Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Storskala celleproduksjon basert på GMP-grade oppløselige porøse mikrobærere

Published: July 7, 2023 doi: 10.3791/65469
Automatic Translation
*1, *2, *2, 2, 2, 2, 2, 2, 1
1Department of Biomedical Engineering, School of Medicine, Tsinghua University, 2Beijing CytoNiche Biotechnology Co. Ltd.
* These authors contributed equally

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å oppnå storskala produksjon av adherente celler gjennom et helt lukket system basert på GMP-klasse oppløselige mikrobærere. Dyrking av humane mesenkymale stamceller, HEK293T celler og Vero-celler ble validert og oppfylte både kvantitetskrav og kvalitetskriterier for celle- og genterapiindustrien.

Abstract

Forskere i celle- og genterapiindustrien (CGT) har lenge stått overfor en formidabel utfordring i effektiv og storskala utvidelse av celler. For å løse de primære manglene i det todimensjonale (2D) plane dyrkingssystemet, utviklet vi innovativt en automatisert ACISCP-plattform (Closed Industrial Scale Cell Production) basert på en GMP-klasse, oppløselig og porøs mikrobærer for 3D-kulturen av adherente celler, inkludert humane mesenkymale stamceller / stromale celler (hMSCs), HEK293T celler og Vero-celler. For å oppnå storskala ekspansjon ble det gjennomført en to-trinns utvidelse med 5 L og 15 L omrørte tankbioreaktorer for å gi 1,1 x 1010 hMSC med en samlet utvidelse på 128 ganger innen 9 dager. Cellene ble høstet ved å fullstendig oppløse mikrobærerne, konsentrert, vasket og formulert med et kontinuerlig strømningssentrifugebasert cellebehandlingssystem, og deretter alisert med et cellefyllingssystem. Sammenlignet med 2D-plane kulturer er det ingen signifikante forskjeller i kvaliteten på hMSCer høstet fra 3D-kultur. Vi har også brukt disse oppløselige porøse mikrobærerne på andre populære celletyper i CGT-sektoren; Spesielt har HEK293T celler og Vero-celler blitt dyrket til topp celletettheter på henholdsvis 1,68 x 107 celler / ml og 1,08 x 107 celler / ml. Denne studien gir en protokoll for bruk av en bioprosessingeniørplattform som utnytter egenskapene til GMP-klasse oppløselige mikrobærere og avansert lukket utstyr for å oppnå industriell skala produksjon av adherente celler.

Introduction

CGT-industrien har vært vitne til en eksponentiell ekspansjon de siste to tiårene. Utviklingen av neste generasjons medisiner forventes å behandle og kurere mange ildfaste sykdommer1. Siden den første Food and Drug Administration (FDA) godkjenningen av et CGT-produkt, Kymriah, i 2017, har CGT-relatert forskning og utvikling i verden fortsatt å vokse raskt, med FDA som ser aktive undersøkende nye legemiddelapplikasjoner for CGT økt til 500 i 20182. Det hadde blitt spådd at antall godkjenninger av CGT-produkter sannsynligvis vil være 54-74 i USA innen 20302.

Mens den raske veksten i CGT-forskning og innovasjon er spennende, er det fortsatt et stort teknologisk gap mellom laboratorieforskning og industriell skalaproduksjon som kan levere disse lovende medisinene for å nå så mange pasienter som nødvendig til rimelige kostnader. De nåværende prosessene som ble vedtatt for disse kliniske forsøkene ble etablert i laboratorier for småskala eksperimenter, og betydelig innsats er nødvendig for å forbedre og innovere på CGT-produksjon3. Det finnes mange typer CGT-produkter, de fleste av dem basert på levende celler, som kan være allogene, autologe, konstruerte eller naturlige. Disse levende stoffene er mye mer komplekse enn små molekylære enheter eller biologiske legemidler, noe som gjør storskala produksjon til en betydelig utfordring 4,5,6. I dette arbeidet demonstrerer vi en storskala celleproduksjonsprotokoll for tre forankringsavhengige celler som er mye brukt i CGT. Disse inkluderer humane mesenkymale stamceller / stromale celler (hMSCs), som har blitt brukt til cellebasert terapi, og HEK293T celler og Vero-celler, som begge brukes til å produsere virus for genteknologi av det endelige terapeutiske celleproduktet. Forankringsavhengige celler dyrkes ofte på plane systemer, som krever manuell behandling. Imidlertid krever manuelle kulturmetoder en betydelig mengde arbeidskraft og er utsatt for forurensning, noe som kan kompromittere kvaliteten på sluttproduktet. Videre er det ingen in-line prosesskontroll, noe som fører til betydelig variasjon i kvalitet mellom batchene7. Hvis vi tar stamcelleterapi som et eksempel, med en lovende pipeline på over 200 stamcelleterapikandidater, er det anslått at 300 billioner hMSC vil være nødvendig per år for å møte kravene til kliniske applikasjoner8. Derfor har storskala produksjon av terapeutiske celler blitt en forutsetning for å utføre disse terapeutiske inngrepene med så høy cellebehov9.

For å unngå tilbakeslagene i plane systemer er det gjort en innsats for å utvikle storskala produksjonsprosesser i bioreaktorer med omrørte tankbioreaktorer med konvensjonelle ikke-oppløselige mikrobærere10,11,12,13, men disse lider av kompliserte prepareringsprosedyrer og lav cellehøstingseffektivitet14. Nylig har vi innovert en oppløselig mikrobærer for stamcelleutvidelse, med sikte på å omgå utfordringene med cellehøsting fra konvensjonelle ikke-oppløselige kommersielle mikrobærere15. Denne nye, kommersielt tilgjengelige GMP-grade 3D oppløselige porøse mikrobæreren, 3D TableTrix, har vist stort potensial for storskala celleproduksjon. Faktisk kan 3D-kultur basert på disse porøse mikrobærerne potensielt gjenskape gunstige biomimetiske mikromiljøer for å fremme celleadhesjon, spredning, migrasjon og aktivering16. De porøse strukturer og sammenkoblede porenettverk av mikrobærere kan skape et større celleadhesjonsområde og fremme utveksling av oksygen, næringsstoffer og metabolitter, og dermed skape et optimalt substrat for in vitro celleutvidelse17. Den høye porøsiteten til disse GMP-grade 3D oppløselige porøse mikrobærerne muliggjør storskala utvidelse av hMSCs, og muligheten for at cellene skal være fullstendig oppløst muliggjør effektiv høsting av disse utvidede cellene18. Det er også et GMP-gradert produkt og har blitt registrert som et farmasøytisk hjelpestoff hos Chinese Center for Drug Evaluation (arkiveringsnummer: F20210000003 og F20200000496)19 og FDA i USA (FDA, USA; Drug Master Filnummer: 35481)20.

Her illustrerer vi et automatisert ACISCP-system (closed industrial scale cell production)18 ved hjelp av disse dispergerbare og oppløselige porøse mikrobærerne for hMSC, HEK293T celle og Vero-celleutvidelse. Vi oppnådde en vellykket todelt utvidelse av hMSC (128 kumulativ fold ekspansjon på 9 dager) fra en 5 l bioreaktor til en 15 l bioreaktor og til slutt oppnådd opptil 1,1 x10 10 hMSC fra en enkelt batch av produksjon. Cellene ble høstet ved å fullstendig oppløse mikrobærerne, konsentrert, vasket og formulert med et kontinuerlig strømningssentrifugebasert cellebehandlingssystem, og deretter alisert med et cellefyllingssystem. Videre vurderte vi kvaliteten på hMSC-produkter for å bekrefte samsvar. Vi demonstrerte også anvendelsen av disse oppløselige mikrobærerne for oppskalert produksjon av to andre typer forankringsceller, HEK293T celler og Vero-celler, som er mye brukt i CGT-industrien. Maksimal celletetthet av HEK293T celler nådde 1,68 x 10 7 celler / ml, mens topptettheten av Vero-celler nådde 1,08 x 107 celler / ml. ACISCP-systemet kan tilpasses til å dyrke en rekke adherente celler, og det kan potensielt bli en kraftig plattform som bidrar til å fremskynde industrialiseringen av CGT.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Den menneskelige navlestrengen ble hentet fra Beijing Tsinghua Changgeng Hospital. Alle prosedyrer og protokoller angående oppkjøp, isolering og kultur av humane navlestrengsmesenkymale stamceller (UCMSC) ble utført med informert samtykke og med godkjenning av etikkomiteen ved Beijing Tsinghua Changgeng Hospital (arkiveringsnummer 22035-4-02), og prosedyrene og protokollene overholdt Helsinki-erklæringen fra 1964 og dens senere endringer eller sammenlignbare etiske standarder.

1. Monolagskultur av hMSCs, HEK293T celler og Vero-celler

  1. Isoler primære humane UCMSC-er fra Whartons gelé i henhold til den rapporterte metoden21. Bruk serumfritt (SF) hMSC-kulturmedium for isolering og utvekst av primære UCMSC-er, høst cellene ved passasje 2 og kryokonservering som en hovedcellebank (MCB).
  2. Inokuler 6 x 105 humane UCMSC-er (helst passasje 2 eller passasje 3-celler) i en T75-kolbe (dvs. såtettheten på 2D-plane kar er 8,000 celler / cm2) for monolagskultur med 15 ml komplett SF hMSC kulturmedium. Sørg for jevn såing gjennom en åttetallsbevegelse av kolben. Dyrkning ved 37 °C i en 5% CO2 cellekultur inkubator til 80% -90% konfluens.
  3. For å høste, dekanter cellekulturmediet, og skyll cellene med 3-5 ml fosfatbufret saltvann (PBS) to ganger. Deretter tilsettes 2 ml 0,25% trypsin-EDTA, og inkuberes ved 37 °C i 1-2 minutter til de fleste celler har blitt runde og har løsnet fra kolben, som observert under et invertert mikroskop med et 4x objektiv. Tilsett 3 ml SF hMSC kulturmedium for å avslutte fordøyelsen.
  4. Overfør cellesuspensjonen til et 15 ml konisk sentrifugerør, og sentrifuge ved 179 x g i 5 minutter. Dekanter supernatanten, skyll cellepelleten med PBS to ganger, og resuspender i rundt 3-5 ml SF hMSC kulturmedium for såing til mikrobærere i bioreaktorer.
    MERK: Kontroller cellens levedyktighet, og sørg for at cellene er >90% levedyktige. Bare forberede cellene etter at alt forberedelsesarbeidet for bioreaktorene er fullført (trinn 2.1-3.6).
  5. For monolagskulturen av HEK293T celler og Vero-celler, inokuler ved 2 x 10 6-3 x 106 celler i hver T75-kolbe og kultur med DMEM som inneholder henholdsvis 10% føtalt bovint serum (FBS) og 10% nyfødt kalveserum (NBS).
  6. Følg trinn 1.3-1.4 for høsting av cellene. Resuspender i 3-5 ml DMEM inneholdende 10% FBS.

2. Fremstilling av bioreaktoren under omrøring før cellesåing

  1. På dag -1, skyll glassbeholderen grundig med rennende avionisert (DI) vann en gang.
  2. Demonter alle rustfrie rør og løpehjul fra hodeplaten, senk dem i DI-vann og sonicate med en ultralydrenser ved 40 kHz og 60 ° C i 1 time for å rengjøre grundig.
    MERK: Forberedelsene og prosedyrene vil være de samme for første tier-utvidelse i 5 L bioreaktoren og den andre tier-utvidelsen i 15 L bioreaktoren. Parametrene for 15 L bioreaktoren er gitt i parentes gjennomgående. Hvis ingen parametere er gitt i parentes, er disse parametrene de samme for bioreaktorene på 5 L og 15 L.
  3. Kontroller nøye at alle O-ringene er intakte og på plass, og installer deretter de demonterte delene tilbake på hodeplaten i henhold til produsentens instruksjoner.
    MERK: Bytt ut slitte eller revne O-ringer før montering om nødvendig. Slitte O-ringer vil kompromittere lufttettheten og dermed steriliteten til fartøyet.
  4. Tilsett 7 L (18 L for 15 L bioreaktoren) med 0,5 M NaOH-oppløsning i 5 L-beholderen, og plasser hodeplaten med rørene montert på kanten av fartøyet for å fordype rørene i NaOH-løsningen. La det stå i 12 timer eller over natten for å fjerne endotoksiner fra rørene og glassbeholderen.
    MERK: Må ikke overskride 7 l (18 l), da dette er det maksimale volumet på 5 l (15 l) glassbeholder. Bruk riktig personlig verneutstyr når du håndterer NaOH-løsningen, da den er etsende.
  5. Fjern hodeplaten og dekanter NaOH-oppløsningen i en riktig avfallsflaske. Kastes i henhold til laboratoriesikkerhetsforskrifter. Skyll beholderen, hodeplaten og dens deler grundig med endotoksinfritt DI-vann eller vann til injeksjon for å fjerne gjenværende alkalisk.
  6. Tilsett 2 L (5 L) PBS til fartøyet, sett sammen alle delene og fest hodeplaten til metallrammen på fartøyet i henhold til produsentens instruksjoner.
  7. Monter en lukket forbrukspakke til riktig deler / rør / porter i rustfritt stål (SS) på frontplaten i henhold til produsentens instruksjoner. Klem alle Robert-klemmene på rørene, og forsterkning ved klemming med hemostater anbefales. La et av rørene, med et 0,22 μm luftventilfilter på enden som er koblet til kondensatoren, ikke klemmes.
    NOTAT: Slip silikonrørene på spissene på hemostatene for å forhindre piercing av silikonrørene. Klem bare på silikonrørene, og unngå å klemme C-flex-rørene som følger med i dette settet. Hvis du lar ett rør på kondensatoren være løs, vil det muliggjøre trykkavlastning under autoklavering.
  8. Forbered 250 ml 0,1 M NaOH-oppløsning i en autoklaverbar 500 ml GL 45 glassflaske, og monter sammen med en GL 45 Multiport Connector Screw Cap med to porter. Koble et 180 mm langt, 0,13 tommer x 0,25 tommer (innvendig diameter x ytre diameter) silikonrør til en av portene på undersiden av hetten; Lengden skal være lang nok til å bare berøre bunnen av flasken.
  9. Koble et annet stykke silikonrør, med en lengde 500 mm lengre enn den forrige, til samme port på oversiden av hetten, og koble den andre enden til en dryppmateport på 5 L fartøyets hodeplate. Koble et 0,22 μm lufteventilfilter til den andre porten på skrukorken.
  10. Utfør en topunktskalibrering på pH-sonden i henhold til produsentens instruksjoner. Sett deretter inn sonder for pH, oppløst oksygen (DO) og antall levende celler i beholderen i de aktuelle PG13,5-portene, og skru fast på frontplaten.
  11. Utfør en lufttetthetskontroll av det ferdigmonterte fartøyet i henhold til produsentens instruksjoner. Oppretthold et trykk på 0,4 bar ± 0,01 bar i minst 30 minutter. Slipp trykket sakte etter at systemet har bestått testen. Hvis lufttetthetstesten mislykkes, må du nøye søke etter lekkasjepunkter og forsterke fartøyets montering.
  12. Autoklav det ferdigmonterte fartøyet med forbrukssett ved 15 psi og 121 °C i 60 minutter. Etter autoklavering, sjekk alle lufteventilfiltrene for å sikre at de er intakte og tørre. Fjern alle hemostater.
    MERK: Et våtluftfilterfilter vil ikke filtrere gassen effektivt og kan kompromittere steriliteten til fartøyet under cellekultur. Bytt luftefilter hvis de er våte, og autoklav hele fartøyet igjen.
  13. Overfør det autoklaverte fartøyet til et renrom, og vent til det er helt avkjølt til romtemperatur. Sett temperatursonden inn i termobrønnrøret, og koble kablene til motoren, pH-sonden og DO-sonden fra kontrolleren til de respektive delene på beholderen. Pakk varmematten tett rundt karet.
  14. Løsne Robert-klemmene på de fleksible rørene på eksosgasskondensatoren, ringspargeren, dryppmateporten for NaOH og luftoverleggsporten. Slå på kontrolleren, logg på og skriv inn parametrene som er oppført i tabell 1 , i systemet i henhold til produsentens instruksjoner. Disse rørene bør ikke klemmes når som helst under kulturprosessen.
  15. Klikk på Start, og navngi eksperimentet for å starte bioreaktoren. La bioreaktoren kjøre på disse innstillingene i minst 12 timer, eller over natten, for å mette PBS med oksygen for å utføre en ettpunktskalibrering for DO-sonden senere.
  16. Kalibrer væskehåndteringsvolumhastigheten til pumpe 1 og pumpe 2 på bioreaktorkontrolleren. Installer en 0,13 i x 0,25 i silikonrør på hver pumpe separat, med den ene enden dyppet i en flaske vann og den andre enden av røret satt inn i en målesylinder.
  17. Sett pumpens rotasjonshastighet til 300 o / min, og ta tiden i 1 min. Legg merke til mengden vann som dispenseres i målesylinderen for begge pumpene. Disse tallene vil være nødvendige for de påfølgende trinnene.
  18. Klargjør 500 ml SF hMSC kulturmedium i henhold til produsentens instruksjoner, og sett på korken på cellekulturmediumflasken på flasken med engangs C-Flex EZ Top beholderlukking og kompatibel hette. Utfør korken utskifting inne i et biosikkerhetsskap (BSC).
  19. Sveis utløpsrøret på flasken med medium til C-flex-røret på flasken med 10 g forhåndssteriliserte W01-mikrobærere for MSC. Monter en del av røret på pumpe 1 på bioreaktorkontrolleren, sett pumpens rotasjon til 300 o / min, og pump inn hele kulturmediet fra flasken til mikrobærerflasken. Oppbevar disse mikrobærerne ved 4 °C til bruk på dag 0.
    MERK: Mikrobærerne skal klargjøres på dag −1. For 15 L bioreaktorkultur, lag fire flasker (dvs. 40 g, med 4 x 500 ml SF-medium) totalt.

3. Cellesåing, kultur og høsting i en 5 L omrørt tankbioreaktor

  1. På dag 0, utfør en ettpunktskalibrering, spesielt 100%, for DO-sonden på bioreaktorkontrolleren i henhold til produsentens instruksjoner. Bioreaktoren med omrøringstank er nå klar for cellekultur.
  2. Klargjør en 2 l (5 l) glassflaske for avfallsoppsamling, monter den med en GL 45 skrukork med multiportkobling med to porter, med 30 mm, 0,25 tommer x 0,44 tommer C-Flex-rør koblet til begge porter, og autoklav for å sterilisere. Sveis C-flex-røret fra en av portene fra avfallsflasken til slakterøret på frontplaten til bioreaktorbeholderen med en rørsveiser.
  3. Stopp temperatur-, pH- og DO-kontrollen på bioreaktorkontrolleren midlertidig, installer silikonrøret festet til høstrøret på peristaltisk pumpe 2 i riktig væskestrømningsretning, og dispenser alle PBS helt fra beholderen inn i avfallsflasken. Fjern røret fra pumpen, og forsegl og koble fra avfallsflasken.
    MERK: Klem alltid ut eventuelle Robert-klemmer på de fleksible rørene som er involvert i væskestrømmen i hvert trinn. Klem tilbake etter at væskeoverføringen er fullført før forsegling og frakobling. Klem nærmere mot hodeplatesiden. Unclamping og klemming bør utføres for alle påfølgende trinn med mindre annet er angitt.
  4. Klargjør 7 l (30 l) komplett SF hMSC-medium, og erstatt hver originale flaskekork med en engangslukking av C-Flex EZ Top-beholderen og et kompatibelt lokk. Sveis en filtreringsmodul til engangsbruk til en av portene på den 10 l (50 l) oppbevaringspose. Utfør operasjonen med å bytte ut hettene i en BSC.
  5. Filtrer og overfør kulturmediet til oppbevaringsposen, en flaske om gangen, ved å sveise flaskene med cellekulturmedium til den andre enden av kapselfilteret og bruke pumpen på bioreaktorkontrolleren. Angi som fôrpose.
  6. Sveis en utløpsport fra mateposen til C-flex-røret på materøret på frontplaten, og installer røret til pumpe 1 på bioreaktorkontrolleren. Sveis den andre utløpsporten fra mateposen til utluftingsrøret, og installer røret for å pumpe 2 på bioreaktorkontrolleren i riktig retning av væskestrøm.
    MERK: Installer seksjonen på væskestrømningsledningen, som er laget av silikonrør, på pumpen for bedre motstand mot slitasje sammenlignet med C-Flex-rør. Forsikre deg om at rørene er installert i riktig retning.
  7. Sett pumpens hastighet 1 til 300 o / min, og stopp pumpen etter at den har dispensert 1 l (5 l) medium fra mateposen inn i beholderen, basert på volumpåføringshastigheten angitt i trinn 2.17. Start temperatur-, pH- og DO-kontrollen på nytt, med de samme innstillingene som beskrevet i trinn 2.14.
  8. Forsegl og koble fra slangen som forbinder mateposen med materøret på hodeplaten. Sveis C-Flex-slangen fra flasken med de dispergerte mikrobærerne klargjort i trinn 2.18 til materøret, og pump alt innholdet fra flasken inn i beholderen. Forsegl og koble fra den tomme flasken med mikrobæreroppheng. Desinfiser hele overflaten av flasken med 75% etanol, og legg i en BSC for bruk som en celleopphengsoverføringsflaske.
    MERK: La et lengre stykke C-Flex-rør ligge på hodeplatesiden når du forsegler og kobler fra engangstilbehøret, da flere sveise- og frakoblingstrinn vil bli utført på samme rør i de følgende trinnene.
  9. Sørg for at temperaturen som vises på kontrolleren når en jevn tilstand på 37 °C, som vanligvis tar ca. 30 minutter, før du fortsetter med å klargjøre frøcellene som i trinn 1.3-1.4. Nytt oppløsningsvæsken på 2,5 x 108 hMSC i 500 ml SF-medium, og overfør til den tomme flasken som tidligere inneholdt mikrobærersuspensjonen.
    MERK: Frøcellene for 15 L bioreaktorutvidelsen skal fremstilles i henhold til trinn 3.21, med sikte på å inokulere 1,0 x 109 celler i 500 ml.
  10. Sveis C-Flex-slangen fra flasken som nå inneholder cellesuspensjonen, til mateporten på hodeplaten, og pump alt innholdet fra flasken inn i beholderen for å starte celleinokulering til mikrobærerne. Forsegl og koble fra den tomme flasken. Sveis mateporten fra mateposen til materøret på hodeplaten.
  11. Juster agitasjonsinnstillingene på kontrolleren for å tillate periodisk omrøring for forbedret inokuleringseffektivitet for hMSC-er ved å stille inn følgende parametere: V1 = 35 (30) o / 5 min; V2 = 0 o / 25 min; antall sykluser = 12 (24); endelig omrøringshastighet = 35 (30) o / min.
    MERK: Omrøringshastigheten kan justeres til 40 (35) o / min eller 45 (40) o / min hvis ujevn fordeling eller sedimentering av mikrobærerne observeres under kulturprosessen.
  12. Sett opp et automatisert medium supplement og utvekslingsregime på bioreaktorkontrolleren i Medium Exchange-grensesnittet. Angi parametrene for hMSC-dyrkingen som angitt i tabell 2.
    MERK: Løsne eventuelle Robert-klemmer på de fleksible rørene som er involvert i væskestrømmen på dette stadiet, spesielt for matings- og blødningsrøret. Hold disse unclamped gjennom hele kulturprosessen.
  13. Ta prøvene gjennom prøvetakingsrøret ved å koble engangsprøvetakingsposene via Luer-koblinger på de ønskede tidspunktene, vanligvis en gang hver dag, og kondensere 10 ml hver gang i prøvetakingsposen. Aliquot 2-3 ml prøve i den første prøvetakingsposen, kast, og deretter aliquot den faktiske 10 ml prøven i en ny prøvetakingspose hver gang.
    MERK: Den første 2-3 ml prøven kan være væske igjen i røret fra forrige prøvetakingstidspunkt og representerer kanskje ikke tilstanden i beholderen nøyaktig. Utfør alltid disse trinnene med ekstra aseptiske tiltak ved å desinfisere Luer-koblingene før og etter opprettelse eller brudd på tilkoblinger med 75 % etanol.
  14. Overfør prøvene tatt til et 15 ml konisk sentrifugerør. Utfør følgende tester på prøvene.
    1. Ta 200 μL av den cellebelastede mikrobæreropphenget, og flekk med Calcein-AM / PI Cell Double Staining i henhold til produsentens instruksjoner. Observer under et fluorescensmikroskop.
    2. Sedimenter mikrobærerne ved gravitasjon, som vanligvis tar 5-10 min. Aspirer supernatanten, og test glukosekonsentrasjonen med en glukosemåler i henhold til produsentens instruksjoner. Plott en glukosenivågraf.
    3. Inkuber de sedimenterte cellebelastede mikrobærerne med en nytilberedt 3-5 ml 1 mg/ml fordøyelsesløsning ved 37 °C i 20-30 minutter for å løse opp mikrobærerne fullstendig. Tell cellene etter farging med AO/PI med en automatisert fluorescenscelleanalysator. Plott en cellevekstkurve. Korreler med sanntids levende cellevekstkurve generert på kontrolleren.
  15. På dag 4 eller dag 5 av kulturen, lag 50 ml (200 ml) fordøyelsesoppløsning ved 30 mg / ml. Arbeidsmasseforholdet mellom fordøyelsesløsningen og oppløselige mikrobærere varierer fra 3:20 til 5:20. Sterilt filter med et 0,22 μm kapselfilter, og videre fortynnes i 500 ml (2 L) av Hanks balanserte saltløsning (HBSS) med kalsium og magnesium. Overfør til en 3 L engangsoppbevaringspose.
    MERK: Forbered bare fordøyelsesløsningen like før cellehøsting. Prøv å sikte på minst 1,0 x 10 9-1,2 x 109 celler for utvidelsen på første nivå og 1,0 x10 10 celler for utvidelsen på andre nivå. Hvis cellene vokser raskere, høst på dag 4; Hvis ikke, høst på dag 5. Det anbefales ikke å gå utover dag 5.
  16. Sett omrøringshastigheten til 0 på kontrolleren for at mikrobærerne skal legge seg, noe som vanligvis skjer innen 20 minutter. Slå av den automatiserte mediumutvekslingsprotokollen, og stopp temperatur-, pH- og DO-kontrollen på bioreaktorkontrolleren. Start pumpe 2 manuelt ved 300 o / min på kontrolleren, og dispenser supernatant i materegimet for å etterlate ca. 1 l (2 l) kultursuspensjon i beholderen (ved å bruke volumdispenseringshastigheten angitt i trinn 2.17 eller måle fra graderingsmerkene på fartøyets kropp). Forsegle og koble fra mateposen helt.
  17. Sveis posen med nylaget fordøyelsesløsning fra trinn 3.15 til materøret, og pump alt innholdet inn i beholderen. Start omrøringshastigheten ved 45 (40) o / min. Sørg for at temperaturkontrollen fortsatt holder temperaturen på 37 °C. Mikrobærere vil løse seg opp innen 40-60 min. Ta 1 ml av prøven med en steril Luer låsesprøyte på 30 minutter og deretter hvert 5-10 minutt for å observere under et lysfeltmikroskop for å kontrollere oppløsningen av mikrobærerne.
  18. Etter at mikrobærerne er oppløst, sveis en 3 L oppbevaringspose (to 3 L oppbevaringsposer for 15 L bioreaktoren) til slakterøret, og pump ut celleopphenget helt ved hjelp av pumpe 2 ved 300 o / min. Tilbered 1 l (3,5 l) saltvann inneholdende 1 % humant serumalbumin (HSA) som vaskebuffer og 500 ml komplett SF-medium (500 ml cellekryopreserveringsbuffer, en formulering på 10 % dimetylsulfat (DMSO) og 90 % SF-medium er tatt som et eksempel) i separate engangsoppbevaringsposer ved hjelp av metodene og tilbehøret nevnt i tidligere trinn for andre væskeoverføringer.
  19. Slå på cellebehandlingssystemet, installer et engangscellebehandlingssett til instrumentet i henhold til produsentens instruksjoner, sveis posene med celleoppheng, vaskebuffer og SF-medium (kryopreserveringsbuffer) til engangscellebehandlingssettet, og følg nøye alle instruksjonene som vises på brukergrensesnittet for å initialisere og kontrollere integriteten og riktig installasjon av settet.
  20. Når installasjonen er fullført, angir du parametrene som er oppført i tabell 3 for cellevasking med vaskebuffer og resuspensjon i SF-medium (kryopreserveringsbuffer) til programvaren for å starte vaske- og opphengsprosessen. Hele prosedyren vil bli utført automatisk med flere manuelle sjekkpunkter.
  21. Ta en prøve av cellene fra sentrifugekammeret, som angitt av cellebehandlingssystemet, og beregne celletettheten med en automatisert celleanalysator i henhold til produsentens instruksjoner. Juster resuspensjonsvolumet for en tetthet på 2 x 106 celler/ml eller et maksimalt totalvolum på 250 ml.
  22. Forsegl og koble celleoverføringsposen fra engangscellebehandlingssettet etter at systemet har aspirert cellene ut fra kammeret. Juster celletettheten til 2 x 106 celler/ml med komplett SF-medium i en større celleoverføringspose/medium oppbevaringspose om nødvendig. Disse vil være frøcellene for den andre tier-utvidelsen i 15 L-bioreaktoren.

4. Celleformulering, fyll og fullfør

  1. Begynn å forberede 15 L bioreaktoren 1 dag før cellehøsting fra 5 L bioreaktoren. Følg trinnene i protokolldel 2 og 3 fullstendig, bortsett fra med parametrene for 15 L angitt i parentes.
  2. Resuspender cellene i 250 ml kryopreserveringsbuffer, og forsegl og koble celleoverføringsposen fra engangscellebehandlingssettet etter at systemet har aspirert cellene ut fra kammeret.
  3. Overfør 2000 ml kryopreserveringsbuffer sammen med 250 ml resuspenderte celler fra trinn 4,2 til en 3-liters celleoverføringspose. Sveis denne overføringsposen til et engangs fyll og avslutt forbrukssett.
    MERK: Det ekstra volumet av kryopreserveringsbuffer som brukes her, bør bestemmes av spesifikasjonen av formulering og beregning av totalt cellenummer i henhold til telleresultatene oppnådd i trinn 3.21
  4. Monter engangsfyllings- og finishforbrukssettet til cellefyllingssystemet, og slå på forkjølesystemet i henhold til produsentens instruksjoner. Følg instruksjonene på systemet, og sett til å fylle 20 ml / pose med totalt 20 poser per batch. Forsegl og koble disse posene fra settet, og følg standard kryopreserveringsprosedyrer. Bruk kryolagringsposer.
  5. Sveis et nytt sett med 20 kryopreserveringsposer til forbrukssettet for engangsfylling og -finish, og gjenta fyllings- og avslutningsprosedyren til alle cellene er aliquoted. Følg standard prosedyrer for å kryokonservere disse cellene.

5. Karakterisering av cellekvaliteten

  1. Ta prøver av høstede hMSCer fra de oppløselige mikrobærerne, og bruk et cellebehandlingssystem for karakterisering ved flowcytometri for bestemmelse av celleidentitet etter metodene beskrevet i litteratur18.
  2. Tine de kryopreserverte cellene, og relatere på konvensjonelle 2D-kolber eller mikroplater for ytterligere karakterisering av cellefunksjonene, inkludert cellemorfologi og tri-lineage differensieringsevne, etter metoder beskrevet i litteratur18.

6. HEK293T utvidelse på G02-mikrobærere i bioreaktoren med omrørt tank

  1. Forbered en 5 l bioreaktor som nevnt i trinn 2. For HEK293T celler, dyrk cellene med sterile G02 mikrobærere i stedet for W01. Kulturprosessen ligner på i protokollseksjon 3, selv om noen parametere er forskjellige, som vil bli beskrevet i de følgende trinnene. Monter et spesielt perfusjonsrør i bioreaktoren til erstatning for blødningsrøret, da perfusjon er nødvendig for kulturen av HEK293T celler.
  2. Forskjellig fra protokollen beskrevet i protokollseksjon 3, lag 20 g G02-mikrobærere (dvs. to flasker) i DMEM med 10% FBS for 5 L bioreaktoren, med dag 0-kulturvolumet satt til 3,5 L (dvs. en endelig konsentrasjon på ca. 5,71 g / l). Dispenser 2 l medium inn i beholderen før de to flaskene med G02 mikrobærere, og inokuler 500 ml 1,75 x 109 HEK293T celler (dvs. ved en endelig tetthet på 5 x 105 celler / ml).
  3. Utfør et agitasjonsregime og middels utvekslingsregime (basert på mengden medium som kreves utvekslet per dag, uttrykt som kulturvolum per dag, CVD), som er forskjellig fra protokollseksjon 3 og er detaljert i tabell 4.
    MERK: Aktiver pumpe 1 og pumpe 2 manuelt slik at begge kan pumpe kontinuerlig for at perfusjon skal skje. Juster pumpehastigheten hver dag for å oppfylle perfusjonshastigheten basert på kalibreringen av pumpens volumpåføringshastighet. Vanligvis vil dette være i det ensifrede området. For HEK293T celler, bruk ferskt medium som fôr, og kast brukt medium helt inn i en avfallsflaske, i motsetning til med hMSCs, hvor mediet sirkuleres.
  4. For den andre tierutvidelsen til 15 L-bioreaktoren, bruk perle-til-perle-overføring av HEK293T-cellene i stedet for full oppløsning av mikrobærerne som brukt med hMSCs. Stopp spesielt omrøringen for å sedimentere mikrobærerne etter at ønsket celletetthet er nådd, og aspirer deretter så mye supernatant som mulig ut av perfusjonsrøret, mate PBS med 3 ganger volumet av gjenværende suspensjon for å vaske mikrobærerne, og gjenta tre ganger. Aspirer og kast så mye PBS som mulig i sluttvasken.
  5. Fôr inn 3,5 l 1x rekombinant trypsin for å løsne cellene fra mikrobærerne mens G02-mikrobærerne forblir intakte. Sett temperaturen til 37 °C og omrøringshastigheten til 60 o / min. Avslutt løsningen innen 45 minutter, når mer enn 80% av cellene har løsnet, med like mye komplett medium.
  6. Overføring direkte fra høstehavnen til et forberedt 15 L fartøy for utvidelse på andre nivå.

7. Verocelleutvidelse på V01-mikrobærere i bioreaktoren under omrøring

  1. Forbered V01-mikrobærere ved å overføre de lyofiliserte mikrobærerne til bioreaktorbeholderen sammen med PBS til en konsentrasjon på 20 mg / ml. Monter og steriliser fartøyet som nevnt i protokoll § 2, men autoklav i 30 min i stedet.
  2. Etter sterilisering slår V01 mikrobærere seg naturlig ned. Bytt supernatanten med basisk DMEM to ganger ved hjelp av blødnings- og materørene, og tilsett hele DMEM som inneholder 10% NBS til 50% -75% av volumet av fartøyet før du går videre til protokollseksjon 3 for celleinokulasjon og kultur.
  3. Forskjellig fra protokollen beskrevet i protokollseksjon 3, bruk 24 g V01-mikrobærere for en 4 L-kultur av Vero-celler (dvs. en endelig konsentrasjon på 6 g / L), og inokuler 500 ml 4 x 109 Vero-celler (dvs. ved en endelig tetthet på 1 x 106 celler / ml).
  4. Følg trinn 6.3-6.6 for kulturprosessparametrene og overgang til andre tier-ekspansjon i 15 L omrørt tankbioreaktor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ACISCP-plattformen er et helt lukket system som benytter en serie bioreaktorer under omrøring for oppskaleringsutvidelse, et cellebehandlingssystem for automatisert cellehøsting og formulering, og et cellefyllingssystem (figur 1). Adherente celler fester seg til de porøse mikrobærerne, som kan dispergeres i bioreaktoren, og dermed oppnå suspendert dyrking av adherente celler.

Etter protokollen som beskrevet ble 2,5 x 108 hMSC med 10 g W01 mikrobærere først inokulert i en 5 L omrørt tankbioreaktor for en første utvidelse. Rundt 2,9 x 10 9 celler ble konsentrert og vasket av cellebehandlingssystemet på dag 4, hvorav 1,0 x 109 høstede celler ble sendt til 15 L omrørt tankbioreaktor med 40 g W01 mikrobærere for den andre fasen av dyrking. Til slutt ble 1,1 x 10 10 MSC høstet, formulert og alisert i over70 formuleringsposer på dag 9 (figur 2A). Celletall, levedyktighet og glukoseforbruk ble overvåket daglig (figur 2B,C). En kumulativ 128-fold utvidelse ble oppnådd; I mellomtiden ble cellens levedyktighet holdt høyere enn 90%. Inntaket av glukose viste en negativ korrelasjon med celleutvidelse, og viste metabolisme assosiert med sunn cellevekst.

De oppløselige porøse mikrobærerne kan steriliseres på forhånd og leveres i en lukket systememballasje til engangsbruk, egnet for GMP (figur 3A). Cellene kunne feste seg til overflaten av mikrobærerne og makroporenes indre vegg (figur 3B). Ved å bruke et fluorescerende fargestoff, for eksempel Calcein-AM / PI Cell Double Staining Kit, kunne cellene inne i de porøse mikrosfærene visualiseres (figur 3C). Sammenslåing av lysfeltbilder med fluorescerende bilder bidro til å analysere ensartetheten i cellefordelingen. Fargeleggingen av levende celler viste også en sterk sammenheng med celletelling målt ved enten manuell prøvetaking eller den nettbaserte tellesonden for levende celler.

I tillegg til den enorme etterspørselen etter høye cellemengder, er vurderinger av kritisk kvalitetsattributt (CQA) og frigjøringstester av MSC uunnværlig, for uten disse kunne celler ikke steriliseres eller renses omfattende etter dyrking. For å sikre cellekvaliteten kan 3D-utvidede MSC-er prøves i hvert trinn av ACISCP-plattformen. MSC-er som nylig høstet fra ACISCP-plattformen beholdt klassiske fenotypiske markører22, med et uttrykk på henholdsvis >95 % og <2 % for de positive markørene (CD73, CD90, CD105) og negative markører (HLA-DR, CD34, CD45, CD19, CD14) (figur 4A). De kryopreserverte cellene ble tint og inokulert til en 2D-plan kolbe og viste god adhesjonsevne, normal ekspansjonsoppførsel (figur 4B) og en typisk spindelform med spiralvekst (figur 4C). Videre opprettholdt cellene også sin evne til å differensiere i osteogene, adipogene og kondrogene linjer (figur 4D).

Videre ble HEK293T celler og Vero-celler testet i ACISCP-plattformen også. For HEK293T cellekultur var inokulumcellekonsentrasjonen 5 x 105 celler/ml i 5 L-bioreaktoren. Etter perle-til-perle-overføringsprosessen nådde toppcellekonsentrasjonen 1,68 x 107 celler / ml i 15 L bioreaktoren (figur 5A), og de HEK293T cellene opprettholdt høy levedyktighet (figur 5B). For Vero-cellekulturen var inokulumcellekonsentrasjonen 2 x 105 celler/ml i 5 L-bioreaktoren. Etter perle-til-perle-overføringsprosessen var maksimal cellekonsentrasjon oppnådd 1,08 x 107 celler / ml i 15 L bioreaktoren (figur 6A), og Vero-cellene opprettholdt også høy levedyktighet (figur 6B).

Figure 1
Figur 1: Skjematisk veikart for hMSC-produksjon via ACISCP-plattformen. Denne figuren er modifisert fra publisert litteratur18. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Celleutvidelse av hMSC via ACISCP-plattformen. (A) ACISCP-plattformen består av en serie bioreaktorer under omrøring, et cellebehandlingssystem og et cellefyllingssystem. (B) Vekstkurve for hMSC i den todelte ekspansjonsprosessen, (C) og glukoseforbrukshastigheten under prosessen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Karakterisering av hMSC-vekst på W01-mikrobæreren. Denne figuren er modifisert fra publisert litteratur18. (A) W01 mikrobærere fremstilles med engangsemballasje for lukkede systemer. (B) Skanning elektronmikroskopbilder av tomme mikrobærere og mikrobærere dyrket med tilhørende hMSCs. De hvite trekantede hodene indikerer celler på overflaten av mikrobærere; skala bar = 100 μm. (C) Representative sammenslåtte lysfelt og fluorescens (levende cellefarging) bilder av hMSCer dyrket på mikrobærere fra dag 1 til dag 4; skala bar = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Celleidentitetsvurdering av hMSC høstet fra ACISCP-plattformen . (A) Overflatemarkørene til hMSC var karakterisert ved flowcytometri. Alle de positive markørene (>95 %) og negative markørene (<2 %) oppfylte kriteriene. (B) Kryopreserverte 3D-utvidede hMSC-er viste normal ekspansjonsoppførsel etter tining og re-plating til 2D-kolber. (C) Morfologi av de 3D-utvidede hMSC-ene; skala bar = 50 μm. (D) Tri-lineage differensiering av 3D-utvidede hMSCs. Osteogene, adipogene og kondrogene evner ble vurdert av henholdsvis Alizarin Red, Oil Red og Alcian Blue-farging. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Celleutvidelse av HEK293T celler via ACISCP-plattformen. (A) HEK293T celletetthet i 5 L og 15 L bioreaktorer. (B) Bright-field (BF) bilde, Calcein-AM-farget (Live) og PI-farget (død) HEK293T celler dyrket på G02 mikrobærere; skala bar = 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Celleutvidelse av Vero-celler via ACISCP-plattformen . (A) Vero-celletetthet i 5 L og 15 L bioreaktorer. (B) Bright-field (BF) bilde, Calcein-AM-farget (Live) og PI-farget (Dead) Vero celler dyrket på V01 mikrobærere; skala bar = 400 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tabell 1: Parameterinnstillinger for bioreaktoren under omrøring. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 2: Parameterinnstillinger for automatisert mediumutveksling for hMSC-dyrking. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 3: Parameterinnstillinger for cellebehandlingssystemet for hMSC-passasje og formulering. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 4: Middels utvekslingsregime og agitasjonsregime for HEK293T- og Vero-celler. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Både immunterapi og stamcelleterapi bruker levende celler som legemidler; Imidlertid bør deres sluttprodukter ikke renses eller steriliseres på samme måte som små molekyler eller virus. Derfor bør prinsippet om Quality by Design (QbD) alltid holdes i tankene og praktisk anvendes på Chemical Manufacturing and Control (CMC) -prosessen under celleproduksjon23. Et helt lukket cellekultursystem, samt et prosesseringssystem og et fyllesystem, vurderes fortrinnsvis for å oppfylle kravene. I denne studien har vi presentert en protokoll for bruk av en ACISCP-plattform basert på GMP-grade, oppløselige og porøse 3D-mikrobærere for å utføre en todelt utvidelse av hMSCs. Noen forskere har undersøkt muligheten for å bruke bioreaktorer sammen med mikrobærere for å utvide hMSC in vitro, men flertallet av rapporterte studier har vist at en økning i skala vil føre til en reduksjon i hMSC-utbyttet, fra 6,1 x 10 5 celler / ml eller til og med 12,5 x 10 5 celler / ml i 100 ml arbeidsvolum til 2,7 x 105 celler / ml i 2 liter arbeidsvolum 24, 25,26. Selv om bioreaktorer med omrørt tank utviser den høyeste skalerbarheten, bør nøkkelspørsmål som fartøyets strukturelle egenskaper, løpehjulstypen, spisshastigheten, den volumetriske masseoverføringskoeffisienten, kLa, oksygen og effektnummeret, vurderes grundig24. Forskjellig fra tidligere bioreaktorer med omrøringstank, som vanligvis ble designet for dyrking av mikrober eller domestiserte forankringsuavhengige celler som CHO-celler, ble bioreaktoren som ble brukt i denne studien spesielt utviklet for mikrobærerbasert kultur og er dermed i stand til å tilfredsstille de forskjellige prosessbehovene til næringsutvekslingsstrategier. I tillegg til forskjeller i prosessen med celledyrking, benytter ACISCP-plattformen et kontinuerlig strømningssentrifugebasert cellebehandlingssystem sammen med et cellefyllingssystem, i motsetning til konvensjonelle høstingsprosedyrer for å produsere store mengder celler utført ved gjentatt manuelt arbeid, og garanterer dermed en høy håndteringseffektivitet. Avanserte automatiserte enheter har et høyt utbytte i en-batch produksjon.

De fleste stamceller er forankringsavhengige; Dermed krever de mikrobærere for celleproduksjon. Konvensjonelt ble tidligere kommersielle mikrobærere formulert for å utnytte forskjellige overflateegenskaper, og dermed oppnå forskjellige celleutvidelsesfoldetall. I tidligere forskning ga bruk av Cytodex type 1 mikrobærere for svinebenmarg MSC en celletetthet på ca. 4 x 10 5 celler / ml, mens bruken av gelatinbelagt Cytodex type 3 produserte sammenlignbare celletall (3,8 x 105 celler / ml) til humane placenta MSCer27. Likevel er Cytodex type 1 og type 3 ikke-oppløselige, og dermed påvirker trypsiniseringsprosessen under cellehøsting ikke bare celleutvinningsutbyttet, men også levedyktigheten og kvaliteten. Derfor er det ingen vellykkede tilfeller av bruk av konvensjonelle mikrobærere for CGT-produkter, hvor celler som sluttprodukter ikke kan gjennomgå omfattende nedstrøms renseprosesser for å eliminere forurensning av ikke-oppløselige mikrobærere28. Derimot er W01-mikrobærere fullt oppløselige, noe som betyr at celleproduktene lett kan høstes ved nedbrytning av mikrobæreren. Dette mikrobærerproduktet kommer også i helt lukket systememballasje, noe som betyr at en driftsprosess som er kompatibel med GMP, enkelt kan oppnås. Vi har vist at passering med en todelt ekspansjonsprosess lett kan oppnås med W01 mikrobærere, og så høyt som 1,1 x10 10 totale celler kan høstes i en enkelt batch; Dette kunne faktisk bare oppnås i 50 L bioreaktorer i tidligere rapporter29,30. I dette arbeidet nådde den maksimale celletettheten inne i bioreaktoren ved omrøringstanken ca. 11,6 x 105 celler/ml før høsting. Dermed kunne det forventes at man lett kunne oppnå 1 x 1011 celler per batch med en 100-200 L bioreaktor i ACISCP-plattformen, noe som ville bety at tusen batcher per år lett kunne møte etterspørselen etter 300 billioner hMSC hvert år.

Siden celler har varierte egenskaper, produseres forskjellige typer 3D-mikrobærere og er tilgjengelige for å teste kompatibiliteten mellom en bestemt celle og en mikrobærer. For ikke-cellede sluttprodukter i CGT er mikrobærerbaserte scale-ups for HEK293T celler og Vero-celler i bioreaktorer rapportert å nå henholdsvis 1,5 x 106 celler / ml og 3,3 x 106 celler / ml31. Vi brukte oppløselige porøse mikrobærere, G02 og V01, i ACISCP-plattformen for å utvide henholdsvis HEK293T celler og Vero-celler, og toppcelletettheten til begge cellene nådde over 1 x 107 celler / ml. Videre kan nedbrytbarheten av 3D-mikrobærere være gunstig for produksjon av biologiske produkter av intracellulære virus, da cellene lett kan separeres fra mikrobærerne. ACISCP-plattformen representerer en etablert ny bioproduksjonsprosess som oppfyller både kvantitets- og kvalitetskravene for celle- og genterapiprodukter. Vi forventer at vår storskala celleproduksjonsplattform vil fungere som et viktig verktøy for å muliggjøre utvikling av celle- og genterapier.

Til tross for fordelene med plattformen diskutert ovenfor, gjenstår flere begrensninger å omgå i fremtiden. For det første er bioreaktorene som brukes i ACISCP-plattformen i dagens form, fortsatt utstyrt med glasstanker, som krever kompliserte vaskeprosedyrer og rengjøringsverifisering for å oppfylle kriteriene for GMP. Et engangs omrørt bioreaktorsystem kan potensielt brukes i fremtiden for å produsere et intakt sett med engangsforbrukssett. For det andre, forskjellig fra domestiserte cellelinjer, er hMSC primære cellestammer isolert fra individuelle donorer og variert vev, noe som betyr at hMSCs utviser heterogenitet. Derfor fungerer protokollen beskrevet i denne artikkelen som referanse, mens systematisk prosessutvikling er nødvendig for å oppnå den tekniske migreringen av ACISCP-plattformen. For det tredje, selv om våre medarbeidere foreløpig har testet muligheten for å produsere vaccinia-viruset med Vero-celler32, gjenstår det å bli ytterligere validert om god ytelse for virusproduksjon i 3D-utvidelsen av HEK293T celler. Avslutningsvis gir ACISCP-plattformens storskala celleproduksjonsmetode, basert på oppløselige porøse mikrobærere og en serie automatiserte lukkede systemer, en mulighet til å forbedre produksjonseffektiviteten og forbedre kvalitetskontrollen i industriell skala for produksjon av CGT-produkter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

YD er en vitenskapelig rådgiver, og H.X., Y.Z., L.G., M.L., Y.Y., W.L. og X.Y. er ansatte i Beijing CytoNiche Biotechnology Co. Ltd. De andre forfatterne har ingen kommersielle, proprietære eller økonomiske interesser i produktene eller selskapene som er beskrevet i denne artikkelen. Alle andre forfattere erklærer at de ikke har noen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet økonomisk av National Science Foundation for Distinguished Young Scholars (82125018).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% trypsin EDTA BasalMedia S310JV Used for 2D cell harvest.
3D FloTrix Digest CytoNiche Biotech R001-500 This is a reagent that specifically dissolves 3D TableTrix microcarriers.
3D FloTrix MSC Serum Free Medium CytoNiche Biotech RMZ112 This is a serum-free,animal-free medium for mesenchymal stem cell expansion and maintenance in 2D planar culture as well as 3D culture on 3D TableTrix microcarriers.
3D FloTrix Single-Use Filtration Module CytoNiche Biotech R020-00-10 This module contains 0.22 μm capsule filters used for filtration of culture medium and digest solution.
3D FloTrix Single-Use Storage Bag (10 L) CytoNiche Biotech R020-00-03 Used as feed bag for 5 L bioreactor.
3D FloTrix Single-Use Storage Bag (3 L) CytoNiche Biotech R020-00-01 Used as cell seeding or transfer bags.
3D FloTrix Single-Use Storage Bag (50 L) CytoNiche Biotech R020-00-04 Used as feed bag for 15 L bioreactor.
3D FloTrix vivaPACK Disposable Fill&Finish Consumable Kit CytoNiche Biotech PACK-01-01 This is a standard kit adapted to 3D vivaPACK fill and finish system.
3D FloTrix vivaPACK fill and finish system for cells CytoNiche Biotech vivaPACK This system is a closed liquid handling device, with automated mixing and gas exhausting functions. Cells resuspended in cryopreservation buffer can be rapidly and evenly aliquoted into 20 bags per batch.
3D FloTrix vivaPREP PLUS cell processing system CytoNiche Biotech vivaPREP PLUS This system is a continuous flow centrifuge-based device.Cells can be concentrated, washed, and resuspended under completely closed procedures.
3D FloTrix vivaPREP PLUS Disposable Cell Processing Kit CytoNiche Biotech PREP-PLUS-00 This is a standard kit adapted to 3D vivaPREP PLUS cell processing.
3D FloTrix vivaSPIN  bioreactor 15 L CytoNiche Biotech FTVS15 This bioreactor product employs a controller, a 15 L glass stirred-tank vessel, and assessories. A special perfusion tube is available.
3D FloTrix vivaSPIN  bioreactor 5 L CytoNiche Biotech FTVS05 This bioreactor product employs a controller, a 5 L glass stirred-tank vessel, and assessories.A special perfusion tube is available.
3D FloTrix vivaSPIN Closed System Consumable Pack (10/15 L) CytoNiche Biotech R020-10-10 This is a standard tubing kit adapted to 3D vivaSPIN bioreactor 15 L, containing sampling bags.
3D FloTrix vivaSPIN Closed System Consumable Pack (2/5 L) CytoNiche Biotech R020-05-10 This is a standard tubing kit adapted to 3D vivaSPIN bioreactor 5 L, containing sampling bags.
3D TableTrix microcarriers G02 CytoNiche Biotech G02-10-10g These porous and degradable microcarriers are suitable for HEK293T cell culture. They come pre-sterilized in 10g/bottle with C-Flex tubings for welding to tubes on bioreactors.
3D TableTrix microcarriers V01 CytoNiche Biotech V01-100-10g These porous and degradable microcarriers are suitable for adherent cell culture, they come as non-sterilized microcarriers that need to be autoclaved in PBS before use. They are especially suitable for vaccine production.
3D TableTrix microcarriers W01 CytoNiche Biotech W01-10-10g (single-use packaging);
W01-200 (tablets)		 These porous and degradable microcarriers are suitable for adherent cell culture, especially for cells that need to be harvested as end products. They come pre-sterilized in 10g/bottle with C-Flex tubings for welding to tubes on bioreactors.The product has obtained 2 qualifications for pharmaceutical excipients from CDE, with the registration numbers of [F20200000496; F20210000003]. It has also received DMF qualification for pharmaceutical excipients from FDA, with the registration number of [DMF:35481]
APC anti-human CD45 Antibody BioLegend 368512 Used in flow cytometry for MSC identity assessment
Calcein-AM/PI Double Staining Kit Dojindo C542 Calcein-AM/PI Double Staining Kit is utilized for simultaneous fluorescence staining of viable and dead cells. This kit contains Calcein-AM and Propidium Iodide (PI) solutions, which stain viable and dead cells, respectively.
Cap for EZ Top Container Closures for NALGENE-containers (500mL) Saint-Gobain CAP-38 Brands and catalogue numbers are only for example, similar products are available from various suppliers and as long as they have the same functionality, items could be substituted with other brands.
C-Flex Tubing, Formulation 374 (0.25 in x 0.44 in) Saint-Gobain 374-250-3 Used for tube welding and disconnection.
CryoMACS Freezing Bag 50 Miltenyi Biotec  200-074-400 Used for expanding the 3D FloTrix vivaPACK Disposable Fill&Finish Consumable Kit.
Dimethyl Sulfate (DMSO)  Sigma D2650-100mL Used for preparation of cryopreservation solution.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) BasalMedia L120KJ Used for cultivation of HEK293T and Vero cells.
DURAN Original GL 45 Laboratory bottle (2 L) DWK life sciences 218016357 Used for waste collection from the 5 L bioreactor.
DURAN Original GL 45 Laboratory bottle (5 L) DWK life sciences 218017353 Used for waste collection from the 15 L bioreactor.
DURAN Original GL 45 Laboratory bottle (500 mL) DWK life sciences 218014459 Used for supplementary bottle of 0.1 M NaOH.
EZ Top Container Closures for NALGENE-containers (500mL) Saint-Gobain EZ500 ML-38-2 Brands and catalogue numbers are only for example, similar products are available from various suppliers and as long as they have the same functionality, items could be substituted with other brands.
Fetal bovine serum (FBS) superior quality Wisent 086-150 Used for cultivation of HEK293T cells.
FITC anti-human CD14 Antibody BioLegend 301804 Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
FITC anti-human CD34 Antibody BioLegend 343504 Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
FITC anti-human CD90 (Thy1) Antibody BioLegend 328108 Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
Flow cytometry Beckman Coulter CytoFLEX Used for cell identity assessment.
Fluorescence Cell Analyzer Alit life science Countstar Rigel S2 Used for cell counting. Cell viability can be calculated by staining with AO/PI dyes.
GL 45 Multiport Connector Screw Cap with 2 ports  DWK life sciences 292632806 Brands and catalogue numbers are only for example, similar products are available from various suppliers and as long as they have the same functionality, items could be substituted with other brands.
Glucose Meter Sinocare 6243578 Used for detecting glucose concentration in cell culture medium and supernatant.
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), with calcium and magnesium Gibco 14025092 Used for preparation of digest solution.
Human Albumin 20% Behring (HSA) CSL Behring N/A Used for preparation of wash buffer.
Inverted fluorescent microscope OLYMBUS CKX53SF Used for brifgt field and fluorescent observation and imaging.
Nalgene Measuring Cylinder (500 mL) Thermo Scientific 3662-0500PK Used for calibrating the liquid handling volume speed of peristaltic pumps.
Newborn calf serum (NBS) superfine MINHAI BIO SC101.02 Used for cultivation of Vero cells.
OriCell human mesenchymal stem cell adipogenic differentiation and characterization kit Cyagen HUXUC-90031 Used for tri-lineage differentiation of hUCMSCs.
OriCell human mesenchymal stem cell chondrogenic differentiation and characterization kit Cyagen HUXUC-90041 Used for tri-lineage differentiation of hUCMSCs.
OriCell human mesenchymal stem cell osteogenic differentiation and characterization kit Cyagen HUXUC-90021 Used for tri-lineage differentiation of hUCMSCs.
PE anti-human CD105 Antibody BioLegend 800504 Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
PE anti-human CD19 Antibody BioLegend 302208 Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
PE anti-human CD73 (Ecto-5'-nucleotidase) Antibody BioLegend 344004 Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
PE anti-human HLA-DR Antibody BioLegend 307605 Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
Phosphate Buffered Saline (PBS) Wisent 311-010-CL Used in autoclaving of glass vessel and V01 microcarriers, and replacement of culture medium.
Sani-Tech Platinum Cured Sanitary Silicone Tubing (0.13 in x 0.25 in) Saint-Gobain ULTRA-C-125-2F Used for solution transfering driven by peristaltic pumps.
Sterile Saline Hopebiol HBPP008-500 Used for preparation of wash buffer.
Trypzyme Recombinant Trypsin BasalMedia S342JV This reagent is used for bead-to-bead transfer of HEK293T and Vero cells.
Tube Sealer Yingqi Biotech Tube Sealer I This sealer is compatible with both C-Flex tubing and PVC tubing.
Tube Welder for PVC tubing Chu Biotech Tube Welder Micro I Used for welding of PVC tubing.
Tube Welder for TPE tubing Yingqi Biotech Tube Welder I-V2 Used for welding of TPE tubing.
ViaStain AO / PI Viability Stains Nexcelom CS2-0106-25mL Dual-Fluorescence Viability, using acridine orange (AO) and propidium iodide (PI), is the recommended method for accurate viability analysis of primary cells, such as PBMCs, and stem cells in samples containing debris.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Golchin, A., Farahany, T. Z. Biological products: Cellular therapy and FDA approved products. Stem Cell Reviews and Reports. 15 (2), 166-175 (2019).
  2. Young, C. M., Quinn, C., Trusheim, M. R. Durable cell and gene therapy potential patient and financial impact: US projections of product approvals, patients treated, and product revenues. Drug Discovery Today. 27 (1), 17-30 (2022).
  3. Elverum, K., Whitman, M. Delivering cellular and gene therapies to patients: solutions for realizing the potential of the next generation of medicine. Gene Therapy. 27 (12), 537-544 (2020).
  4. Blache, U., Popp, G., Dünkel, A., Koehl, U., Fricke, S. Potential solutions for manufacture of CAR T cells in cancer immunotherapy. Nature Communications. 13 (1), 5225 (2022).
  5. Lee, B., et al. Cell culture process scale-up challenges for commercial-scale manufacturing of allogeneic pluripotent stem cell products. Bioengineering. 9 (3), 92 (2022).
  6. Emerson, J., Glassey, J. Bioprocess monitoring and control: Challenges in cell and gene therapy. Current Opinion in Chemical Engineering. 34, 100722 (2021).
  7. Robb, K. P., Fitzgerald, J. C., Barry, F., Viswanathan, S. Mesenchymal stromal cell therapy: progress in manufacturing and assessments of potency. Cytotherapy. 21 (3), 289-306 (2019).
  8. Olsen, T. R., Ng, K. S., Lock, L. T., Ahsan, T., Rowley, J. A. Peak MSC-Are we there yet. Frontiers in Medicine. 5, 178 (2018).
  9. Roots Analysis. Stem Cell Therapy Contract Manufacturing (CMO) Market, 2019 - 2030. , Available from: https://www.rootsanalysis.com/reports/view_document/stem-cell-therapy-contract-manufacturing-market-2019-2030/271.html (2019).
  10. Elseberg, C. L., et al. Microcarrier-based expansion process for hMSCs with high vitality and undifferentiated characteristics. The International Journal of Artificial Organs. 35 (2), 93-107 (2012).
  11. de Soure, A. M., Fernandes-Platzgummer, A., Silva, da, L, C., Cabral, J. M. Scalable microcarrier-based manufacturing of mesenchymal stem/stromal cells. Journal of Biotechnology. 236, 88-109 (2016).
  12. Rafiq, Q. A., Coopman, K., Nienow, A. W., Hewitt, C. J. Systematic microcarrier screening and agitated culture conditions improves human mesenchymal stem cell yield in bioreactors. Biotechnology Journal. 11 (4), 473-486 (2016).
  13. Tavassoli, H., et al. Large-scale production of stem cells utilizing microcarriers: A biomaterials engineering perspective from academic research to commercialized products. Biomaterials. 181, 333-346 (2018).
  14. Mizukami, A., et al. Technologies for large-scale umbilical cord-derived MSC expansion: Experimental performance and cost of goods analysis. Biochemical Engineering Journal. 135, 36-48 (2018).
  15. Yan, X., et al. Dispersible and dissolvable porous microcarrier tablets enable efficient large-scale human mesenchymal stem cell expansion. Tissue Engineering. Part C, Methods. 26 (5), 263-275 (2020).
  16. Carletti, E., Motta, A., Migliaresi, C. Scaffolds for tissue engineering and 3D cell culture. 3D Cell Culture: Methods and Protocols. Haycock, J. W. , Humana Press. Totowa, NJ. 17-39 (2011).
  17. Loh, Q. L., Choong, C. Three-dimensional scaffolds for tissue engineering applications: Role of porosity and pore size. Tissue Engineering. Part B Reviews. 19 (6), 485-502 (2013).
  18. Zhang, Y., et al. GMP-grade microcarrier and automated closed industrial scale cell production platform for culture of MSCs. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 16 (10), 934-944 (2022).
  19. NMPA. Pharmaceutical Excipient Registration Database: Microcarrier tablets for cells. Center for Drug Evaluation. , Available from: https://www.cde.org.cn/main/xxgk/listpage/ba7aed094c29ae314670a3563a716e (2023).
  20. List of Drug Master Files (DMFs). US Food and Drug Administration. , Available from: https://www.fda.gov/drug-mater-files-dmfs/list-drug-master-files-dmfs (2023).
  21. Beeravolu, N., et al. Isolation and characterization of mesenchymal stromal cells from human umbilical cord and fetal placenta. Journal of Visualized Experiments. (122), e55224 (2017).
  22. Xie, Y., et al. The quality evaluation system establishment of mesenchymal stromal cells for cell-based therapy products. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 176 (2020).
  23. Maillot, C., Sion, C., De Isla, N., Toye, D., Olmos, E. Quality by design to define critical process parameters for mesenchymal stem cell expansion. Biotechnology Advances. 50, 107765 (2021).
  24. Silva Couto, P., et al. Expansion of human mesenchymal stem/stromal cells (hMSCs) in bioreactors using microcarriers: Lessons learnt and what the future holds. Biotechnology Advances. 45, 107636 (2020).
  25. Chen, S., et al. Facile bead-to-bead cell-transfer method for serial subculture and large-scale expansion of human mesenchymal stem cells in bioreactors. Stem Cells Translational Medicine. 10 (9), 1329-1342 (2021).
  26. Tsai, A. C., Pacak, C. A. Bioprocessing of human mesenchymal stem cells: From planar culture to microcarrier-based bioreactors. Bioengineering. 8 (7), 96 (2021).
  27. Hewitt, C. J., et al. Expansion of human mesenchymal stem cells on microcarriers. Biotechnology Letters. 33 (11), 2325-2335 (2011).
  28. Mawji, I., Roberts, E. L., Dang, T., Abraham, B., Kallos, M. S. Challenges and opportunities in downstream separation processes for mesenchymal stromal cells cultured in microcarrier-based stirred suspension bioreactors. Biotechnology and Bioengineering. 119 (11), 3062-3078 (2022).
  29. Schirmaier, C., et al. Scale-up of adipose tissue-derived mesenchymal stem cell production in stirred single-use bioreactors under low-serum conditions. Engineering in Life Sciences. 14 (3), 292-303 (2014).
  30. Lawson, T., et al. Process development for expansion of human mesenchymal stromal cells in a 50L single-use stirred tank bioreactor. Biochemical Engineering Journal. 120, 49-62 (2017).
  31. Yang, J., et al. Large-scale microcarrier culture of HEK293T cells and Vero cells in single-use bioreactors. AMB Express. 9 (1), 70 (2019).
  32. Fang, Z., et al. Development of scalable vaccinia virus-based vector production process using dissolvable porous microcarriers. 25th Annual Meeting of the American Society of Gene & Cell Therapy. Molecular Therapy. 30, 195-196 (2022).

Tags

Storskala celleproduksjon GMP-klasse oppløselige porøse mikrobærere celle- og genterapi 3D-kultur adherente celler HMSC-er HEK293T celler Vero-celler todimensjonale plane dyrkingssystem ACISCP-plattform røretankbioreaktorer ekspansjon høsting cellebehandlingssystem cellefyllingssystem kvalitetsvurdering bioprosessteknikk
Storskala celleproduksjon basert på GMP-grade oppløselige porøse mikrobærere
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, Y., Xu, H., Zhang, Y., Guo,… More

Chen, Y., Xu, H., Zhang, Y., Guo, L., Lan, M., Yang, Y., Liu, W., Yan, X., Du, Y. Large-Scale Cell Production Based on GMP-Grade Dissolvable Porous Microcarriers. J. Vis. Exp. (197), e65469, doi:10.3791/65469 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter