Summary
هنا ، نقدم بروتوكولا لتحقيق التصنيع على نطاق واسع للخلايا الملتصقة من خلال نظام مغلق تماما يعتمد على ناقلات دقيقة قابلة للذوبان من فئة GMP. تم التحقق من صحة زراعة الخلايا الجذعية الوسيطة البشرية والخلايا HEK293T وخلايا Vero وتلبية متطلبات الكمية ومعايير الجودة لصناعة العلاج بالخلايا والجينات.
Abstract
واجه الباحثون في صناعة العلاج بالخلايا والجينات (CGT) منذ فترة طويلة تحديا هائلا في التوسع الفعال والواسع النطاق للخلايا. لمعالجة أوجه القصور الأساسية في نظام الاستزراع المستوي ثنائي الأبعاد (2D) ، قمنا بتطوير منصة إنتاج خلايا آلية مغلقة النطاق الصناعي (ACISCP) تعتمد على ناقل دقيق من الدرجة GMP وقابل للذوبان ومسامي لثقافة 3D للخلايا الملتصقة ، بما في ذلك الخلايا الجذعية / اللحمة المتوسطة البشرية (hMSCs) وخلايا HEK293T وخلايا Vero. لتحقيق توسع واسع النطاق ، تم إجراء توسع على مرحلتين مع مفاعلات حيوية ذات خزان تحريك 5 لتر و 15 لتر لإنتاج 1.1 × 1010 hMSCs مع توسع إجمالي 128 ضعفا في غضون 9 أيام. تم حصاد الخلايا عن طريق إذابة الناقلات الدقيقة تماما ، وتركيزها وغسلها وصياغتها باستخدام نظام معالجة الخلايا القائم على الطرد المركزي المستمر التدفق ، ثم تم اقتباسها بنظام ملء الخلايا. بالمقارنة مع الثقافة المستوية 2D ، لا توجد فروق ذات دلالة إحصائية في جودة hMSCs التي يتم حصادها من ثقافة 3D. لقد قمنا أيضا بتطبيق هذه الناقلات الدقيقة المسامية القابلة للذوبان على أنواع الخلايا الشائعة الأخرى في قطاع CGT. على وجه التحديد ، تمت زراعة خلايا HEK293T وخلايا Vero لذروة كثافة الخلايا 1.68 × 107 خلايا / مل و 1.08 × 107 خلايا / مل ، على التوالي. توفر هذه الدراسة بروتوكولا لاستخدام منصة هندسة العمليات الحيوية التي تسخر خصائص الناقلات الدقيقة القابلة للذوبان من فئة GMP والمعدات المغلقة المتقدمة لتحقيق التصنيع على نطاق صناعي للخلايا الملتصقة.
Introduction
شهدت صناعة CGT توسعا هائلا على مدار العقدين الماضيين. من المتوقع أن يؤدي تطور أدوية الجيل التالي إلى علاج وعلاج العديد من الأمراض المقاومةللحرارة 1. منذ أول موافقة من إدارة الغذاء والدواء (FDA) على منتج CGT ، Kymriah ، في عام 2017 ، استمر البحث والتطوير المتعلق ب CGT في العالم في النمو بمعدل سريع ، حيث شهدت إدارة الغذاء والدواء الأمريكية زيادة تطبيقات الأدوية الجديدة التجريبية النشطة ل CGT إلى 500 في 20182. كان من المتوقع أن يكون عدد الموافقات على منتجات CGT على الأرجح 54-74 في الولايات المتحدة بحلول عام 20302.
في حين أن النمو السريع في أبحاث CGT والابتكار مثير ، لا تزال هناك فجوة تكنولوجية كبيرة بين الأبحاث المعملية والتصنيع على نطاق صناعي يمكن أن تقدم هذه الأدوية الواعدة للوصول إلى أكبر عدد ممكن من المرضى حسب الحاجة بتكاليف معقولة. تم إنشاء العمليات الحالية المعتمدة لهذه التجارب السريرية في المختبرات للتجارب الصغيرة ، وهناك حاجة إلى بذل جهود كبيرة لتحسين وابتكار تصنيع CGT3. هناك العديد من أنواع منتجات CGT ، يعتمد معظمها على الخلايا الحية ، والتي يمكن أن تكون خيفية أو ذاتية أو هندسية أو طبيعية. هذه الأدوية الحية أكثر تعقيدا بكثير من الكيانات الجزيئية الصغيرة أو البيولوجية ، مما يجعل التصنيع على نطاق واسع تحديا كبيرا4،5،6. في هذا العمل ، نوضح بروتوكول إنتاج الخلايا على نطاق واسع لثلاث خلايا تعتمد على المرسى والتي يتم تطبيقها على نطاق واسع في CGTs. وتشمل هذه الخلايا الجذعية / اللحمة المتوسطة البشرية (hMSCs) ، والتي تم استخدامها للعلاج القائم على الخلايا ، والخلايا HEK293T وخلايا Vero ، وكلاهما يستخدم لإنتاج فيروسات للهندسة الوراثية لمنتج الخلية العلاجية النهائي. عادة ما يتم استزراع الخلايا المعتمدة على المرساة على أنظمة مستوية ، والتي تتطلب معالجة يدوية. ومع ذلك ، تتطلب طرق الزراعة اليدوية قدرا كبيرا من العمالة وتكون عرضة للتلوث ، مما قد يضر بجودة المنتج النهائي. علاوة على ذلك ، لا يوجد تحكم في العملية على الخط ، مما يؤدي إلى تباين كبير في الجودة بين الدفعات7. إذا أخذنا العلاج بالخلايا الجذعية كمثال ، مع وجود خط أنابيب واعد يضم أكثر من 200 مرشح للعلاج بالخلايا الجذعية ، تشير التقديرات إلى أن هناك حاجة إلى 300 تريليون hMSCs سنويا لتلبية متطلبات التطبيقات السريرية8. وبالتالي ، أصبح التصنيع على نطاق واسع للخلايا العلاجية شرطا أساسيا لإجراء هذه التدخلات العلاجية مع هذا الطلب العالي على الخلايا9.
وللحيلولة دون حدوث انتكاسات للنظم المستوية، بذلت جهود في تطوير عمليات تصنيع واسعة النطاق في المفاعلات الحيوية ذات الصهاريج المقلوبة ذات الناقلات الدقيقة التقليدية غير القابلة للذوبان10،11،12،13، ولكنها تعاني من إجراءات تحضير معقدة وكفاءة حصاد خلايامنخفضة 14. في الآونة الأخيرة ، ابتكرنا حاملا دقيقا قابلا للذوبان لتوسيع الخلايا الجذعية ، بهدف التحايل على تحديات حصاد الخلايا من الناقلات الدقيقة التجارية التقليدية غير القابلة للذوبان15. أظهرت هذه الحاملة الدقيقة المسامية ثلاثية الأبعاد القابلة للذوبان من فئة GMP ، 3D TableTrix ، إمكانات كبيرة لإنتاج الخلايا على نطاق واسع. في الواقع ، يمكن لثقافة 3D القائمة على هذه الناقلات الدقيقة المسامية أن تعيد إنشاء بيئات دقيقة مواتية للمحاكاة الحيوية لتعزيز التصاق الخلايا وانتشارها وهجرتها وتنشيطها16. يمكن للهياكل المسامية وشبكات المسام المترابطة للناقلات الدقيقة أن تخلق منطقة التصاق أكبر للخلايا وتعزز تبادل الأكسجين والمغذيات والمستقلبات ، وبالتالي إنشاء ركيزة مثالية لتوسيع الخلايا في المختبر 17. تتيح المسامية العالية لهذه الناقلات الدقيقة المسامية القابلة للذوبان 3D من الدرجة GMP توسعا واسع النطاق ل hMSCs ، وتسمح القدرة على إذابة الخلايا بالكامل بالحصاد الفعال لهذه الخلايا الموسعة18. وهو أيضا منتج من الدرجة GMP وقد تم تسجيله كسواغ صيدلاني لدى المركز الصيني لتقييم الأدوية (أرقام الإيداع: F20210000003 و F20200000496)19 وإدارة الغذاء والدواء في الولايات المتحدة (FDA ، الولايات المتحدة الأمريكية ؛ FDA ، الولايات المتحدة الأمريكية ، الولايات المتحدة الأمريكية ، الولايات المخدرات الرئيسية رقم الملف: 35481)20.
هنا ، نوضح نظام إنتاج الخلايا الصناعية المغلقة الآلية (ACISCP)18 باستخدام هذه الناقلات الدقيقة المسامية القابلة للتشتت والقابلة للذوبان ل hMSC وخلية HEK293T وتوسيع خلية Vero. لقد حققنا توسعا ناجحا من مستويين ل hMSCs (128 توسعة تراكمية في 9 أيام) من مفاعل حيوي سعة 5 لتر إلى مفاعل حيوي سعة 15 لترا وحصلنا أخيرا على ما يصل إلى 1.1 × 1010 hMSCs من دفعة واحدة من الإنتاج. تم حصاد الخلايا عن طريق إذابة الناقلات الدقيقة تماما ، وتركيزها وغسلها وصياغتها باستخدام نظام معالجة الخلايا القائم على الطرد المركزي المستمر التدفق ، ثم تم اقتباسها بنظام تعبئة الخلايا. علاوة على ذلك ، قمنا بتقييم جودة منتجات hMSC لتأكيد الامتثال. لقد أظهرنا أيضا تطبيق هذه الناقلات الدقيقة القابلة للذوبان للإنتاج الموسع لنوعين آخرين من خلايا التثبيت ، خلايا HEK293T وخلايا Vero ، والتي يتم تطبيقها على نطاق واسع في صناعة CGT. بلغت ذروة كثافة الخلايا لخلايا HEK293T 1.68 × 10 7 خلايا / مل ، بينما بلغت ذروة كثافة خلايا Vero 1.08 × 107 خلايا / مل. يمكن تكييف نظام ACISCP لاستزراع مجموعة متنوعة من الخلايا الملتصقة ، ويمكن أن يصبح منصة قوية تساهم في تسريع تصنيع CGT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم الحصول على الحبل السري البشري من مستشفى بكين تسينغهوا تشانغينغ. تم إجراء جميع الإجراءات والبروتوكولات المتعلقة باكتساب وعزل وزراعة الخلايا الجذعية الوسيطة للحبل السري البشري (UCMSCs) بموافقة مستنيرة وبموافقة لجنة الأخلاقيات في مستشفى بكين تسينغهوا تشانغينغ (رقم الإيداع 22035-4-02) ، وامتثلت الإجراءات والبروتوكولات لإعلان هلسنكي لعام 1964 وتعديلاته اللاحقة أو المعايير الأخلاقية المماثلة.
1. ثقافة أحادية الطبقة من hMSCs وخلايا HEK293T وخلايا Vero
- عزل UCMSCs البشرية الأولية من هلام وارتون وفقا للطريقةالمبلغ عنها 21. استخدم وسط استزراع hMSC الخالي من المصل (SF) لعزل ونمو UCMSCs الأولية ، وحصاد الخلايا عند الممر 2 ، والحفظ بالتبريد كبنك خلايا رئيسي (MCB).
- تلقيح 6 × 105 UCMSCs بشرية (يفضل المرور 2 أو المرور 3 خلايا) في قارورة T75 واحدة (أي أن كثافة البذر على الأوعية المستوية ثنائية الأبعاد هي 8000 خلية / سم2) للاستزراع أحادي الطبقة مع 15 مل من وسط زراعة SF hMSC الكامل. تأكد من البذر الموحد من خلال حركة الشكل الثامن للقارورة. الثقافة عند 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة خلايا CO2 بنسبة 5٪ إلى التقاء 80٪ -90٪.
- للحصاد ، صب وسط زراعة الخلايا ، وشطف الخلايا ب 3-5 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) مرتين. ثم أضف 2 مل من 0.25٪ Trypsin-EDTA ، واحتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 1-2 دقيقة حتى تصبح معظم الخلايا مستديرة وانفصلت عن القارورة ، كما لوحظ تحت مجهر مقلوب ساطع المجال بهدف 4x. أضف 3 مل من وسط زراعة SF hMSC لإنهاء عملية الهضم.
- انقل تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 15 مل ، وأجهزة طرد مركزي عند 179 × جم لمدة 5 دقائق. صب المادة الطافية ، وشطف حبيبات الخلية باستخدام PBS مرتين ، وإعادة التعليق في حوالي 3-5 مل من وسط زراعة SF hMSC للبذر إلى الناقلات الدقيقة في المفاعلات الحيوية.
ملاحظة: تحقق من صلاحية الخلية ، وتأكد من أن الخلايا قابلة للحياة بنسبة >90٪. قم بإعداد الخلايا فقط بعد الانتهاء من جميع أعمال التحضير للمفاعلات الحيوية (الخطوات 2.1-3.6). - بالنسبة للثقافة أحادية الطبقة لخلايا HEK293T وخلايا Vero ، قم بالتلقيح عند 2 × 106-3 × 106 خلايا في كل قارورة T75 ، وثقافة مع DMEM تحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 10٪ مصل عجل حديثي الولادة (NBS) ، على التوالي.
- اتبع الخطوات 1.3-1.4 لحصاد الخلايا. أعد التعليق في 3-5 مل من DMEM تحتوي على 10٪ FBS.
2. تحضير المفاعل الحيوي للخزان المقلوب قبل بذر الخلية
- في اليوم −1 ، اشطف الوعاء الزجاجي جيدا بالماء الجاري منزوع الأيونات (DI) مرة واحدة.
- قم بتفكيك جميع الأنابيب والدفاعات غير القابل للصدأ من صفيحة الرأس ، واغمرها في ماء DI ، وقم بصوتنة بمنظف بالموجات فوق الصوتية عند 40 كيلو هرتز و 60 درجة مئوية لمدة 1 ساعة لتنظيف شامل.
ملاحظة: ستكون الاستعدادات والإجراءات هي نفسها بالنسبة للتوسع من الدرجة الأولى في المفاعل الحيوي سعة 5 لتر والتوسع من المستوى الثاني في المفاعل الحيوي سعة 15 لترا. يتم إعطاء معلمات المفاعل الحيوي 15 L بين قوسين في جميع أنحاء. إذا لم يتم إعطاء أي معلمات بين قوسين ، فإن هذه المعلمات هي نفسها بالنسبة للمفاعلات الحيوية 5 L و 15 L. - تحقق بعناية من أن جميع الحلقات O سليمة وفي مكانها ، ثم قم بتثبيت الأجزاء المفككة مرة أخرى على لوح الرأس وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
ملاحظة: استبدل أي حلقات O مهترئة أو ممزقة قبل التجميع إذا لزم الأمر. سوف تؤثر الحلقات O البالية على إحكام الإغلاق ، وبالتالي عقم الوعاء. - أضف 7 لتر (18 لترا للمفاعل الحيوي سعة 15 لترا) من محلول 0.5 M NaOH في الوعاء سعة 5 لتر ، وضع صفيحة الرأس مع الأنابيب المجمعة على حافة الوعاء لغمر الأنابيب في محلول NaOH. دعها تقف لمدة 12 ساعة أو بين عشية وضحاها لإزالة السموم الداخلية من الأنابيب والأوعية الزجاجية.
ملاحظة: لا تتجاوز 7 لتر (18 لتر) لأن هذا هو الحد الأقصى لحجم الوعاء الزجاجي سعة 5 لتر (15 لترا). ارتد معدات الحماية الشخصية المناسبة عند التعامل مع محلول NaOH ، لأنه يسبب التآكل. - قم بإزالة لوح الرأس وصب محلول هيدروكسيد الصوديوم في زجاجة نفايات مناسبة. تخلص منه وفقا للوائح سلامة المختبر. اشطف الوعاء ولوح الرأس وأجزائه جيدا بماء DI الخالي من السموم الداخلية أو ماء للحقن لإزالة القلوية المتبقية.
- أضف 2 لتر (5 لتر) من PBS إلى الوعاء ، وأعد تجميع جميع الأجزاء ، وقم بتثبيت لوح الرأس بالإطار المعدني للسفينة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
- قم بتركيب عبوة مستهلكة لنظام مغلق على الأجزاء / الأنابيب / المنافذ المناسبة من الفولاذ المقاوم للصدأ (SS) على لوح الرأس وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. قم بتثبيت جميع مشابك روبرت على الأنابيب ، ويوصى بالتعزيز عن طريق التثبيت باستخدام مرقئ. اترك أحد الأنابيب ، مع مرشح تهوية 0.22 ميكرومتر في النهاية متصل بالمكثف ، غير مثبت.
ملاحظة: ضع أنابيب السيليكون على الأطراف الموجودة على مرقئ لمنع ثقب أنابيب السيليكون. ثبت فقط على أنابيب السيليكون ، وتجنب تثبيت أنابيب C-flex المضمنة في هذه المجموعة. سيسمح ترك أنبوب واحد على المكثف غير مثبت بتخفيف الضغط أثناء التعقيم. - قم بإعداد 250 مل من محلول 0.1 M NaOH في زجاجة زجاجية GL 45 قابلة للتعقيم سعة 500 مل ، وتناسب مع غطاء لولبي موصل متعدد المنافذ GL 45 مع منفذين. قم بتوصيل أنبوب سيليكون بطول 180 مم ، 0.13 بوصة × 0.25 بوصة (القطر الداخلي × القطر الخارجي) بأحد المنافذ الموجودة على الجانب السفلي من الغطاء ؛ يجب أن يكون الطول طويلا بما يكفي للمس قاع الزجاجة.
- قم بتوصيل قطعة أخرى من أنبوب السيليكون ، بطول 500 مم أطول من سابقتها ، بنفس المنفذ على الجانب العلوي من الغطاء ، وقم بتوصيل الطرف الآخر بمنفذ تغذية بالتنقيط على لوح رأس الوعاء سعة 5 لتر. قم بتوصيل مرشح فتحة تهوية 0.22 ميكرومتر بالمنفذ الآخر الموجود على الغطاء اللولبي.
- قم بإجراء معايرة من نقطتين على مسبار الأس الهيدروجيني وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. بعد ذلك ، أدخل مجسات الأس الهيدروجيني والأكسجين المذاب (DO) وعدد الخلايا الحية في الوعاء في منافذ PG13,5 المناسبة ، وقم بإحكام على لوح الرأس.
- قم بإجراء فحص محكم للوعاء المجمع بالكامل وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. حافظ على ضغط 0.4 بار ± 0.01 بار لمدة 30 دقيقة على الأقل. حرر الضغط ببطء بعد اجتياز النظام للاختبار. إذا فشل اختبار إحكام الهواء ، فابحث بعناية عن نقاط التسرب ، وقم بتعزيز مجموعة السفينة.
- الأوتوكلاف الوعاء المجمع بالكامل مع المجموعة الاستهلاكية عند 15 رطل لكل بوصة مربعة و 121 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة. بعد التعقيم ، تحقق من جميع مرشحات فتحات التهوية للتأكد من أنها سليمة وجافة. إزالة جميع مرقئ.
ملاحظة: لن يقوم مرشح فتحة الهواء الرطب بتصفية الغاز بكفاءة وقد يضر بعقم الوعاء أثناء زراعة الخلايا. قم بتغيير مرشحات فتحات التهوية إذا كانت مبللة ، وقم بتعقيم الوعاء بأكمله مرة أخرى. - انقل الوعاء المعقم إلى غرفة الأبحاث ، وانتظر حتى يبرد تماما إلى درجة حرارة الغرفة. أدخل مسبار درجة الحرارة في أنبوب thermowell ، وقم بتوصيل الكابلات للمحرك ، ومسبار الأس الهيدروجيني ، ومسبار DO من وحدة التحكم إلى الأجزاء المعنية على الوعاء. لف حصيرة الحرارة حول الوعاء بإحكام.
- قم بفك مشابك Robert على الأنابيب المرنة الموجودة على مكثف غاز العادم ، و sparger الحلقي ، ومنفذ التغذية بالتنقيط ل NaOH ، ومنفذ تراكب الهواء. قم بتشغيل وحدة التحكم ، وقم بتسجيل الدخول ، وأدخل المعلمات المدرجة في الجدول 1 في النظام وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. لا ينبغي تثبيت هذه الأنابيب في أي وقت أثناء عملية الاستزراع.
- انقر فوق ابدأ ، وقم بتسمية التجربة لبدء المفاعل الحيوي. اسمح للمفاعل الحيوي بالعمل على هذه الإعدادات لمدة 12 ساعة على الأقل ، أو طوال الليل ، لتشبع PBS بالأكسجين من أجل إجراء معايرة من نقطة واحدة لمسبار الأكسجين المذاب لاحقا.
- قم بمعايرة سرعة حجم مناولة السوائل للمضخة 1 والمضخة 2 على وحدة تحكم المفاعل الحيوي. قم بتركيب أنبوب سيليكون 0.13 بوصة × 0.25 بوصة على كل مضخة على حدة ، مع غمس أحد طرفيه في زجاجة ماء وإدخال الطرف الآخر من الأنبوب في أسطوانة قياس.
- اضبط سرعة دوران المضخة على 300 دورة في الدقيقة ، والوقت لمدة 1 دقيقة. لاحظ كمية المياه التي يتم صرفها في أسطوانة القياس لكلا المضختين. ستكون هناك حاجة إلى هذه الأرقام للخطوات اللاحقة.
- قم بإعداد 500 مل من وسط زراعة SF hMSC وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، واستبدل غطاء الزجاجة المتوسطة لزراعة الخلايا بحاوية C-Flex EZ Top لإغلاق الحاوية يمكن التخلص منها وغطاء متوافق. قم بإجراء استبدال الغطاء داخل خزانة السلامة البيولوجية (BSC).
- قم بلحام أنبوب المخرج على زجاجة متوسطة إلى أنبوب C-flex مدخل على زجاجة 10 جم من ناقلات W01 الدقيقة المعقمة مسبقا ل MSC. قم بتركيب جزء من الأنبوب على المضخة 1 من وحدة التحكم في المفاعل الحيوي ، واضبط دوران المضخة على 300 دورة في الدقيقة ، وضخ جميع وسائط الاستزراع من الزجاجة إلى زجاجة الناقلات الدقيقة. قم بتخزين هذه الناقلات الدقيقة في درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى الاستخدام في اليوم 0.
ملاحظة: يجب تحضير الناقلات الدقيقة في اليوم −1. بالنسبة لاستزراع المفاعل الحيوي سعة 15 لترا ، قم بإعداد أربع زجاجات (أي 40 جم ، مع 4 × 500 مل من وسط SF) في المجموع.
3. بذر الخلايا ، والاستزراع ، والحصاد في مفاعل حيوي ذو خزان تحريك سعة 5 لتر
- في اليوم 0 ، قم بإجراء معايرة من نقطة واحدة ، وتحديدا 100٪ ، لمسبار الأكسجين المذاب على وحدة التحكم في المفاعل الحيوي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. المفاعل الحيوي ذو الخزان المقلوب جاهز الآن لزراعة الخلايا.
- قم بإعداد زجاجة زجاجية سعة 2 لتر (5 لتر) لجمع النفايات ، وقم بتركيبها مع غطاء لولبي GL 45 متعدد المنافذ مع منفذين ، مع أنابيب C-Flex مقاس 30 مم ، 0.25 بوصة × 0.44 بوصة متصلة بكلا المنفذين ، وأجهزة الأوتوكلاف للتعقيم. قم بلحام أنبوب C-flex من أحد المنافذ من زجاجة النفايات إلى أنبوب الحصاد على الصفيحة الأمامية لوعاء المفاعل الحيوي باستخدام لحام أنبوبي.
- أوقف درجة الحرارة ودرجة الحموضة والتحكم في الأكسجين المذاب على وحدة تحكم المفاعل الحيوي مؤقتا ، وقم بتثبيت أنبوب السيليكون المتصل بأنبوب الحصاد على المضخة التمعجية 2 في اتجاه تدفق السائل الصحيح ، وقم بتوزيع جميع PBS بالكامل من الوعاء في زجاجة النفايات. أخرج الأنبوب من المضخة ، وأغلق زجاجة النفايات وافصلها.
ملاحظة: قم دائما بفك أي مشابك روبرت على الأنابيب المرنة المشاركة في تدفق السائل في كل خطوة. قم بالتثبيت مرة أخرى بعد اكتمال نقل السائل قبل الختم والفصل. مشبك أقرب نحو جانب لوح الرأس. يجب إجراء فك التثبيت والتثبيت لجميع الخطوات اللاحقة ما لم ينص على خلاف ذلك. - قم بإعداد 7 لتر (30 لتر) من وسيط SF hMSC الكامل ، واستبدل كل غطاء زجاجة أصلي بحاوية C-Flex EZ Top للإغلاق يمكن التخلص منها وغطاء متوافق. قم بلحام وحدة ترشيح للاستخدام مرة واحدة بأحد المنافذ الموجودة في حقيبة التخزين ذات الاستخدام الواحد سعة 10 لتر (50 لترا). قم بإجراء عملية استبدال الأغطية داخل BSC.
- قم بتصفية ونقل وسيط الاستزراع إلى كيس التخزين ، زجاجة واحدة في كل مرة ، عن طريق لحام زجاجات وسط زراعة الخلايا إلى الطرف الآخر من مرشح الكبسولة واستخدام المضخة على وحدة تحكم المفاعل الحيوي. تعيين ككيس الأعلاف.
- قم بلحام منفذ مخرج واحد من كيس التغذية إلى أنبوب C-flex على أنبوب التغذية الخاص بالصفيحة الأمامية ، وقم بتثبيت الأنبوب لضخ 1 على وحدة تحكم المفاعل الحيوي. قم بلحام منفذ المخرج الآخر من كيس التغذية إلى أنبوب النزف ، وقم بتثبيت الأنبوب لضخ 2 على وحدة تحكم المفاعل الحيوي في الاتجاه الصحيح لتدفق السائل.
ملاحظة: قم بتثبيت القسم الموجود على خط تدفق السوائل ، المصنوع من أنابيب السيليكون ، على المضخة للحصول على مقاومة أفضل للتآكل والتمزق مقارنة بأنابيب C-Flex. تأكد من تثبيت الأنابيب في الاتجاه الصحيح. - اضبط سرعة المضخة 1 على 300 دورة في الدقيقة ، وأوقف المضخة بعد توزيع 1 لتر (5 لتر) من الوسط من كيس التغذية في الوعاء ، بناء على سرعة توزيع الحجم المذكورة في الخطوة 2.17. ابدأ تشغيل التحكم في درجة الحرارة والأس الهيدروجيني والأكسجين المذاب مرة أخرى، بنفس الإعدادات الموضحة في الخطوة 2.14.
- أغلق وافصل الأنبوب الذي يربط كيس التغذية بأنبوب التغذية الموجود على لوح الرأس. قم بلحام أنبوب C-Flex من زجاجة الناقلات الدقيقة المشتتة المحضرة في الخطوة 2.18 إلى أنبوب التغذية ، وضخ كل المحتوى من الزجاجة إلى الوعاء. أغلق وافصل الزجاجة الفارغة لتعليق الناقل الصغير. قم بتطهير سطح الزجاجة بالكامل باستخدام 75٪ من الإيثانول ، وضعها في BSC لاستخدامها كزجاجة نقل تعليق الخلية.
ملاحظة: اترك قطعة أطول من أنبوب C-Flex على جانب لوح الرأس عند إغلاق وفصل الملحقات التي تستخدم لمرة واحدة ، حيث سيتم تنفيذ خطوات لحام وفصل متعددة على نفس الأنبوب في الخطوات التالية. - تأكد من أن درجة الحرارة الموضحة على وحدة التحكم تصل إلى حالة ثابتة تبلغ 37 درجة مئوية ، والتي تستغرق عادة حوالي 30 دقيقة ، قبل الشروع في تحضير خلايا البذور كما في الخطوات 1.3-1.4. أعد تعليق 2.5 × 108 hMSCs في 500 مل من وسط SF ، وانقله إلى الزجاجة الفارغة التي كانت تحتوي سابقا على تعليق الناقل الصغير.
ملاحظة: يجب تحضير خلايا البذور لتوسيع المفاعل الحيوي 15 لترا وفقا للخطوة 3.21 ، بهدف تلقيح 1.0 × 109 خلايا في 500 مل. - قم بلحام أنبوب C-Flex من الزجاجة التي تحتوي الآن على تعليق الخلية إلى منفذ التغذية على لوح الرأس ، وضخ جميع المحتويات من الزجاجة إلى الوعاء لبدء التلقيح الخلوي إلى الناقلات الدقيقة. أغلق الزجاجة الفارغة وافصلها. أعد لحام منفذ التغذية من كيس التغذية إلى أنبوب التغذية الموجود على لوح الرأس.
- اضبط إعدادات التقليب على وحدة التحكم للسماح بالتحريك المتقطع لتحسين كفاءة التلقيح ل hMSCs عن طريق تعيين المعلمات التالية: V1 = 35 (30) دورة في الدقيقة / 5 دقائق ؛ V2 = 0 دورة في الدقيقة / 25 دقيقة ؛ عدد الدورات = 12 (24) ؛ سرعة التحريض النهائية = 35 (30) دورة في الدقيقة.
ملاحظة: يمكن تعديل سرعة التقليب إلى 40 (35) دورة في الدقيقة أو 45 (40) دورة في الدقيقة إذا لوحظ توزيع أو ترسيب غير منتظم للناقلات الدقيقة أثناء عملية الاستزراع. - قم بإعداد نظام آلي للملحق والتبادل الوسيط على وحدة التحكم في المفاعل الحيوي في واجهة التبادل المتوسط. قم بتعيين معلمات زراعة hMSC كما هو مذكور في الجدول 2.
ملاحظة: قم بفك أي مشابك روبرت على الأنابيب المرنة المشاركة في تدفق السائل في هذه المرحلة ، خاصة بالنسبة لأنبوب التغذية والنزيف. حافظ على هذه غير مثبتة خلال عملية الثقافة بأكملها. - خذ العينات من خلال أنبوب أخذ العينات عن طريق توصيل أكياس أخذ العينات التي تستخدم لمرة واحدة عبر موصلات Luer في النقاط الزمنية المطلوبة ، عادة مرة واحدة كل يوم ، واقتباس 10 مل في كل مرة في كيس أخذ العينات. قسمة 2-3 مل من العينة في كيس أخذ العينات الأول ، وتجاهل ، ثم قسمة 10 مل الفعلية من العينة في كيس أخذ عينات جديد في كل مرة.
ملاحظة: يمكن أن تكون العينة الأولية 2-3 مل سائلة متبقية في الأنبوب من النقطة الزمنية السابقة لأخذ العينات وقد لا تمثل بدقة الحالة في الوعاء. قم دائما بتنفيذ هذه الخطوات بإجراءات معقمة إضافية عن طريق تعقيم موصلات Luer قبل وبعد إجراء أو قطع التوصيلات بنسبة 75٪ من الإيثانول. - نقل العينات المأخوذة إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 15 مل. قم بإجراء الاختبارات التالية على العينات.
- خذ 200 ميكرولتر من تعليق الناقل الدقيق المحمل بالخلايا ، وقم بتلطيخه باستخدام تلطيخ مزدوج لخلية Calcein-AM / PI وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. مراقبة تحت المجهر مضان.
- ترسب الناقلات الدقيقة عن طريق الجاذبية ، والتي تستغرق عادة 5-10 دقائق. نضح المادة الطافية ، واختبر تركيز الجلوكوز باستخدام مقياس الجلوكوز وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. ارسم تمثيلا بيانيا لمستوى الجلوكوز.
- احتضان الناقلات الدقيقة المحملة بالخلايا المترسبة بمحلول هضم طازج 3-5 مل من 1 مجم / مل عند 37 درجة مئوية لمدة 20-30 دقيقة لإذابة الناقلات الدقيقة بالكامل. عد الخلايا بعد تلطيخها باستخدام AO / PI باستخدام محلل خلية مضان آلي. ارسم منحنى نمو الخلية. ارتبط بمنحنى نمو الخلايا الحية في الوقت الفعلي الذي تم إنشاؤه على وحدة التحكم.
- في اليوم 4 أو اليوم 5 من الثقافة، قم بإعداد 50 مل (200 مل) من محلول الهضم عند 30 ملغ/مل. تتراوح نسبة كتلة العمل بين محلول الهضم والناقلات الدقيقة القابلة للذوبان من 3:20 إلى 5:20. مرشح معقم مع مرشح كبسولة 0.22 ميكرومتر ، ويخفف أكثر في 500 مل (2 لتر) من محلول الملح المتوازن هانك (HBSS) مع الكالسيوم والمغنيسيوم. انقله إلى كيس تخزين سعة 3 لتر.
ملاحظة: قم بإعداد محلول الهضم فقط قبل حصاد الخلايا مباشرة. حاول أن تستهدف ما لا يقل عن 1.0 × 10 9-1.2 × 109 خلايا لتوسيع الطبقة الأولى و 1.0 × 1010 خلايا لتوسيع الطبقة الثانية. إذا كانت الخلايا تنمو بشكل أسرع ، فقم بالحصاد في اليوم 4 ؛ إذا لم يكن كذلك ، الحصاد في اليوم 5. لا ينصح بتجاوز اليوم 5. - اضبط سرعة التحريض على 0 على وحدة التحكم حتى تستقر الناقلات الدقيقة ، وهو ما يحدث عادة في غضون 20 دقيقة. قم بإيقاف تشغيل بروتوكول التبادل الوسيط الآلي ، وأوقف درجة الحرارة ودرجة الحموضة والتحكم في الأكسجين المذاب على وحدة تحكم المفاعل الحيوي. ابدأ المضخة يدويا 2 عند 300 دورة في الدقيقة على وحدة التحكم ، وقم بتوزيع المادة الطافية في نظام التغذية لترك حوالي 1 لتر (2 لتر) من تعليق الاستزراع في الوعاء (باستخدام سرعة توزيع الحجم المذكورة في الخطوة 2.17 أو القياس من علامات التخرج على جسم الوعاء). أغلق كيس التغذية وافصله تماما.
- قم بلحام كيس محلول الهضم الطازج من الخطوة 3.15 إلى أنبوب التغذية ، وضخ جميع المحتويات في الوعاء. ابدأ سرعة التحريض عند 45 (40) دورة في الدقيقة. تأكد من أن التحكم في درجة الحرارة لا يزال يحافظ على درجة الحرارة عند 37 درجة مئوية. سوف تذوب الناقلات الدقيقة في غضون 40-60 دقيقة. خذ 1 مل من العينة باستخدام حقنة قفل Luer معقمة لمدة 30 دقيقة وبعد ذلك كل 5-10 دقائق للمراقبة تحت مجهر المجال الساطع للتحقق من انحلال الناقلات الدقيقة.
- بعد إذابة الناقلات الدقيقة ، قم بلحام كيس تخزين واحد سعة 3 لتر (كيسان تخزين سعة 3 لتر للمفاعل الحيوي سعة 15 لترا) بأنبوب الحصاد ، وضخ تعليق الخلية بالكامل باستخدام المضخة 2 عند 300 دورة في الدقيقة. تحضير 1 لتر (3.5 لتر) من محلول ملحي يحتوي على 1٪ ألبومين مصل بشري (HSA) كمخزن مؤقت للغسيل و 500 مل من وسط SF الكامل (500 مل من محلول الحفظ بالتبريد للخلايا ، وتركيبة من 10٪ ثنائي ميثيل كبريتات (DMSO) و 90٪ وسط SF كمثال) في أكياس تخزين منفصلة يمكن التخلص منها باستخدام الطرق والملحقات المذكورة في الخطوات السابقة لعمليات نقل السوائل الأخرى.
- قم بتشغيل نظام معالجة الخلايا ، وقم بتثبيت مجموعة معالجة الخلايا التي يمكن التخلص منها على الجهاز وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، وقم بلحام أكياس تعليق الخلية ، ومخزن الغسيل المؤقت ، ووسيط SF (المخزن المؤقت للحفظ بالتبريد) بمجموعة معالجة الخلايا التي تستخدم لمرة واحدة ، واتبع بعناية جميع التعليمات المعروضة على واجهة المستخدم لتهيئة والتحقق من سلامة المجموعة والتثبيت المناسب.
- بمجرد اكتمال التثبيت ، أدخل المعلمات المدرجة في الجدول 3 لغسل الخلايا باستخدام المخزن المؤقت للغسيل وإعادة التعليق في وسط SF (المخزن المؤقت للحفظ بالتبريد) إلى البرنامج لبدء عملية الغسيل وإعادة التعليق. سيتم تنفيذ الإجراء بأكمله تلقائيا باستخدام العديد من نقاط الفحص اليدوي.
- خذ عينة من الخلايا من غرفة الطرد المركزي ، كما هو موضح في نظام معالجة الخلايا ، واحسب كثافة الخلية باستخدام محلل خلوي آلي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. اضبط حجم إعادة التعليق لكثافة 2 × 106 خلايا / مل أو حجم إجمالي أقصى يبلغ 250 مل.
- قم بإغلاق وفصل كيس نقل الخلايا من مجموعة معالجة الخلايا التي تستخدم لمرة واحدة بعد أن يقوم النظام باستنشاق الخلايا من الحجرة. أعد ضبط كثافة الخلية إلى 2 × 106 خلايا / مل مع وسيط SF كامل في كيس نقل خلايا أكبر / كيس تخزين متوسط إذا لزم الأمر. ستكون هذه هي خلايا البذور للتوسع من الدرجة الثانية في المفاعل الحيوي 15 لتر.
4. صياغة الخلية وتعبئتها وإنهائها
- ابدأ في تحضير المفاعل الحيوي سعة 15 لترا قبل يوم واحد من حصاد الخلايا من المفاعل الحيوي سعة 5 لتر. اتبع الخطوات الواردة في قسم البروتوكول 2 و 3 تماما باستثناء معلمات 15 لترا المشار إليها بين قوسين.
- أعد تعليق الخلايا في 250 مل من المخزن المؤقت للحفظ بالتبريد ، وقم بإغلاق وفصل كيس نقل الخلايا من مجموعة معالجة الخلايا التي تستخدم لمرة واحدة بعد أن يقوم النظام باستنشاق الخلايا من الغرفة.
- انقل 2000 مل من المخزن المؤقت للحفظ بالتبريد مع 250 مل من الخلايا المعاد تعليقها من الخطوة 4.2 إلى كيس نقل الخلايا سعة 3 لتر. قم بلحام حقيبة النقل هذه بمجموعة مستهلكة يمكن التخلص منها.
ملاحظة: يجب تحديد الحجم الإضافي للمخزن المؤقت للحفظ بالتبريد المستخدم هنا من خلال مواصفات التركيبة وحساب إجمالي عدد الخلايا وفقا لنتائج العد المكتسبة في الخطوة 3.21 - قم بتجميع مجموعة التعبئة والتشطيب الاستهلاكية التي تستخدم لمرة واحدة في نظام تعبئة الخلايا ، وقم بتشغيل نظام التبريد المسبق وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. اتبع التعليمات الموجودة على النظام ، واضبط لملء 20 مل / كيس بإجمالي 20 كيسا لكل دفعة. أغلق هذه الأكياس وافصلها عن المجموعة ، واتبع إجراءات الحفظ بالتبريد القياسية. استخدم أكياس التخزين بالتبريد.
- قم بلحام مجموعة جديدة من 20 كيسا للحفظ بالتبريد في مجموعة الملء والتشطيب الاستهلاكية التي تستخدم لمرة واحدة ، وكرر إجراء التعبئة والإنهاء حتى يتم اقتباس جميع الخلايا. اتبع الإجراءات القياسية لحفظ هذه الخلايا بالتبريد.
5. توصيف جودة الخلية
- أخذ عينات من hMSCs المحصودة من الناقلات الدقيقة القابلة للذوبان ، واستخدام نظام معالجة الخلايا للتوصيف عن طريق قياس التدفق الخلوي لتحديد هوية الخلية باتباع الطرق الموضحة في الأدبيات18.
- قم بإذابة الخلايا المحفوظة بالتبريد ، وأعد الطلاء على قوارير 2D التقليدية أو الألواح الدقيقة لمزيد من توصيف ميزات الخلية ، بما في ذلك مورفولوجيا الخلية وقدرة التمايز ثلاثية النسب ، باتباع الطرق الموضحة في الأدبيات18.
6. التوسع HEK293T على الناقلات الدقيقة G02 في المفاعل الحيوي ذو الخزان المقلوب
- قم بإعداد مفاعل حيوي سعة 5 لتر كما هو مذكور في الخطوة 2. بالنسبة للخلايا HEK293T ، قم بزراعة الخلايا باستخدام ناقلات دقيقة G02 معقمة بدلا من W01. تشبه عملية الاستزراع القسم 3 من البروتوكول ، على الرغم من اختلاف بعض المعلمات ، كما سيتم تفصيلها في الخطوات التالية. قم بتركيب أنبوب تروية خاص في المفاعل الحيوي بدلا من أنبوب النزف ، حيث أن التروية ضرورية لثقافة الخلايا HEK293T.
- يختلف عن البروتوكول المفصل في قسم البروتوكول 3 ، قم بإعداد 20 جم من الناقلات الدقيقة G02 (أي زجاجتين) في DMEM مع 10٪ FBS للمفاعل الحيوي 5 لتر ، مع ضبط حجم الاستزراع اليومي 0 على 3.5 لتر (أي تركيز نهائي يبلغ حوالي 5.71 جم / لتر). قم بتوزيع 2 لتر من الوسط في الوعاء قبل زجاجتي الناقلات الدقيقة G02 ، وقم بتلقيح 500 مل من خلايا HEK293T 1.75 × 109 (أي بكثافة نهائية تبلغ 5 × 105 خلايا / مل).
- تنفيذ نظام التحريض ونظام التبادل المتوسط (بناء على كمية الوسط المطلوب تبادلها يوميا ، معبرا عنها بحجم الثقافة في اليوم ، CVD) ، والتي تختلف عن قسم البروتوكول 3 ويتم تفصيلها في الجدول 4.
ملاحظة: قم بتنشيط المضخة 1 والمضخة 2 يدويا حتى يتمكن كلاهما من الضخ باستمرار حتى يحدث التروية. اضبط سرعة المضخة كل يوم لتلبية معدل التروية بناء على معايرة سرعة توزيع حجم المضخات. عادة ، سيكون هذا في نطاق رقم واحد. بالنسبة للخلايا HEK293T ، استخدم وسيطا جديدا كعلف ، وتخلص من الوسط المستهلك تماما في زجاجة نفايات ، على عكس hMSCs ، التي يتم تدوير الوسيط لها. - بالنسبة للتوسع من الطبقة الثانية إلى المفاعل الحيوي سعة 15 لترا ، استخدم نقل الخلايا HEK293T من حبة إلى حبة بدلا من الذوبان الكامل للناقلات الدقيقة كما هو مستخدم مع hMSCs. على وجه التحديد ، أوقف التحريض على ترسب الناقلات الدقيقة بعد الوصول إلى كثافة الخلية المطلوبة ، ثم استنشاق أكبر قدر ممكن من المواد الطافية من أنبوب التروية ، وقم بتغذية PBS ب 3 أضعاف حجم التعليق المتبقي لغسل الناقلات الدقيقة ، وكرر ثلاث مرات. نضح وتجاهل أكبر قدر ممكن من PBS في الغسيل النهائي.
- قم بتغذية 3.5 لتر من 1x من التربسين المؤتلف لفصل الخلايا عن الناقلات الدقيقة بينما تظل الناقلات الدقيقة G02 سليمة. اضبط درجة الحرارة على 37 درجة مئوية وسرعة التقليب على 60 دورة في الدقيقة. قم بإنهاء الانفصال في غضون 45 دقيقة ، عندما يتم فصل أكثر من 80٪ من الخلايا ، مع وجود كمية متساوية من الوسط الكامل.
- نقل مباشرة من ميناء الحصاد إلى سفينة 15 لتر المعدة للتوسع من الدرجة الثانية.
7. توسيع خلايا Vero على ناقلات V01 الدقيقة في المفاعل الحيوي للخزان المقلوب
- تحضير الناقلات الدقيقة V01 عن طريق نقل الناقلات الدقيقة المجففة بالتجميد إلى وعاء المفاعل الحيوي مع PBS إلى تركيز 20 مجم / مل. قم بتجميع وتعقيم الوعاء كما هو مذكور في قسم البروتوكول 2 ، ولكن الأوتوكلاف لمدة 30 دقيقة بدلا من ذلك.
- بعد التعقيم ، تستقر الناقلات الدقيقة V01 بشكل طبيعي. تبادل المادة الطافية مع DMEM الأساسي مرتين باستخدام أنابيب النزف والتغذية ، وإضافة DMEM الكامل الذي يحتوي على 10 ٪ NBS إلى 50 ٪ -75 ٪ من حجم الوعاء قبل الانتقال إلى قسم البروتوكول 3 لتلقيح الخلايا والثقافة.
- يختلف عن البروتوكول المفصل في قسم البروتوكول 3 ، استخدم 24 جم من الناقلات الدقيقة V01 لثقافة 4 لتر من خلايا Vero (أي تركيز نهائي قدره 6 جم / لتر) ، وتلقيح 500 مل من 4 × 109 خلايا Vero (أي بكثافة نهائية تبلغ 1 × 106 خلايا / مل).
- اتبع الخطوات 6.3-6.6 لمعلمات عملية الاستزراع والانتقال إلى التوسع من الدرجة الثانية في المفاعل الحيوي ذو الخزان المتحرك سعة 15 لترا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
منصة ACISCP عبارة عن نظام مغلق بالكامل يستخدم سلسلة من المفاعلات الحيوية ذات الخزانات المقلوبة لتوسيع النطاق ، ونظام معالجة الخلايا لحصاد الخلايا وتركيبها آليا ، ونظام ملء الخلايا (الشكل 1). تلتصق الخلايا الملتصقة بالناقلات الدقيقة المسامية ، والتي يمكن تشتيتها في المفاعل الحيوي ، وبالتالي تحقيق الزراعة المعلقة للخلايا الملتصقة.
باتباع البروتوكول كما هو موضح ، تم أولا تلقيح 2.5 × 108 hMSCs مع 10 g من الناقلات الدقيقة W01 في مفاعل حيوي ذو خزان متحرك سعة 5 لتر للتوسع الأولي. تم تركيز حوالي 2.9 × 109 خلايا وغسلها بواسطة نظام معالجة الخلايا في اليوم الرابع ، منها 1.0 × 109 خلايا تم حصادها إلى المفاعل الحيوي ذو الخزان المقلوب سعة 15 لترا مع 40 جم من الناقلات الدقيقة W01 للمرحلة الثانية من الزراعة. في النهاية ، تم حصاد 1.1 × 10 10 MSCs وصياغتها وتحويلها إلى أكثر من70 كيس صياغة في اليوم 9 (الشكل 2 أ). تمت مراقبة عدد الخلايا وصلاحيتها واستهلاك الجلوكوز يوميا (الشكل 2B ، C). وتحقق توسع تراكمي قدره 128 ضعفا؛ وفي الوقت نفسه ، تم الحفاظ على صلاحية الخلية أعلى من 90٪. أظهر تناول الجلوكوز علاقة سلبية مع توسع الخلايا ، مما يدل على التمثيل الغذائي المرتبط بنمو الخلايا السليمة.
يمكن تعقيم الناقلات الدقيقة المسامية القابلة للذوبان مسبقا وتأتي في عبوة نظام مغلق للاستخدام مرة واحدة ، ومناسبة ل GMP (الشكل 3 أ). يمكن أن تلتصق الخلايا بسطح الناقلات الدقيقة والجدار الداخلي للمسام الكبيرة (الشكل 3 ب). باستخدام صبغة الفلورسنت ، مثل Calcein-AM / PI Cell Double Staining Kit ، يمكن تصور الخلايا داخل الكرات المجهرية المسامية (الشكل 3C). ساعد دمج صور المجال الساطع مع صور الفلورسنت في تحليل توحيد توزيع الخلايا. أظهر تلطيخ الخلايا الحية أيضا ارتباطا قويا بعدد الخلايا الذي تم قياسه إما عن طريق أخذ العينات اليدوية أو مسبار عد الخلايا الحية عبر الإنترنت.
بالإضافة إلى الطلب الهائل على كميات الخلايا العالية ، لا غنى عن تقييمات سمات الجودة الحرجة (CQA) واختبارات إطلاق MSCs ، لأنه بدونها ، لا يمكن تعقيم الخلايا أو تنقيتها على نطاق واسع بعد الاستزراع. لضمان جودة الخلية ، يمكن أخذ عينات من MSCs الموسعة 3D في كل مرحلة من مراحل منصة ACISCP. احتفظت MSCs التي تم حصادها حديثا من منصة ACISCP بعلامات النمط الظاهري الكلاسيكية22 ، مع تعبير >95٪ و <2٪ للعلامات الإيجابية (CD73 ، CD90 ، CD105) والعلامات السلبية (HLA-DR ، CD34 ، CD45 ، CD19 ، CD14) ، على التوالي (الشكل 4A). تم إذابة الخلايا المحفوظة بالتبريد وتلقيحها في دورق مستو 2D وأظهرت قدرة جيدة على الالتصاق ، وسلوك تمدد طبيعي (الشكل 4B) ، وشكل مغزل نموذجي مع نمو حلزوني (الشكل 4C). علاوة على ذلك ، حافظت الخلايا أيضا على قدرتها على التمايز إلى سلالات عظمية المنشأ ، ودهنية المنشأ ، وكوندروجينيك (الشكل 4 د).
علاوة على ذلك ، تم اختبار خلايا HEK293T وخلايا Vero في منصة ACISCP أيضا. بالنسبة لزراعة الخلايا HEK293T ، كان تركيز خلية اللقاح 5 × 10 5 خلايا / مل في المفاعل الحيوي5 لتر. بعد عملية نقل الخرزة إلى الخرز ، وصل تركيز الخلية الذروة إلى 1.68 × 107 خلايا / مل في المفاعل الحيوي 15 لترا (الشكل 5 أ) ، وحافظت الخلايا HEK293T على قابلية عالية للحياة (الشكل 5 ب). بالنسبة لمزرعة خلايا Vero ، كان تركيز خلية اللقاح 2 × 10 5 خلايا / مل في المفاعل الحيوي5 L. بعد عملية نقل الخرزة إلى الخرز ، كان تركيز الخلية الذروة الذي تم تحقيقه 1.08 × 107 خلايا / مل في المفاعل الحيوي 15 لترا (الشكل 6 أ) ، وحافظت خلايا فيرو على قابلية عالية للبقاء أيضا (الشكل 6 ب).
الشكل 1: خارطة طريق تخطيطية لإنتاج hMSC عبر منصة ACISCP. تم تعديل هذا الرقم من الأدبيات المنشورة18. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تمدد الخلايا من hMSCs عبر منصة ACISCP. (أ) تتكون منصة ACISCP من سلسلة من المفاعلات الحيوية ذات الخزانات المقلوبة ، ونظام معالجة الخلايا ، ونظام ملء الخلايا. (ب) منحنى نمو hMSCs في عملية التمدد ذات المستويين ، (C) ومعدل استهلاك الجلوكوز أثناء العملية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: توصيف نمو hMSC على الناقل الصغير W01. تم تعديل هذا الرقم من الأدبيات المنشورة18. (أ) يتم تحضير الناقلات الدقيقة W01 بعبوات ذات نظام مغلق للاستخدام مرة واحدة. (ب) صور المجهر الإلكتروني الماسح للناقلات الدقيقة الفارغة والناقلات الدقيقة المستزرعة باستخدام hMSCs الملتصقة. تشير الرؤوس المثلثة البيضاء إلى خلايا على سطح الناقلات الدقيقة. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. (ج) دمج صور المجال الساطع والتألق (تلطيخ الخلايا الحية) ل hMSCs المستزرعة على ناقلات دقيقة من اليوم 1 إلى اليوم 4 ؛ شريط المقياس = 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4: تقييم هوية الخلية ل hMSCs التي تم حصادها من منصة ACISCP . (أ) تميزت العلامات السطحية ل hMSCs بقياس التدفق الخلوي. جميع العلامات الإيجابية (>95٪) والعلامات السلبية (<2٪) استوفت المعايير. (ب) أظهرت hMSCs الموسعة 3D المحفوظة بالتبريد سلوك تمدد طبيعي بعد الذوبان وإعادة الطلاء إلى قوارير 2D. (ج) مورفولوجيا hMSCs الموسعة 3D ؛ شريط المقياس = 50 ميكرومتر. (د) تمايز ثلاثي النسب ل hMSCs الموسعة 3D. تم تقييم القدرات العظمية ، الدهنية ، والغضروفية من خلال تلطيخ Alizarin Red و Oil Red و Alcian Blue ، على التوالي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: تمدد الخلايا HEK293T عبر منصة ACISCP. (أ) كثافة الخلايا HEK293T في المفاعلين الحيويين 5 لتر و15 لتر. (B) صورة المجال الساطع (BF) ، وخلايا HEK293T الملطخة بالكالسيين (حي) ، وخلايا الملطخة ب PI (الميتة) المزروعة على ناقلات G02 الدقيقة ؛ شريط المقياس = 1 مم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 6: تمدد خلايا Vero عبر منصة ACISCP . (أ) كثافة خلايا فيرو في المفاعلين الحيويين 5 لتر و15 لتر. (ب) صورة المجال الساطع (BF) ، وخلايا Vero الملطخة بالكالسيين (الحي) ، وخلايا Vero الملطخة ب PI (الميتة) المزروعة على ناقلات صغيرة V01 ؛ شريط المقياس = 400 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الجدول 1: إعدادات المعلمات للمفاعل الحيوي ذو الخزان المقلوب. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
الجدول 2: إعدادات المعلمات للتبادل الوسيط الآلي لزراعة hMSC. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
الجدول 3: إعدادات المعلمات لنظام معالجة الخلايا لمرور hMSC وصياغته. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
الجدول 4: نظام التبادل المتوسط ونظام التحريض لخلايا HEK293T وفيرو. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يستخدم كل من العلاج المناعي والعلاج بالخلايا الجذعية الخلايا الحية كأدوية. ومع ذلك ، لا ينبغي تنقية منتجاتها النهائية أو تعقيمها بنفس طريقة الجزيئات الصغيرة أو الفيروسات. لذلك ، يجب دائما مراعاة مبدأ الجودة حسب التصميم (QbD) وتطبيقه عمليا على عملية التصنيع والتحكم الكيميائي (CMC) أثناء إنتاج الخلايا23. يتم اعتبار نظام زراعة الخلايا المغلقة بالكامل ، بالإضافة إلى نظام المعالجة ونظام التعبئة ، بشكل تفضيلي لتلبية المتطلبات. في هذه الدراسة ، قدمنا بروتوكولا لاستخدام منصة ACISCP تعتمد على ناقلات 3D 3D من الدرجة GMP والقابلة للذوبان والمسامية لإجراء توسع من مستويين ل hMSCs. استكشف بعض الباحثين جدوى استخدام المفاعلات الحيوية مع الناقلات الدقيقة لتوسيع hMSCs في المختبر ، لكن غالبية الدراسات المبلغ عنها أظهرت أن الزيادة في الحجم ستؤدي إلى انخفاض في إنتاجية hMSC ، من 6.1 × 10 5 خلايا / مل أو حتى 12.5 × 10 5 خلايا / مل في 100 مل من حجم العمل إلى 2.7 × 10 5 خلايا / مل في 2 لتر من حجم العمل 24 ، 25,26. على الرغم من أن المفاعلات الحيوية ذات الخزان المقلوب تظهر أعلى قابلية للتوسع ، إلا أن القضايا الرئيسية مثل الخصائص الهيكلية للوعاء ، ونوع المكره ، وسرعة الطرف ، ومعامل نقل الكتلة الحجمي ، و kLa ، للأكسجين ، ورقم الطاقة ، يجب أن تؤخذ في الاعتبار بدقة24. وبخلاف المفاعلات الحيوية السابقة ذات الخزانات المقلدة، والتي كانت مصممة عادة لزراعة الميكروبات أو الخلايا المستأنسة المستقلة عن المرساة مثل خلايا CHO، تم تصميم المفاعل الحيوي المستخدم في هذه الدراسة خصيصا للاستزراع القائم على الناقلات الدقيقة، وبالتالي، فهو قادر على تلبية احتياجات العملية المختلفة لاستراتيجيات تبادل المغذيات. بالإضافة إلى الاختلافات في عملية زراعة الخلايا ، تستخدم منصة ACISCP نظام معالجة الخلايا القائم على الطرد المركزي بالتدفق المستمر جنبا إلى جنب مع نظام ملء الخلايا ، على عكس إجراءات الحصاد التقليدية لإنتاج كميات كبيرة من الخلايا التي يتم إجراؤها عن طريق العمل اليدوي المتكرر ، وبالتالي ضمان فعالية معالجة عالية. تتمتع الأجهزة الآلية المتقدمة بإنتاجية عالية في الإنتاج دفعة واحدة.
معظم الخلايا الجذعية تعتمد على المرساة. وبالتالي ، فإنهم يطالبون بناقلات صغيرة لتصنيع الخلايا. تقليديا ، تمت صياغة الناقلات الدقيقة التجارية السابقة للاستفادة من خصائص السطح المختلفة ، وبالتالي تحقيق أرقام مختلفة من أضعاف تمدد الخلايا. في بحث سابق ، أنتج استخدام الناقلات الدقيقة Cytodex من النوع 1 لنخاع عظم الخنزير MSCs كثافة خلية تبلغ حوالي 4 × 10 5 خلايا / مل ، في حين أن استخدام Cytodex من النوع 3 المطلي بالجيلاتين أنتج أرقام خلايا قابلة للمقارنة (3.8 × 105 خلايا / مل) إلى MSCs المشيمة البشرية27. ومع ذلك ، فإن النوع 1 والنوع 3 من Cytodex غير قابلين للذوبان ، وبالتالي ، فإن عملية التربسين أثناء حصاد الخلايا لا تؤثر فقط على عائد استعادة الخلايا ولكن أيضا على الجدوى والجودة. وبالتالي ، لا توجد حالات ناجحة لاستخدام الناقلات الدقيقة التقليدية لمنتجات CGT ، حيث لا يمكن للخلايا كمنتجات نهائية الخضوع لعمليات تنقية واسعة النطاق للقضاء على تلوث الناقلات الدقيقة غير القابلة للذوبان28. على النقيض من ذلك ، فإن الناقلات الدقيقة W01 قابلة للذوبان بالكامل ، مما يعني أنه يمكن حصاد منتجات الخلايا بسهولة عن طريق تحلل الناقل الدقيق. يأتي منتج الناقل الدقيق هذا أيضا في عبوة نظام مغلقة تماما ، مما يعني أنه يمكن تحقيق عملية تشغيل متوافقة مع GMP بسهولة. لقد أظهرنا أن المرور بعملية توسيع من مستويين يمكن تحقيقه بسهولة باستخدام ناقلات W01 الدقيقة ، ويمكن حصاد ما يصل إلى 1.1 × 1010 خلايا إجمالية في دفعة واحدة ؛ في الواقع ، لا يمكن تحقيق ذلك إلا في 50 L المفاعلات الحيوية في التقارير السابقة29,30. في هذا العمل ، وصلت كثافة الخلايا القصوى داخل المفاعل الحيوي للخزان المقلوب إلى حوالي 11.6 × 105 خلايا / مل قبل الحصاد. وبالتالي ، يمكن توقع أنه يمكن للمرء بسهولة تحقيق 1 × 1011 خلية لكل دفعة باستخدام مفاعل حيوي 100-200 لتر في منصة ACISCP ، مما يعني أن ألف دفعة سنويا يمكن أن تلبي بسهولة الطلب على 300 تريليون hMSCs كل عام.
نظرا لأن الخلايا لها خصائص متنوعة ، يتم إنتاج أنواع مختلفة من الناقلات الدقيقة 3D وهي متاحة لاختبار التوافق بين خلية معينة وناقل دقيق. بالنسبة للمنتجات النهائية غير الخلوية في CGT ، تم الإبلاغ عن عمليات توسيع النطاق القائمة على الناقلات الدقيقة للخلايا HEK293T وخلايا Vero في المفاعلات الحيوية لتصل إلى 1.5 × 106 خلايا / مل و 3.3 × 106 خلايا / مل ، على التوالي31. استخدمنا ناقلات دقيقة مسامية قابلة للذوبان ، G02 و V01 ، في منصة ACISCP لتوسيع خلايا HEK293T وخلايا Vero ، على التوالي ، ووصلت كثافة الخلايا القصوى لكلتا الخليتين إلى أعلى من 1 × 107 خلايا / مل. علاوة على ذلك ، يمكن أن تكون قابلية تحلل الناقلات الدقيقة 3D مفيدة لإنتاج المنتجات البيولوجية للفيروسات داخل الخلايا ، حيث يمكن فصل الخلايا بسهولة عن الناقلات الدقيقة. بشكل حاسم ، تمثل منصة ACISCP عملية تصنيع حيوي جديدة راسخة تلبي متطلبات الكمية والنوعية لمنتجات العلاج بالخلايا والجينات. نتوقع أن تعمل منصة إنتاج الخلايا على نطاق واسع كأداة أساسية لتمكين تطوير العلاجات الخلوية والجينية.
على الرغم من مزايا المنصة التي نوقشت أعلاه ، لا تزال هناك العديد من القيود التي يجب التحايل عليها في المستقبل. أولا ، لا تزال المفاعلات الحيوية المستخدمة في منصة ACISCP في الشكل الحالي مجهزة بخزانات زجاجية ، والتي تتطلب إجراءات غسيل معقدة والتحقق من التنظيف لتلبية معايير GMP. ويمكن استخدام نظام مفاعل حيوي صهريج متقلب يستخدم مرة واحدة في المستقبل لإنتاج مجموعة سليمة من المجموعات الاستهلاكية ذات الاستخدام الواحد. ثانيا ، تختلف عن خطوط الخلايا المستأنسة ، فإن hMSCs هي سلالات خلايا أولية معزولة من متبرعين فرديين وأنسجة متنوعة ، مما يعني أن hMSCs تظهر عدم تجانس. لذلك ، فإن البروتوكول الموصوف في هذه الورقة بمثابة مرجع ، في حين أن تطوير العملية المنهجية مطلوب لتحقيق الترحيل التقني لمنصة ACISCP. ثالثا ، على الرغم من أن زملائنا في العمل قد اختبروا مبدئيا جدوى إنتاج فيروس اللقاح باستخدام خلايا Vero32 ، إلا أنه لا يزال يتعين التحقق من صحة ما إذا كان الأداء الجيد للإنتاج الفيروسي في التوسع ثلاثي الأبعاد للخلايا HEK293T. في الختام ، توفر طريقة إنتاج الخلايا على نطاق واسع لمنصة ACISCP ، القائمة على ناقلات دقيقة مسامية قابلة للذوبان وسلسلة من الأنظمة المغلقة الآلية ، فرصة لتعزيز كفاءة الإنتاج وتحسين مراقبة الجودة على نطاق صناعي لتصنيع منتجات CGT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Y.D. هو مستشار علمي ، و H.X. ، Y.Z. ، L.G. ، M.L. ، Y.Y. ، W.L. ، و X.Y. موظفون في شركة Beijing CytoNiche Biotechnology Co. Ltd. ليس للمؤلفين الآخرين أي مصلحة تجارية أو ملكية أو مالية في المنتجات أو الشركات الموضحة في هذه المقالة. يعلن جميع المؤلفين الآخرين أنه ليس لديهم مصالح متنافسة.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل ماليا من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم للعلماء الشباب المتميزين (82125018).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin EDTA | BasalMedia | S310JV | Used for 2D cell harvest. |
| 3D FloTrix Digest | CytoNiche Biotech | R001-500 | This is a reagent that specifically dissolves 3D TableTrix microcarriers. |
| 3D FloTrix MSC Serum Free Medium | CytoNiche Biotech | RMZ112 | This is a serum-free,animal-free medium for mesenchymal stem cell expansion and maintenance in 2D planar culture as well as 3D culture on 3D TableTrix microcarriers. |
| 3D FloTrix Single-Use Filtration Module | CytoNiche Biotech | R020-00-10 | This module contains 0.22 μm capsule filters used for filtration of culture medium and digest solution. |
| 3D FloTrix Single-Use Storage Bag (10 L) | CytoNiche Biotech | R020-00-03 | Used as feed bag for 5 L bioreactor. |
| 3D FloTrix Single-Use Storage Bag (3 L) | CytoNiche Biotech | R020-00-01 | Used as cell seeding or transfer bags. |
| 3D FloTrix Single-Use Storage Bag (50 L) | CytoNiche Biotech | R020-00-04 | Used as feed bag for 15 L bioreactor. |
| 3D FloTrix vivaPACK Disposable Fill&Finish Consumable Kit | CytoNiche Biotech | PACK-01-01 | This is a standard kit adapted to 3D vivaPACK fill and finish system. |
| 3D FloTrix vivaPACK fill and finish system for cells | CytoNiche Biotech | vivaPACK | This system is a closed liquid handling device, with automated mixing and gas exhausting functions. Cells resuspended in cryopreservation buffer can be rapidly and evenly aliquoted into 20 bags per batch. |
| 3D FloTrix vivaPREP PLUS cell processing system | CytoNiche Biotech | vivaPREP PLUS | This system is a continuous flow centrifuge-based device.Cells can be concentrated, washed, and resuspended under completely closed procedures. |
| 3D FloTrix vivaPREP PLUS Disposable Cell Processing Kit | CytoNiche Biotech | PREP-PLUS-00 | This is a standard kit adapted to 3D vivaPREP PLUS cell processing. |
| 3D FloTrix vivaSPIN bioreactor 15 L | CytoNiche Biotech | FTVS15 | This bioreactor product employs a controller, a 15 L glass stirred-tank vessel, and assessories. A special perfusion tube is available. |
| 3D FloTrix vivaSPIN bioreactor 5 L | CytoNiche Biotech | FTVS05 | This bioreactor product employs a controller, a 5 L glass stirred-tank vessel, and assessories.A special perfusion tube is available. |
| 3D FloTrix vivaSPIN Closed System Consumable Pack (10/15 L) | CytoNiche Biotech | R020-10-10 | This is a standard tubing kit adapted to 3D vivaSPIN bioreactor 15 L, containing sampling bags. |
| 3D FloTrix vivaSPIN Closed System Consumable Pack (2/5 L) | CytoNiche Biotech | R020-05-10 | This is a standard tubing kit adapted to 3D vivaSPIN bioreactor 5 L, containing sampling bags. |
| 3D TableTrix microcarriers G02 | CytoNiche Biotech | G02-10-10g | These porous and degradable microcarriers are suitable for HEK293T cell culture. They come pre-sterilized in 10g/bottle with C-Flex tubings for welding to tubes on bioreactors. |
| 3D TableTrix microcarriers V01 | CytoNiche Biotech | V01-100-10g | These porous and degradable microcarriers are suitable for adherent cell culture, they come as non-sterilized microcarriers that need to be autoclaved in PBS before use. They are especially suitable for vaccine production. |
| 3D TableTrix microcarriers W01 | CytoNiche Biotech | W01-10-10g (single-use packaging); W01-200 (tablets) |
These porous and degradable microcarriers are suitable for adherent cell culture, especially for cells that need to be harvested as end products. They come pre-sterilized in 10g/bottle with C-Flex tubings for welding to tubes on bioreactors.The product has obtained 2 qualifications for pharmaceutical excipients from CDE, with the registration numbers of [F20200000496; F20210000003]. It has also received DMF qualification for pharmaceutical excipients from FDA, with the registration number of [DMF:35481] |
| APC anti-human CD45 Antibody | BioLegend | 368512 | Used in flow cytometry for MSC identity assessment |
| Calcein-AM/PI Double Staining Kit | Dojindo | C542 | Calcein-AM/PI Double Staining Kit is utilized for simultaneous fluorescence staining of viable and dead cells. This kit contains Calcein-AM and Propidium Iodide (PI) solutions, which stain viable and dead cells, respectively. |
| Cap for EZ Top Container Closures for NALGENE-containers (500mL) | Saint-Gobain | CAP-38 | Brands and catalogue numbers are only for example, similar products are available from various suppliers and as long as they have the same functionality, items could be substituted with other brands. |
| C-Flex Tubing, Formulation 374 (0.25 in x 0.44 in) | Saint-Gobain | 374-250-3 | Used for tube welding and disconnection. |
| CryoMACS Freezing Bag 50 | Miltenyi Biotec | 200-074-400 | Used for expanding the 3D FloTrix vivaPACK Disposable Fill&Finish Consumable Kit. |
| Dimethyl Sulfate (DMSO) | Sigma | D2650-100mL | Used for preparation of cryopreservation solution. |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | BasalMedia | L120KJ | Used for cultivation of HEK293T and Vero cells. |
| DURAN Original GL 45 Laboratory bottle (2 L) | DWK life sciences | 218016357 | Used for waste collection from the 5 L bioreactor. |
| DURAN Original GL 45 Laboratory bottle (5 L) | DWK life sciences | 218017353 | Used for waste collection from the 15 L bioreactor. |
| DURAN Original GL 45 Laboratory bottle (500 mL) | DWK life sciences | 218014459 | Used for supplementary bottle of 0.1 M NaOH. |
| EZ Top Container Closures for NALGENE-containers (500mL) | Saint-Gobain | EZ500 ML-38-2 | Brands and catalogue numbers are only for example, similar products are available from various suppliers and as long as they have the same functionality, items could be substituted with other brands. |
| Fetal bovine serum (FBS) superior quality | Wisent | 086-150 | Used for cultivation of HEK293T cells. |
| FITC anti-human CD14 Antibody | BioLegend | 301804 | Used in flow cytometry for MSC identity assessment. |
| FITC anti-human CD34 Antibody | BioLegend | 343504 | Used in flow cytometry for MSC identity assessment. |
| FITC anti-human CD90 (Thy1) Antibody | BioLegend | 328108 | Used in flow cytometry for MSC identity assessment. |
| Flow cytometry | Beckman Coulter | CytoFLEX | Used for cell identity assessment. |
| Fluorescence Cell Analyzer | Alit life science | Countstar Rigel S2 | Used for cell counting. Cell viability can be calculated by staining with AO/PI dyes. |
| GL 45 Multiport Connector Screw Cap with 2 ports | DWK life sciences | 292632806 | Brands and catalogue numbers are only for example, similar products are available from various suppliers and as long as they have the same functionality, items could be substituted with other brands. |
| Glucose Meter | Sinocare | 6243578 | Used for detecting glucose concentration in cell culture medium and supernatant. |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), with calcium and magnesium | Gibco | 14025092 | Used for preparation of digest solution. |
| Human Albumin 20% Behring (HSA) | CSL Behring | N/A | Used for preparation of wash buffer. |
| Inverted fluorescent microscope | OLYMBUS | CKX53SF | Used for brifgt field and fluorescent observation and imaging. |
| Nalgene Measuring Cylinder (500 mL) | Thermo Scientific | 3662-0500PK | Used for calibrating the liquid handling volume speed of peristaltic pumps. |
| Newborn calf serum (NBS) superfine | MINHAI BIO | SC101.02 | Used for cultivation of Vero cells. |
| OriCell human mesenchymal stem cell adipogenic differentiation and characterization kit | Cyagen | HUXUC-90031 | Used for tri-lineage differentiation of hUCMSCs. |
| OriCell human mesenchymal stem cell chondrogenic differentiation and characterization kit | Cyagen | HUXUC-90041 | Used for tri-lineage differentiation of hUCMSCs. |
| OriCell human mesenchymal stem cell osteogenic differentiation and characterization kit | Cyagen | HUXUC-90021 | Used for tri-lineage differentiation of hUCMSCs. |
| PE anti-human CD105 Antibody | BioLegend | 800504 | Used in flow cytometry for MSC identity assessment. |
| PE anti-human CD19 Antibody | BioLegend | 302208 | Used in flow cytometry for MSC identity assessment. |
| PE anti-human CD73 (Ecto-5'-nucleotidase) Antibody | BioLegend | 344004 | Used in flow cytometry for MSC identity assessment. |
| PE anti-human HLA-DR Antibody | BioLegend | 307605 | Used in flow cytometry for MSC identity assessment. |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Wisent | 311-010-CL | Used in autoclaving of glass vessel and V01 microcarriers, and replacement of culture medium. |
| Sani-Tech Platinum Cured Sanitary Silicone Tubing (0.13 in x 0.25 in) | Saint-Gobain | ULTRA-C-125-2F | Used for solution transfering driven by peristaltic pumps. |
| Sterile Saline | Hopebiol | HBPP008-500 | Used for preparation of wash buffer. |
| Trypzyme Recombinant Trypsin | BasalMedia | S342JV | This reagent is used for bead-to-bead transfer of HEK293T and Vero cells. |
| Tube Sealer | Yingqi Biotech | Tube Sealer I | This sealer is compatible with both C-Flex tubing and PVC tubing. |
| Tube Welder for PVC tubing | Chu Biotech | Tube Welder Micro I | Used for welding of PVC tubing. |
| Tube Welder for TPE tubing | Yingqi Biotech | Tube Welder I-V2 | Used for welding of TPE tubing. |
| ViaStain AO / PI Viability Stains | Nexcelom | CS2-0106-25mL | Dual-Fluorescence Viability, using acridine orange (AO) and propidium iodide (PI), is the recommended method for accurate viability analysis of primary cells, such as PBMCs, and stem cells in samples containing debris. |
References
- Golchin, A., Farahany, T. Z. Biological products: Cellular therapy and FDA approved products. Stem Cell Reviews and Reports. 15 (2), 166-175 (2019).
- Young, C. M., Quinn, C., Trusheim, M. R. Durable cell and gene therapy potential patient and financial impact: US projections of product approvals, patients treated, and product revenues. Drug Discovery Today. 27 (1), 17-30 (2022).
- Elverum, K., Whitman, M. Delivering cellular and gene therapies to patients: solutions for realizing the potential of the next generation of medicine. Gene Therapy. 27 (12), 537-544 (2020).
- Blache, U., Popp, G., Dünkel, A., Koehl, U., Fricke, S. Potential solutions for manufacture of CAR T cells in cancer immunotherapy. Nature Communications. 13 (1), 5225 (2022).
- Lee, B., et al. Cell culture process scale-up challenges for commercial-scale manufacturing of allogeneic pluripotent stem cell products. Bioengineering. 9 (3), 92 (2022).
- Emerson, J., Glassey, J. Bioprocess monitoring and control: Challenges in cell and gene therapy. Current Opinion in Chemical Engineering. 34, 100722 (2021).
- Robb, K. P., Fitzgerald, J. C., Barry, F., Viswanathan, S. Mesenchymal stromal cell therapy: progress in manufacturing and assessments of potency. Cytotherapy. 21 (3), 289-306 (2019).
- Olsen, T. R., Ng, K. S., Lock, L. T., Ahsan, T., Rowley, J. A. Peak MSC-Are we there yet. Frontiers in Medicine. 5, 178 (2018).
- Roots Analysis. Stem Cell Therapy Contract Manufacturing (CMO) Market, 2019 - 2030. , Available from: https://www.rootsanalysis.com/reports/view_document/stem-cell-therapy-contract-manufacturing-market-2019-2030/271.html (2019).
- Elseberg, C. L., et al. Microcarrier-based expansion process for hMSCs with high vitality and undifferentiated characteristics. The International Journal of Artificial Organs. 35 (2), 93-107 (2012).
- de Soure, A. M., Fernandes-Platzgummer, A., Silva, da, L, C., Cabral, J. M. Scalable microcarrier-based manufacturing of mesenchymal stem/stromal cells. Journal of Biotechnology. 236, 88-109 (2016).
- Rafiq, Q. A., Coopman, K., Nienow, A. W., Hewitt, C. J. Systematic microcarrier screening and agitated culture conditions improves human mesenchymal stem cell yield in bioreactors. Biotechnology Journal. 11 (4), 473-486 (2016).
- Tavassoli, H., et al. Large-scale production of stem cells utilizing microcarriers: A biomaterials engineering perspective from academic research to commercialized products. Biomaterials. 181, 333-346 (2018).
- Mizukami, A., et al. Technologies for large-scale umbilical cord-derived MSC expansion: Experimental performance and cost of goods analysis. Biochemical Engineering Journal. 135, 36-48 (2018).
- Yan, X., et al. Dispersible and dissolvable porous microcarrier tablets enable efficient large-scale human mesenchymal stem cell expansion. Tissue Engineering. Part C, Methods. 26 (5), 263-275 (2020).
- Carletti, E., Motta, A., Migliaresi, C. Scaffolds for tissue engineering and 3D cell culture. 3D Cell Culture: Methods and Protocols. Haycock, J. W. , Humana Press. Totowa, NJ. 17-39 (2011).
- Loh, Q. L., Choong, C. Three-dimensional scaffolds for tissue engineering applications: Role of porosity and pore size. Tissue Engineering. Part B Reviews. 19 (6), 485-502 (2013).
- Zhang, Y., et al. GMP-grade microcarrier and automated closed industrial scale cell production platform for culture of MSCs. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 16 (10), 934-944 (2022).
- NMPA. Pharmaceutical Excipient Registration Database: Microcarrier tablets for cells. Center for Drug Evaluation. , Available from: https://www.cde.org.cn/main/xxgk/listpage/ba7aed094c29ae314670a3563a716e (2023).
- List of Drug Master Files (DMFs). US Food and Drug Administration. , Available from: https://www.fda.gov/drug-mater-files-dmfs/list-drug-master-files-dmfs (2023).
- Beeravolu, N., et al. Isolation and characterization of mesenchymal stromal cells from human umbilical cord and fetal placenta. Journal of Visualized Experiments. (122), e55224 (2017).
- Xie, Y., et al. The quality evaluation system establishment of mesenchymal stromal cells for cell-based therapy products. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 176 (2020).
- Maillot, C., Sion, C., De Isla, N., Toye, D., Olmos, E. Quality by design to define critical process parameters for mesenchymal stem cell expansion. Biotechnology Advances. 50, 107765 (2021).
- Silva Couto, P., et al. Expansion of human mesenchymal stem/stromal cells (hMSCs) in bioreactors using microcarriers: Lessons learnt and what the future holds. Biotechnology Advances. 45, 107636 (2020).
- Chen, S., et al. Facile bead-to-bead cell-transfer method for serial subculture and large-scale expansion of human mesenchymal stem cells in bioreactors. Stem Cells Translational Medicine. 10 (9), 1329-1342 (2021).
- Tsai, A. C., Pacak, C. A. Bioprocessing of human mesenchymal stem cells: From planar culture to microcarrier-based bioreactors. Bioengineering. 8 (7), 96 (2021).
- Hewitt, C. J., et al. Expansion of human mesenchymal stem cells on microcarriers. Biotechnology Letters. 33 (11), 2325-2335 (2011).
- Mawji, I., Roberts, E. L., Dang, T., Abraham, B., Kallos, M. S. Challenges and opportunities in downstream separation processes for mesenchymal stromal cells cultured in microcarrier-based stirred suspension bioreactors. Biotechnology and Bioengineering. 119 (11), 3062-3078 (2022).
- Schirmaier, C., et al. Scale-up of adipose tissue-derived mesenchymal stem cell production in stirred single-use bioreactors under low-serum conditions. Engineering in Life Sciences. 14 (3), 292-303 (2014).
- Lawson, T., et al. Process development for expansion of human mesenchymal stromal cells in a 50L single-use stirred tank bioreactor. Biochemical Engineering Journal. 120, 49-62 (2017).
- Yang, J., et al. Large-scale microcarrier culture of HEK293T cells and Vero cells in single-use bioreactors. AMB Express. 9 (1), 70 (2019).
- Fang, Z., et al. Development of scalable vaccinia virus-based vector production process using dissolvable porous microcarriers. 25th Annual Meeting of the American Society of Gene & Cell Therapy. Molecular Therapy. 30, 195-196 (2022).
