 细胞扩增
- 通过将冻干的微载体与PBS一起转移到生物反应器容器中至浓度为20mg / mL来制备V01微载体。按照方案第 2 节所述组装和灭菌容器，但高压灭菌 30 分钟。
- 灭菌后，V01微载体自然沉淀下来。使用放气管和补料管将上清液与碱性DMEM交换两次，并将含有10%NBS的完整DMEM加入容器体积的50%-75%中，然后再进行方案第3部分进行细胞接种和培养。
- 与方案第3节中详述的方案不同，使用24g V01微载体对Vero细胞进行4L培养（即终浓度为6g / L），并接种500mL的4 x 109 Vero细胞（即，最终密度为1 x 106 个细胞/ mL）。
- 按照步骤6.3-6.6了解培养过程参数，并在15L搅拌罐生物反应器中传代至第二层扩增。
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Representative Results
ACISCP 平台是一个全封闭系统，采用一系列用于放大扩增的搅拌罐生物反应器、用于自动细胞收获和配制的细胞处理系统以及细胞填充系统（图 1）。贴壁细胞附着在多孔微载体上，可分散到生物反应器中，从而实现贴壁细胞的悬浮培养。
按照所述方案，首先将2.5×108个hMSCs和10g W01微载体接种在5L搅拌罐生物反应器中以进行初始扩增。在第 4 天，通过细胞处理系统浓缩和洗涤约 2.9 x 10 9 个细胞，其中 1.0 x 109 个收获的细胞与 40 g W01 微载体一起传代到 15 L 搅拌罐生物反应器中，用于第二阶段培养。最终，在第 9 天收获 1.1 x10 10 个 MSC，配制并分装到 70 多个制剂袋中（图 2A）。每天监测细胞数量、活力和葡萄糖消耗（图2B，C）。累计实现128倍的扩张;同时，细胞活力保持在90%以上。葡萄糖的摄入与细胞扩增呈负相关，显示出与健康细胞生长相关的代谢。
可溶解的多孔微载体可以进行预灭菌，并采用一次性封闭系统包装，适用于GMP（图3A）。细胞可以附着在微载体的表面和大孔的内壁上（图3B）。通过使用荧光染料，例如Calcein-AM / PI细胞双重染色试剂盒，可以观察多孔微球内的细胞（图3C）。将明场图像与荧光图像合并有助于分析细胞分布的均匀性。活细胞染色还显示出与通过手动采样或在线活细胞计数探针测量的细胞计数的强烈相关性。
除了对高细胞数量的巨大需求外，间充质干细胞的关键质量属性（CQA）评估和释放测试也是必不可少的，因为没有这些，细胞就无法在培养后进行灭菌或广泛纯化。为确保细胞质量，可在 ACISCP 平台的每个阶段对 3D 扩增的 MSC 进行采样。从ACISCP平台新鲜收获的MSCs保留了经典表型标记物22，阳性标记物（CD73，CD90，CD105）和阴性标记物（HLA-DR，CD34，CD45，CD19，CD14）的表达率分别为>95%和<2%（图4A）。将冻存的细胞解冻并接种到2D平面烧瓶中，并显示出良好的粘附能力，正常的膨胀行为（图4B）和具有螺旋生长的典型纺锤体形状（图4C）。此外，这些细胞还保持了分化成骨、成脂和成软骨谱系的能力（图4D）。
此外，HEK293T细胞和Vero细胞也在ACISCP平台上进行了测试。对于HEK293T细胞培养，在5 L生物反应器中接种细胞浓度为5 x 105个细胞/mL。在微球间转移过程后，15 L生物反应器中的峰值细胞浓度达到1.68 x 107个细胞/mL（图5A），HEK293T细胞保持高活力（图5B）。对于 Vero 细胞培养物，在 5 L 生物反应器中接种细胞浓度为 2 x 105 个细胞/mL。在磁珠到磁珠转移过程后，在 15 L 生物反应器中达到的峰值细胞浓度为 1.08 x 107 个细胞/mL（图 6A），Vero 细胞也保持了高活力（图 6B）。
图 1： 通过 ACISCP 平台生产 hMSC 的路线图示意图。 该数字已根据已发表的文献18 进行了修改。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2： 通过 ACISCP 平台扩增 hMSC 。 （A） ACISCP平台由一系列搅拌罐生物反应器、细胞处理系统和细胞填充系统组成。（B）hMSCs在两层扩增过程中的生长曲线，（C）和过程中的葡萄糖消耗率。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3：W01 微载体上 hMSC 生长的表征。 该数字已根据已发表的文献18 进行了修改。（A） W01微载体采用一次性密闭系统包装制备。（B） 空微载体和贴壁 hMSC 培养的微载体的扫描电子显微镜图像。白色三角形头部表示微载体表面的细胞;比例尺 = 100 μm。 （C） 从第 1 天到第 4 天在微载体上培养的 hMSC 的代表性合并明场和荧光（活细胞染色）图像;比例尺 = 100 μm。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 4：从 ACISCP 平台收获的 hMSC 的细胞鉴定评估 。 （A）通过流式细胞术对hMSCs的表面标志物进行表征。阳性标志物（>95%）和阴性标志物（<2%）均符合标准。（B） 冻存的 3D 扩增 hMSC 在解冻并重新铺板至 2D 烧瓶后表现出正常的扩增行为。（C） 3D扩增hMSCs的形态;比例尺 = 50 μm。 （D） 3D 扩增的 hMSC 的三谱系分化。分别通过茜素红、油红和阿尔新蓝染色评估成骨、产脂和成软骨能力。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 5：通过 ACISCP 平台对HEK293T细胞进行细胞扩增。 （A） 5 L 和 15 L 生物反应器中的细胞密度HEK293T。（B） 在 G02 微载体上培养的明场 （BF） 图像、钙黄绿素染色（活）和 PI 染色（死）HEK293T细胞;比例尺 = 1 mm. 请点击这里查看此图的较大版本.
图 6： 通过 ACISCP 平台对 Vero 细胞进行细胞扩增。 （A） 5 L 和 15 L 生物反应器中的 Vero 细胞密度。（B） 在 V01 微载体上培养的明场 （BF） 图像、钙黄绿素染色（活）和 PI 染色（死）Vero 细胞;比例尺 = 400 μm。 请点击这里查看此图的较大版本.
表1：搅拌罐生物反应器的参数设置。请按此下载此表格。
表2：hMSC培养自动培养基交换的参数设置。请按此下载此表格。
表3：hMSC传代和配方的细胞处理系统的参数设置。请按此下载此表格。
表 4：HEK293T 和 Vero 细胞的培养基交换方案和搅拌方案。请按此下载此表格。
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Discussion
免疫疗法和干细胞疗法都使用活细胞作为药物;然而，它们的最终产品不应像小分子或病毒那样进行纯化或灭菌。因此，应始终牢记质量源于设计 （QbD） 的原则，并将其实际应用于电池生产过程中的化学制造和控制 （CMC） 过程23。优先考虑完全封闭的细胞培养系统以及处理系统和灌装系统，以满足要求。在这项研究中，我们提出了一种利用基于 GMP 级、可溶解和多孔 3D 微载体的 ACISCP 平台对 hMSC 进行两层扩增的方案。一些研究人员已经探索了将生物反应器与微载体一起使用以在体外扩增 hMSC 的可行性，但大多数报道的研究表明，规模的增加会导致 hMSC 产量下降，从 100 mL 工作体积中的 6.1 x 10 5 个细胞/mL 甚至 12.5 x 10 5 个细胞/mL 降至 2 L 工作体积24 中的 2.7 x 105 个细胞/mL，25,26.尽管搅拌罐式生物反应器具有最高的可扩展性，但应彻底考虑容器的结构特性、叶轮类型、尖端速度、体积传质系数、氧气的 kLa 和功率数等关键问题24。与以前的搅拌罐生物反应器不同，以前的搅拌罐生物反应器通常设计用于培养微生物或驯化的锚定非依赖细胞（如CHO细胞），本研究中使用的生物反应器是专门为基于微载体的培养而设计的，因此能够满足营养交换策略的不同工艺需求。除了细胞培养过程的差异外，ACISCP平台还采用了基于连续流动离心机的细胞处理系统和细胞填充系统，与传统的收获程序相比，通过重复的手工操作来生产大量细胞，从而保证了高处理效率。先进的自动化设备在批量生产中具有很高的产量。
大多数干细胞是锚定依赖性的;因此，他们需要用于细胞制造的微载体。传统上，以前的商业微载体被配制成利用不同的表面特性，从而实现不同的细胞扩增倍数。在先前的研究中，使用 Cytodex 1 型微载体治疗猪骨髓 MSC 产生的细胞密度约为 4 x 10 5 个细胞/mL，而使用明胶包被的 Cytodex 3 型产生的细胞数量（3.8 x 105 个细胞/mL）与人胎盘 MSC 相当27。然而，Cytodex 1 型和 3 型是不可溶解的，因此，细胞收获过程中的胰蛋白酶消化过程不仅会影响细胞回收率，还会影响活力和质量。因此，对于CGT产品使用常规微载体，没有成功的案例，其中细胞作为最终产物不能经过广泛的下游纯化过程来消除不可溶解的微载体的污染28。相比之下，W01微载体是完全可溶解的，这意味着细胞产物可以很容易地通过微载体的降解来收获。这种微载体产品还采用全封闭系统包装，这意味着可以轻松实现符合GMP的操作过程。我们已经证明，使用 W01 微载体可以很容易地实现两层扩增过程的传代，并且单批可以收获高达 1.1 x10 10 个细胞的总量;事实上，在以前的报告29,30 中，这只能在 50 L 生物反应器中实现。在这项工作中，搅拌罐生物反应器内的峰值细胞密度在收获前达到约 11.6 x 105 个细胞/mL。因此，可以预期，在ACISCP平台中，使用100-200 L的生物反应器可以轻松实现每批1 x 1011个细胞，这意味着每年数千个批次可以轻松满足每年300万亿个hMSC的需求。
由于细胞具有不同的特性，因此可以生产不同类型的 3D 微载体，并可用于测试特定细胞和微载体之间的相容性。对于CGT中的非细胞终产物，据报道，生物反应器中HEK293T细胞和Vero细胞的微载体放大分别达到1.5 x 10 6个细胞/mL和3.3 x 106个细胞/mL，31。我们在ACISCP平台中使用可溶解的多孔微载体G02和V01分别扩增HEK293T细胞和Vero细胞，两种细胞的峰值细胞密度均达到1 x 107 cells/mL以上。此外，3D微载体的降解性有利于细胞内病毒生物产物的生产，因为细胞可以很容易地从微载体中分离出来。至关重要的是，ACISCP平台代表了一种成熟的新生物制造工艺，可以满足细胞和基因治疗产品的数量和质量要求。我们预计，我们的大规模细胞生产平台将成为实现细胞和基因疗法开发的重要工具。
尽管上面讨论的平台具有优势，但未来仍有一些限制需要规避。首先，目前ACISCP平台采用的生物反应器仍配备玻璃罐，需要复杂的清洗程序和清洁验证才能满足GMP标准。未来可能会采用一次性搅拌罐生物反应器系统来生产一套完整的一次性耗材试剂盒。其次，与驯化细胞系不同，hMSCs是从单个供体和不同组织中分离出来的原代细胞株，这意味着hMSCs表现出异质性。因此，本文所述的协议可作为参考，同时需要系统的工艺开发来实现ACISCP平台的技术迁移。第三，尽管我们的同事已经初步测试了用Vero细胞32生产牛痘病毒的可行性，但是否可以在HEK293T细胞的3D扩增中实现病毒生产的良好性能仍有待进一步验证。综上所述，ACISCP平台基于可溶解多孔微载体和一系列自动化封闭系统的大规模电池生产方法，为CGT产品的制造提供了提高生产效率和精细化工业规模质量控制的机会。
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Disclosures
Y.D.是北京CytoNiche生物技术有限公司的科学顾问，H.X.、Y.Z.、L.G.、M.L.、Y.Y.、W.L.和X.Y.是北京CytoNiche生物技术有限公司的员工。其他作者在本文所述的产品或公司中没有商业、专有或财务利益。所有其他作者都声明他们没有竞争利益。
Acknowledgments
这项工作得到了美国国家杰出青年学者科学基金会（82125018）的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin EDTA | BasalMedia | S310JV | Used for 2D cell harvest. |
| 3D FloTrix Digest | CytoNiche Biotech | R001-500 | This is a reagent that specifically dissolves 3D TableTrix microcarriers. |
| 3D FloTrix MSC Serum Free Medium | CytoNiche Biotech | RMZ112 | This is a serum-free,animal-free medium for mesenchymal stem cell expansion and maintenance in 2D planar culture as well as 3D culture on 3D TableTrix microcarriers. |
| 3D FloTrix Single-Use Filtration Module | CytoNiche Biotech | R020-00-10 | This module contains 0.22 μm capsule filters used for filtration of culture medium and digest solution. |
| 3D FloTrix Single-Use Storage Bag (10 L) | CytoNiche Biotech | R020-00-03 | Used as feed bag for 5 L bioreactor. |
| 3D FloTrix Single-Use Storage Bag (3 L) | CytoNiche Biotech | R020-00-01 | Used as cell seeding or transfer bags. |
| 3D FloTrix Single-Use Storage Bag (50 L) | CytoNiche Biotech | R020-00-04 | Used as feed bag for 15 L bioreactor. |
| 3D FloTrix vivaPACK Disposable Fill&Finish Consumable Kit | CytoNiche Biotech | PACK-01-01 | This is a standard kit adapted to 3D vivaPACK fill and finish system. |
| 3D FloTrix vivaPACK fill and finish system for cells | CytoNiche Biotech | vivaPACK | This system is a closed liquid handling device, with automated mixing and gas exhausting functions. Cells resuspended in cryopreservation buffer can be rapidly and evenly aliquoted into 20 bags per batch. |
| 3D FloTrix vivaPREP PLUS cell processing system | CytoNiche Biotech | vivaPREP PLUS | This system is a continuous flow centrifuge-based device.Cells can be concentrated, washed, and resuspended under completely closed procedures. |
| 3D FloTrix vivaPREP PLUS Disposable Cell Processing Kit | CytoNiche Biotech | PREP-PLUS-00 | This is a standard kit adapted to 3D vivaPREP PLUS cell processing. |
| 3D FloTrix vivaSPIN bioreactor 15 L | CytoNiche Biotech | FTVS15 | This bioreactor product employs a controller, a 15 L glass stirred-tank vessel, and assessories. A special perfusion tube is available. |
| 3D FloTrix vivaSPIN bioreactor 5 L | CytoNiche Biotech | FTVS05 | This bioreactor product employs a controller, a 5 L glass stirred-tank vessel, and assessories.A special perfusion tube is available. |
| 3D FloTrix vivaSPIN Closed System Consumable Pack (10/15 L) | CytoNiche Biotech | R020-10-10 | This is a standard tubing kit adapted to 3D vivaSPIN bioreactor 15 L, containing sampling bags. |
| 3D FloTrix vivaSPIN Closed System Consumable Pack (2/5 L) | CytoNiche Biotech | R020-05-10 | This is a standard tubing kit adapted to 3D vivaSPIN bioreactor 5 L, containing sampling bags. |
| 3D TableTrix microcarriers G02 | CytoNiche Biotech | G02-10-10g | These porous and degradable microcarriers are suitable for HEK293T cell culture. They come pre-sterilized in 10g/bottle with C-Flex tubings for welding to tubes on bioreactors. |
| 3D TableTrix microcarriers V01 | CytoNiche Biotech | V01-100-10g | These porous and degradable microcarriers are suitable for adherent cell culture, they come as non-sterilized microcarriers that need to be autoclaved in PBS before use. They are especially suitable for vaccine production. |
| 3D TableTrix microcarriers W01 | CytoNiche Biotech | W01-10-10g (single-use packaging); W01-200 (tablets) |
These porous and degradable microcarriers are suitable for adherent cell culture, especially for cells that need to be harvested as end products. They come pre-sterilized in 10g/bottle with C-Flex tubings for welding to tubes on bioreactors.The product has obtained 2 qualifications for pharmaceutical excipients from CDE, with the registration numbers of [F20200000496; F20210000003]. It has also received DMF qualification for pharmaceutical excipients from FDA, with the registration number of [DMF:35481] |
| APC anti-human CD45 Antibody | BioLegend | 368512 | Used in flow cytometry for MSC identity assessment |
| Calcein-AM/PI Double Staining Kit | Dojindo | C542 | Calcein-AM/PI Double Staining Kit is utilized for simultaneous fluorescence staining of viable and dead cells. This kit contains Calcein-AM and Propidium Iodide (PI) solutions, which stain viable and dead cells, respectively. |
| Cap for EZ Top Container Closures for NALGENE-containers (500mL) | Saint-Gobain | CAP-38 | Brands and catalogue numbers are only for example, similar products are available from various suppliers and as long as they have the same functionality, items could be substituted with other brands. |
| C-Flex Tubing, Formulation 374 (0.25 in x 0.44 in) | Saint-Gobain | 374-250-3 | Used for tube welding and disconnection. |
| CryoMACS Freezing Bag 50 | Miltenyi Biotec | 200-074-400 | Used for expanding the 3D FloTrix vivaPACK Disposable Fill&Finish Consumable Kit. |
| Dimethyl Sulfate (DMSO) | Sigma | D2650-100mL | Used for preparation of cryopreservation solution. |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | BasalMedia | L120KJ | Used for cultivation of HEK293T and Vero cells. |
| DURAN Original GL 45 Laboratory bottle (2 L) | DWK life sciences | 218016357 | Used for waste collection from the 5 L bioreactor. |
| DURAN Original GL 45 Laboratory bottle (5 L) | DWK life sciences | 218017353 | Used for waste collection from the 15 L bioreactor. |
| DURAN Original GL 45 Laboratory bottle (500 mL) | DWK life sciences | 218014459 | Used for supplementary bottle of 0.1 M NaOH. |
| EZ Top Container Closures for NALGENE-containers (500mL) | Saint-Gobain | EZ500 ML-38-2 | Brands and catalogue numbers are only for example, similar products are available from various suppliers and as long as they have the same functionality, items could be substituted with other brands. |
| Fetal bovine serum (FBS) superior quality | Wisent | 086-150 | Used for cultivation of HEK293T cells. |
| FITC anti-human CD14 Antibody | BioLegend | 301804 | Used in flow cytometry for MSC identity assessment. |
| FITC anti-human CD34 Antibody | BioLegend | 343504 | Used in flow cytometry for MSC identity assessment. |
| FITC anti-human CD90 (Thy1) Antibody | BioLegend | 328108 | Used in flow cytometry for MSC identity assessment. |
| Flow cytometry | Beckman Coulter | CytoFLEX | Used for cell identity assessment. |
| Fluorescence Cell Analyzer | Alit life science | Countstar Rigel S2 | Used for cell counting. Cell viability can be calculated by staining with AO/PI dyes. |
| GL 45 Multiport Connector Screw Cap with 2 ports | DWK life sciences | 292632806 | Brands and catalogue numbers are only for example, similar products are available from various suppliers and as long as they have the same functionality, items could be substituted with other brands. |
| Glucose Meter | Sinocare | 6243578 | Used for detecting glucose concentration in cell culture medium and supernatant. |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), with calcium and magnesium | Gibco | 14025092 | Used for preparation of digest solution. |
| Human Albumin 20% Behring (HSA) | CSL Behring | N/A | Used for preparation of wash buffer. |
| Inverted fluorescent microscope | OLYMBUS | CKX53SF | Used for brifgt field and fluorescent observation and imaging. |
| Nalgene Measuring Cylinder (500 mL) | Thermo Scientific | 3662-0500PK | Used for calibrating the liquid handling volume speed of peristaltic pumps. |
| Newborn calf serum (NBS) superfine | MINHAI BIO | SC101.02 | Used for cultivation of Vero cells. |
| OriCell human mesenchymal stem cell adipogenic differentiation and characterization kit | Cyagen | HUXUC-90031 | Used for tri-lineage differentiation of hUCMSCs. |
| OriCell human mesenchymal stem cell chondrogenic differentiation and characterization kit | Cyagen | HUXUC-90041 | Used for tri-lineage differentiation of hUCMSCs. |
| OriCell human mesenchymal stem cell osteogenic differentiation and characterization kit | Cyagen | HUXUC-90021 | Used for tri-lineage differentiation of hUCMSCs. |
| PE anti-human CD105 Antibody | BioLegend | 800504 | Used in flow cytometry for MSC identity assessment. |
| PE anti-human CD19 Antibody | BioLegend | 302208 | Used in flow cytometry for MSC identity assessment. |
| PE anti-human CD73 (Ecto-5'-nucleotidase) Antibody | BioLegend | 344004 | Used in flow cytometry for MSC identity assessment. |
| PE anti-human HLA-DR Antibody | BioLegend | 307605 | Used in flow cytometry for MSC identity assessment. |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Wisent | 311-010-CL | Used in autoclaving of glass vessel and V01 microcarriers, and replacement of culture medium. |
| Sani-Tech Platinum Cured Sanitary Silicone Tubing (0.13 in x 0.25 in) | Saint-Gobain | ULTRA-C-125-2F | Used for solution transfering driven by peristaltic pumps. |
| Sterile Saline | Hopebiol | HBPP008-500 | Used for preparation of wash buffer. |
| Trypzyme Recombinant Trypsin | BasalMedia | S342JV | This reagent is used for bead-to-bead transfer of HEK293T and Vero cells. |
| Tube Sealer | Yingqi Biotech | Tube Sealer I | This sealer is compatible with both C-Flex tubing and PVC tubing. |
| Tube Welder for PVC tubing | Chu Biotech | Tube Welder Micro I | Used for welding of PVC tubing. |
| Tube Welder for TPE tubing | Yingqi Biotech | Tube Welder I-V2 | Used for welding of TPE tubing. |
| ViaStain AO / PI Viability Stains | Nexcelom | CS2-0106-25mL | Dual-Fluorescence Viability, using acridine orange (AO) and propidium iodide (PI), is the recommended method for accurate viability analysis of primary cells, such as PBMCs, and stem cells in samples containing debris. |
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