هنا ، نقدم بروتوكولا لتحقيق التصنيع على نطاق واسع للخلايا الملتصقة من خلال نظام مغلق تماما يعتمد على ناقلات دقيقة قابلة للذوبان من فئة GMP. تم التحقق من صحة زراعة الخلايا الجذعية الوسيطة البشرية والخلايا HEK293T وخلايا Vero وتلبية متطلبات الكمية ومعايير الجودة لصناعة العلاج بالخلايا والجينات.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
إنتاج الخلايا على نطاق واسع على أساس الناقلات الدقيقة المسامية القابلة للذوبان من الدرجة GMP
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
واجه الباحثون في صناعة العلاج بالخلايا والجينات (CGT) منذ فترة طويلة تحديا هائلا في التوسع الفعال والواسع النطاق للخلايا. لمعالجة أوجه القصور الأساسية في نظام الاستزراع المستوي ثنائي الأبعاد (2D) ، قمنا بتطوير منصة إنتاج خلايا آلية مغلقة النطاق الصناعي (ACISCP) تعتمد على ناقل دقيق من الدرجة GMP وقابل للذوبان ومسامي لثقافة 3D للخلايا الملتصقة ، بما في ذلك الخلايا الجذعية / اللحمة المتوسطة البشرية (hMSCs) وخلايا HEK293T وخلايا Vero. لتحقيق توسع واسع النطاق ، تم إجراء توسع على مرحلتين مع مفاعلات حيوية ذات خزان تحريك 5 لتر و 15 لتر لإنتاج 1.1 × 1010 hMSCs مع توسع إجمالي 128 ضعفا في غضون 9 أيام. تم حصاد الخلايا عن طريق إذابة الناقلات الدقيقة تماما ، وتركيزها وغسلها وصياغتها باستخدام نظام معالجة الخلايا القائم على الطرد المركزي المستمر التدفق ، ثم تم اقتباسها بنظام ملء الخلايا. بالمقارنة مع الثقافة المستوية 2D ، لا توجد فروق ذات دلالة إحصائية في جودة hMSCs التي يتم حصادها من ثقافة 3D. لقد قمنا أيضا بتطبيق هذه الناقلات الدقيقة المسامية القابلة للذوبان على أنواع الخلايا الشائعة الأخرى في قطاع CGT. على وجه التحديد ، تمت زراعة خلايا HEK293T وخلايا Vero لذروة كثافة الخلايا 1.68 × 107 خلايا / مل و 1.08 × 107 خلايا / مل ، على التوالي. توفر هذه الدراسة بروتوكولا لاستخدام منصة هندسة العمليات الحيوية التي تسخر خصائص الناقلات الدقيقة القابلة للذوبان من فئة GMP والمعدات المغلقة المتقدمة لتحقيق التصنيع على نطاق صناعي للخلايا الملتصقة.
المقدمة
شهدت صناعة CGT توسعا هائلا على مدار العقدين الماضيين. من المتوقع أن يؤدي تطور أدوية الجيل التالي إلى علاج وعلاج العديد من الأمراض المقاومةللحرارة 1. منذ أول موافقة من إدارة الغذاء والدواء (FDA) على منتج CGT ، Kymriah ، في عام 2017 ، استمر البحث والتطوير المتعلق ب CGT في العالم في النمو بمعدل سريع ، حيث شهدت إدارة الغذاء والدواء الأمريكية زيادة تطبيقات الأدوية الجديدة التجريبية النشطة ل CGT إلى 500 في 20182. كان من المتوقع أن يكون عدد الموافقات على منتجات CGT على الأرجح 54-74 في الولايات المتحدة بحلول عام 20302.
في حين أن النمو السريع في أبحاث CGT والابتكار مثير ، لا تزا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تم الحصول على الحبل السري البشري من مستشفى بكين تسينغهوا تشانغينغ. تم إجراء جميع الإجراءات والبروتوكولات المتعلقة باكتساب وعزل وزراعة الخلايا الجذعية الوسيطة للحبل السري البشري (UCMSCs) بموافقة مستنيرة وبموافقة لجنة الأخلاقيات في مستشفى بكين تسينغهوا تشانغينغ (رقم الإيداع 22035-4-02) ، وامتثلت الإجراءات والبروتوكولات لإعلان هلسنكي لعام 1964 وتعديلاته اللاحقة أو المعايير الأخلاقية المماثلة.
1. ثقافة أحادية الطبقة من hMSCs وخلايا HEK293T وخلايا Vero
- عزل UCMSCs البشرية الأولية من هلام وارتون وفقا للطريقةالمبلغ عنها 21. استخدم وسط استزراع hMSC الخالي من المصل (SF) لعزل ونمو UCMSCs الأولية ، وحص....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
منصة ACISCP عبارة عن نظام مغلق بالكامل يستخدم سلسلة من المفاعلات الحيوية ذات الخزانات المقلوبة لتوسيع النطاق ، ونظام معالجة الخلايا لحصاد الخلايا وتركيبها آليا ، ونظام ملء الخلايا (الشكل 1). تلتصق الخلايا الملتصقة بالناقلات الدقيقة المسامية ، والتي يمكن تشتيتها في المفاعل الحيوي ، وبالتالي تحقيق الزراعة المعلقة للخلايا الملتصقة.
باتباع البروتوكول كما هو موضح ، تم أولا تلقيح 2.5 × 108 hMSCs مع 10 g من الناقلات الدقيقة W01 في مفاعل حيوي ذو خزان متحرك سعة .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يستخدم كل من العلاج المناعي والعلاج بالخلايا الجذعية الخلايا الحية كأدوية. ومع ذلك ، لا ينبغي تنقية منتجاتها النهائية أو تعقيمها بنفس طريقة الجزيئات الصغيرة أو الفيروسات. لذلك ، يجب دائما مراعاة مبدأ الجودة حسب التصميم (QbD) وتطبيقه عمليا على عملية التصنيع والتحكم الكيميائي (CMC) أثناء إنتاج الخلايا23. يتم اعتبار نظام زراعة الخلايا المغلقة بالكامل ، بالإضافة إلى نظام المعالجة ونظام التعبئة ، بشكل تفضيلي لتلبية المتطلبات. في هذه الدراسة ، قدمنا بروتوكولا لاستخدام منصة ACISCP تعتمد على ناقلات 3D 3D .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
Y.D. هو مستشار علمي ، و H.X. ، Y.Z. ، L.G. ، M.L. ، Y.Y. ، W.L. ، و X.Y. موظفون في شركة Beijing CytoNiche Biotechnology Co. Ltd. ليس للمؤلفين الآخرين أي مصلحة تجارية أو ملكية أو مالية في المنتجات أو الشركات الموضحة في هذه المقالة. يعلن جميع المؤلفين الآخرين أنه ليس لديهم مصالح متنافسة.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل ماليا من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم للعلماء الشباب المتميزين (82125018).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 0.25٪ التربسين EDTA | BasalMedia | S310JV | تستخدم لحصاد الخلايا ثنائية الأبعاد. |
| 3D FloTrix Digest | CytoNiche Biotech | R001-500 | هذا كاشف يذيب على وجه التحديد الناقلات الدقيقة 3D TableTrix. |
| 3D FloTrix MSC مصل مجاني متوسط | CytoNiche Biotech | RMZ112 | هذا وسيط خال من المصل وخالية من لتوسيع الخلايا الجذعية الوسيطة وصيانتها في ثقافة مستوية ثنائية الأبعاد بالإضافة إلى ثقافة ثلاثية الأبعاد على الناقلات الدقيقة ثلاثية الأبعاد TableTrix. |
| 3D FloTrix وحدة الترشيح ذات الاستخدام الواحد | CytoNiche Biotech | R020-00-10 | تحتوي هذه الوحدة على 0.22 & mu ؛ مرشحات الكبسولة M المستخدمة لترشيح وسط الثقافة ومحلول الهضم. |
| 3D FloTrix حقيبة تخزين للاستخدام مرة واحدة (10 لتر) | CytoNiche Biotech | R020-00-03 | تستخدم ككيس تغذية للمفاعل الحيوي سعة 5 لتر. |
| 3D FloTrix حقيبة تخزين للاستخدام مرة واحدة (3 لتر) | CytoNiche Biotech | R020-00-01 | تستخدم كبذر الخلايا أو أكياس النقل. |
| 3D FloTrix حقيبة تخزين للاستخدام الفردي (50 لتر) | CytoNiche Biotech | R020-00-04 | تستخدم ككيس تغذية للمفاعل الحيوي سعة 15 لترا. |
| 3D FloTrix vivaPACK تعبئة يمكن التخلص منها & طقم الانتهاء من المواد الاستهلاكية | CytoNiche Biotech | PACK-01-01 | هذه مجموعة قياسية تتكيف مع نظام التعبئة والتشطيب 3D vivaPACK. |
| نظام تعبئة وتشطيب 3D FloTrix vivaPACK للخلايا | CytoNiche Biotech | vivaPACK | هذا النظام عبارة عن جهاز مغلق لمناولة السوائل ، مع وظائف الخلط الآلي واستنفاد الغاز. يمكن تقسيم الخلايا المعلقة في المخزن المؤقت للحفظ بالتبريد بسرعة وبشكل متساو إلى 20 كيسا لكل دفعة. |
| 3D FloTrix vivaPREP PLUS نظام معالجة الخلايا | CytoNiche Biotech | vivaPREP PLUS | هذا النظام عبارة عن جهاز قائم على أجهزة الطرد المركزي ذات التدفق المستمر. يمكن تركيز الخلايا وغسلها وإعادة تعليقها في ظل إجراءات مغلقة تماما. |
| 3D FloTrix vivaPREP PLUS طقم معالجة الخلايا القابل للتصرف | CytoNiche Biotech | PREP-PLUS-00 | هذه مجموعة قياسية تتكيف مع معالجة خلايا 3D vivaPREP PLUS. |
| 3D FloTrix vivaSPIN مفاعل حيوي 15 لتر | CytoNiche Biotech | FTVS15 | يستخدم منتج المفاعل الحيوي هذا وحدة تحكم ، ووعاء خزان زجاجي مقاس 15 لترا ، ومقيمين. يتوفر أنبوب تروية خاص. |
| 3D FloTrix vivaSPIN bioreactor 5 L | CytoNiche Biotech | FTVS05 | يستخدم منتج المفاعل الحيوي هذا وحدة تحكم ، ووعاء خزان زجاجي مقاس 5 لتر ، ومقيمين. يتوفر أنبوب تروية خاص. |
| 3D FloTrix vivaSPIN حزمة مستهلكة بنظام مغلق (10/15 لتر) | CytoNiche Biotech | R020-10-10 | هذه مجموعة أنابيب قياسية تتكيف مع المفاعل الحيوي 3D vivaSPIN 15 L ، تحتوي على أكياس أخذ العينات. |
| 3D FloTrix vivaSPIN حزمة مستهلكة بنظام مغلق (2/5 لتر) | CytoNiche Biotech | R020-05-10 | هذه مجموعة أنابيب قياسية تتكيف مع المفاعل الحيوي 3D vivaSPIN 5 L ، تحتوي على أكياس أخذ العينات. |
| 3D TableTrix microcarriers G02 | CytoNiche Biotech | G02-10-10g | هذه الناقلات الصغيرة المسامية والقابلة للتحلل مناسبة لزراعة الخلايا HEK293T. تأتي معقمة مسبقا في 10 جم / زجاجة مع أنابيب C-Flex للحام بالأنابيب على المفاعلات الحيوية. |
| 3D TableTrix microcarriers V01 | CytoNiche Biotech | V01-100-10g | هذه الناقلات الدقيقة المسامية والقابلة للتحلل مناسبة لزراعة الخلايا الملتصقة ، فهي تأتي كناقلات دقيقة غير معقمة تحتاج إلى التعقيم في PBS قبل الاستخدام. إنها مناسبة بشكل خاص لإنتاج اللقاحات. |
| 3D TableTrix microcarriers W01 | CytoNiche Biotech | W01-10-10g (تغليف للاستخدام الواحد) ؛ W01-200 (أقراص) | هذه الناقلات الدقيقة المسامية والقابلة للتحلل مناسبة لزراعة الخلايا الملتصقة ، خاصة للخلايا التي تحتاج إلى الحصاد كمنتجات نهائية. تأتي معقمة مسبقا في 10 جم / زجاجة مع أنابيب C-Flex للحام بالأنابيب على المفاعلات الحيوية. حصل المنتج على 2 مؤهلات للسواغات الصيدلانية من CDE ، بأرقام تسجيل [F20200000496; F20210000003]. كما حصلت على مؤهل DMF للسواغات الصيدلانية من إدارة الغذاء والدواء الأمريكية ، مع رقم تسجيل [DMF: 35481] |
| APC المضاد للإنسان CD45 | BioLegend | 368512 | يستخدم في قياس التدفق الخلوي لتقييم هوية MSC |
| Calcein-AM / PI Double Staining | Dojindo | C542 | Calcein-AM / PI Double Staining Kit يستخدم لتلوين التألق المتزامن للخلايا القابلة للحياة والميتة. تحتوي هذه المجموعة على محاليل Calcein-AM و Propidium Iodide (PI) ، والتي تلطخ الخلايا القابلة للحياة والميتة ، على التوالي. |
| غطاء لإغلاق الحاويات العلوية EZ لحاويات NALGENE (500 مل) | التجارية وأرقام الكتالوج Saint-Gobain CAP-38 هي فقط على سبيل المثال ، تتوفر منتجات مماثلة من موردين مختلفين وطالما أن لديهم نفس الوظيفة ، يمكن استبدال العناصر بعلامات تجارية أخرى. | ||
| أنابيب C-Flex ، الصيغة 374 (0.25 بوصة × 0.44 بوصة) | Saint-Gobain | 374-250-3 | تستخدم للحام الأنبوب وفصله. |
| كيس تجميد CryoMACS 50 | Miltenyi Biotec | 200-074-400 | تستخدم لتوسيع 3D FloTrix vivaPACK Disposable Fill& مجموعة الانتهاء من المواد الاستهلاكية. |
| ثنائي ميثيل كبريتات (DMSO) | سيجما | D2650-100 مل | تستخدم لتحضير محلول الحفظ بالتبريد. |
| وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) | BasalMedia | L120KJ | يستخدم لزراعة خلايا HEK293T و Vero. |
| زجاجة مختبر DURAN الأصلية GL 45 (2 لتر) | DWK علوم الحياة | 218016357 | تستخدم لجمع النفايات من المفاعل الحيوي سعة 5 لتر. |
| زجاجة مختبر DURAN الأصلية GL 45 (5 لتر) | DWK علوم الحياة | 218017353 | تستخدم لجمع النفايات من المفاعل الحيوي سعة 15 لترا. |
| زجاجة مختبر DURAN الأصلية GL 45 (500 مل) | 218014459 | DWK لعلوم الحياة | تستخدم لزجاجة تكميلية من 0.1 متر هيدروكسيد الصوديوم. |
| الحاويات العلوية EZ لحاويات NALGENE (500 مل) | Saint-Gobain | EZ500 ML-38-2 | العلامات التجارية وأرقام الكتالوج هي فقط على سبيل المثال ، تتوفر منتجات مماثلة من موردين مختلفين وطالما أن لديهم نفس الوظيفة ، يمكن استبدال العناصر بعلامات تجارية أخرى. |
| مصل الأبقار الجنيني (FBS) عالي الجودة | Wisent | 086-150 | يستخدم لزراعة خلايا HEK293T. |
| BioLegend | BioLegend للجسم المضاد CD14 المضاد للإنسان من FITC | 301804 في قياس التدفق الخلوي لتقييم هوية MSC. | |
| Bio343504Legend BioLegend للأجسام المضادة CD34 المضاد للإنسان من FITC | في قياس التدفق الخلوي لتقييم هوية MSC. | ||
| BioLegend | للأجسام المضادة CD90 (Thy1) المضاد للإنسان FITC | 328108 في قياس التدفق الخلوي لتقييم هوية MSC. | |
| قياس التدفق الخلوي | Beckman Coulter | CytoFLEX | يستخدم لتقييم هوية الخلية. |
| محلل الخلايا الفلورية | Alit علوم الحياة | Countstar Rigel S2 | يستخدم في عد الخلايا. يمكن حساب صلاحية الخلية عن طريق تلطيخ أصباغ AO / PI. |
| GL 45 متعدد المنافذ موصل برغي كاب مع 2 منافذ | DWK علوم الحياة | 292632806 | العلامات التجارية وأرقام الكتالوج هي فقط على سبيل المثال ، تتوفر منتجات مماثلة من موردين مختلفين وطالما أن لديهم نفس الوظيفة ، يمكن استبدال العناصر بعلامات تجارية أخرى. |
| الجلوكوز | سينوكير | 6243578 | يستخدم للكشف عن تركيز الجلوكوز في وسط زراعة الخلايا والمواد الطافية. |
| يستخدم محلول الملح المتوازن من هانك (HBSS) ، مع الكالسيوم والمغنيسيوم | جيبكو | 14025092 | لتحضير محلول الهضم. |
| ألبومين بشري 20٪ Behring (HSA) CSL | Behring | N / A | يستخدم لإعداد عازلة الغسيل. |
| المجهر الفلوري المقلوب | OLYMBUS | CKX53SF | يستخدم لمجال brifgt والمراقبة والتصوير. |
| أسطوانة قياس Nalgene (500 مل) | Thermo Scientific | 3662-0500PK | تستخدم لمعايرة سرعة حجم مناولة السائل للمضخات التمعجية. |
| مصل العجل حديثي الولادة (NBS) فائق النعومة | MINHAI BIO | SC101.02 | يستخدم لزراعة خلايا فيرو. |
| مجموعة التمايز والتوصيف بالخلايا الجذعية الوسيطة البشرية من OriCell | Cyagen | HUXUC-90031 | تستخدم للتمايز الثلاثي للسلالات الهيجانية hUCMSCs. |
| مجموعة التمايز والتوصيف بالخلايا الجذعية الوسيطة البشرية للخلايا الوسيطة الغضروفية من OriCell | Cyagen | HUXUC-90041 | تستخدم للتمايز الثلاثي للسلالات الهيدروجيني hUCMSCs. |
| مجموعة تمايز وتوصيف الخلايا الجذعية الوسيطة البشرية من OriCell | Cyagen | HUXUC-90021 | تستخدم للتمايز الثلاثي للسلالات hUCMSCs. |
| Bio800504Legend | BioLegend للأجسام المضادة CD105 المضاد للإنسان | PE في قياس التدفق الخلوي لتقييم هوية MSC. | |
| Bio302208Legend | BioLegend للأجسام المضادة CD19 المضاد للإنسان | PE في قياس التدفق الخلوي لتقييم هوية MSC. | |
| المضاد للإنسان CD73 (Ecto-5'-nucleotidase) | BioLegend | يستخدم 344004 في قياس التدفق الخلوي لتقييم هوية MSC. | |
| Bio307605Legend | BioLegend للأجسام المضادة HLA-DR المضاد للإنسان | PE في قياس التدفق الخلوي لتقييم هوية MSC. | |
| ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) | Wisent | 311-010-CL | يستخدم في التعقيم بالأوعية الزجاجية والناقلات الدقيقة V01 ، واستبدال وسط الاستزراع. |
| السيليكون الصحية المعالجة بالبلاتين من Sani-Tech (0.13 بوصة × 0.25 بوصة) | Saint-Gobain | ULTRA-C-125-2F | تستخدم لنقل المحلول مدفوعا بالمضخات التمعجية. |
| محلول ملحي معقم | Hopebiol | HBPP008-500 | يستخدم لتحضير محلول الغسيل. |
| Trypzyme المؤتلف Trypsin | BasalMedia | S342JV | يستخدم هذا الكاشف لنقل حبة إلى حبة لخلايا HEK293T و Vero. |
| أنبوب السدادة | Yingqi | Biotech أنبوب السدادة I | هذا السدادة متوافق مع كل من أنابيب C-Flex وأنابيب PVC. |
| الأنبوب لأنابيب PVC | Chu | Biotech أنبوب لحام مايكرو أنا | تستخدم لحام الأنابيب البلاستيكية. |
| الأنبوب لأنابيب TPE | Yingqi | Biotech أنبوب لحام I-V2 | تستخدم لحام أنابيب TPE. |
| ViaStain AO / PI Viability Stains | Nexcelom | CS2-0106-25mL | الجدوى المزدوجة الفلورية ، باستخدام برتقال أكريدين (AO) ويوديد البروبيديوم (PI) ، هي الطريقة الموصى بها لتحليل دقيق للبقاء للخلايا الأولية ، مثل PBMCs ، والخلايا الجذعية في العينات التي تحتوي على الحطام. |
المراجع
- Golchin, A., Farahany, T. Z. Biological products: Cellular therapy and FDA approved products. Stem Cell Reviews and Reports. 15 (2), 166-175 (2019).
- Young, C. M., Quinn, C., Trusheim, M. R.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
