Summary
여기에서는 GMP 등급의 용해성 마이크로캐리어를 기반으로 하는 완전 폐쇄형 시스템을 통해 부착 세포의 대규모 제조를 달성하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 인간 중간엽 줄기 세포, HEK293T 세포 및 Vero 세포의 배양은 검증되었으며 세포 및 유전자 치료 산업의 수량 요구와 품질 기준을 모두 충족했습니다.
Abstract
세포 및 유전자 치료(CGT) 산업의 연구자들은 세포의 효율적이고 대규모적인 확장이라는 만만치 않은 과제에 오랫동안 직면해 왔습니다. 2차원(2D) 평면 배양 시스템의 주요 단점을 해결하기 위해 인간 중간엽 줄기/기질 세포(hMSC), HEK293T 세포 및 Vero 세포를 포함한 부착 세포의 3D 배양을 위한 GMP 등급의 용해성 다공성 마이크로캐리어를 기반으로 하는 자동 폐쇄형 산업 규모 세포 생산(ACISCP) 플랫폼을 혁신적으로 개발했습니다. 대규모 확장을 달성하기 위해 5L 및 15L 교반 탱크 바이오리액터로 2단계 확장을 수행하여 9일 이내에 전체 128배 팽창으로 1.1 x 1010 hMSC를 생산했습니다. 세포는 마이크로캐리어를 완전히 용해시켜 수거하고, 농축하고, 세척하고, 연속 흐름 원심분리기 기반 세포 처리 시스템으로 제형화한 다음, 세포 충전 시스템으로 분주하였다. 2D 평면 배양과 비교했을 때, 3D 배양에서 채취한 hMSC의 품질에는 큰 차이가 없습니다. 우리는 또한 이러한 용해성 다공성 마이크로캐리어를 CGT 부문의 다른 인기 있는 세포 유형에도 적용했습니다. 구체적으로, HEK293T 세포 및 Vero 세포는 각각 1.68 x 10 7 cells/mL 및 1.08 x 107 cells/mL의 피크 세포 밀도로 배양되었습니다. 이 연구는 부착 세포의 산업 규모 제조를 달성하기 위해 GMP 등급 용해성 마이크로캐리어 및 고급 폐쇄 장비의 특성을 활용하는 바이오프로세스 엔지니어링 플랫폼을 사용하기 위한 프로토콜을 제공합니다.
Introduction
CGT 산업은 지난 20년 동안 기하급수적으로 확장되었습니다. 차세대 의약품의 발전은 수많은 난치성 질환을 치료하고 완치할 것으로 예상됩니다1. 2017년 미국 식품의약국(FDA)이 CGT 제품인 킴리아(Kymriah)를 최초로 승인한 이후, 전 세계적으로 CGT 관련 연구 개발은 빠른 속도로 계속 성장하고 있으며, FDA는 CGT에 대한 활발한 임상시험용 신약 신청이 2018년에 500건으로 증가했다고 밝혔다2. 2030년까지 미국에서 CGT 제품의 승인 건수는 54-74건이 될 것으로 예측되었다2.
CGT 연구 및 혁신의 급속한 성장은 흥미진진하지만, 저렴한 비용으로 필요한 만큼 많은 환자에게 도달할 수 있는 유망한 의약품을 제공할 수 있는 실험실 연구와 산업 규모 제조 사이에는 여전히 큰 기술 격차가 있습니다. 이러한 임상시험에 채택된 현재 공정은 소규모 실험을 위해 실험실에서 확립되었으며, CGT 제조를 개선하고 혁신하기 위해서는 상당한 노력이 필요하다3. CGT 제품에는 여러 유형이 있으며, 대부분은 동종 세포, 자가 세포, 엔지니어링 또는 천연 세포를 기반으로 합니다. 이러한 살아있는 약물은 저분자 개체나 생물학적 제제보다 훨씬 더 복잡하기 때문에 대규모 제조는 중요한 과제입니다 4,5,6. 이 연구에서는 CGT에 널리 적용되는 3개의 앵커리지 의존성 세포에 대한 대규모 세포 생산 프로토콜을 시연합니다. 여기에는 세포 기반 치료에 사용되어 온 인간 중간엽 줄기/기질 세포(hMSC)와 최종 치료 세포 산물의 유전 공학을 위한 바이러스 생산에 사용되는 HEK293T 세포 및 Vero 세포가 포함됩니다. 앵커리지 의존성 세포는 일반적으로 수동 처리가 필요한 평면 시스템에서 배양됩니다. 그러나 수동 배양 방법은 상당한 노동력이 필요하고 오염되기 쉬워 최종 제품의 품질을 저하시킬 수 있습니다. 또한 인라인 공정 제어가 없어 배치 간에 상당한 품질 변동이 발생합니다7. 줄기세포 치료제를 예로 들면, 200개 이상의 줄기세포 치료제 후보 물질로 구성된 유망한 파이프라인을 통해 임상 응용 분야의 수요를 충족하려면 연간 300조 개의 hMSC가 필요할 것으로 추정됩니다8. 따라서, 치료용 세포의 대규모 제조는 이러한 높은 세포 요구량으로 이러한 치료적 개입을 수행하기 위한 전제조건이 되었다9.
평면 시스템의 차질을 배제하기 위해, 종래의 비용해성 마이크로캐리어(10,11,12,13)를 사용하여 교반 탱크 바이오리액터에서 대규모 제조 공정을 개발하기 위한 노력이 이루어졌지만, 이들은 복잡한 준비 절차와 낮은 세포 수확 효율 14로 어려움을 겪고 있다 . 최근에, 우리는 줄기세포 확장을 위한 용해성 마이크로캐리어를 혁신하였는데, 이는 종래의 비용해성 상용 마이크로캐리어(15)로부터의 세포 수확의 문제를 회피하는 것을 목표로 한다. 이 새로운 상용 GMP 등급 3D 용해성 다공성 마이크로 캐리어인 3D TableTrix는 대규모 셀 생산에 대한 큰 잠재력을 보여주었습니다. 실제로, 이러한 다공성 마이크로캐리어를 기반으로 한 3D 배양은 세포 부착, 증식, 이동 및 활성화를 촉진하기 위해 유리한 생체 모방 미세환경을 잠재적으로 재현할 수 있습니다16. 마이크로캐리어의 다공성 구조 및 상호 연결된 공극 네트워크는 더 큰 세포 접착 영역을 생성하고 산소, 영양소 및 대사 산물의 교환을 촉진하여 시험관 내 세포 확장을 위한 최적의 기질을 생성할 수 있다17. 이러한 GMP 등급 3D 용해성 다공성 마이크로캐리어의 높은 다공성은 hMSC의 대규모 팽창을 가능하게 하고, 세포가 완전히 용해될 수 있는 능력은 이러한 팽창된 세포의 효율적인 수확을 가능하게 한다18. 또한 GMP 등급 제품이며 중국 약물 평가 센터(출원 번호: F20210000003 및 F20200000496)19 및 미국 FDA(FDA, USA; 약물 마스터 파일 번호: 35481)20.
여기에서, 우리는 hMSC, HEK293T 셀 및 Vero 셀 증식을 위해 이들 분산성 및 용해성 다공성 마이크로캐리어를 사용하는 자동화된 폐쇄형 산업 규모 셀 생산(ACISCP) 시스템(18)을 예시한다. 당사는 5L 바이오리액터에서 15L 바이오리액터로 hMSC의 2단계 확장(9일 동안 누적 128배 팽창)을 성공적으로 달성했으며, 최종적으로 단일 생산 배치에서 최대 1.1 x 1010 hMSC를 얻었습니다. 세포는 마이크로캐리어를 완전히 용해시켜 수거하고, 농축하고, 세척하고, 연속흐름 원심분리기 기반 세포 처리 시스템으로 제형화한 후, 세포 충전 시스템으로 분주하였다. 또한 hMSC 제품의 품질을 평가하여 규정 준수를 확인했습니다. 또한 CGT 산업에서 광범위하게 적용되는 두 가지 다른 유형의 앵커리지 셀인 HEK293T 셀과 Vero 셀의 스케일 업 생산을 위한 이러한 용해성 마이크로캐리어의 적용을 시연했습니다. HEK293T 세포의 피크 세포 밀도는 1.68 x 10 7 cells/mL에 도달한 반면, Vero 세포의 피크 밀도는 1.08 x 107 cells/mL에 도달했습니다. ACISCP 시스템은 다양한 부착 세포를 배양하는 데 적용할 수 있으며, CGT의 산업화를 가속화하는 데 기여하는 강력한 플랫폼이 될 수 있습니다.
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Protocol
인간 탯줄은 베이징 칭화 창겅 병원에서 입수했습니다. 인간 탯줄 중간엽 줄기세포(UCMSC)의 획득, 분리 및 배양에 관한 모든 절차와 프로토콜은 정보에 입각한 동의와 베이징 칭화창겅 병원 윤리 위원회(출원 번호 22035-4-02)의 승인을 받아 수행되었으며, 절차와 프로토콜은 1964년 헬싱키 선언 및 이후 개정안 또는 이에 상응하는 윤리 기준을 준수했습니다.
1. hMSC, HEK293T 세포 및 Vero 세포의 단층 배양
- 보고된 방법21에 따라 Wharton's jelly에서 1차 인간 UCMSC를 분리합니다. 일차 UCMSC의 분리 및 증식을 위해 무혈청(SF) hMSC 배양 배지를 사용하고, 통로 2에서 세포를 수확하고, 마스터 세포 은행(MCB)으로 냉동 보존합니다.
- 단층 배양을 위해 하나의 T75 플라스크에 6 x 105 개의 인간 UCMSC(바람직하게는 통로 2 또는 통로 3 세포)를 15mL의 완전한 SF hMSC 배양 배지로 접종합니다(즉, 2D 평면 용기의 파종 밀도는 8,000 cells/cm2). 플라스크의 8자 이동을 통해 균일한 파종을 보장합니다. 37°C에서 5%CO2 세포 배양 인큐베이터에서 80%-90% 밀도로 배양.
- 수확하려면 세포 배양 배지를 디캔팅하고 3-5mL의 인산염 완충 식염수(PBS)로 세포를 두 번 헹굽니다. 그런 다음 0.25% 트립신-EDTA 2mL를 첨가하고 4x 대물렌즈가 있는 명시야 도립 현미경으로 관찰한 후 대부분의 세포가 둥글게 되어 플라스크에서 분리될 때까지 37°C에서 1-2분 동안 배양합니다. 분해를 종료하기 위해 3mL의 SF hMSC 배양 배지를 추가합니다.
- 세포 현탁액을 15mL 원뿔형 원심분리 튜브로 옮기고 179 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 디캔팅하고, PBS로 세포 펠릿을 두 번 헹구고, 약 3-5mL의 SF hMSC 배양 배지에 재현탁하여 바이오리액터의 마이크로캐리어에 파종합니다.
알림: 세포 생존율을 확인하고 세포가 >90% 생존할 수 있는지 확인하십시오. 생물반응기에 대한 모든 준비 작업이 완료된 후에만 세포를 준비합니다(단계 2.1-3.6). - HEK293T 세포 및 Vero 세포의 단층 배양의 경우 각 T75 플라스크에 2 x 106-3 x 106 세포를 접종하고 각각 10% 소 태아 혈청(FBS) 및 10% 신생아 송아지 혈청(NBS)을 포함하는 DMEM으로 배양합니다.
- 세포 채취를 위해 1.3-1.4단계를 따르십시오. 10% FBS를 함유한 3-5mL의 DMEM에 재현탁합니다.
2. 세포 파종 전 교반 탱크 생물반응기의 준비
- −1일째에 흐르는 탈이온수(DI)로 유리 용기를 한 번 철저히 헹굽니다.
- 헤드 플레이트에서 모든 스테인레스 튜브와 임펠러를 분해하고 DI 물에 담근 다음 40kHz 및 60 ° C에서 초음파 세척기로 1 시간 동안 초음파 처리하여 철저히 청소하십시오.
참고: 준비 및 절차는 5L 바이오리액터의 1단계 확장과 15L 바이오리액터의 2단계 확장에 대해 동일합니다. 15L 바이오리액터의 매개변수는 전체적으로 괄호 안에 표시되어 있습니다. 괄호 안에 파라미터가 지정되지 않은 경우 이러한 파라미터는 5L 및 15L 바이오리액터에 대해 동일합니다. - 모든 O-링이 손상되지 않고 제자리에 있는지 주의 깊게 확인한 다음 제조업체의 지침에 따라 분해된 부품을 헤드플레이트에 다시 설치합니다.
알림: 필요한 경우 조립하기 전에 마모되거나 찢어진 O-링을 교체하십시오. 마모된 O-링은 기밀성을 손상시켜 용기의 무균성을 손상시킵니다. - 0.5M NaOH 용액 7L(15L 바이오리액터의 경우 18L)를 5L 용기에 넣고 용기 가장자리에 조립된 튜브가 있는 헤드플레이트를 놓아 튜브를 NaOH 용액에 담그십시오. 튜브와 유리 용기에서 내독소를 제거하기 위해 12시간 또는 하룻밤 동안 그대로 두십시오.
알림: 7L(18L) 유리 용기의 최대 부피는 5L(15L)이므로 초과하지 마십시오. NaOH 용액은 부식성이므로 취급할 때 적절한 개인 보호 장비를 착용하십시오. - 헤드플레이트를 제거하고 NaOH 용액을 적절한 쓰레기통에 디캔팅합니다. 실험실 안전 규정에 따라 폐기하십시오. 혈관, 헤드플레이트 및 그 부품을 내독소가 없는 DI 물 또는 잔류 알칼리성을 제거하기 위한 주입 물로 철저히 헹굽니다.
- 용기에 PBS 2L(5L)를 추가하고 모든 부품을 재조립한 다음 제조업체의 지침에 따라 헤드플레이트를 용기의 금속 프레임에 볼트로 고정합니다.
- 제조업체의 지침에 따라 폐쇄형 시스템 소모품 팩을 헤드플레이트의 적절한 스테인리스 스틸(SS) 부품/튜브/포트에 장착합니다. 모든 로버트 클램프를 튜브에 고정하고 지혈제로 클램핑하여 강화하는 것이 좋습니다. 콘덴서에 연결된 끝에 0.22μm 통풍구 필터가 있는 튜브 중 하나를 고정하지 않은 상태로 둡니다.
알림: 실리콘 튜브가 뚫리지 않도록 지혈제 팁에 실리콘 튜브를 밀어 넣습니다. Clamp 실리콘 튜브에만 적용하고 cl을 피하십시오.amp이 키트에 포함된 C-flex 튜브. 콘덴서에 하나의 튜브를 클램핑되지 않은 상태로 두면 오토클레이브 중에 압력을 완화할 수 있습니다. - 오토클레이브 가능한 500mL GL 45 유리병에 0.1M NaOH 용액 250mL를 준비하고 2개의 포트가 있는 GL 45 멀티포트 커넥터 나사 캡을 장착합니다. 길이 180mm, 0.13인치 x 0.25인치(내경 x 외경) 실리콘 튜브를 캡 하단의 포트 중 하나에 연결합니다. 길이는 병 바닥에 닿을 수 있을 만큼 길어야 합니다.
- 이전 것보다 길이가 500mm 더 긴 다른 실리콘 튜브 조각을 캡 상단의 동일한 포트에 연결하고 다른 쪽 끝을 5L 용기 헤드플레이트의 드립 공급 포트에 연결합니다. 0.22μm 에어 벤트 필터를 나사 캡의 다른 포트에 연결합니다.
- 제조업체의 지침에 따라 pH 프로브에서 2점 교정을 수행합니다. 그런 다음 pH, 용존 산소(DO) 및 살아있는 세포 수 프로브를 적절한 PG13,5 포트의 용기에 삽입하고 헤드플레이트에 단단히 조입니다.
- 제조업체의 지침에 따라 완전히 조립된 용기의 기밀 검사를 수행하십시오. 최소 0.4분 동안 0.01bar ± 30bar의 압력을 유지합니다. 시스템이 테스트를 통과한 후 천천히 압력을 해제합니다. 기밀 테스트에 실패하면 누출 지점을 주의 깊게 검색하고 용기 어셈블리를 강화하십시오.
- 소모품 키트를 사용하여 완전히 조립된 용기를 15psi 및 121°C에서 60분 동안 오토클레이브합니다. 오토클레이브 후 모든 통풍구 필터가 손상되지 않고 건조한지 확인하십시오. 모든 지혈제를 제거하십시오.
알림: 습식 에어 벤트 필터는 가스를 효율적으로 여과하지 않으며 세포 배양 중에 용기의 멸균성을 손상시킬 수 있습니다. 통풍구 필터가 젖어 있으면 교체하고 전체 용기를 다시 오토클레이브하십시오. - 고압멸균 용기를 클린룸으로 옮기고 실온으로 완전히 식을 때까지 기다립니다. 온도 프로브를 써모웰 튜브에 삽입하고 컨트롤러의 모터, pH 프로브 및 DO 프로브용 케이블을 용기의 각 부품에 연결합니다. 용기 주위에 열 매트를 단단히 감쌉니다.
- 로버트 클램프를 풀다amp배기 가스 콘덴서, 링 스파저, NaOH용 드립 공급 포트 및 공기 오버레이 포트의 유연한 튜브에 s를 고정합니다. 컨트롤러를 켜고 로그인한 다음 제조업체의 지침에 따라 표 1 에 나열된 매개변수를 시스템에 입력합니다. 이 튜브는 배양 과정 중 언제든지 클램핑해서는 안 됩니다.
- Start( 시작)를 클릭하고 실험의 이름을 지정하여 바이오리액터를 시작합니다. 바이오리액터를 최소 12시간 또는 밤새 이러한 설정에서 실행하여 PBS를 산소로 포화시켜 나중에 DO 프로브에 대한 원포인트 보정을 수행할 수 있도록 합니다.
- 바이오리액터 컨트롤러에서 펌프 1과 펌프 2의 액체 처리 부피 속도를 보정합니다. 각 펌프에 0.13인치 x 0.25인치 실리콘 튜브를 별도로 설치하고 한쪽 끝은 물병에 담그고 튜브의 다른 쪽 끝은 측정 실린더에 삽입합니다.
- 펌프 회전 속도를 300rpm으로 설정하고 시간을 1분으로 설정합니다. 두 펌프의 측정 실린더에 주입되는 물의 양을 기록하십시오. 이 숫자는 후속 단계에 필요합니다.
- 제조업체의 지침에 따라 SF hMSC 배양 배지 500mL를 준비하고 세포 배양 배지 병의 캡을 일회용 C-Flex EZ Top 용기 마개 및 호환 가능한 캡으로 교체합니다. 생물 안전 캐비닛(BSC) 내부에서 캡 교체를 수행합니다.
- MSC용 사전 멸균된 W01 마이크로캐리어 10g 병의 입구 C-플렉스 튜브에 배지 병의 배출 튜브를 용접합니다. 튜브의 한 부분을 바이오리액터 컨트롤러의 펌프 1에 설치하고, 펌프 회전을 300rpm으로 설정하고, 병의 모든 배양 배지를 마이크로캐리어 병으로 펌핑합니다. 이 마이크로캐리어는 0일째에 사용할 때까지 4°C에서 보관하십시오.
알림: 마이크로캐리어는 −1일에 준비해야 합니다. 15L 바이오리액터 배양의 경우 총 4병(즉, 40g, SF 배지 4 x 500mL 포함)을 준비합니다.
3. 세포 파종, 배양 및 5L 교반 탱크 생물반응기에서 수확
- 0일차에는 제조업체의 지침에 따라 바이오리액터 컨트롤러의 DO 프로브에 대해 1점 교정(특히 100%)을 수행합니다. 교반 탱크 바이오리액터는 이제 세포 배양 준비가 되었습니다.
- 폐기물 수거를 위해 2L(5L) 유리병을 준비하고 두 개의 포트가 있는 GL 45 멀티포트 커넥터 나사 캡, 두 포트에 연결된 30mm, 0.25인치 x 0.44인치 C-Flex 튜브 및 멸균할 오토클레이브에 맞춥니다. 튜브 용접기를 사용하여 폐기물 병의 포트 중 하나에서 생물 반응기 용기 헤드플레이트의 수확 튜브로 C-flex 튜브를 용접합니다.
- 바이오리액터 컨트롤러의 온도, pH 및 DO 제어를 일시적으로 중지하고, 수확 튜브에 부착된 실리콘 튜브를 올바른 액체 흐름 방향으로 연동 펌프 2에 설치하고, 용기의 모든 PBS를 폐기물 병으로 완전히 분배합니다. 펌프에서 튜브를 빼내고 폐기물 병을 밀봉하고 분리합니다.
알림: 항상 언clamp 모든 Robert clamps는 각 단계에서 액체 흐름과 관련된 유연한 튜브에 있습니다. Clamp 밀봉 및 분리하기 전에 액체 이송이 완료된 후 뒤로. Clamp 헤드플레이트 쪽에 더 가깝습니다. 언클램핑 및 클램핑은 달리 명시되지 않는 한 모든 후속 단계에 대해 수행해야 합니다. - 완전한 SF hMSC 배지 7L(30L)를 준비하고 각 원래 병 뚜껑을 일회용 C-Flex EZ Top 용기 마개 및 호환 가능한 캡으로 교체합니다. 일회용 여과 모듈을 10L(50L) 일회용 보관 백의 포트 중 하나에 용접합니다. BSC 내부의 캡을 교체하는 작업을 수행합니다.
- 세포 배양 배지 병을 캡슐 필터의 다른 쪽 끝에 용접하고 생물 반응기 컨트롤러의 펌프를 사용하여 배양 배지를 여과하고 한 번에 한 병씩 저장 백으로 옮깁니다. 피드 백으로 지정합니다.
- 피드 백에서 헤드플레이트의 피드 튜브에 있는 C-플렉스 튜브로 하나의 출구 포트를 용접하고 튜브를 바이오리액터 컨트롤러의 펌프 1에 설치합니다. 피드 백의 다른 출구 포트를 블리드 튜브로 용접하고 튜브를 올바른 액체 흐름 방향으로 바이오리액터 컨트롤러의 펌프 2에 설치합니다.
알림: C-Flex 튜브에 비해 마모에 대한 저항성을 높이기 위해 실리콘 튜브로 만들어진 유체 흐름 라인의 섹션을 펌프에 설치하십시오. 튜브가 올바른 방향으로 설치되었는지 확인하십시오. - 펌프 1 속도를 300rpm으로 설정하고 1단계에서 기록한 부피 분배 속도에 따라 공급 백에서 용기로 5L(2.17L)의 매체를 분배한 후 펌프를 중지합니다. 2.14단계에서 설명한 것과 동일한 설정으로 온도, pH 및 DO 제어를 다시 시작합니다.
- 피드 백을 헤드플레이트의 피드 튜브에 연결하는 튜브를 밀봉하고 분리합니다. 2.18단계에서 준비한 분산된 마이크로캐리어의 병에서 공급 튜브로 C-Flex 튜브를 용접하고 병의 모든 내용물을 용기로 펌핑합니다. 마이크로캐리어 서스펜션의 빈 병을 밀봉하고 분리합니다. 75% 에탄올로 병의 전체 표면을 소독하고 BSC에 넣어 세포 현탁액 이송 병으로 사용합니다.
알림: 다음 단계에서 동일한 튜브에 대해 여러 용접 및 분리 단계가 수행되므로 일회용 액세서리를 밀봉하고 분리할 때 헤드플레이트 쪽에 더 긴 C-Flex 튜브 조각을 남겨 두십시오. - 컨트롤러에 표시된 온도가 37-30단계와 같이 시드 셀을 준비하기 전에 일반적으로 약 1.3분이 소요되는 1.4°C의 안정 상태에 도달하는지 확인합니다. 500mL의 SF 배지에 2.5 x 108 hMSC를 재현탁시키고 이전에 마이크로캐리어 현탁액이 들어 있던 빈 병으로 옮깁니다.
참고: 15L 생물반응기 확장을 위한 종자 세포는 500mL에 1.0 x 109 세포를 접종하는 것을 목표로 3.21단계에 따라 준비해야 합니다. - 이제 세포 현탁액이 들어 있는 병의 C-Flex 튜브를 헤드플레이트의 공급 포트에 용접하고 병의 모든 내용물을 용기로 펌핑하여 마이크로캐리어에 세포 접종을 시작합니다. 빈 병을 밀봉하고 분리합니다. 피드 백에서 헤드플레이트의 피드 튜브로 피드 포트를 다시 용접합니다.
- 다음 매개변수를 설정하여 hMSC의 접종 효율 향상을 위해 간헐적 교반을 허용하도록 컨트롤러의 교반 설정을 조정합니다: V1 = 35(30) rpm/5분; V2 = 0rpm/25분; 싸이클 수 = 12 (24); 최종 교반 속도 = 35(30)rpm.
알림: 배양 과정에서 마이크로캐리어의 불균일한 분포 또는 침전이 관찰되는 경우 교반 속도를 40(35) rpm 또는 45(40) rpm으로 조정할 수 있습니다. - Medium Exchange 인터페이스에서 바이오리액터 컨트롤러에 자동화된 배지 보충 및 교환 체제를 설정합니다. 표 2에 명시된 대로 hMSC 배양을 위한 매개변수를 설정합니다.
알림: Unclamp 모든 Robert clamps는 이 s에서 액체 흐름과 관련된 유연한 튜브에amps, 특히 피드 및 블리드 튜브의 경우. 전체 배양 과정에서 클램핑되지 않은 상태로 유지하십시오. - 일반적으로 하루에 한 번씩 원하는 시점에 Luer 커넥터를 통해 일회용 샘플링 백을 연결하고 매번 10mL를 샘플링 백에 분주하여 샘플링 튜브를 통해 샘플을 채취합니다. 첫 번째 샘플링 백에 2-3mL의 샘플을 분취하고 폐기한 다음 매번 실제 10mL의 시료를 새 샘플링 백에 분취합니다.
참고: 초기 2-3mL 샘플은 이전 샘플링 시점의 튜브에 액체가 남아 있을 수 있으며 용기의 상태를 정확하게 나타내지 못할 수 있습니다. 75% 에탄올로 연결을 만들거나 끊기 전후에 Luer 커넥터를 소독하여 항상 추가 무균 조치로 이 단계를 수행하십시오. - 채취한 샘플을 15mL 원뿔형 원심분리 튜브로 옮깁니다. 샘플에 대해 다음 테스트를 수행합니다.
- 200 μL의 세포가 함유된 마이크로캐리어 현탁액을 취하여 제조업체의 지침에 따라 Calcein-AM/PI Cell Double Staining으로 염색합니다. 형광 현미경으로 관찰하십시오.
- 일반적으로 5-10분이 소요되는 중력에 의해 마이크로캐리어를 침전시킵니다. 상층액을 흡인하고 제조업체의 지침에 따라 혈당 측정기로 포도당 농도를 테스트합니다. 포도당 수치 그래프를 플로팅합니다.
- 침전된 세포가 함유된 마이크로캐리어를 37°C에서 20-30분 동안 갓 준비한 3-5mL의 1mg/mL 분해 용액으로 배양하여 마이크로캐리어를 완전히 용해시킵니다. 자동 형광 세포 분석기로 AO/PI로 염색한 후 세포를 계수합니다. 세포 성장 곡선을 플로팅합니다. 컨트롤러에서 생성된 실시간 라이브 세포 성장 곡선과 상관 관계가 있습니다.
- 배양 4일차 또는 5일차에 30mg/mL의 분해액 50mL(200mL)를 준비합니다. 분해 용액과 용해성 마이크로 캐리어 사이의 작동 질량 비율은 3:20에서 5:20 사이입니다. 0.22μm 캡슐 필터가 있는 멸균 필터를 사용하고 칼슘 및 마그네슘과 함께 Hank's Balanced Sal 용액(HBSS) 500mL(2L)에 추가로 희석합니다. 3L 일회용 보관 가방에 옮깁니다.
알림: 세포 수확 직전에만 분해 용액을 준비하십시오. 첫 번째 계층 확장의 경우 최소 1.0 x 10 9-1.2 x 109 셀, 두 번째 계층 확장의 경우 1.0 x 1010 셀을 목표로 하십시오. 세포가 더 빨리 자라면 4일째에 수확하십시오. 그렇지 않은 경우 5일째에 수확하십시오. 5일을 넘기지 않는 것이 좋습니다. - 마이크로캐리어가 정착되도록 컨트롤러에서 교반 속도를 0으로 설정하며, 이는 일반적으로 20분 이내에 발생합니다. 자동 배지 교환 프로토콜을 끄고 바이오리액터 컨트롤러에서 온도, pH 및 DO 제어를 중지합니다. 컨트롤러의 300rpm에서 펌프 2를 수동으로 시작하고 공급 영역에 상층액을 분주하여 용기에 약 1L(2L)의 배양 현탁액을 남깁니다(2.17단계에서 기록한 부피 분주 속도 사용 또는 용기 본체의 눈금 표시에서 측정). 피드 백을 밀봉하고 완전히 분리합니다.
- 3.15단계에서 갓 준비한 분해액 백을 공급 튜브에 용접하고 모든 내용물을 용기에 펌핑합니다. 교반 속도는 45(40)rpm에서 시작합니다. 온도 조절기가 여전히 37°C의 온도를 유지하고 있는지 확인하십시오. 마이크로캐리어는 40-60분 이내에 용해됩니다. 멸균 Luer lock 주사기로 30분에 샘플 1mL를 채취한 후 5-10분마다 명시야 현미경으로 관찰하여 마이크로캐리어의 용해를 확인합니다.
- 마이크로캐리어가 용해된 후 3L 보관 백 1개(15L 바이오리액터용 3L 보관 백 2개)를 채취 튜브에 용접하고 펌프 2를 사용하여 300rpm에서 셀 현탁액을 완전히 펌핑합니다. 세척 완충액으로 1% 인간 혈청 알부민(HSA)을 함유한 식염수 1L(3.5L)와 완전한 SF 배지 500mL(세포 동결 보존 완충액 500mL, 10% 디메틸 설페이트(DMSO) 및 90% SF 배지의 제형이 예로 사용됨)를 다른 액체 이송을 위해 이전 단계에서 언급한 방법 및 액세서리를 사용하여 별도의 일회용 보관 백에 준비합니다.
- 세포 처리 시스템을 켜고, 제조업체의 지침에 따라 일회용 세포 처리 키트를 기기에 설치하고, 세포 현탁액, 세척 완충액 및 SF 배지(동결 보존 완충액)의 백을 일회용 세포 처리 키트에 용접하고, 사용자 인터페이스에 표시된 모든 지침을 주의 깊게 따라 키트의 무결성과 적절한 설치를 초기화하고 확인합니다.
- 설치가 완료되면 세척 완충액을 사용한 세포 세척 및 SF 배지(동결 보존 완충액)의 재현탁에 대해 표 3 에 나열된 매개변수를 소프트웨어에 입력하여 세척 및 재현탁 프로세스를 시작합니다. 전체 절차는 몇 가지 수동 확인 지점을 통해 자동으로 수행됩니다.
- 세포 처리 시스템에 표시된 대로 원심분리기 챔버에서 세포 샘플을 채취하고 제조업체의 지침에 따라 자동 세포 분석기로 세포 밀도를 계산합니다. 농도 2 x 106 cells/mL 또는 최대 총 부피 250mL에 맞게 재현탁 부피를 조정합니다.
- 시스템이 챔버에서 세포를 흡인한 후 일회용 세포 처리 키트에서 세포 이송 백을 밀봉하고 분리합니다. 필요한 경우 더 큰 세포 이송 백/배지 보관 백에 완전한 SF 배지를 사용하여 세포 밀도를 2 x 106 cells/mL로 재조정합니다. 이들은 15L 생물 반응기의 2단계 확장을 위한 종자 세포가 될 것입니다.
4. 세포 제형, 충전 및 마무리
- 5L 바이오리액터에서 세포를 수확하기 1일 전에 15L 바이오리액터 준비를 시작합니다. 괄호 안에 표시된 2L에 대한 매개변수를 제외하고 프로토콜 섹션 3 및 15의 단계를 완전히 따르십시오.
- 250mL의 동결 보존 완충액에 세포를 재현탁시키고, 시스템이 챔버에서 세포를 흡인한 후 일회용 세포 처리 키트에서 세포 이송 백을 밀봉하고 분리합니다.
- 2,000mL의 동결 보존 완충액을 4.2단계에서 재현탁 세포 250mL와 함께 3L 세포 이송 백으로 옮깁니다. 이 전사 백을 일회용 Fill&Finish 소모품 키트에 용접합니다.
참고: 여기에 사용된 동결 보존 완충액의 추가 부피는 3.21단계에서 얻은 계수 결과에 따라 제형 사양 및 총 세포 수 계산에 따라 결정되어야 합니다. - 일회용 Fill&Finish 소모품 키트를 셀 충전 시스템에 조립하고 제조업체의 지침에 따라 사전 냉각 시스템을 켭니다. 시스템의 지침에 따라 배치당 총 20개의 백으로 20mL/백을 채우도록 설정합니다. 키트에서 이 백을 밀봉 및 분리하고 표준 동결 보존 절차를 따르십시오. 극저온 보관 백을 사용하십시오.
- 새로운 20개의 동결 보존 백 세트를 일회용 Fill&Finish 소모품 키트에 용접하고 모든 셀이 할당될 때까지 충전 및 마감 절차를 반복합니다. 이러한 세포를 동결 보존하기 위한 표준 절차를 따르십시오.
5. 세포 품질의 특성화
- 용해성 마이크로캐리어에서 채취한 hMSC를 샘플링하고, 문헌18에 설명된 방법에 따라 세포 정체성을 결정하기 위해 유세포 분석에 의한 특성 분석을 위한 세포 처리 시스템을 사용합니다.
- 동결 보존된 세포를 해동하고, 문헌18에 설명된 방법에 따라 세포 형태 및 삼중 계통 분화 기능을 포함한 세포 특징의 추가 특성 분석을 위해 기존의 2D 플라스크 또는 마이크로플레이트에 다시 플레이트합니다.
6. 교반 탱크 생물 반응기의 G02 마이크로 캐리어에 대한 HEK293T 확장
- 2단계에서 언급한 대로 5L 바이오리액터를 준비합니다. HEK293T 세포의 경우 W01 대신 멸균 G02 마이크로캐리어를 사용하여 세포를 배양합니다. 문화권 프로세스는 프로토콜 섹션 3과 유사하지만 다음 단계에서 자세히 설명하는 것처럼 일부 매개 변수가 다릅니다. HEK293T 세포의 배양을 위해 관류가 필요하므로 블리드 튜브 대신 생물 반응기에 특수 관류 튜브를 설치하십시오.
- 프로토콜 섹션 3에 자세히 설명된 프로토콜과 달리, 5L 바이오리액터에 대해 10% FBS가 있는 DMEM에서 G02 마이크로캐리어 20g(즉, 2병)을 준비하고, day 0 배양 부피를 3.5L(즉, 최종 농도 약 5.71g/L)로 설정합니다. G02 마이크로캐리어 2병 전에 2L의 배지를 용기에 분주하고 1.75 x 109 HEK293T 세포 500mL를 접종합니다(즉, 최종 밀도 5 x 105 cells/mL).
- 교반 체제 및 배지 교환 체제(하루에 교환해야 하는 배지의 양을 기준으로, 일일 배양량, CVD로 표시)를 수행하며, 이는 프로토콜 섹션 3과 다르며 표 4에 자세히 설명되어 있습니다.
알림: 펌프 1과 펌프 2를 수동으로 활성화하여 둘 다 관류가 발생하도록 지속적으로 펌핑할 수 있도록 합니다. 펌프의 부피 분배 속도 보정에 따라 관류 속도를 충족하기 위해 매일 펌프 속도를 조정합니다. 일반적으로 이 값은 한 자릿수 범위입니다. HEK293T 세포의 경우 신선한 배지를 사료로 사용하고 배지가 순환되는 hMSC와 달리 사용한 배지를 폐기물 병에 완전히 버립니다. - 15L 바이오리액터로의 2단계 확장의 경우, hMSC와 함께 사용되는 마이크로캐리어의 완전한 용해 대신 HEK293T 세포의 비드 간 이동을 사용하십시오. 구체적으로, 원하는 세포 밀도에 도달한 후 마이크로캐리어를 침전시키기 위한 교반을 중지한 다음 관류관에서 가능한 한 많은 상층액을 흡인하고 PBS에 남은 현탁액 부피의 3배를 공급하여 마이크로캐리어를 세척하고 3회 반복합니다. 최종 세척 시 가능한 한 많은 PBS를 흡입하고 버리십시오.
- 3.5L의 1x 재조합 트립신을 공급하여 G02 마이크로캐리어가 손상되지 않은 상태에서 마이크로캐리어에서 세포를 분리합니다. 온도를 37°C로 설정하고 교반 속도를 60rpm으로 설정합니다. 세포의 80% 이상이 분리되었을 때 동일한 양의 완전한 배지를 사용하여 45분 이내에 분리를 종료합니다.
- 2단계 확장을 위해 수확 항구에서 준비된 15L 선박으로 직접 옮깁니다.
7. 교반 탱크 바이오리액터의 V01 마이크로캐리어에 대한 Vero 셀 확장
- 동결건조된 마이크로캐리어를 PBS와 함께 바이오리액터 용기에 20mg/mL 농도로 옮겨 V01 마이크로캐리어를 준비합니다. 프로토콜 섹션 2에 언급된 대로 용기를 조립하고 멸균하되 대신 30분 동안 고압멸균합니다.
- 멸균 후 V01 마이크로캐리어는 자연적으로 가라앉습니다. 블리드 및 피드 튜브를 사용하여 상층액을 기본 DMEM과 두 번 교환하고, 세포 접종 및 배양을 위한 프로토콜 섹션 3을 진행하기 전에 용기 부피의 50%-75%에 10% NBS를 포함하는 완전한 DMEM을 추가합니다.
- 프로토콜 섹션 3에 자세히 설명된 프로토콜과 달리, Vero 세포의 4L 배양(즉, 최종 농도 6g/L)에 24g의 V01 마이크로캐리어를 사용하고 4 x 109 Vero 세포(즉, 1 x 106 cells/mL의 최종 밀도)에 500mL를 접종합니다.
- 배양 공정 파라미터에 대해 6.3-6.6단계를 따르고 15L 교반 탱크 바이오리액터에서 2단계 확장으로 패세이징합니다.
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Representative Results
ACISCP 플랫폼은 확장 확장을 위한 일련의 교반 탱크 바이오리액터, 자동화된 세포 수확 및 제형을 위한 세포 처리 시스템, 세포 주입 시스템을 사용하는 완전 폐쇄형 시스템입니다(그림 1). 부착 세포는 다공성 마이크로 캐리어에 부착되어 생물 반응기로 분산될 수 있으므로 부착 세포의 부유 배양을 달성할 수 있습니다.
설명된 프로토콜에 따라, 10g의 W01 마이크로캐리어가 포함된 2.5 x 108 hMSC를 초기 팽창을 위해 5L 교반 탱크 바이오리액터에 먼저 접종했습니다. 약 2.9 x 10 9 세포를 농축하여 4일째에 세포 처리 시스템에 의해 세척하고, 그 중 1.0 x 109 수거된 세포를 2단계 배양을 위해 40g의 W01 마이크로캐리어와 함께 15L 교반 탱크 바이오리액터로 통과시켰다. 최종적으로 1.1 x 10 10 MSC를 수확하여 제형화한 후 9일째에70개 이상의 제형 백에 분주했습니다(그림 2A). 세포 수, 생존력 및 포도당 소비를 매일 모니터링했습니다(그림 2B,C). 누적 128배 확장이 달성되었습니다. 한편, 세포 생존율은 90% 이상으로 유지되었습니다. 포도당 섭취는 세포 확장과 음의 상관관계를 보였으며, 건강한 세포 성장과 관련된 신진대사를 보여주었습니다.
용해성 다공성 마이크로캐리어는 사전 멸균이 가능하며 GMP에 적합한 일회용 폐쇄형 시스템 포장으로 제공됩니다(그림 3A). 세포는 마이크로 캐리어의 표면과 거대 기공의 내벽에 부착 될 수 있습니다 (그림 3B). Calcein-AM/PI Cell Double Staining Kit와 같은 형광 염료를 사용하여 다공성 미세구 내부의 세포를 시각화할 수 있었습니다(그림 3C). 명시야 이미지와 형광 이미지를 병합하면 세포 분포의 균일성을 분석하는 데 도움이 됩니다. 또한 살아있는 세포 염색은 수동 샘플링 또는 온라인 살아있는 세포 계수 프로브로 측정한 세포 계수와 강한 연관성을 보여주었습니다.
많은 양의 세포에 대한 엄청난 수요 외에도 MSC의 중요 품질 특성(CQA) 평가 및 방출 테스트가 필수적이며, 이러한 평가 없이는 배양 후 세포를 멸균하거나 광범위하게 정제할 수 없습니다. 세포 품질을 보장하기 위해 ACISCP 플랫폼의 각 단계에서 3D 확장 MSC를 샘플링할 수 있습니다. ACISCP 플랫폼에서 갓 채취한 MSC는 양성 마커(CD73, CD90, CD105)와 음성 마커(HLA-DR, CD34, CD45, CD19, CD14)에 대해 각각 >95% 및 <2%의 발현으로 고전적인 표현형 마커22를 유지했습니다(그림 4A). 동결 보존된 세포를 해동하여 2D 평면 플라스크에 접종한 결과, 우수한 접착력, 정상 팽창 거동(그림 4B) 및 나선형 성장이 있는 전형적인 방추 모양(그림 4C)을 보여주었습니다. 또한, 세포는 골형성, 지방형성 및 연골형성 계통으로 분화하는 능력도 유지했습니다(그림 4D).
또한 HEK293T 셀과 Vero 셀도 ACISCP 플랫폼에서 테스트되었습니다. HEK293T 세포 배양의 경우, 접종 세포 농도는 5L 바이오리액터에서 5 x 105 cells/mL였습니다. 비드 간 전달 공정 후 15L 바이오리액터에서 최대 세포 농도는 1.68 x 107 cells/mL에 도달했으며(그림 5A), HEK293T 세포는 높은 생존율을 유지했습니다(그림 5B). Vero 세포 배양의 경우, 접종 세포 농도는 5L 바이오리액터에서 2 x 105 cells/mL였습니다. 비드 간 전달 공정 후 달성된 최대 세포 농도는 15L 바이오리액터에서 1.08 x 107 cells/mL였으며(그림 6A), Vero 세포도 높은 생존율을 유지했습니다(그림 6B).
그림 1: ACISCP 플랫폼을 통한 hMSC 생산의 개략적인 로드맵. 이 수치는 출판된 문헌18에서 수정되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: ACISCP 플랫폼을 통한 hMSC의 세포 확장. (A) ACISCP 플랫폼은 일련의 교반 탱크 바이오리액터, 세포 처리 시스템 및 세포 충전 시스템으로 구성됩니다. (B) 2단계 확장 과정에서 hMSC의 성장 곡선, (C) 및 이 과정에서 포도당 소비율. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: W01 마이크로캐리어의 hMSC 성장 특성. 이 수치는 출판된 문헌18에서 수정되었다. (A) W01 마이크로캐리어는 일회용 폐쇄형 시스템 포장으로 준비됩니다. (B) 부착성 hMSC로 배양된 빈 마이크로캐리어 및 마이크로캐리어의 주사 전자 현미경 이미지. 흰색 삼각형 머리는 마이크로캐리어 표면의 세포를 나타냅니다. 척도 막대 = 100μm. (C) 대표 병합된 명시야 및 형광(살아있는 세포 염색) 이미지는 1일차부터 4일차까지 마이크로캐리어에서 배양되었습니다. 축척 막대 = 100μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: ACISCP 플랫폼에서 채취한 hMSC의 세포 동일성 평가. (A) hMSC의 표면 마커는 유세포 분석으로 특성화되었습니다. 모든 양성 마커(>95%)와 음성 마커(<2%)가 기준을 충족했습니다. (B) 냉동 보존된 3D 확장 hMSC는 해동 및 2D 플라스크로 재도금된 후 정상적인 팽창 거동을 보였습니다. (C) 3D 확장 hMSC의 형태; 스케일 바 = 50 μm. (D) 3D 확장 hMSC의 삼중 계통 분화. 골형성, 지방형성 및 연골형성 능력은 각각 Alizarin Red, Oil Red 및 Alcian Blue 염색으로 평가되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: ACISCP 플랫폼을 통한 HEK293T 세포의 세포 확장. (A) 5 L 및 15 L 바이오리액터의 HEK293T 세포 밀도. (B) G02 마이크로캐리어에서 배양된 명시야(BF) 이미지, Calcein-AM 염색(Live) 및 PI 염색(Dead) HEK293T 세포; 축척 막대 = 1mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: ACISCP 플랫폼을 통한 Vero 세포의 세포 확장. (A) 5 L 및 15 L 바이오리액터의 Vero 세포 밀도. (B) V01 마이크로캐리어에서 배양된 명시야(BF) 이미지, Calcein-AM 염색(Live) 및 PI 염색(Dead) Vero 세포; 스케일 바 = 400 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1: 교반 탱크 바이오리액터의 파라미터 설정. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 2: hMSC 배양을 위한 자동 배지 교환의 파라미터 설정. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 3: hMSC 통로 및 제형을 위한 세포 처리 시스템의 파라미터 설정. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 4: HEK293T 및 Vero 셀에 대한 배지 교환 체제 및 교반 체제. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
면역 요법과 줄기 세포 요법 모두 살아있는 세포를 약물로 사용합니다. 그러나 최종 제품은 저분자 또는 바이러스와 같은 방식으로 정제하거나 멸균해서는 안 됩니다. 그러므로, QbD(Quality by Design)의 원칙은 항상 염두에 두어야 하며, 셀 생산 중 화학 제조 및 제어(CMC) 공정에 실질적으로 적용되어야 한다23. 완전 폐쇄형 세포 배양 시스템, 처리 시스템 및 충전 시스템은 요구 사항을 충족하는 것으로 우선적으로 고려됩니다. 이 연구에서는 GMP 등급, 용해성 및 다공성 3D 마이크로캐리어를 기반으로 하는 ACISCP 플랫폼을 활용하여 hMSC의 2계층 확장을 수행하기 위한 프로토콜을 제시했습니다. 일부 연구자들은 시험관 내에서 hMSC를 확장하기 위해 마이크로캐리어와 함께 바이오리액터를 사용하는 타당성을 탐구했지만, 보고된 연구의 대다수는 규모가 증가하면 hMSC 수율이 감소하여 100mL의 작업 부피에서 6.1 x 10 5 cells/mL 또는 12.5 x 105 cells/mL에서 2 L의 작업 부피24에서 2.7 x 105 cells/mL로 감소할 수 있음을 보여주었습니다. 25,26. 교반 탱크 바이오리액터가 가장 높은 확장성을 나타내지만, 용기의 구조적 특성, 임펠러 유형, 팁 속도, 체적 질량 전달 계수, 산소의 kla및 전력 수와 같은 주요 문제를 철저히 고려해야 합니다24. 일반적으로 미생물 또는 CHO 세포와 같은 가축화된 앵커리지 독립 세포의 배양을 위해 설계된 이전의 교반 탱크 바이오리액터와 달리 이 연구에 사용된 바이오리액터는 마이크로캐리어 기반 배양을 위해 특별히 설계되었으므로 영양소 교환 전략의 다양한 공정 요구 사항을 충족할 수 있습니다. 세포 배양 공정의 차이 외에도 ACISCP 플랫폼은 반복적인 수작업으로 많은 양의 세포를 생산하는 기존의 수확 절차와 달리 세포 충전 시스템과 함께 연속 흐름 원심분리기 기반 세포 처리 시스템을 사용하여 높은 취급 효율성을 보장합니다. 고급 자동화 장치는 원배치 생산에서 높은 수율을 제공합니다.
대부분의 줄기 세포는 고정에 의존합니다. 따라서 그들은 셀 제조를 위한 마이크로캐리어를 요구합니다. 종래에, 이전의 상용 마이크로캐리어는 상이한 표면 특성을 활용하도록 공식화되어, 상이한 세포 팽창 폴드 수를 달성하였다. 이전 연구에서, 돼지 골수 MSC에 대한 Cytodex type 1 microcarrier의 사용은 약 4 x 10 5 cells/mL의 세포 밀도를 생성한 반면, 젤라틴으로 코팅된 Cytodex type 3의 사용은 인간 태반 MSC와 유사한 세포 수(3.8 x 105 cells/mL)를 생성했다27. 그럼에도 불구하고 Cytodex 유형 1 및 유형 3은 용해되지 않으므로 세포 수확 중 트립신화 공정은 세포 회수 수율뿐만 아니라 생존율과 품질에도 영향을 미칩니다. 따라서, CGT 생성물에 종래의 마이크로캐리어를 사용하는 성공적인 사례는 없으며, 최종 생성물인 세포는 비용해성 마이크로캐리어의 오염을 제거하기 위해 광범위한 다운스트림 정제 공정을 거칠 수 없다(28). 대조적으로, W01 마이크로캐리어는 완전히 용해될 수 있으며, 이는 마이크로캐리어의 분해에 의해 세포 생성물을 쉽게 수확할 수 있음을 의미합니다. 이 마이크로캐리어 제품은 또한 완전 폐쇄형 시스템 패키지로 제공되므로 GMP를 준수하는 운영 프로세스를 쉽게 달성할 수 있습니다. 우리는 W01 마이크로캐리어를 사용하여 2계층 팽창 공정을 통한 패시징을 쉽게 달성할 수 있으며 단일 배치에서 최대 1.1 x 1010개의 총 세포를 수확할 수 있음을 보여주었습니다. 실제로, 이것은 이전 보고서29,30에서 50L 생물 반응기에서만 달성 될 수 있었다. 이 작업에서 교반 탱크 바이오리액터 내부의 피크 세포 밀도는 수확 전에 약 11.6 x 105 cells/mL에 도달했습니다. 따라서 ACISCP 플랫폼에서 100-200L 바이오리액터를 사용하여 배치당 1 x 1011 세포를 쉽게 달성할 수 있을 것으로 예상할 수 있으며, 이는 연간 수천 개의 배치가 매년 300조 개의 hMSC에 대한 수요를 쉽게 충족할 수 있음을 의미합니다.
셀은 다양한 특성을 가지고 있기 때문에 다양한 유형의 3D 마이크로캐리어가 생산되며 특정 셀과 마이크로캐리어 간의 호환성을 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. CGT의 비세포 최종 제품의 경우, 바이오리액터의 HEK293T 세포 및 Vero 세포에 대한 마이크로캐리어 기반 스케일업은 각각 1.5 x 10 6 cells/mL 및 3.3 x 106 cells/mL에 도달하는 것으로 보고되었습니다31. ACISCP 플랫폼에서 용해성 다공성 마이크로캐리어인 G02 및 V01을 사용하여 각각 HEK293T 세포와 Vero 세포를 확장했으며 두 세포의 피크 세포 밀도는 1 x 107 cells/mL 이상에 도달했습니다. 또한, 3D 마이크로캐리어의 분해성은 세포가 마이크로캐리어로부터 쉽게 분리될 수 있기 때문에 세포내 바이러스의 생물학적 산물 생산에 도움이 될 수 있습니다. 결정적으로, ACISCP 플랫폼은 세포 및 유전자 치료 제품에 대한 수량 및 품질 요구 사항을 모두 충족하는 확립된 새로운 바이오 제조 공정을 나타냅니다. 우리는 우리의 대규모 세포 생산 플랫폼이 세포 및 유전자 치료제 개발을 가능하게 하는 필수 도구 역할을 할 것으로 기대합니다.
위에서 논의한 플랫폼의 장점에도 불구하고 앞으로 우회해야 할 몇 가지 제약이 남아 있습니다. 첫째, 현재 형태의 ACISCP 플랫폼에 사용되는 바이오리액터에는 여전히 유리 탱크가 장착되어 있어 GMP 기준을 충족하기 위해 복잡한 세척 절차와 세척 검증이 필요합니다. 일회용 교반 탱크 바이오리액터 시스템은 미래에 온전한 일회용 소모품 키트 세트를 생산하는 데 잠재적으로 사용될 수 있습니다. 둘째, 가축화된 세포주와 달리 hMSC는 개별 공여체 및 다양한 조직에서 분리된 일차 세포 균주이며, 이는 hMSC가 이질성을 나타낸다는 것을 의미합니다. 따라서 이 백서에 설명된 프로토콜은 참조 역할을 하며, ACISCP 플랫폼의 기술적 마이그레이션을 달성하기 위해서는 체계적인 프로세스 개발이 필요합니다. 셋째, 우리 동료들이 베로 세포 32로 백시니아 바이러스를 생산할 수 있는 타당성을 예비적으로 테스트했음에도 불구하고, HEK293T 세포의3D 확장에서 바이러스 생산에 대한 우수한 성능을 달성할 수 있는지 여부는 더 검증되어야 합니다. 결론적으로, 용해성 다공성 마이크로캐리어와 일련의 자동화된 폐쇄 시스템을 기반으로 하는 ACISCP 플랫폼의 대규모 셀 생산 방법은 CGT 제품 제조를 위한 산업 규모에서 생산 효율성을 높이고 품질 관리를 개선할 수 있는 기회를 제공한다.
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Disclosures
Y.D.는 과학 고문이며, H.X., Y.Z., L.G., M.L., Y.Y., W.L. 및 X.Y.는 Beijing CytoNiche Biotechnology Co. Ltd.의 직원입니다. 다른 저자는 이 문서에 설명된 제품이나 회사에 대해 상업적, 독점적 또는 재정적 이해관계가 없습니다. 다른 모든 저자는 경쟁 이익이 없음을 선언합니다.
Acknowledgments
이 연구는 미국 국립과학재단(National Science Foundation for Distinguished Young Scholars, 82125018)의 재정 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin EDTA | BasalMedia | S310JV | Used for 2D cell harvest. |
| 3D FloTrix Digest | CytoNiche Biotech | R001-500 | This is a reagent that specifically dissolves 3D TableTrix microcarriers. |
| 3D FloTrix MSC Serum Free Medium | CytoNiche Biotech | RMZ112 | This is a serum-free,animal-free medium for mesenchymal stem cell expansion and maintenance in 2D planar culture as well as 3D culture on 3D TableTrix microcarriers. |
| 3D FloTrix Single-Use Filtration Module | CytoNiche Biotech | R020-00-10 | This module contains 0.22 μm capsule filters used for filtration of culture medium and digest solution. |
| 3D FloTrix Single-Use Storage Bag (10 L) | CytoNiche Biotech | R020-00-03 | Used as feed bag for 5 L bioreactor. |
| 3D FloTrix Single-Use Storage Bag (3 L) | CytoNiche Biotech | R020-00-01 | Used as cell seeding or transfer bags. |
| 3D FloTrix Single-Use Storage Bag (50 L) | CytoNiche Biotech | R020-00-04 | Used as feed bag for 15 L bioreactor. |
| 3D FloTrix vivaPACK Disposable Fill&Finish Consumable Kit | CytoNiche Biotech | PACK-01-01 | This is a standard kit adapted to 3D vivaPACK fill and finish system. |
| 3D FloTrix vivaPACK fill and finish system for cells | CytoNiche Biotech | vivaPACK | This system is a closed liquid handling device, with automated mixing and gas exhausting functions. Cells resuspended in cryopreservation buffer can be rapidly and evenly aliquoted into 20 bags per batch. |
| 3D FloTrix vivaPREP PLUS cell processing system | CytoNiche Biotech | vivaPREP PLUS | This system is a continuous flow centrifuge-based device.Cells can be concentrated, washed, and resuspended under completely closed procedures. |
| 3D FloTrix vivaPREP PLUS Disposable Cell Processing Kit | CytoNiche Biotech | PREP-PLUS-00 | This is a standard kit adapted to 3D vivaPREP PLUS cell processing. |
| 3D FloTrix vivaSPIN bioreactor 15 L | CytoNiche Biotech | FTVS15 | This bioreactor product employs a controller, a 15 L glass stirred-tank vessel, and assessories. A special perfusion tube is available. |
| 3D FloTrix vivaSPIN bioreactor 5 L | CytoNiche Biotech | FTVS05 | This bioreactor product employs a controller, a 5 L glass stirred-tank vessel, and assessories.A special perfusion tube is available. |
| 3D FloTrix vivaSPIN Closed System Consumable Pack (10/15 L) | CytoNiche Biotech | R020-10-10 | This is a standard tubing kit adapted to 3D vivaSPIN bioreactor 15 L, containing sampling bags. |
| 3D FloTrix vivaSPIN Closed System Consumable Pack (2/5 L) | CytoNiche Biotech | R020-05-10 | This is a standard tubing kit adapted to 3D vivaSPIN bioreactor 5 L, containing sampling bags. |
| 3D TableTrix microcarriers G02 | CytoNiche Biotech | G02-10-10g | These porous and degradable microcarriers are suitable for HEK293T cell culture. They come pre-sterilized in 10g/bottle with C-Flex tubings for welding to tubes on bioreactors. |
| 3D TableTrix microcarriers V01 | CytoNiche Biotech | V01-100-10g | These porous and degradable microcarriers are suitable for adherent cell culture, they come as non-sterilized microcarriers that need to be autoclaved in PBS before use. They are especially suitable for vaccine production. |
| 3D TableTrix microcarriers W01 | CytoNiche Biotech | W01-10-10g (single-use packaging); W01-200 (tablets) |
These porous and degradable microcarriers are suitable for adherent cell culture, especially for cells that need to be harvested as end products. They come pre-sterilized in 10g/bottle with C-Flex tubings for welding to tubes on bioreactors.The product has obtained 2 qualifications for pharmaceutical excipients from CDE, with the registration numbers of [F20200000496; F20210000003]. It has also received DMF qualification for pharmaceutical excipients from FDA, with the registration number of [DMF:35481] |
| APC anti-human CD45 Antibody | BioLegend | 368512 | Used in flow cytometry for MSC identity assessment |
| Calcein-AM/PI Double Staining Kit | Dojindo | C542 | Calcein-AM/PI Double Staining Kit is utilized for simultaneous fluorescence staining of viable and dead cells. This kit contains Calcein-AM and Propidium Iodide (PI) solutions, which stain viable and dead cells, respectively. |
| Cap for EZ Top Container Closures for NALGENE-containers (500mL) | Saint-Gobain | CAP-38 | Brands and catalogue numbers are only for example, similar products are available from various suppliers and as long as they have the same functionality, items could be substituted with other brands. |
| C-Flex Tubing, Formulation 374 (0.25 in x 0.44 in) | Saint-Gobain | 374-250-3 | Used for tube welding and disconnection. |
| CryoMACS Freezing Bag 50 | Miltenyi Biotec | 200-074-400 | Used for expanding the 3D FloTrix vivaPACK Disposable Fill&Finish Consumable Kit. |
| Dimethyl Sulfate (DMSO) | Sigma | D2650-100mL | Used for preparation of cryopreservation solution. |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | BasalMedia | L120KJ | Used for cultivation of HEK293T and Vero cells. |
| DURAN Original GL 45 Laboratory bottle (2 L) | DWK life sciences | 218016357 | Used for waste collection from the 5 L bioreactor. |
| DURAN Original GL 45 Laboratory bottle (5 L) | DWK life sciences | 218017353 | Used for waste collection from the 15 L bioreactor. |
| DURAN Original GL 45 Laboratory bottle (500 mL) | DWK life sciences | 218014459 | Used for supplementary bottle of 0.1 M NaOH. |
| EZ Top Container Closures for NALGENE-containers (500mL) | Saint-Gobain | EZ500 ML-38-2 | Brands and catalogue numbers are only for example, similar products are available from various suppliers and as long as they have the same functionality, items could be substituted with other brands. |
| Fetal bovine serum (FBS) superior quality | Wisent | 086-150 | Used for cultivation of HEK293T cells. |
| FITC anti-human CD14 Antibody | BioLegend | 301804 | Used in flow cytometry for MSC identity assessment. |
| FITC anti-human CD34 Antibody | BioLegend | 343504 | Used in flow cytometry for MSC identity assessment. |
| FITC anti-human CD90 (Thy1) Antibody | BioLegend | 328108 | Used in flow cytometry for MSC identity assessment. |
| Flow cytometry | Beckman Coulter | CytoFLEX | Used for cell identity assessment. |
| Fluorescence Cell Analyzer | Alit life science | Countstar Rigel S2 | Used for cell counting. Cell viability can be calculated by staining with AO/PI dyes. |
| GL 45 Multiport Connector Screw Cap with 2 ports | DWK life sciences | 292632806 | Brands and catalogue numbers are only for example, similar products are available from various suppliers and as long as they have the same functionality, items could be substituted with other brands. |
| Glucose Meter | Sinocare | 6243578 | Used for detecting glucose concentration in cell culture medium and supernatant. |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), with calcium and magnesium | Gibco | 14025092 | Used for preparation of digest solution. |
| Human Albumin 20% Behring (HSA) | CSL Behring | N/A | Used for preparation of wash buffer. |
| Inverted fluorescent microscope | OLYMBUS | CKX53SF | Used for brifgt field and fluorescent observation and imaging. |
| Nalgene Measuring Cylinder (500 mL) | Thermo Scientific | 3662-0500PK | Used for calibrating the liquid handling volume speed of peristaltic pumps. |
| Newborn calf serum (NBS) superfine | MINHAI BIO | SC101.02 | Used for cultivation of Vero cells. |
| OriCell human mesenchymal stem cell adipogenic differentiation and characterization kit | Cyagen | HUXUC-90031 | Used for tri-lineage differentiation of hUCMSCs. |
| OriCell human mesenchymal stem cell chondrogenic differentiation and characterization kit | Cyagen | HUXUC-90041 | Used for tri-lineage differentiation of hUCMSCs. |
| OriCell human mesenchymal stem cell osteogenic differentiation and characterization kit | Cyagen | HUXUC-90021 | Used for tri-lineage differentiation of hUCMSCs. |
| PE anti-human CD105 Antibody | BioLegend | 800504 | Used in flow cytometry for MSC identity assessment. |
| PE anti-human CD19 Antibody | BioLegend | 302208 | Used in flow cytometry for MSC identity assessment. |
| PE anti-human CD73 (Ecto-5'-nucleotidase) Antibody | BioLegend | 344004 | Used in flow cytometry for MSC identity assessment. |
| PE anti-human HLA-DR Antibody | BioLegend | 307605 | Used in flow cytometry for MSC identity assessment. |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Wisent | 311-010-CL | Used in autoclaving of glass vessel and V01 microcarriers, and replacement of culture medium. |
| Sani-Tech Platinum Cured Sanitary Silicone Tubing (0.13 in x 0.25 in) | Saint-Gobain | ULTRA-C-125-2F | Used for solution transfering driven by peristaltic pumps. |
| Sterile Saline | Hopebiol | HBPP008-500 | Used for preparation of wash buffer. |
| Trypzyme Recombinant Trypsin | BasalMedia | S342JV | This reagent is used for bead-to-bead transfer of HEK293T and Vero cells. |
| Tube Sealer | Yingqi Biotech | Tube Sealer I | This sealer is compatible with both C-Flex tubing and PVC tubing. |
| Tube Welder for PVC tubing | Chu Biotech | Tube Welder Micro I | Used for welding of PVC tubing. |
| Tube Welder for TPE tubing | Yingqi Biotech | Tube Welder I-V2 | Used for welding of TPE tubing. |
| ViaStain AO / PI Viability Stains | Nexcelom | CS2-0106-25mL | Dual-Fluorescence Viability, using acridine orange (AO) and propidium iodide (PI), is the recommended method for accurate viability analysis of primary cells, such as PBMCs, and stem cells in samples containing debris. |
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