Storskala celleproduktion baseret på GMP-grade opløselige porøse mikrobærere

Summary

Her præsenterer vi en protokol for at opnå storskala fremstilling af klæbende celler gennem et helt lukket system baseret på opløselige mikrobærere af GMP-kvalitet. Dyrkningen af humane mesenkymale stamceller, HEK293T celler og Vero-celler blev valideret og opfyldte både kvantitetskrav og kvalitetskriterier for celle- og genterapiindustrien.

Abstract

Forskere i celle- og genterapiindustrien (CGT) har længe stået over for en formidabel udfordring i effektiv og storstilet udvidelse af celler. For at løse de primære mangler ved det todimensionelle (2D) plane dyrkningssystem udviklede vi innovativt en automatiseret ACISCP-platform (Closed Industrial Scale Cell Production) baseret på en GMP-kvalitet, opløselig og porøs mikrobærer til 3D-kulturen af klæbende celler, herunder humane mesenkymale stamceller / stromale celler (hMSC'er), HEK293T celler og Vero-celler. For at opnå storstilet ekspansion blev der udført en to-trins udvidelse med 5 L og 15 L omrørte tankbioreaktorer for at give 1,1 x 10¹⁰ hMSC'er med en samlet 128 gange udvidelse inden for 9 dage. Cellerne blev høstet ved fuldstændig opløsning af mikrobærerne, koncentreret, vasket og formuleret med et kontinuerligt flow centrifugebaseret cellebehandlingssystem og derefter aliquoteret med et cellepåfyldningssystem. Sammenlignet med 2D plan kultur er der ingen signifikante forskelle i kvaliteten af hMSC'er høstet fra 3D-kultur. Vi har også anvendt disse opløselige porøse mikrobærere på andre populære celletyper i CGT-sektoren; specifikt er HEK293T celler og Vero-celler blevet dyrket til maksimale celletætheder på henholdsvis 1,68 x 10 7 celler / ml og 1,08 x 10⁷ celler / ml. Denne undersøgelse giver en protokol til anvendelse af en bioprocesteknisk platform, der udnytter egenskaberne ved opløselige mikrobærere af GMP-kvalitet og avanceret lukket udstyr til at opnå industriel fremstilling af klæbende celler.

Introduction

CGT-industrien har været vidne til en eksponentiel ekspansion i løbet af de sidste to årtier. Udviklingen af næste generation af lægemidler forventes at behandle og helbrede talrige ildfaste sygdomme¹. Siden den første Food and Drug Administration (FDA) godkendelse af et CGT-produkt, Kymriah, i 2017 er CGT-relateret forskning og udvikling i verden fortsat med at vokse hurtigt, hvor FDA ser aktive undersøgelsesansøgninger om nye lægemidler til CGT steget til 500 i 2018². Det var blevet forudsagt, at antallet af godkendelser af CGT-produkter sandsynligvis vil være 54-74 i USA i 2030².

Mens den hurtige vækst i CGT-forskning og innovation er spændende, er der stadig en stor teknologisk kløft mellem laboratorieforskning og industriel produktion, der kunne levere disse lovende lægemidler til at nå så mange patienter som nødvendigt til overkommelige omkostninger. De nuværende processer, der blev vedtaget for disse kliniske forsøg, blev etableret i laboratorier til mindre eksperimenter, og der er behov for en betydelig indsats for at forbedre og innovere CGT-fremstilling³. Der er mange typer CGT-produkter, de fleste af dem baseret på levende celler, som kan være allogene, autologe, konstruerede eller naturlige. Disse levende lægemidler er meget mere komplekse end små molekylære enheder eller biologiske lægemidler, hvilket gør storskala fremstilling til en betydelig udfordring ^4,5,6. I dette arbejde demonstrerer vi en storskala celleproduktionsprotokol for tre forankringsafhængige celler, der anvendes bredt i CGT'er. Disse omfatter humane mesenkymale stamceller / stromale celler (hMSC'er), som er blevet brugt til cellebaseret terapi, og HEK293T celler og Vero-celler, som begge bruges til at producere vira til gensplejsning af det endelige terapeutiske celleprodukt. Forankringsafhængige celler dyrkes almindeligvis på plane systemer, som kræver manuel behandling. Imidlertid kræver manuelle kulturmetoder en betydelig mængde arbejdskraft og er tilbøjelige til forurening, hvilket kan kompromittere slutproduktets kvalitet. Desuden er der ingen in-line proceskontrol, hvilket fører til betydelige variationer i kvaliteten mellem batcher⁷. Hvis man tager stamcelleterapi som et eksempel, med en lovende pipeline på over 200 stamcelleterapikandidater, anslås det, at der vil være behov for 300 billioner hMSC'er om året for at opfylde kravene til kliniske anvendelser⁸. Derfor er storskala fremstilling af terapeutiske celler blevet en forudsætning for at udføre disse terapeutiske indgreb med et så højt cellebehov⁹.

For at undgå tilbageslag i plane systemer er der gjort en indsats for at udvikle storstilede fremstillingsprocesser i bioreaktorer med omrøring af tanke med konventionelle ikke-opløselige mikrobærere 10,11,12,13^, men disse lider under komplicerede forberedelsesprocedurer og lav cellehøstningseffektivitet ¹⁴. For nylig har vi innoveret en opløselig mikrobærer til stamcelleekspansion med det formål at omgå udfordringerne ved cellehøstning fra konventionelle ikke-opløselige kommercielle mikrobærere¹⁵. Denne nye, kommercielt tilgængelige GMP-grade 3D opløselige porøse mikrocarrier, 3D TableTrix, har vist stort potentiale for storskala celleproduktion. Faktisk kunne 3D-kultur baseret på disse porøse mikrobærere potentielt genskabe gunstige biomimetiske mikromiljøer for at fremme celleadhæsion, spredning, migration og aktivering¹⁶. De porøse strukturer og sammenkoblede porenetværk af mikrobærere kunne skabe et større celleadhæsionsområde og fremme udvekslingen af ilt, næringsstoffer og metabolitter og dermed skabe et optimalt substrat til in vitro-celleekspansion¹⁷. Den høje porøsitet af disse GMP-grade 3D opløselige porøse mikrobærere muliggør storstilet udvidelse af hMSC'er, og evnen til, at cellerne kan opløses fuldstændigt, muliggør effektiv høst af disse ekspanderede celler¹⁸. Det er også et produkt af GMP-kvalitet og er blevet registreret som farmaceutisk hjælpestof hos Chinese Center for Drug Evaluation (arkiveringsnumre: F20210000003 og F20200000496)¹⁹ og FDA i USA (FDA, USA; Drug Master Filnummer: 35481)²⁰.

Her illustrerer vi et automatiseret ACISCP-system (Closed Industrial Scale Cell Production)¹⁸ ved hjælp af disse dispergerbare og opløselige porøse mikrobærere til hMSC-, HEK293T- og Vero-celleudvidelse. Vi opnåede en vellykket todelt udvidelse af hMSC'er (128 kumulativ foldudvidelse på 9 dage) fra en 5 L bioreaktor til en 15 L bioreaktor og opnåede endelig op til 1,1 x 10¹⁰ hMSC'er fra en enkelt produktionsbatch. Cellerne blev høstet ved fuldstændig opløsning af mikrobærerne, koncentreret, vasket og formuleret med et kontinuerligt flow centrifugebaseret cellebehandlingssystem og derefter aliquoteret med et cellefyldningssystem. Desuden vurderede vi kvaliteten af hMSC-produkter for at bekræfte overholdelsen. Vi demonstrerede også anvendelsen af disse opløselige mikrobærere til opskaleret produktion af to andre typer forankringsceller, HEK293T celler og Vero-celler, der anvendes i vid udstrækning i CGT-industrien. Den maksimale celletæthed af HEK293T celler nåede 1,68 x 10 7 celler / ml, mens topdensiteten af Vero-celler nåede 1,08 x 10⁷ celler / ml. ACISCP-systemet kunne tilpasses til dyrkning af en række vedhængende celler, og det kunne potentielt blive en stærk platform, der bidrager til at fremskynde industrialiseringen af CGT.

Protocol

Den menneskelige navlestreng blev opnået fra Beijing Tsinghua Changgeng Hospital. Alle procedurer og protokoller vedrørende erhvervelse, isolering og dyrkning af humane navlesnorsmesenkymale stamceller (UCMSC'er) blev udført med informeret samtykke og med godkendelse fra den etiske komité på Beijing Tsinghua Changgeng Hospital (arkiveringsnummer 22035-4-02), og procedurerne og protokollerne var i overensstemmelse med Helsingfors-erklæringen fra 1964 og dens senere ændringer eller sammenlignelige etiske standarder.

1. Monolagskultur af hMSC'er, HEK293T celler og Vero-celler

1. Primære humane UCMSC'er isoleres fra Whartons gelé i henhold til den rapporterede metode²¹. Brug serumfrit (SF) hMSC-dyrkningsmedium til isolering og udvækst af primære UCMSC'er, høst cellerne ved passage 2 og kryopræserver som en mastercellebank (MCB).
2. Podes 6 x 10⁵ humane UCMSC'er (helst passage 2 eller passage 3-celler) i en T75-kolbe (dvs. sådensiteten på 2D-plane beholdere er 8.000 celler / cm²) til enkeltlagskultur med 15 ml komplet SF hMSC-kulturmedium. Sørg for ensartet såning gennem en ottetalsbevægelse af kolben. Kultur ved 37 °C i en 5% CO₂ celle kultur inkubator til 80% -90% sammenløb.
3. For at høste dekanteres cellekulturmediet og skylles cellerne med 3-5 ml fosfatbufret saltvand (PBS) to gange. Derefter tilsættes 2 ml 0,25% trypsin-EDTA, og inkuberes ved 37 °C i 1-2 minutter, indtil de fleste celler er blevet runde og har løsnet sig fra kolben, som observeret under et omvendt mikroskop med et lyst felt med et 4x mål. Tilsæt 3 ml SF hMSC dyrkningsmedium for at afslutte fordøjelsen.
4. Overfør cellesuspensionen til et 15 ml konisk centrifugeglas, og centrifuger ved 179 x g i 5 min. Supernatanten dekanteres, cellepelletten skylles med PBS to gange, og der resuspenderes i ca. 3-5 ml SF hMSC-dyrkningsmedium til såning til mikrobærere i bioreaktorer.
   BEMÆRK: Kontroller cellens levedygtighed, og sørg for, at cellerne er >90% levedygtige. Først forberede cellerne, når alt forberedelsesarbejdet til bioreaktorerne er afsluttet (trin 2.1-3.6).
5. Til enkeltlagskultur af HEK293T celler og Vero-celler podes ved 2 x 10 6-3 x 10⁶ celler i hver T75-kolbe og kultur med DMEM indeholdende henholdsvis 10% føtalt bovint serum (FBS) og 10% nyfødt kalveserum (NBS).
6. Følg trin 1.3-1.4 for at høste cellerne. Resuspender i 3-5 ml DMEM indeholdende 10% FBS.

2. Fremstilling af bioreaktoren med omrøringstanke inden cellesåning

1. På dag -1 skylles glasbeholderen grundigt med rindende deioniseret (DI) vand en gang.
2. Demonter alle de rustfrie rør og løbehjul fra hovedpladen, nedsænk dem i DI-vand og soniker med en ultralydsrenser ved 40 kHz og 60 ° C i 1 time for at rengøre grundigt.
   BEMÆRK: Forberedelserne og procedurerne vil være de samme for første niveau ekspansion i 5 L bioreaktor og anden tier ekspansion i 15 L bioreaktor. Parametrene for 15 L bioreaktoren er angivet i parentes hele vejen igennem. Hvis der ikke er angivet parametre i parentes, er disse parametre de samme for 5 L og 15 L bioreaktorerne.
3. Kontroller omhyggeligt, at alle O-ringe er intakte og på plads, og monter derefter de adskilte dele tilbage på hovedpladen i henhold til producentens anvisninger.
   BEMÆRK: Udskift slidte eller revne O-ringe før montering, hvis det er nødvendigt. Slidte O-ringe vil kompromittere lufttætheden og dermed steriliteten af beholderen.
4. Der tilsættes 7 L (18 L til 15 L bioreaktoren) 0,5 M NaOH-opløsning i 5 L-beholderen, og hovedpladen anbringes med rørene samlet på kanten af beholderen for at nedsænke rørene i NaOH-opløsningen. Lad det stå i 12 timer eller natten over for at fjerne endotoksiner fra rørene og glasbeholderen.
   BEMÆRK: Overskrid ikke 7 L (18 L), da dette er den maksimale volumen af 5 L (15 L) glasbeholderen. Brug korrekt personligt beskyttelsesudstyr, når du håndterer NaOH-opløsningen, da den er ætsende.
5. Fjern hovedpladen, og dekanter NaOH-opløsningen i en ordentlig affaldsflaske. Kassér i henhold til laboratoriesikkerhedsforskrifter. Skyl beholderen, hovedpladen og dens dele grundigt med endotoksinfrit DI-vand eller vand til injektion for at fjerne resterende alkalisk.
6. Tilsæt 2 L (5 L) PBS til beholderen, saml alle delene igen, og bolt hovedpladen til beholderens metalramme i henhold til producentens anvisninger.
7. Monter en lukket systemforbrugspakke på de relevante dele / rør / porte i rustfrit stål (SS) på hovedpladen i henhold til producentens anvisninger. Klem alle Robert-klemmerne på rørene, og forstærkning ved fastspænding med hæmostater anbefales. Lad et af rørene med et 0,22 μm udluftningsfilter i enden, der er forbundet til kondensatoren, være fastspændt.
   BEMÆRK: Sæt silikonerørene på spidserne på hæmostaterne for at forhindre gennemboring af silikonerørene. Klem kun på silikonerørene, og undgå at klemme C-flex-rørene, der følger med dette sæt. Hvis du lader et rør på kondensatoren være fastspændt, kan du aflaste trykket under autoklavering.
8. Forbered 250 ml 0,1 M NaOH-opløsning i en autoklaverbar 500 ml GL 45-glasflaske, og monter den med et GL 45 Multiport-skruelåg med to porte. Tilslut et 180 mm langt, 0,13 tommer x 0,25 tommer (indvendigt diameter x udvendigt diameter) silikonerør til en af portene på undersiden af hætten; Længden skal være lang nok til bare at røre bunden af flasken.
9. Tilslut et andet stykke silikonerør med en længde, der er 500 mm længere end det foregående, til den samme port på oversiden af hætten, og tilslut den anden ende til en drypfødeport på 5 L beholderens hovedplade. Tilslut et 0,22 μm udluftningsfilter til den anden port på skruelåget.
10. Udfør en topunktskalibrering på pH-sonden i henhold til producentens anvisninger. Indsæt derefter sonderne pH, opløst ilt (DO) og strømførende celletal i beholderen i de relevante PG13,5-porte, og skru fast på hovedpladen.
11. Udfør en lufttæthedskontrol af den fuldt monterede beholder i henhold til producentens anvisninger. Hold et tryk på 0,4 bar ± 0,01 bar i mindst 30 min. Slip langsomt trykket, når systemet har bestået testen. Hvis lufttæthedstesten mislykkes, skal du omhyggeligt søge efter lækagepunkter og forstærke beholderenheden.
12. Autoklave den fuldt monterede beholder med forbrugssættet ved 15 psi og 121 °C i 60 min. Efter autoklavering skal du kontrollere alle luftudluftningsfiltre for at sikre, at de er intakte og tørre. Fjern alle hæmostater.
    BEMÆRK: Et vådluftudluftningsfilter filtrerer ikke gassen effektivt og kan kompromittere beholderens sterilitet under cellekultur. Skift luftudluftningsfiltrene, hvis de er våde, og autoklave hele beholderen igen.
13. Overfør det autoklaverede fartøj til et rent rum, og vent på, at det er helt afkølet til stuetemperatur. Indsæt temperatursonden i termobrøndrøret, og tilslut kablerne til motoren, pH-sonden og DO-sonden fra controlleren til de respektive dele på beholderen. Sæt varmemåtten tæt rundt om beholderen.
14. Fjern Robert-klemmerne på de fleksible rør på udstødningsgaskondensatoren, ringspargeren, drypfødeporten til NaOH og luftoverlayporten. Tænd controlleren, log ind, og indtast parametrene i tabel 1 i systemet i henhold til producentens anvisninger. Disse rør bør ikke fastspændes på noget tidspunkt under kulturprocessen.
15. Klik på Start, og navngiv eksperimentet for at starte bioreaktoren. Lad bioreaktoren køre på disse indstillinger i mindst 12 timer eller natten over for at mætte PBS med ilt for at udføre en etpunktskalibrering for DO-sonden senere.
16. Kalibrer væskehåndteringsvolumenhastigheden for pumpe 1 og pumpe 2 på bioreaktorregulatoren. Installer et 0,13 tommer x 0,25 tommer silikonerør på hver pumpe separat, med den ene ende dyppet i en flaske vand og den anden ende af røret indsat i en målecylinder.
17. Indstil pumpens rotationshastighed til 300 o / min, og tid i 1 min. Bemærk mængden af vand, der hældes i målecylinderen for begge pumper. Disse tal vil være nødvendige for de efterfølgende trin.
18. Forbered 500 ml SF hMSC-kulturmedium i henhold til producentens anvisninger, og udskift hætten på cellekulturmedieflasken med en engangslukning af C-Flex EZ Top-beholderen og kompatibel hætte. Udfør udskiftningen af hætten inde i et biosikkerhedsskab (BSC).
19. Svejs udløbsrøret på flasken med medium til indløbsrøret C-flex på flasken med 10 g præsteriliserede W01-mikrobærere til MSC. Installer en del af røret på pumpe 1 i bioreaktorregulatoren, indstil pumpens rotation til 300 o / min, og pump i alt dyrkningsmediet fra flasken ind i flasken med mikrobærere. Disse mikrobærere opbevares ved 4 °C indtil brug på dag 0.
    BEMÆRK: Mikrobærerne skal tilberedes på dag -1. Til 15 L bioreaktorkultur fremstilles fire flasker (dvs. 40 g med 4 x 500 ml SF-medium) i alt.

3. Cellesåning, dyrkning og høst i en 5 L omrørt tank bioreaktor

1. På dag 0 skal du udføre en etpunktskalibrering, specifikt 100%, for DO-sonden på bioreaktorregulatoren i henhold til producentens anvisninger. Bioreaktoren med omrøring er nu klar til cellekultur.
2. Forbered en 2 L (5 L) glasflaske til affaldsindsamling, monter den med et GL 45 Multiport Connector Screw Cap med to porte, med 30 mm, 0,25 in x 0,44 i C-Flex rør forbundet til begge porte, og autoklave til sterilisering. Svejs C-flex-røret fra en af portene fra affaldsflasken til høstrøret på bioreaktorbeholderens hovedplade med en rørsvejser.
3. Stop temperatur-, pH- og DO-kontrollen midlertidigt på bioreaktorregulatoren, installer silikonerøret, der er fastgjort til høstrøret, på peristaltisk pumpe 2 i den korrekte væskestrømningsretning, og dispenser al PBS helt fra beholderen til affaldsflasken. Fjern røret fra pumpen, og forsegl og frakobl affaldsflasken.
   BEMÆRK: Fjern altid eventuelle Robert-klemmer på de fleksible rør, der er involveret i væskestrømmen i hvert trin. Klem tilbage, når væskeoverførslen er afsluttet, før du forsegler og frakobler. Klem tættere på hovedpladesiden. Afspænding og fastspænding skal udføres i alle efterfølgende trin, medmindre andet er angivet.
4. Forbered 7 L (30 L) komplet SF hMSC-medium, og udskift hver original flaskehætte med en engangslukning til C-Flex EZ Top-beholderen og en kompatibel hætte. Svejs et filtreringsmodul til engangsbrug til en af portene på 10 L (50 L) opbevaringsposen til engangsbrug. Udfør operationen med at udskifte hætterne inde i en BSC.
5. Filtrer og overfør dyrkningsmediet til opbevaringsposen, en flaske ad gangen, ved at svejse flaskerne med cellekulturmediet til den anden ende af kapselfilteret og bruge pumpen på bioreaktorregulatoren. Udpeg som foderpose.
6. Svejs en udløbsport fra fødeposen til C-flex-røret på hovedpladens føderør, og monter røret til pumpe 1 på bioreaktorregulatoren. Svejs den anden udløbsport fra fødeposen til udluftningsrøret, og installer røret for at pumpe 2 på bioreaktorregulatoren i den korrekte retning af væskestrømmen.
   BEMÆRK: Installer sektionen på væskestrømsledningen, som er lavet af silikoneslanger, på pumpen for bedre modstandsdygtighed over for slid sammenlignet med C-Flex-rør. Sørg for, at rørene er installeret i den rigtige retning.
7. Indstil pumpens 1 hastighed til 300 omdr./min., og stop pumpen efter at have dispenseret 1 L (5 L) medium fra fødeposen ind i beholderen, baseret på volumendispenseringshastigheden angivet i trin 2.17. Start temperatur-, pH- og DO-kontrollen igen med de samme indstillinger som beskrevet i trin 2.14.
8. Forsegl og frakobl røret, der forbinder fødeposen med føderøret på hovedpladen. Svejs C-Flex-røret fra flasken med de dispergerede mikrobærere, der er fremstillet i trin 2.18, til føderøret, og pump alt indholdet fra flasken ind i beholderen. Forsegl og frakobl den tomme flaske mikrobærerophæng. Desinficer hele flaskens overflade med 75% ethanol, og læg den i en BSC til brug som en cellesuspensionsoverførselsflaske.
   BEMÆRK: Lad et længere stykke C-Flex-rør stå på hovedpladesiden, når engangstilbehøret forsegles og frakobles, da der udføres flere svejse- og frakoblingstrin på det samme rør i de følgende trin.
9. Sørg for, at den temperatur, der vises på regulatoren, når en stabil tilstand på 37 °C, hvilket normalt tager ca. 30 minutter, før du fortsætter med at forberede frøcellerne som i trin 1.3-1.4. 2,5 x 10⁸ hMSC'er resuspenderes i 500 ml SF-medium, og overføres til den tomme flaske, der tidligere indeholdt mikrobærersuspensionen.
   BEMÆRK: Frøcellerne til 15 L bioreaktorudvidelsen skal fremstilles i henhold til trin 3.21 med det formål at inokulere 1,0 x 10⁹ celler i 500 ml.
10. Svejs C-Flex-røret fra flasken, der nu indeholder cellesuspensionen, til fødeporten på hovedpladen, og pump alt indholdet fra flasken ind i beholderen for at starte cellepodning til mikrobærerne. Forsegl og frakobl den tomme flaske. Svejs fødeporten fra fødeposen til føderøret på hovedpladen igen.
11. Juster omrøringsindstillingerne på controlleren for at tillade intermitterende omrøring for forbedret podningseffektivitet af hMSC'er ved at indstille følgende parametre: V1 = 35 (30) o / min / 5 min; V2 = 0 omdr./min./25 min; antal cyklusser = 12 (24); endelig omrøringshastighed = 35 (30) o / min.
    BEMÆRK: Omrøringshastigheden kan justeres til 40 (35) o/min eller 45 (40) o/min, hvis der observeres uensartet fordeling eller sedimentering af mikrobærerne under dyrkningsprocessen.
12. Opret et automatiseret medium supplement og udvekslingsregime på bioreaktorcontrolleren i Medium Exchange-grænsefladen. Indstil parametrene for hMSC-dyrkningen som angivet i tabel 2.
    BEMÆRK: Fjern eventuelle Robert-klemmer på de fleksible rør, der er involveret i væskestrømmen på dette stadium, især til føde- og udluftningsrøret. Hold disse uspændte gennem hele kulturprocessen.
13. Udtag prøverne gennem prøvetagningsrøret ved at forbinde engangsprøveudtagningsposerne via Luer-konnektorer på de ønskede tidspunkter, normalt en gang dagligt, og aliquotere 10 ml hver gang i prøveudtagningsposen. Der lægges 2-3 ml prøve i den første prøveudtagningspose, kasseres og derefter alikvote de faktiske 10 ml prøve i en ny prøveudtagningspose hver gang.
    BEMÆRK: Den indledende prøve på 2-3 ml kan være væske tilbage i røret fra det foregående prøvetagningstidspunkt og repræsenterer muligvis ikke nøjagtigt tilstanden i beholderen. Udfør altid disse trin med ekstra aseptiske foranstaltninger ved at desinficere Luer-konnektorerne før og efter oprettelse eller afbrydelse af forbindelser med 75 % ethanol.
14. De udtagne prøver overføres til et konisk centrifugeglas på 15 ml. Udfør følgende test på prøverne.
    1. Tag 200 μL af den cellebelastede mikrobærersuspension, og pletter med Calcein-AM / PI Cell Double Staining i henhold til producentens anvisninger. Overhold under et fluorescensmikroskop.
    2. Sedimenter mikrobærerne ved tyngdekraft, hvilket normalt tager 5-10 min. Opsug supernatanten, og test glukosekoncentrationen med en glukosemåler i henhold til producentens anvisninger. Afbild en graf over glukoseniveau.
    3. De sedimenterede cellebelastede mikrobærere inkuberes med en frisklavet 3-5 ml 1 mg/ml fordøjelsesopløsning ved 37 °C i 20-30 minutter for at opløse mikrobærerne fuldstændigt. Tæl cellerne efter farvning med AO/PI med en automatiseret fluorescenscelleanalysator. Plot en cellevækstkurve. Korrelere med realtids live-cellevækstkurven, der genereres på controlleren.
15. På dag 4 eller dag 5 i kulturen fremstilles 50 ml (200 ml) fordøjelsesopløsning ved 30 mg/ml. Arbejdsmasseforholdet mellem fordøjelsesopløsningen og opløselige mikrobærere varierer fra 3:20 til 5:20. Sterilt filter med et 0,22 μm kapselfilter og yderligere fortyndes i 500 ml (2 L) af Hanks afbalancerede saltopløsning (HBSS) med calcium og magnesium. Overfør til en 3 L engangsopbevaringspose.
    BEMÆRK: Forbered kun fordøjelsesopløsningen lige før cellehøstning. Prøv at sigte efter mindst 1,0 x 10 9-1,2 x 10⁹ celler til udvidelsen på første niveau og 1,0 x 10¹⁰ celler til udvidelsen på andet niveau. Hvis cellerne vokser hurtigere, høstes på dag 4; Hvis ikke, høst på dag 5. Det anbefales ikke at gå ud over dag 5.
16. Indstil omrøringshastigheden til 0 på controlleren, så mikrobærerne kan bundfælde sig, hvilket normalt sker inden for 20 minutter. Sluk for den automatiske mediumudvekslingsprotokol, og stop temperatur-, pH- og DO-kontrollen på bioreaktorregulatoren. Start manuelt pumpen 2 ved 300 o/min på regulatoren, og overnatanten hældes i føderegimet, så der efterlades ca. 1 l (2 l) opslæmning i beholderen (ved hjælp af volumendispenseringshastigheden som angivet i trin 2.17 eller måling fra gradueringsmærkerne på beholderens krop). Forsegl og frakobl fødeposen helt.
17. Svejs posen med frisklavet fordøjelsesopløsning fra trin 3.15 til føderøret, og pump alt indholdet ind i beholderen. Start omrøringshastigheden ved 45 (40) o / min. Sørg for, at temperaturreguleringen stadig holder temperaturen på 37 °C. Mikrobærere opløses inden for 40-60 min. Tag 1 ml af prøven med en steril Luer låsesprøjte på 30 min og derefter hvert 5-10 minut for at observere under et lysfeltmikroskop for at kontrollere opløsningen af mikrobærere.
18. Når mikrobærerne er opløst, svejses en 3 L opbevaringspose (to 3 L opbevaringsposer til 15 L bioreaktoren) til høstrøret og pumper cellesuspensionen helt ud ved hjælp af pumpe 2 ved 300 o / min. Forbered 1 liter (3,5 l) saltvand indeholdende 1% humant serumalbumin (HSA) som vaskebuffer og 500 ml komplet SF-medium (500 ml cellekryopræserveringsbuffer, en formulering af 10% dimethylsulfat (DMSO) og 90% SF-medium tages som et eksempel) i separate engangsopbevaringsposer ved hjælp af de metoder og tilbehør, der er nævnt i tidligere trin til andre væskeoverførsler.
19. Tænd for cellebehandlingssystemet, installer et engangscellebehandlingssæt på instrumentet i henhold til producentens anvisninger, svejs poserne med cellesuspension, vaskebuffer og SF-medium (kryopræserveringsbuffer) til engangscellebehandlingssættet, og følg omhyggeligt alle instruktionerne, der vises på brugergrænsefladen for at initialisere og kontrollere integriteten og korrekt installation af sættet.
20. Når installationen er fuldført, skal du indtaste parametrene i tabel 3 for cellevask med vaskebuffer og resuspension i SF-medium (kryopræserveringsbuffer) til softwaren for at starte vaske- og resuspensionsprocessen. Hele proceduren udføres automatisk med flere manuelle kontrolpunkter.
21. Udtag en prøve af cellerne fra centrifugekammeret som angivet af cellebehandlingssystemet, og beregn celletætheden med en automatiseret celleanalysator i henhold til producentens anvisninger. Resuspensionsvolumen justeres til en massefylde på 2 x 10⁶ celler/ml eller et maksimalt samlet volumen på 250 ml.
22. Forsegl og frakobl celleoverførselsposen fra engangscellebehandlingssættet, efter at systemet har suget cellerne ud af kammeret. Juster celletætheden igen til 2 x 10⁶ celler/ml med komplet SF-medium i en større celleoverførselspose/medium opbevaringspose, hvis det er nødvendigt. Disse vil være frøcellerne til den anden niveau ekspansion i 15 L bioreaktoren.

4. Celleformulering, fyld og finish

1. Start forberedelsen af 15 L bioreaktoren 1 dag før cellehøst fra 5 L bioreaktoren. Følg trinnene i protokolafsnit 2 og 3 fuldstændigt, undtagen med parametrene for 15 L angivet i parentes.
2. Resuspender cellerne i 250 ml kryopræserveringsbuffer, og forsegl og frakobl celleoverførselsposen fra engangscellebehandlingssættet, efter at systemet har suget cellerne ud af kammeret.
3. Overfør 2.000 ml kryopræserveringsbuffer sammen med de 250 ml resuspenderede celler fra trin 4.2 til en 3 L celleoverførselspose. Svejs denne overførselspose til et engangs Fill&Finish forbrugssæt.
   BEMÆRK: Det ekstra volumen kryopræserveringsbuffer, der anvendes her, skal bestemmes ved specifikation af formulering og beregning af totalt celleantal i henhold til de tælleresultater, der er opnået i trin 3.21
4. Saml engangspåfyldnings- og finishforbrugssættet til cellepåfyldningssystemet, og tænd forkølesystemet i henhold til producentens anvisninger. Følg instruktionerne på systemet, og indstil til at fylde 20 ml / pose med i alt 20 poser pr. Batch. Forsegl og frakobl disse poser fra sættet, og følg standard kryopræserveringsprocedurer. Brug kryoopbevaringsposer.
5. Svejs et nyt sæt med 20 kryopræserveringsposer til engangspåfyldnings- og finishforbrugssættet, og gentag påfyldnings- og efterbehandlingsproceduren, indtil alle cellerne er alikvoteret. Følg standardprocedurer for at kryopræservere disse celler.

5. Karakterisering af cellekvaliteten

1. Prøve de høstede hMSC'er fra de opløselige mikrobærere, og brug et cellebehandlingssystem til karakterisering ved flowcytometri til bestemmelse af celleidentiteten efter metoderne beskrevet i litteratur¹⁸.
2. De kryopræserverede celler optøes, og pladerne omlægges på konventionelle 2D-kolber eller mikroplader for yderligere karakterisering af celleegenskaberne, herunder cellemorfologi og tri-lineagedifferentieringsevne, efter metoder beskrevet i litteratur¹⁸.

6. HEK293T udvidelse på G02-mikrobærere i bioreaktoren med omrøring af tanken

1. Forbered en 5 L bioreaktor som nævnt i trin 2. For HEK293T celler dyrkes cellerne med sterile G02-mikrobærere i stedet for W01. Kulturprocessen ligner i protokolafsnit 3, selvom nogle parametre er forskellige, som det vil blive beskrevet i de følgende trin. Installer et specielt perfusionsrør i bioreaktoren til erstatning for udluftningsrøret, da perfusion er nødvendig til dyrkning af HEK293T celler.
2. I modsætning til protokollen, der er beskrevet i protokolafsnit 3, fremstilles 20 g G02-mikrobærere (dvs. to flasker) i DMEM med 10% FBS til 5 L bioreaktoren, med dag 0-kulturvolumen indstillet til 3,5 L (dvs. en slutkoncentration på ca. 5,71 g / l). Dispenser 2 liter medium i beholderen før de to flasker G02-mikrobærere, og pod 500 ml 1,75 x 10⁹ HEK293T celler (dvs. ved en endelig densitet på 5 x 10⁵ celler / ml).
3. Udfør et agitationsregime og mellemudvekslingsregime (baseret på mængden af medium, der skal udveksles pr. dag, udtrykt som kulturvolumen pr. dag, CVD), som adskiller sig fra protokolafsnit 3 og er detaljeret i tabel 4.
   BEMÆRK: Aktivér pumpe 1 og pumpe 2 manuelt, så begge kan pumpe kontinuerligt, så perfusion kan forekomme. Juster pumpehastigheden hver dag for at opfylde perfusionshastigheden baseret på kalibreringen af pumpernes volumendispenseringshastighed. Normalt vil dette være i det encifrede interval. For HEK293T celler skal du bruge frisk medium som foder og kassere brugt medium helt i en affaldsflaske, i modsætning til hMSC'er, hvor mediet cirkuleres.
4. Til udvidelse på andet niveau til 15 L bioreaktoren skal du bruge perle-til-perle-overførsel af HEK293T-cellerne i stedet for fuld opløsning af mikrobærerne som anvendt med hMSC'er. Specifikt skal du stoppe omrøringen for at sedimentere mikrobærerne, efter at den ønskede celletæthed er nået, og derefter aspirere så meget supernatant som muligt ud af perfusionsrøret, fodre PBS med 3 gange mængden af resterende suspension ind for at vaske mikrobærerne og gentage tre gange. Opsug og kassér så meget PBS som muligt ved den endelige vask.
5. Foder i 3,5 L 1x rekombinant trypsin for at løsne cellerne fra mikrobærerne, mens G02-mikrobærerne forbliver intakte. Indstil temperaturen til 37 °C og omrøringshastigheden til 60 omdr./min. Afslut løsningen inden for 45 min, når mere end 80% af cellerne har løsnet sig, med en lige stor mængde komplet medium.
6. Overfør direkte fra høsthavnen til et forberedt 15 L-fartøj til udvidelse på andet niveau.

7. Vero-celleudvidelse på V01-mikrobærere i bioreaktoren med omrøring af tanken

1. V01-mikrobærere fremstilles ved at overføre de frysetørrede mikrobærere til bioreaktorbeholderen sammen med PBS til en koncentration på 20 mg/ml. Saml og steriliser beholderen som nævnt i protokolafsnit 2, men autoklave i 30 minutter i stedet.
2. Efter sterilisering sætter V01-mikrobærere sig naturligt ned. Supernatanten udskiftes med basisk DMEM to gange ved hjælp af udluftnings- og tilførselsrørene, og der tilsættes hele DMEM, der indeholder 10 % NBS, til 50-75 % af beholderens volumen, inden der fortsættes til protokol afsnit 3 for cellepodning og -dyrkning.
3. I modsætning til protokollen beskrevet i protokolafsnit 3 skal du bruge 24 g V01-mikrobærere til en 4 L-kultur af Vero-celler (dvs. en slutkoncentration på 6 g / L) og inokulere 500 ml 4 x 10⁹ Vero-celler (dvs. ved en endelig densitet på 1 x 10⁶ celler / ml).
4. Følg trin 6.3-6.6 for kulturprocesparametrene og overgang til udvidelse på andet niveau i 15 L omrørt tankbioreaktor.

Representative Results

ACISCP-platformen er et helt lukket system, der anvender en række bioreaktorer med omrøring til opskaleringsudvidelse, et cellebehandlingssystem til automatiseret cellehøst og formulering og et cellepåfyldningssystem (figur 1). Vedhængende celler binder sig til de porøse mikrobærere, som kan spredes i bioreaktoren og dermed opnå den suspenderede dyrkning af klæbende celler.

Efter den beskrevne protokol blev 2,5 x 10⁸ hMSC'er med 10 g W01-mikrobærere først podet i en 5 L omrørt tankbioreaktor til en indledende ekspansion. Omkring 2,9 x 10 9 celler blev koncentreret og vasket af cellebehandlingssystemet på dag 4, hvoraf 1,0 x 10⁹ høstede celler blev ført til 15 L omrørt tank bioreaktor med 40 g W01 mikrobærere til anden fase af dyrkning. Til sidst blev 1,1 x 10 10 MSC'er høstet, formuleret og aliquoteret i over⁷⁰ formuleringsposer på dag 9 (figur 2A). Celleantallet, levedygtigheden og glukoseforbruget blev overvåget dagligt (figur 2B, C). En kumulativ 128 gange udvidelse blev opnået; I mellemtiden blev cellelevedygtigheden holdt højere end 90%. Indtagelsen af glukose udviste en negativ korrelation med celleekspansion, hvilket viser metabolisme forbundet med sund cellevækst.

De opløselige porøse mikrobærere kan præsteriliseres og leveres i en lukket engangssystememballage, der er egnet til GMP (figur 3A). Cellerne kunne binde sig til overfladen af mikrobærerne og makroporernes indre væg (figur 3B). Ved at bruge et fluorescerende farvestof, såsom Calcein-AM / PI Cell Double Staining Kit, kunne cellerne inde i de porøse mikrosfærer visualiseres (figur 3C). Sammenlægning af lysfeltbilleder med fluorescerende billeder hjalp med at analysere ensartetheden af cellefordelingen. Den levende cellefarvning viste også en stærk sammenhæng med celletælling målt ved enten manuel prøveudtagning eller online live celletællingssonden.

Ud over den enorme efterspørgsel efter høje cellemængder er vurderinger af kritisk kvalitetsattribut (CQA) og frigivelsestest af MSC'er uundværlige, da celler uden disse ikke kunne steriliseres eller ekstensivt renses efter dyrkning. For at sikre cellekvaliteten kan 3D-udvidede MSC'er samples på hvert trin i ACISCP-platformen. MSC'er, der er frisk høstet fra ACISCP-platformen, bevarede klassiske fænotypiske markører²² med et udtryk på >95% og <2% for henholdsvis de positive markører (CD73, CD90, CD105) og negative markører (HLA-DR, CD34, CD45, CD19, CD14) (figur 4A). De kryopræserverede celler blev optøet og podet til en 2D plan kolbe og viste god vedhæftningsevne, normal ekspansionsadfærd (figur 4B) og en typisk spindelform med spiralvækst (figur 4C). Desuden opretholdt cellerne også deres evne til at differentiere sig i osteogene, adipogene og kondrogene slægter (figur 4D).

Desuden blev HEK293T celler og Vero-celler også testet i ACISCP-platformen. For HEK293T cellekultur var podecellekoncentrationen 5 x 10 5 celler/ml i⁵ L bioreaktoren. Efter perle-til-perle-overførselsprocessen nåede den maksimale cellekoncentration 1,68 x 10⁷ celler / ml i 15 L bioreaktoren (figur 5A), og HEK293T cellerne opretholdt høj levedygtighed (figur 5B). For Vero-cellekulturen var podecellekoncentrationen 2 x 10 5 celler/ml i⁵ L bioreaktoren. Efter perle-til-perle-overførselsprocessen var den opnåede maksimale cellekoncentration 1,08 x 10⁷ celler / ml i 15 L bioreaktoren (figur 6A), og Vero-cellerne opretholdt også høj levedygtighed (figur 6B).

Figur 1: Skematisk køreplan for hMSC-produktion via ACISCP-platformen. Dette tal er ændret fra offentliggjort litteratur¹⁸. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2: Celleudvidelse af hMSC'er via ACISCP-platformen. (A) ACISCP-platformen består af en række bioreaktorer med omrøring, et cellebehandlingssystem og et cellepåfyldningssystem. (B) Vækstkurve for hMSC'er i den todelte ekspansionsproces, (C) og glukoseforbrugshastigheden under processen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3: Karakterisering af hMSC-vækst på W01-mikrobæreren. Dette tal er ændret fra offentliggjort litteratur¹⁸. A) W01-mikrobærere fremstilles med engangsemballage i lukket system. (B) Scanning elektronmikroskopbilleder af tomme mikrobærere og mikrobærere dyrket med klæbende hMSC'er. De hvide trekantede hoveder angiver celler på overfladen af mikrobærere; skalabjælke = 100 μm. (C) Repræsentative fusionerede bright-field og fluorescens (levende cellefarvning) billeder af hMSC'er dyrket på mikrobærere fra dag 1 til dag 4; skalabjælke = 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4: Vurdering af celleidentitet af hMSC'er høstet fra ACISCP-platformen . (A) Overflademarkørerne for hMSC'er var karakteriseret ved flowcytometri. Alle positive markører (>95%) og negative markører (<2%) opfyldte kriterierne. (B) Kryopræserverede 3D-ekspanderede hMSC'er udviste normal ekspansionsadfærd efter optøning og genbelægning til 2D-kolber. C) morfologi af de 3D-udvidede hMSC'er skalabjælke = 50 μm. (D) Tri-lineage differentiering af de 3D-udvidede hMSC'er. Osteogene, adipogene og kondrogene evner blev vurderet af henholdsvis Alizarin Red, Oil Red og Alcian Blue farvning. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 5: Celleudvidelse af HEK293T celler via ACISCP-platformen . A) HEK293T celletæthed i 5 L og 15 L bioreaktorerne. (B) Bright-field (BF) billede, Calcein-AM-farvet (levende) og PI-farvet (død) HEK293T celler dyrket på G02-mikrobærere; Vægtstang = 1 mm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 6: Celleudvidelse af Vero-celler via ACISCP-platformen . (A) Vero-celletæthed i 5 L og 15 L bioreaktorer. (B) Bright-field (BF) billede, Calcein-AM-farvede (Live) og PI-farvede (døde) Vero-celler dyrket på V01-mikrobærere; skalabjælke = 400 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Tabel 1: Parameterindstillinger for bioreaktoren med omrøringstanken. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 2: Parameterindstillinger for automatiseret medieudveksling til hMSC-dyrkning. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 3: Parameterindstillinger for cellebehandlingssystemet til hMSC-passage og formulering. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 4: Mellemudvekslingsregime og agitationsregime for HEK293T- og Vero-celler. Klik her for at downloade denne tabel.

Discussion

Både immunterapi og stamcelleterapi bruger levende celler som lægemidler; Imidlertid bør deres slutprodukter ikke renses eller steriliseres på samme måde som små molekyler eller vira. Derfor bør princippet om Quality by Design (QbD) altid holdes for øje og praktisk anvendes på den kemiske fremstillings- og kontrolproces (CMC) under celleproduktion²³. Et fuldt lukket cellekultursystem samt et behandlingssystem og et påfyldningssystem anses fortrinsvis for at opfylde kravene. I denne undersøgelse har vi præsenteret en protokol til brug af en ACISCP-platform baseret på GMP-kvalitet, opløselige og porøse 3D-mikrobærere til at udføre en todelt udvidelse af hMSC'er. Nogle forskere har undersøgt muligheden for at bruge bioreaktorer sammen med mikrobærere til at udvide hMSC'er in vitro, men størstedelen af rapporterede undersøgelser har vist, at en stigning i skala ville føre til et fald i hMSC-udbyttet, fra 6,1 x 10 5 celler / ml eller endda 12,5 x 10 5 celler / ml i 100 ml arbejdsvolumen til 2,7 x 10 ⁵ celler / ml i 2 liter arbejdsvolumen ^{24, 25,26}. Selvom bioreaktorer med omrøring af tanke udviser den højeste skalerbarhed, bør nøglespørgsmål som beholderens strukturelle egenskaber, pumpehjulstypen, spidshastigheden, den volumetriske masseoverførselskoefficient, k_La ilt, og effekttallet overvejes grundigt²⁴. Adskilt fra tidligere omrørte tankbioreaktorer, som normalt var designet til dyrkning af mikrober eller domesticerede forankringsuafhængige celler som CHO-celler, var bioreaktoren, der blev anvendt i denne undersøgelse, specielt designet til mikrobærerbaseret kultur og er således i stand til at tilfredsstille de forskellige procesbehov for næringsudvekslingsstrategier. Ud over forskelle i celledyrkningsprocessen anvender ACISCP-platformen et kontinuerligt flowcentrifugebaseret cellebehandlingssystem sammen med et cellepåfyldningssystem i modsætning til konventionelle høstprocedurer til fremstilling af store mængder celler udført ved gentaget manuelt arbejde, hvilket garanterer en høj håndteringseffektivitet. Avancerede automatiserede enheder har et højt udbytte i en-batch-produktion.

De fleste stamceller er forankringsafhængige; Således kræver de mikrobærere til cellefremstilling. Konventionelt blev tidligere kommercielle mikrobærere formuleret til at udnytte forskellige overfladeegenskaber og dermed opnå forskellige celleudvidelsesfoldnumre. I tidligere forskning producerede brugen af Cytodex type 1-mikrobærere til svineknoglemarvs-MSC'er en celletæthed på ca. 4 x 10 5 celler / ml, mens brugen af gelatinebelagt Cytodex type 3 producerede sammenlignelige celletal (3,8 x 10⁵ celler / ml) med humane placenta MSC'er²⁷. Ikke desto mindre er Cytodex type 1 og type 3 ikke-opløselige, og trypsiniseringsprocessen under cellehøstning påvirker således ikke kun cellegendannelsesudbyttet, men også levedygtigheden og kvaliteten. Der er derfor ingen vellykkede tilfælde af anvendelse af konventionelle mikrobærere til CGT-produkter, hvor celler som slutprodukter ikke kan gennemgå omfattende downstream-rensningsprocesser for at eliminere kontaminering af ikke-opløselige mikrobærere²⁸. I modsætning hertil er W01-mikrobærere fuldt opløselige, hvilket betyder, at celleprodukterne let kan høstes ved nedbrydning af mikrobæreren. Dette mikrocarrier-produkt leveres også i fuldt lukket systememballage, hvilket betyder, at en driftsproces, der er i overensstemmelse med GMP, let kan opnås. Vi har vist, at passaging med en todelt ekspansionsproces let kan opnås med W01-mikrobærere, og så højt som 1,1 x 10¹⁰ samlede celler kan høstes i en enkelt batch; Faktisk kunne dette kun opnås i 50 L bioreaktorer i tidligere rapporter^29,30. I dette arbejde nåede den maksimale celletæthed inde i bioreaktoren med omrøring ca. 11,6 x 10⁵ celler / ml før høst. Det kunne således forventes, at man let kunne opnå 1 x 10¹¹ celler pr. batch med en 100-200 L bioreaktor i ACISCP-platformen, hvilket ville betyde, at tusind batcher om året let kunne imødekomme efterspørgslen efter 300 billioner hMSC'er hvert år.

Da celler har forskellige egenskaber, produceres forskellige typer 3D-mikrobærere og er tilgængelige til test af kompatibiliteten mellem en bestemt celle og en mikrobærer. For ikke-celleslutprodukter i CGT er mikrobærerbaserede opskaleringer for HEK293T celler og Vero-celler i bioreaktorer rapporteret at nå henholdsvis 1,5 x 10 6 celler / ml og 3,3 x 10⁶ celler / ml³¹. Vi brugte opløselige porøse mikrobærere, G02 og V01, i ACISCP-platformen til at udvide henholdsvis HEK293T celler og Vero-celler, og begge cellers maksimale celletætheder nåede over 1 x 10⁷ celler / ml. Desuden kan nedbrydeligheden af 3D-mikrobærere være gavnlig for produktionen af biologiske produkter af intracellulære vira, da cellerne let kan adskilles fra mikrobærerne. ACISCP-platformen repræsenterer en etableret ny biofremstillingsproces, der opfylder både kvantitets- og kvalitetskravene til celle- og genterapiprodukter. Vi forventer, at vores store celleproduktionsplatform vil fungere som et vigtigt værktøj til at muliggøre udvikling af celle- og genterapier.

På trods af fordelene ved platformen, der er diskuteret ovenfor, er der stadig flere begrænsninger, der skal omgås i fremtiden. For det første er de bioreaktorer, der anvendes i ACISCP-platformen i den nuværende form, stadig udstyret med glastanke, som kræver komplicerede vaskeprocedurer og rengøringsverifikation for at opfylde kriterierne for GMP. Et bioreaktorsystem til engangsbrug kan potentielt anvendes i fremtiden til at producere et intakt sæt engangsforbrugssæt. For det andet, forskellig fra domesticerede cellelinjer, er hMSC'er primære cellestammer isoleret fra individuelle donorer og varieret væv, hvilket betyder, at hMSC'er udviser heterogenitet. Derfor tjener den protokol, der er beskrevet i dette dokument, som reference, mens der kræves systematisk procesudvikling for at opnå den tekniske migrering af ACISCP-platformen. For det tredje, selvom vores medarbejdere foreløbigt har testet muligheden for at producere vaccinia-virus med Vero-celler³², skal det stadig valideres yderligere, om der kunne opnås god ydeevne for viral produktion i 3D-udvidelsen af HEK293T celler. Afslutningsvis giver ACISCP-platformens storskala celleproduktionsmetode, der er baseret på opløselige porøse mikrobærere og en række automatiserede lukkede systemer, mulighed for at forbedre produktionseffektiviteten og forfine kvalitetskontrol i industriel skala til fremstilling af CGT-produkter.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% trypsin EDTA	BasalMedia	S310JV	Used for 2D cell harvest.
3D FloTrix Digest	CytoNiche Biotech	R001-500	This is a reagent that specifically dissolves 3D TableTrix microcarriers.
3D FloTrix MSC Serum Free Medium	CytoNiche Biotech	RMZ112	This is a serum-free,animal-free medium for mesenchymal stem cell expansion and maintenance in 2D planar culture as well as 3D culture on 3D TableTrix microcarriers.
3D FloTrix Single-Use Filtration Module	CytoNiche Biotech	R020-00-10	This module contains 0.22 μm capsule filters used for filtration of culture medium and digest solution.
3D FloTrix Single-Use Storage Bag (10 L)	CytoNiche Biotech	R020-00-03	Used as feed bag for 5 L bioreactor.
3D FloTrix Single-Use Storage Bag (3 L)	CytoNiche Biotech	R020-00-01	Used as cell seeding or transfer bags.
3D FloTrix Single-Use Storage Bag (50 L)	CytoNiche Biotech	R020-00-04	Used as feed bag for 15 L bioreactor.
3D FloTrix vivaPACK Disposable Fill&Finish Consumable Kit	CytoNiche Biotech	PACK-01-01	This is a standard kit adapted to 3D vivaPACK fill and finish system.
3D FloTrix vivaPACK fill and finish system for cells	CytoNiche Biotech	vivaPACK	This system is a closed liquid handling device, with automated mixing and gas exhausting functions. Cells resuspended in cryopreservation buffer can be rapidly and evenly aliquoted into 20 bags per batch.
3D FloTrix vivaPREP PLUS cell processing system	CytoNiche Biotech	vivaPREP PLUS	This system is a continuous flow centrifuge-based device.Cells can be concentrated, washed, and resuspended under completely closed procedures.
3D FloTrix vivaPREP PLUS Disposable Cell Processing Kit	CytoNiche Biotech	PREP-PLUS-00	This is a standard kit adapted to 3D vivaPREP PLUS cell processing.
3D FloTrix vivaSPIN  bioreactor 15 L	CytoNiche Biotech	FTVS15	This bioreactor product employs a controller, a 15 L glass stirred-tank vessel, and assessories. A special perfusion tube is available.
3D FloTrix vivaSPIN  bioreactor 5 L	CytoNiche Biotech	FTVS05	This bioreactor product employs a controller, a 5 L glass stirred-tank vessel, and assessories.A special perfusion tube is available.
3D FloTrix vivaSPIN Closed System Consumable Pack (10/15 L)	CytoNiche Biotech	R020-10-10	This is a standard tubing kit adapted to 3D vivaSPIN bioreactor 15 L, containing sampling bags.
3D FloTrix vivaSPIN Closed System Consumable Pack (2/5 L)	CytoNiche Biotech	R020-05-10	This is a standard tubing kit adapted to 3D vivaSPIN bioreactor 5 L, containing sampling bags.
3D TableTrix microcarriers G02	CytoNiche Biotech	G02-10-10g	These porous and degradable microcarriers are suitable for HEK293T cell culture. They come pre-sterilized in 10g/bottle with C-Flex tubings for welding to tubes on bioreactors.
3D TableTrix microcarriers V01	CytoNiche Biotech	V01-100-10g	These porous and degradable microcarriers are suitable for adherent cell culture, they come as non-sterilized microcarriers that need to be autoclaved in PBS before use. They are especially suitable for vaccine production.
3D TableTrix microcarriers W01	CytoNiche Biotech	W01-10-10g (single-use packaging); W01-200 (tablets)	These porous and degradable microcarriers are suitable for adherent cell culture, especially for cells that need to be harvested as end products. They come pre-sterilized in 10g/bottle with C-Flex tubings for welding to tubes on bioreactors.The product has obtained 2 qualifications for pharmaceutical excipients from CDE, with the registration numbers of [F20200000496; F20210000003]. It has also received DMF qualification for pharmaceutical excipients from FDA, with the registration number of [DMF:35481]
APC anti-human CD45 Antibody	BioLegend	368512	Used in flow cytometry for MSC identity assessment
Calcein-AM/PI Double Staining Kit	Dojindo	C542	Calcein-AM/PI Double Staining Kit is utilized for simultaneous fluorescence staining of viable and dead cells. This kit contains Calcein-AM and Propidium Iodide (PI) solutions, which stain viable and dead cells, respectively.
Cap for EZ Top Container Closures for NALGENE-containers (500mL)	Saint-Gobain	CAP-38	Brands and catalogue numbers are only for example, similar products are available from various suppliers and as long as they have the same functionality, items could be substituted with other brands.
C-Flex Tubing, Formulation 374 (0.25 in x 0.44 in)	Saint-Gobain	374-250-3	Used for tube welding and disconnection.
CryoMACS Freezing Bag 50	Miltenyi Biotec	200-074-400	Used for expanding the 3D FloTrix vivaPACK Disposable Fill&Finish Consumable Kit.
Dimethyl Sulfate (DMSO)	Sigma	D2650-100mL	Used for preparation of cryopreservation solution.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	BasalMedia	L120KJ	Used for cultivation of HEK293T and Vero cells.
DURAN Original GL 45 Laboratory bottle (2 L)	DWK life sciences	218016357	Used for waste collection from the 5 L bioreactor.
DURAN Original GL 45 Laboratory bottle (5 L)	DWK life sciences	218017353	Used for waste collection from the 15 L bioreactor.
DURAN Original GL 45 Laboratory bottle (500 mL)	DWK life sciences	218014459	Used for supplementary bottle of 0.1 M NaOH.
EZ Top Container Closures for NALGENE-containers (500mL)	Saint-Gobain	EZ500 ML-38-2	Brands and catalogue numbers are only for example, similar products are available from various suppliers and as long as they have the same functionality, items could be substituted with other brands.
Fetal bovine serum (FBS) superior quality	Wisent	086-150	Used for cultivation of HEK293T cells.
FITC anti-human CD14 Antibody	BioLegend	301804	Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
FITC anti-human CD34 Antibody	BioLegend	343504	Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
FITC anti-human CD90 (Thy1) Antibody	BioLegend	328108	Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
Flow cytometry	Beckman Coulter	CytoFLEX	Used for cell identity assessment.
Fluorescence Cell Analyzer	Alit life science	Countstar Rigel S2	Used for cell counting. Cell viability can be calculated by staining with AO/PI dyes.
GL 45 Multiport Connector Screw Cap with 2 ports	DWK life sciences	292632806	Brands and catalogue numbers are only for example, similar products are available from various suppliers and as long as they have the same functionality, items could be substituted with other brands.
Glucose Meter	Sinocare	6243578	Used for detecting glucose concentration in cell culture medium and supernatant.
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), with calcium and magnesium	Gibco	14025092	Used for preparation of digest solution.
Human Albumin 20% Behring (HSA)	CSL Behring	N/A	Used for preparation of wash buffer.
Inverted fluorescent microscope	OLYMBUS	CKX53SF	Used for brifgt field and fluorescent observation and imaging.
Nalgene Measuring Cylinder (500 mL)	Thermo Scientific	3662-0500PK	Used for calibrating the liquid handling volume speed of peristaltic pumps.
Newborn calf serum (NBS) superfine	MINHAI BIO	SC101.02	Used for cultivation of Vero cells.
OriCell human mesenchymal stem cell adipogenic differentiation and characterization kit	Cyagen	HUXUC-90031	Used for tri-lineage differentiation of hUCMSCs.
OriCell human mesenchymal stem cell chondrogenic differentiation and characterization kit	Cyagen	HUXUC-90041	Used for tri-lineage differentiation of hUCMSCs.
OriCell human mesenchymal stem cell osteogenic differentiation and characterization kit	Cyagen	HUXUC-90021	Used for tri-lineage differentiation of hUCMSCs.
PE anti-human CD105 Antibody	BioLegend	800504	Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
PE anti-human CD19 Antibody	BioLegend	302208	Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
PE anti-human CD73 (Ecto-5'-nucleotidase) Antibody	BioLegend	344004	Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
PE anti-human HLA-DR Antibody	BioLegend	307605	Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Wisent	311-010-CL	Used in autoclaving of glass vessel and V01 microcarriers, and replacement of culture medium.
Sani-Tech Platinum Cured Sanitary Silicone Tubing (0.13 in x 0.25 in)	Saint-Gobain	ULTRA-C-125-2F	Used for solution transfering driven by peristaltic pumps.
Sterile Saline	Hopebiol	HBPP008-500	Used for preparation of wash buffer.
Trypzyme Recombinant Trypsin	BasalMedia	S342JV	This reagent is used for bead-to-bead transfer of HEK293T and Vero cells.
Tube Sealer	Yingqi Biotech	Tube Sealer I	This sealer is compatible with both C-Flex tubing and PVC tubing.
Tube Welder for PVC tubing	Chu Biotech	Tube Welder Micro I	Used for welding of PVC tubing.
Tube Welder for TPE tubing	Yingqi Biotech	Tube Welder I-V2	Used for welding of TPE tubing.
ViaStain AO / PI Viability Stains	Nexcelom	CS2-0106-25mL	Dual-Fluorescence Viability, using acridine orange (AO) and propidium iodide (PI), is the recommended method for accurate viability analysis of primary cells, such as PBMCs, and stem cells in samples containing debris.