Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Grootschalige celproductie op basis van GMP-kwaliteit oplosbare poreuze microdragers

Published: July 7, 2023 doi: 10.3791/65469
Automatic Translation
*1, *2, *2, 2, 2, 2, 2, 2, 1
1Department of Biomedical Engineering, School of Medicine, Tsinghua University, 2Beijing CytoNiche Biotechnology Co. Ltd.
* These authors contributed equally

Summary

Hier presenteren we een protocol om de grootschalige productie van aanhangende cellen te bereiken via een volledig gesloten systeem op basis van GMP-kwaliteit oplosbare microdragers. De kweek van menselijke mesenchymale stamcellen, HEK293T cellen en Vero-cellen werd gevalideerd en voldeed aan zowel de kwantiteitseisen als de kwaliteitscriteria voor de cel- en gentherapie-industrie.

Abstract

Onderzoekers in de cel- en gentherapie-industrie (CGT) staan al lang voor een formidabele uitdaging bij het efficiënt en op grote schaal uitbreiden van cellen. Om de belangrijkste tekortkomingen van het tweedimensionale (2D) vlakke kweeksysteem aan te pakken, hebben we op innovatieve wijze een geautomatiseerd platform voor gesloten celproductie op industriële schaal (ACISCP) ontwikkeld op basis van een GMP-kwaliteit, oplosbare en poreuze microdrager voor de 3D-kweek van aanhangende cellen, waaronder menselijke mesenchymale stam-/stromale cellen (hMSC's), HEK293T cellen en Vero-cellen. Om grootschalige expansie te bereiken, werd een tweetraps expansie uitgevoerd met 5 L en 15 L geroerde tank bioreactoren om 1,1 x 1010 hMSC's op te leveren met een totale 128-voudige expansie binnen 9 dagen. De cellen werden geoogst door de microdragers volledig op te lossen, geconcentreerd, gewassen en geformuleerd met een celverwerkingssysteem op basis van een continue stroomcentrifuge, en vervolgens gealiquoteerd met een celvulsysteem. Vergeleken met 2D-vlakcultuur zijn er geen significante verschillen in de kwaliteit van hMSC's die uit 3D-cultuur worden geoogst. We hebben deze oplosbare poreuze microdragers ook toegepast op andere populaire celtypen in de CGT-sector; in het bijzonder zijn HEK293T cellen en Vero-cellen gekweekt tot piekceldichtheden van respectievelijk 1,68 x 10 7 cellen/ml en 1,08 x 107 cellen/ml. Deze studie biedt een protocol voor het gebruik van een bioprocestechnologieplatform dat gebruik maakt van de kenmerken van oplosbare microcarriers van GMP-kwaliteit en geavanceerde gesloten apparatuur om de productie van aanhangende cellen op industriële schaal te bereiken.

Introduction

De CGT-industrie is de afgelopen twee decennia getuige geweest van een exponentiële expansie. Verwacht wordt dat de evolutie van geneesmiddelen van de volgende generatie tal van refractaire ziekten zal behandelen en genezen1. Sinds de eerste goedkeuring door de Food and Drug Administration (FDA) van een CGT-product, Kymriah, in 2017, is CGT-gerelateerd onderzoek en ontwikkeling in de wereld in een snel tempo blijven groeien, waarbij de FDA actieve aanvragen voor nieuwe geneesmiddelen voor CGT zag toenemen tot 500 in 20182. Er was voorspeld dat het aantal goedkeuringen van CGT-producten in de Verenigde Staten tegen 2030 waarschijnlijk 54-74 zal zijn2.

Hoewel de snelle groei in CGT-onderzoek en -innovatie opwindend is, is er nog steeds een grote technologische kloof tussen laboratoriumonderzoek en productie op industriële schaal die deze veelbelovende geneesmiddelen zou kunnen leveren om zoveel patiënten te bereiken als nodig is tegen betaalbare kosten. De huidige processen die voor deze klinische proeven zijn toegepast, zijn vastgesteld in laboratoria voor kleinschalige experimenten, en er zijn aanzienlijke inspanningen nodig om de CGT-productie te verbeteren en te innoveren3. Er zijn veel soorten CGT-producten, de meeste gebaseerd op levende cellen, die allogeen, autoloog, gemanipuleerd of natuurlijk kunnen zijn. Deze levende geneesmiddelen zijn veel complexer dan kleine moleculaire entiteiten of biologische geneesmiddelen, waardoor grootschalige productie een grote uitdaging is 4,5,6. In dit werk demonstreren we een grootschalig celproductieprotocol voor drie ankerplaatsafhankelijke cellen die op grote schaal worden toegepast in CGT's. Deze omvatten menselijke mesenchymale stam-/stromale cellen (hMSC's), die zijn gebruikt voor celgebaseerde therapie, en HEK293T cellen en Vero-cellen, die beide worden gebruikt om virussen te produceren voor de genetische manipulatie van het uiteindelijke therapeutische celproduct. Verankeringsafhankelijke cellen worden gewoonlijk gekweekt op vlakke systemen, die handmatige verwerking vereisen. Handmatige kweekmethoden vereisen echter een aanzienlijke hoeveelheid arbeid en zijn vatbaar voor contaminatie, wat de kwaliteit van het eindproduct in gevaar kan brengen. Bovendien is er geen in-line procescontrole, wat leidt tot aanzienlijke variabiliteit in kwaliteit tussen batches7. Als we stamceltherapie als voorbeeld nemen, met een veelbelovende pijplijn van meer dan 200 kandidaten voor stamceltherapie, wordt geschat dat er 300 biljoen hMSC's per jaar nodig zouden zijn om aan de eisen van klinische toepassingen te voldoen8. Daarom is de grootschalige productie van therapeutische cellen een voorwaarde geworden om deze therapeutische interventies uit te voeren met zo'n hogecelvraag9.

Om de tegenslagen van vlakke systemen te voorkomen, zijn inspanningen geleverd om grootschalige productieprocessen te ontwikkelen in bioreactoren met geroerde tanks met conventionele niet-oplosbare microcarriers10,11,12,13, maar deze hebben te lijden onder ingewikkelde bereidingsprocedures en een lage efficiëntie bij het oogsten vancellen14. Onlangs hebben we een oplosbare microdrager voor stamcelexpansie geïnnoveerd, met als doel de uitdagingen van het oogsten van cellen van conventionele niet-oplosbare commerciële microdragers te omzeilen15. Deze nieuwe, in de handel verkrijgbare 3D-oplosbare poreuze microdrager van GMP-kwaliteit, 3D TableTrix, heeft een groot potentieel getoond voor grootschalige celproductie. Inderdaad, 3D-kweek op basis van deze poreuze microdragers zou mogelijk gunstige biomimetische micro-omgevingen kunnen nabootsen om celadhesie, proliferatie, migratie en activering te bevorderen16. De poreuze structuren en onderling verbonden poriënnetwerken van microdragers kunnen een groter celadhesiegebied creëren en de uitwisseling van zuurstof, voedingsstoffen en metabolieten bevorderen, waardoor een optimaal substraat ontstaat voor in vitro celexpansie17. De hoge porositeit van deze GMP-grade 3D oplosbare poreuze microdragers maakt grootschalige expansie van hMSC's mogelijk, en het vermogen om de cellen volledig op te lossen maakt het mogelijk om deze geëxpandeerde cellen efficiënt te oogsten18. Het is ook een product van GMP-kwaliteit en is geregistreerd als farmaceutische hulpstof bij het Chinese Center for Drug Evaluation (indieningsnummers: F20210000003 en F20200000496)19 en de FDA van de Verenigde Staten (FDA, VS; Drug Master Dossiernummer: 35481)20.

Hier illustreren we een geautomatiseerd gesloten systeem voor celproductie op industriële schaal (ACISCP)18 met behulp van deze dispergeerbare en oplosbare poreuze microdragers voor hMSC-, HEK293T- en Vero-celexpansie. We bereikten een succesvolle tweeledige uitbreiding van hMSC's (128 cumulatieve vouwexpansie in 9 dagen) van een 5 L bioreactor naar een 15 L bioreactor en verkregen uiteindelijk tot 1,1 x 1010 hMSC's uit een enkele batch productie. De cellen werden geoogst door de microdragers volledig op te lossen, geconcentreerd, gewassen en geformuleerd met een celverwerkingssysteem op basis van een continue stroomcentrifuge, en vervolgens gealiquoteerd met een celvulsysteem. Verder hebben we de kwaliteit van hMSC-producten beoordeeld om de naleving te bevestigen. We demonstreerden ook de toepassing van deze oplosbare microcarriers voor de opgeschaalde productie van twee andere typen ankercellen, HEK293T cellen en Vero-cellen, die op grote schaal worden toegepast in de CGT-industrie. De piekceldichtheid van HEK293T cellen bereikte 1,68 x 10 7 cellen/ml, terwijl de piekdichtheid van Vero-cellen 1,08 x 107 cellen/ml bereikte. Het ACISCP-systeem zou kunnen worden aangepast om een verscheidenheid aan aanhangende cellen te kweken, en het zou mogelijk een krachtig platform kunnen worden dat bijdraagt aan het versnellen van de industrialisatie van CGT.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

De menselijke navelstreng werd verkregen uit het Beijing Tsinghua Changgeng Hospital. Alle procedures en protocollen met betrekking tot het verwerven, isoleren en kweken van mesenchymale stamcellen uit de navelstreng (UCMSC's) werden uitgevoerd met geïnformeerde toestemming en met goedkeuring van de ethische commissie van het Beijing Tsinghua Changgeng Hospital (dossiernummer 22035-4-02), en de procedures en protocollen voldeden aan de Verklaring van Helsinki van 1964 en de latere wijzigingen ervan of vergelijkbare ethische normen.

1. Monolaagcultuur van hMSC's, HEK293T-cellen en Vero-cellen

  1. Isoleer primaire menselijke UCMSC's uit Wharton's jelly volgens de gerapporteerde methode21. Gebruik serumvrij (SF) hMSC-kweekmedium voor de isolatie en uitgroei van primaire UCMSC's, oogst de cellen bij passage 2 en cryopreserve als een hoofdcelbank (MCB).
  2. Inoculeer 6 x 10 5 menselijke UCMSC's (bij voorkeur passage 2 ofpassage 3 cellen) in één T75-kolf (d.w.z. de zaaidichtheid op 2D-vlakke vaten is 8.000 cellen/cm2) voor monolaagkweek met 15 ml compleet SF hMSC-kweekmedium. Zorg voor een gelijkmatige zaaiing door middel van een achtvormige beweging van de kolf. Kweek bij 37 °C in een incubator voor 5% CO2 -celculturen tot 80%-90% confluentie.
  3. Om te oogsten, decanteert u het celkweekmedium en spoelt u de cellen twee keer met 3-5 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Voeg vervolgens 2 ml 0,25% trypsine-EDTA toe en incubeer bij 37 °C gedurende 1-2 minuten totdat de meeste cellen rond zijn geworden en zijn losgekomen van de kolf, zoals waargenomen onder een omgekeerde helderveldmicroscoop met een 4x objectief. Voeg 3 ml SF hMSC-kweekmedium toe om de spijsvertering te beëindigen.
  4. Breng de celsuspensie over in een conische centrifugebuis van 15 ml en centrifugeer gedurende 5 minuten op 179 x g . Decanteer de supernatant, spoel de celpellet twee keer met PBS en resuspendeer in ongeveer 3-5 ml SF hMSC-kweekmedium voor zaaien tot microcarriers in bioreactoren.
    OPMERKING: Controleer de levensvatbaarheid van de cel en zorg ervoor dat de cellen >90% levensvatbaar zijn. Bereid de cellen pas voor nadat al het voorbereidende werk voor de bioreactoren is voltooid (stappen 2.1-3.6).
  5. Voor de monolaagkweek van HEK293T cellen en Vero-cellen, inoculeer met 2 x 10 6-3 x 106 cellen in elke T75-kolf en kweek met DMEM dat respectievelijk 10% foetaal runderserum (FBS) en 10% serum van pasgeboren kalveren (NBS) bevat.
  6. Volg stap 1.3-1.4 voor het oogsten van de cellen. Resuspendeer in 3-5 ml DMEM met 10% FBS.

2. Voorbereiding van de bioreactor met geroerde tank vóór het zaaien van cellen

  1. Spoel op dag −1 het glazen vat eenmaal grondig af met stromend gedeïoniseerd (DI) water.
  2. Demonteer alle roestvrijstalen buizen en waaiers van de kopplaat, dompel ze onder in DI-water en sonificeer gedurende 1 uur met een ultrasone reiniger op 40 kHz en 60 °C om grondig schoon te maken.
    OPMERKING: De voorbereidingen en procedures zullen hetzelfde zijn voor eerstelijnsexpansie in de 5 L-bioreactor en de tweedelijnsexpansie in de 15 L-bioreactor. De parameters voor de 15 L bioreactor staan overal tussen haakjes. Als er geen parameters tussen haakjes worden vermeld, zijn deze parameters dezelfde voor de bioreactoren van 5 L en 15 L.
  3. Controleer zorgvuldig of alle O-ringen intact en op hun plaats zitten en monteer vervolgens de gedemonteerde onderdelen terug op de kopplaat volgens de instructies van de fabrikant.
    NOTITIE: Vervang indien nodig versleten of gescheurde O-ringen voor montage. Versleten O-ringen brengen de luchtdichtheid en daarmee de steriliteit van het vat in gevaar.
  4. Voeg 7 L (18 L voor de 15 L bioreactor) 0,5 M NaOH-oplossing toe aan het vat van 5 L en plaats de kopplaat met de buizen gemonteerd op de rand van het vat om de buizen onder te dompelen in de NaOH-oplossing. Laat het 12 uur of een nacht staan om endotoxinen uit de buizen en het glazen vat te verwijderen.
    NOTITIE: Overschrijd niet meer dan 7 L (18 L), aangezien dit het maximale volume is van het glazen vat van 5 L (15 L). Draag de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen bij het hanteren van de NaOH-oplossing, aangezien deze corrosief is.
  5. Verwijder de kopplaat en decanteer de NaOH-oplossing in een goede afvalfles. Gooi weg volgens de veiligheidsvoorschriften van het laboratorium. Spoel het vat, de kopplaat en de onderdelen ervan grondig af met endotoxinevrij DI-water of water voor injectie om alkalisch achtergebleven water te verwijderen.
  6. Voeg 2 L (5 L) PBS toe aan het vat, zet alle onderdelen weer in elkaar en schroef de kopplaat vast aan het metalen frame van het vat volgens de instructies van de fabrikant.
  7. Monteer een verbruiksartikel voor gesloten systemen op de juiste roestvrijstalen (SS) onderdelen/buizen/poorten op de kopplaat volgens de instructies van de fabrikant. Klem alle Robert klemmen op de buizen, en versterking door klemmen met hemostaten wordt aanbevolen. Laat een van de buizen, met aan het uiteinde een ontluchtingsfilter van 0,22 μm dat op de condensor is aangesloten, los.
    NOTITIE: Schuif de siliconenslangen op de uiteinden op de hemostaten om te voorkomen dat u de siliconenslangen doorboort. Klem alleen op de siliconen slangen en vermijd het vastklemmen van de C-flex buizen die in deze set zitten. Door één buis op de condensor niet vast te klemmen, kan de druk tijdens het autoclaveren worden ontlast.
  8. Bereid 250 ml 0,1 M NaOH-oplossing in een autoclaveerbare GL 45 glazen fles van 500 ml en monteer deze met een GL 45 Multiport Connector schroefdop met twee poorten. Sluit een 180 mm lange, 0.13 inch x 0.25 inch (binnendiameter x buitendiameter) siliconenslang aan op een van de poorten aan de onderkant van de dop; De lengte moet lang genoeg zijn om net de bodem van de fles te raken.
  9. Sluit een ander stuk siliconenslang, met een lengte van 500 mm langer dan de vorige, aan op dezelfde poort aan de bovenkant van de dop en sluit het andere uiteinde aan op een druppeltoevoerpoort op de kopplaat van het vat van 5 liter. Sluit een ontluchtingsfilter van 0.22 μm aan op de andere poort op de schroefdop.
  10. Voer een tweepuntskalibratie uit op de pH-sonde volgens de instructies van de fabrikant. Steek vervolgens de pH-sondes, de opgeloste zuurstof (DO) en de sondes voor het aantal levende cellen in het vat in de daarvoor bestemde PG13,5-poorten en schroef ze stevig op de kopplaat.
  11. Voer een luchtdichtheidscontrole uit van het volledig gemonteerde vat volgens de instructies van de fabrikant. Houd een druk van 0.4 bar ± 0.01 bar aan gedurende ten minste 30 min. Laat de druk langzaam ontsnappen nadat het systeem de test heeft doorstaan. Als de luchtdichtheidstest mislukt, zoek dan zorgvuldig naar lekpunten en versterk de vatconstructie.
  12. Autoclaaf het volledig geassembleerde vat met de verbruiksset bij 15 psi en 121 °C gedurende 60 minuten. Controleer na het autoclaveren alle ontluchtingsfilters om er zeker van te zijn dat ze intact en droog zijn. Verwijder alle hemostaten.
    NOTITIE: Een natteluchtfilter filtert het gas niet efficiënt en kan de steriliteit van het vat tijdens de celkweek in gevaar brengen. Vervang de ontluchtingsfilters als ze nat zijn en autoclaaf het hele vat opnieuw.
  13. Breng het geautoclaveerde vat over naar een cleanroom en wacht tot het volledig is afgekoeld tot kamertemperatuur. Steek de temperatuursonde in de thermowell-buis en sluit de kabels voor de motor, pH-sonde en DO-sonde van de controller aan op de respectievelijke onderdelen op het vat. Wikkel de warmtemat strak om het vat.
  14. Maak de Robert-klemmen los op de flexibele buizen op de uitlaatgascondensor, ringsparger, druppeltoevoerpoort voor NaOH en luchtoverlaypoort. Schakel de controller in, log in en voer de parameters in tabel 1 in het systeem in volgens de instructies van de fabrikant. Deze buisjes mogen op geen enkel moment tijdens het kweekproces worden vastgeklemd.
  15. Klik op Start en geef het experiment een naam om de bioreactor te starten. Laat de bioreactor ten minste 12 uur of een nacht op deze instellingen draaien om de PBS met zuurstof te verzadigen om later een eenpuntskalibratie voor de DO-sonde uit te voeren.
  16. Kalibreer de vloeistofbehandelingsvolumesnelheid van pomp 1 en pomp 2 op de bioreactorcontroller. Installeer een siliconenslang van 0.13 inch x 0.25 op elke pomp afzonderlijk, waarbij het ene uiteinde in een fles water wordt gedompeld en het andere uiteinde van de buis in een maatcilinder wordt gestoken.
  17. Stel de rotatiesnelheid van de pomp in op 300 tpm en de tijd gedurende 1 minuut. Let op de hoeveelheid water die in de maatcilinder van beide pompen wordt afgegeven. Deze nummers zijn nodig voor de volgende stappen.
  18. Bereid 500 ml SF hMSC-kweekmedium volgens de instructies van de fabrikant en vervang de dop van de fles celkweekmedium door een wegwerpsluiting van de C-Flex EZ Top-container en een compatibele dop. Voer de vervanging van de dop uit in een bioveiligheidskast (BSC).
  19. Las de uitlaatbuis op de fles medium aan de inlaatbuis C-flex op de fles van 10 g voorgesteriliseerde W01-microdragers voor MSC. Installeer een deel van de buis op pomp 1 van de bioreactorcontroller, stel de pomprotatie in op 300 tpm en pomp al het kweekmedium uit de fles in de fles met microdragers. Bewaar deze microdragers bij 4 °C tot gebruik op dag 0.
    OPMERKING: De microdragers moeten op dag −1 worden voorbereid. Bereid voor een bioreactorcultuur van 15 liter in totaal vier flessen (d.w.z. 40 g, met 4 x 500 ml SF-medium).

3. Celzaaien, kweken en oogsten in een bioreactor met geroerde tank van 5 liter

  1. Voer op dag 0 een eenpuntskalibratie uit, met name 100%, voor de DO-sonde op de bioreactorcontroller volgens de instructies van de fabrikant. De bioreactor met roertank is nu klaar voor celkweek.
  2. Bereid een glazen fles van 2 L (5 L) voor op afvalinzameling, voorzie deze van een GL 45 Multiport Connector Screw Cap met twee poorten, met 30 mm, 0.25 in x 0.44 in C-Flex-buizen aangesloten op beide poorten, en autoclaaf om te steriliseren. Las de C-flex buis van een van de poorten van de afvalfles naar de oogstbuis op de kopplaat van het bioreactorvat met een buislasapparaat.
  3. Stop de temperatuur-, pH- en DO-regeling op de bioreactorcontroller tijdelijk, installeer de siliconenslang die aan de oogstbuis is bevestigd op peristaltische pomp 2 in de juiste vloeistofstroomrichting en doseer alle PBS volledig uit het vat in de afvalfles. Maak de slang los van de pomp en sluit de afvalfles af en koppel deze los.
    NOTITIE: Maak altijd alle Robert-klemmen los op de flexibele buizen die betrokken zijn bij de vloeistofstroom in elke stap. Klem terug nadat de vloeistofoverdracht is voltooid voordat u deze afdicht en loskoppelt. Clamp dichter bij de kant van de kopplaat. Losmaken en vastklemmen moet worden uitgevoerd voor alle volgende stappen, tenzij anders vermeld.
  4. Bereid 7 L (30 L) volledig SF hMSC-medium voor en vervang elke originele dop van de fles door een wegwerp C-Flex EZ Top-containersluiting en compatibele dop. Las een filtratiemodule voor eenmalig gebruik aan een van de poorten op de opbergtas voor eenmalig gebruik van 10 l (50 l). Voer de handeling uit van het vervangen van de doppen in een BSC.
  5. Filter en breng het kweekmedium over in de opbergzak, één fles per keer, door de flessen celkweekmedium aan het andere uiteinde van het capsulefilter te lassen en de pomp op de bioreactorcontroller te gebruiken. Aanwijzen als de voerzak.
  6. Las een uitlaatpoort van de toevoerzak naar de C-flex-buis op de toevoerbuis van de kopplaat en installeer de buis op pomp 1 op de bioreactorcontroller. Las de andere uitlaatpoort van de toevoerzak naar de ontluchtingsbuis en installeer de buis om pomp 2 op de bioreactorcontroller in de juiste richting van de vloeistofstroom te installeren.
    NOTITIE: Installeer het gedeelte op de vloeistofstroomleiding, die is gemaakt van siliconenslangen, op de pomp voor een betere weerstand tegen slijtage in vergelijking met C-Flex-buizen. Zorg ervoor dat de buizen in de juiste richting worden geïnstalleerd.
  7. Stel de snelheid van pomp 1 in op 300 tpm en stop de pomp nadat u 1 L (5 L) medium uit de voerzak in het vat hebt gedoseerd, op basis van de volumeafgiftesnelheid vermeld in stap 2.17. Start de temperatuur-, pH- en DO-regeling opnieuw, met dezelfde instellingen als beschreven in stap 2.14.
  8. Sluit de slang die de voerzak verbindt met de vulopening op de kopplaat af en koppel deze los. Las de C-Flex-buis van de fles van de in stap 2.18 voorbereide gedispergeerde microcarriers op de vulopening en pomp alle inhoud uit de fles in het vat. Sluit de lege fles met microcarrier-suspensie af en koppel deze los. Desinfecteer het gehele oppervlak van de fles met 75% ethanol en plaats deze in een BSC om te gebruiken als transferfles voor celsuspensie.
    NOTITIE: Laat een langer stuk C-Flex-buis aan de kant van de kopplaat liggen bij het afdichten en loskoppelen van de wegwerpaccessoires, aangezien in de volgende stappen meerdere las- en loskoppelstappen op dezelfde buis zullen worden uitgevoerd.
  9. Zorg ervoor dat de temperatuur op de regelaar een constante temperatuur van 37 °C bereikt, wat gewoonlijk ongeveer 30 minuten duurt, voordat u verder gaat met het voorbereiden van de zaadcellen zoals in de stappen 1.3-1.4. Resuspendeer 2,5 x 108 hMSC's in 500 ml SF-medium en breng over naar de lege fles die eerder de microcarrier-suspensie bevatte.
    OPMERKING: De zaadcellen voor de uitbreiding van de bioreactor van 15 liter moeten worden voorbereid volgens stap 3.21, met als doel 1,0 x 109 cellen in 500 ml te inoculeren.
  10. Las de C-Flex-buis van de fles die nu de celsuspensie bevat naar de voedingspoort op de kopplaat en pomp alle inhoud van de fles in het vat om de celinoculatie naar de microdragers te starten. Sluit de lege fles af en koppel deze los. Las de toevoerpoort van de voerzak opnieuw aan de vulopening op de kopplaat.
  11. Pas de roerinstellingen op de controller aan om intermitterende agitatie mogelijk te maken voor verbeterde inoculatie-efficiëntie van hMSC's door de volgende parameters in te stellen: V1 = 35 (30) tpm/5 min; V2 = 0 omw/m 25 min; aantal cycli = 12 (24); eindroersnelheid = 35 (30) tpm.
    OPMERKING: De roersnelheid kan worden aangepast tot 40 (35) tpm of 45 (40) tpm als tijdens het kweekproces een niet-uniforme verdeling of sedimentatie van de microdragers wordt waargenomen.
  12. Stel een geautomatiseerd mediumsupplement en -uitwisselingsregime in op de bioreactorcontroller in de Medium Exchange-interface. Stel de parameters voor de hMSC-teelt in zoals vermeld in tabel 2.
    NOTITIE: Maak in dit stadium alle Robert-klemmen los op de flexibele buizen die betrokken zijn bij de vloeistofstroom, vooral voor de toevoer- en ontluchtingsbuis. Houd deze gedurende het hele kweekproces ongeklemd.
  13. Neem de monsters door de bemonsteringsbuis door de wegwerpbemonsteringszakken via Luer-connectoren op de gewenste tijdstippen aan te sluiten, meestal eenmaal per dag, en elke keer 10 ml in de bemonsteringszak te doen. Aliquot 2-3 ml monster in de eerste monsterzak, gooi weg en aliquot vervolgens de werkelijke 10 ml monster elke keer in een nieuwe monsterzak.
    NOTITIE: Het eerste monster van 2-3 ml kan vloeistof zijn die in de buis is achtergebleven vanaf het vorige bemonsteringstijdstip en geeft mogelijk niet nauwkeurig de toestand in het vat weer. Voer deze stappen altijd uit met extra aseptische maatregelen door de Luer-connectoren te ontsmetten voor en na het maken of verbreken van verbindingen met 75% ethanol.
  14. Breng de genomen monsters over in een conische centrifugebuis van 15 ml. Voer de volgende tests uit op de monsters.
    1. Neem 200 μL van de met cellen beladen microcarrier-suspensie en beits deze met Calcein-AM/PI Cell Double Staining volgens de instructies van de fabrikant. Observeer onder een fluorescentiemicroscoop.
    2. Sedimenteer de microdragers door zwaartekracht, wat meestal 5-10 minuten duurt. Zuig het supernatant op en test de glucoseconcentratie met een glucosemeter volgens de instructies van de fabrikant. Teken een grafiek van het glucosegehalte.
    3. Incubeer de bezinkselde met cellen beladen microdragers met een vers bereide 3-5 ml 1 mg/ml digestieoplossing bij 37 °C gedurende 20-30 minuten om de microdragers volledig op te lossen. Tel de cellen na kleuring met AO/PI met een geautomatiseerde fluorescentiecelanalysator. Teken een celgroeicurve. Correleer met de real-time live celgroeicurve die op de controller wordt gegenereerd.
  15. Bereid op dag 4 of dag 5 van de kweek 50 ml (200 ml) digestieoplossing van 30 mg/ml. De verhouding tussen de digestieoplossing en de oplosbare microdragers varieert van 3:20 tot 5:20. Steriel filter met een capsulefilter van 0,22 μm en verder verdunnen in 500 ml (2 L) van Hank's gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) met calcium en magnesium. Breng over naar een wegwerpopbergzak van 3 liter.
    OPMERKING: Bereid de digestieoplossing pas vlak voor het oogsten van cellen. Probeer te streven naar ten minste 1,0 x 10 9-1,2 x 109 cellen voor de uitbreiding van het eerste niveau en 1,0 x 1010 cellen voor de uitbreiding van het tweede niveau. Als de cellen sneller groeien, oogst dan op dag 4; Zo niet, oogst dan op dag 5. Het wordt afgeraden om verder te gaan dan dag 5.
  16. Stel de roersnelheid op 0 in op de controller om de microcarriers te laten bezinken, wat meestal binnen 20 minuten gebeurt. Schakel het geautomatiseerde mediumuitwisselingsprotocol uit en stop de temperatuur-, pH- en DO-regeling op de bioreactorcontroller. Start pomp 2 handmatig bij 300 tpm op de regelaar en doseer supernatans in het toevoerregime om ongeveer 1 L (2 L) kweeksuspensie in het vat achter te laten (met behulp van de volumedoseersnelheid die is vermeld in stap 2.17 of te meten aan de hand van de schaalverdelingsmarkeringen op het lichaam van het vat). Sluit de voerzak af en koppel deze volledig los.
  17. Las de zak met vers bereide digestieoplossing van stap 3.15 in de vulopening en pomp alle inhoud in het vat. Start het roertoerental bij 45 (40) tpm. Zorg ervoor dat de temperatuurregelaar de temperatuur nog steeds op 37 °C houdt. Microcarriers lossen binnen 40-60 minuten op. Neem 1 ml van het monster met een steriele Luerlock-spuit na 30 minuten en vervolgens elke 5-10 minuten om te observeren onder een helderveldmicroscoop om de oplossing van de microdragers te controleren.
  18. Nadat de microcarriers zijn opgelost, last u een opbergzak van 3 liter (twee opbergzakken van 3 liter voor de bioreactor van 15 liter) aan de oogstbuis en pompt u de celsuspensie volledig leeg met pomp 2 bij 300 tpm. Bereid 1 L (3,5 L) zoutoplossing met 1% humaan serumalbumine (HSA) als wasbuffer en 500 ml volledig SF-medium (500 ml cryopreservatiebuffer voor cellen, een formulering van 10% dimethylsulfaat (DMSO) en 90% SF-medium als voorbeeld) in aparte wegwerpopbergzakken met behulp van de methoden en accessoires die in de vorige stappen zijn genoemd voor andere vloeistofoverdrachten.
  19. Schakel het celverwerkingssysteem in, installeer een Disposable Cell Processing Kit op het instrument volgens de instructies van de fabrikant, las de zakken met celsuspensie, wasbuffer en SF-medium (cryopreservatiebuffer) aan de Disposable Cell Processing Kit en volg zorgvuldig alle instructies die op de gebruikersinterface worden weergegeven om de integriteit en juiste installatie van de kit te initialiseren en te controleren.
  20. Zodra de installatie is voltooid, voert u de parameters in tabel 3 in voor het wassen van cellen met wasbuffer en resuspensie in SF-medium (cryopreservatiebuffer) in de software om het was- en resuspensieproces te starten. De hele procedure wordt automatisch uitgevoerd met verschillende handmatige controlepunten.
  21. Neem een monster van de cellen uit de centrifugekamer, zoals aangegeven door het celverwerkingssysteem, en bereken de celdichtheid met een geautomatiseerde celanalysator volgens de instructies van de fabrikant. Pas het resuspensievolume aan voor een dichtheid van 2 x 106 cellen/ml of een maximaal totaal volume van 250 ml.
  22. Sluit de celtransferzak af en koppel deze los van de Disposable Cell Processing Kit nadat het systeem de cellen uit de kamer heeft opgezogen. Pas de celdichtheid indien nodig opnieuw aan tot 2 x 106 cellen/ml met volledig SF-medium in een grotere celtransferzak/medium-opbergzak. Dit zullen de zaadcellen zijn voor de tweedelijnsexpansie in de 15 L bioreactor.

4. Celformulering, vulling en afwerking

  1. Begin 1 dag voor de celoogst van de 5 L-bioreactor met het voorbereiden van de 15 L-bioreactor. Volg de stappen in protocolsectie 2 en 3 volledig, behalve met de parameters voor 15 L die tussen haakjes zijn aangegeven.
  2. Resuspendeer de cellen in 250 ml cryopreservatiebuffer en sluit en koppel de celtransferzak los van de Disposable Cell Processing Kit nadat het systeem de cellen uit de kamer heeft opgezogen.
  3. Breng 2.000 ml cryopreservatiebuffer samen met de 250 ml geresuspendeerde cellen over van stap 4.2 naar een transferzak met 3 L-cellen. Las deze transferzak aan een Disposable Fill & Finish Consumable Kit.
    OPMERKING: Het extra volume cryopreservatiebuffer dat hier wordt gebruikt, moet worden bepaald door de specificatie van de formulering en de berekening van het totale aantal cellen volgens de telresultaten die zijn verkregen in stap 3.21
  4. Monteer de Disposable Fill &Finish Consumable Kit op het celvulsysteem en schakel het voorkoelsysteem in volgens de instructies van de fabrikant. Volg de instructies op het systeem en stel in om 20 ml/zak te vullen met in totaal 20 zakken per batch. Sluit deze zakken af en koppel ze los van de kit en volg de standaard cryopreservatieprocedures. Gebruik cryo-opslagzakken.
  5. Las een nieuwe set van 20 cryopreservatiezakken aan de Disposable Fill & Finish Consumable Kit en herhaal de vul- en afwerkingsprocedure totdat alle cellen zijn gealiquoteerd. Volg de standaardprocedures om deze cellen te cryopreservatie.

5. Karakterisering van de celkwaliteit

  1. Bemonstering van de geoogste hMSC's van de oplosbare microdragers en gebruik een celverwerkingssysteem voor karakterisering door middel van flowcytometrie voor de bepaling van de celidentiteit volgens de methoden beschreven in literatuur18.
  2. Ontdooi de gecryopreserveerde cellen en plaats ze opnieuw op conventionele 2D-kolven of microplaten voor verdere karakterisering van de celkenmerken, inclusief de celmorfologie en het differentiatievermogen van de tri-lineage, volgens methoden beschreven in literatuur18.

6. HEK293T expansie op G02-microcarriers in de bioreactor met geroerde tank

  1. Bereid een bioreactor van 5 liter voor zoals vermeld in stap 2. Kweek voor HEK293T cellen de cellen met steriele G02-microdragers in plaats van W01. Het kweekproces is vergelijkbaar met in protocolsectie 3, hoewel sommige parameters anders zijn, zoals in de volgende stappen zal worden beschreven. Installeer een speciale perfusiebuis in de bioreactor ter vervanging van de ontluchtingsbuis, aangezien perfusie nodig is voor de kweek van HEK293T cellen.
  2. In afwijking van het protocol dat wordt beschreven in protocolsectie 3, bereidt u 20 g G02-microdragers (d.w.z. twee flessen) in DMEM met 10% FBS voor de bioreactor van 5 L, waarbij het kweekvolume van dag 0 is vastgesteld op 3,5 L (d.w.z. een eindconcentratie van ongeveer 5,71 g/l). Doseer 2 L medium in het vat vóór de twee flessen G02-microdragers en inoculeer 500 ml 1,75 x 109 HEK293T cellen (d.w.z. bij een einddichtheid van 5 x 105 cellen/ml).
  3. Voer een agitatieregime en een mediumuitwisselingsregime uit (gebaseerd op de hoeveelheid medium die per dag moet worden uitgewisseld, uitgedrukt als kweekvolume per dag, CVD), die verschilt van protocolsectie 3 en wordt beschreven in tabel 4.
    NOTITIE: Activeer pomp 1 en pomp 2 handmatig, zodat beide continu kunnen pompen om perfusie tot stand te brengen. Pas de pompsnelheid elke dag aan om te voldoen aan de perfusiesnelheid op basis van de kalibratie van de volumeafgiftesnelheid van de pompen. Meestal zal dit in het bereik van één cijfer liggen. Gebruik voor HEK293T cellen vers medium als voer en gooi verbruikt medium volledig weg in een afvalfles, in tegenstelling tot hMSC's, waarvoor het medium wordt gecirculeerd.
  4. Gebruik voor de uitbreiding van de tweede laag naar de 15 L-bioreactor de HEK293T cellen van kraal tot kraal in plaats van volledige oplossing van de microdragers zoals bij hMSC's. Stop in het bijzonder het roeren om de microcarriers te bezinken nadat de gewenste celdichtheid is bereikt, en zuig vervolgens zoveel mogelijk supernatant uit de perfusiebuis, voed PBS met 3 keer het volume resterende suspensie om de microcarriers te wassen en herhaal drie keer. Zuig zoveel mogelijk PBS op en gooi het weg in de laatste wasbeurt.
  5. Voer 3,5 L 1x recombinant trypsine toe om de cellen los te maken van de microdragers terwijl de G02-microdragers intact blijven. Stel de temperatuur in op 37 °C en het roertoerental op 60 omw/min. Beëindig de onthechting binnen 45 minuten, wanneer meer dan 80% van de cellen is losgekomen, met een gelijke hoeveelheid volledig medium.
  6. Rechtstreeks overbrengen van de oogsthaven naar een voorbereid schip van 15 liter voor uitbreiding op het tweede niveau.

7. Expansie van Vero-cellen op V01-microdragers in de bioreactor met geroerde tank

  1. Bereid V01-microcarriers voor door de gevriesdroogde microcarriers samen met PBS in het bioreactorvat over te brengen tot een concentratie van 20 mg/ml. Monteer en steriliseer het vat zoals vermeld in protocolsectie 2, maar autoclaaf in plaats daarvan gedurende 30 minuten.
  2. Na sterilisatie komen V01-microdragers op natuurlijke wijze tot rust. Vervang het supernatans twee keer door basis-DMEM met behulp van de ontluchtings- en voedingssondes, en voeg de volledige DMEM met 10% NBS toe aan 50%-75% van het volume van het vat voordat u doorgaat met protocolsectie 3 voor celinoculatie en -kweek.
  3. Anders dan het protocol dat wordt beschreven in protocolsectie 3, gebruikt u 24 g V01-microdragers voor een 4 L-kweek van Vero-cellen (d.w.z. een eindconcentratie van 6 g/L) en inoculeert u 500 ml 4 x 109 Vero-cellen (d.w.z. met een einddichtheid van 1 x 106 cellen/ml).
  4. Volg de stappen 6.3-6.6 voor de parameters van het kweekproces en de overgang naar tweedelijns expansie in de 15 L geroerde tank bioreactor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Het ACISCP-platform is een volledig gesloten systeem dat gebruik maakt van een reeks bioreactoren met geroerde tanks voor opschalingsuitbreiding, een celverwerkingssysteem voor geautomatiseerde celoogst en -formulering, en een celvulsysteem (Figuur 1). Hechtende cellen hechten zich aan de poreuze microdragers, die in de bioreactor kunnen worden gedispergeerd, waardoor de hangende kweek van aanhangende cellen wordt bereikt.

Volgens het beschreven protocol werden eerst 2,5 x 108 hMSC's met 10 g W01-microcarriers geïnoculeerd in een bioreactor met een roertank van 5 liter voor een eerste expansie. Ongeveer 2,9 x 10 9 cellen werden geconcentreerd en gewassen door het celverwerkingssysteem op dag 4, waarvan 1,0 x 109 geoogste cellen werden overgebracht naar de 15 L geroerde tank bioreactor met 40 g W01-microdragers voor de tweede fase van de teelt. Uiteindelijk werden op dag 9 1,1 x10 10 MSC's geoogst, geformuleerd en verdeeld in meer dan 70 formuleringszakken (Figuur 2A). Het celaantal, de levensvatbaarheid en het glucoseverbruik werden dagelijks gecontroleerd (Figuur 2B,C). Er werd een cumulatieve 128-voudige expansie bereikt; Ondertussen werd de levensvatbaarheid van de cellen hoger gehouden dan 90%. De inname van glucose vertoonde een negatieve correlatie met celexpansie, wat wijst op metabolisme geassocieerd met gezonde celgroei.

De oplosbare poreuze microdragers kunnen worden voorgesteriliseerd en worden geleverd in een gesloten systeemverpakking voor eenmalig gebruik, geschikt voor GMP (Figuur 3A). De cellen kunnen zich hechten aan het oppervlak van de microdragers en de binnenwand van de macroporiën (Figuur 3B). Door gebruik te maken van een fluorescerende kleurstof, zoals Calcein-AM/PI Cell Double Staining Kit, konden de cellen in de poreuze microsferen worden gevisualiseerd (Figuur 3C). Het samenvoegen van helderveldbeelden met fluorescerende beelden hielp bij het analyseren van de uniformiteit van de celverdeling. De kleuring van levende cellen vertoonde ook een sterke associatie met het tellen van cellen, gemeten door handmatige bemonstering of de online sonde voor het tellen van levende cellen.

Naast de enorme vraag naar hoge celhoeveelheden, zijn beoordelingen van kritische kwaliteitskenmerken (CQA) en vrijgavetests van MSC's onmisbaar, omdat zonder deze cellen na het kweken niet kunnen worden gesteriliseerd of uitgebreid gezuiverd. Om de celkwaliteit te garanderen, kunnen 3D-geëxpandeerde MSC's in elke fase van het ACISCP-platform worden bemonsterd. MSC's die vers van het ACISCP-platform werden geoogst, behielden klassieke fenotypische markers22, met een expressie van respectievelijk >95% en <2% voor de positieve markers (CD73, CD90, CD105) en negatieve markers (HLA-DR, CD34, CD45, CD19, CD14) (Figuur 4A). De gecryopreserveerde cellen werden ontdooid en geïnoculeerd in een 2D vlakke kolf en vertoonden een goed hechtingsvermogen, normaal expansiegedrag (Figuur 4B) en een typische spoelvorm met spiraalvormige groei (Figuur 4C). Bovendien behielden de cellen ook hun vermogen om te differentiëren in osteogene, adipogene en chondrogene lijnen (Figuur 4D).

Bovendien werden HEK293T cellen en Vero-cellen ook getest in het ACISCP-platform. Voor HEK293T celkweek was de concentratie inoculumcellen 5 x 10 5 cellen/ml in de bioreactor van5 liter. Na het overdrachtsproces van kraal naar kraal bereikte de piekcelconcentratie 1,68 x 107 cellen/ml in de 15 L bioreactor (Figuur 5A), en de HEK293T cellen behielden een hoge levensvatbaarheid (Figuur 5B). Voor de Vero-celkweek was de inoculumcelconcentratie 2 x 105 cellen/ml in de 5 L-bioreactor. Na het overdrachtsproces van kraal naar kraal bedroeg de bereikte piekcelconcentratie 1,08 x 107 cellen/ml in de 15 L-bioreactor (Figuur 6A), en de Vero-cellen behielden ook een hoge levensvatbaarheid (Figuur 6B).

Figure 1
Figuur 1: Schematische roadmap van hMSC-productie via het ACISCP-platform. Dit cijfer is aangepast op basis van gepubliceerde literatuur18. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Celuitbreiding van hMSC's via het ACISCP-platform. (A) Het ACISCP-platform bestaat uit een reeks geroerde bioreactoren, een celverwerkingssysteem en een celvulsysteem. (B) Groeicurve van hMSC's in het tweeledige expansieproces, (C) en de glucoseconsumptie tijdens het proces. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Karakterisering van hMSC-groei op de W01-microdrager. Dit cijfer is aangepast op basis van gepubliceerde literatuur18. (A) W01-microdragers worden bereid met een gesloten systeemverpakking voor eenmalig gebruik. (B) Scanning-elektronenmicroscoopbeelden van lege microdragers en microdragers gekweekt met aanhangende hMSC's. De witte driehoekige koppen duiden op cellen op het oppervlak van microdragers; schaalbalk = 100 μm. (C) Representatieve samengevoegde helderveld- en fluorescentiebeelden (kleuring van levende cellen) van hMSC's gekweekt op microdragers van dag 1 tot dag 4; schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Beoordeling van de celidentiteit van hMSC's die zijn geoogst van het ACISCP-platform . (A) De oppervlaktemarkers van hMSC's werden gekarakteriseerd door middel van flowcytometrie. Alle positieve markers (>95%) en negatieve markers (<2%) voldeden aan de criteria. (B) Gecryopreserveerde 3D-geëxpandeerde hMSC's vertoonden normaal expansiegedrag na ontdooien en opnieuw plateren in 2D-kolven. (C) Morfologie van de 3D-geëxpandeerde hMSC's; schaalbalk = 50 μm. (D) Tri-lineage differentiatie van de 3D-geëxpandeerde hMSC's. Osteogene, adipogene en chondrogene eigenschappen werden beoordeeld door respectievelijk Alizarinerood, Olierood en Alcianblauw. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Celexpansie van HEK293T cellen via het ACISCP-platform. (A) HEK293T celdichtheid in de bioreactoren van 5 L en 15 L. (B) Bright-field (BF) beeld, Calceïne-AM-gekleurd (Live) en PI-gekleurd (Dead) HEK293T cellen gekweekt op G02-microdragers; schaalbalk = 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: Celexpansie van Vero-cellen via het ACISCP-platform . (A) Vero-celdichtheid in de bioreactoren van 5 L en 15 L. (B) Bright-field (BF) beeld, Calcein-AM-gekleurd (Live) en PI-gekleurd (Dead) Vero-cellen gekweekt op V01-microdragers; schaalbalk = 400 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1: Parameterinstellingen van de bioreactor met roertank. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 2: Parameterinstellingen van geautomatiseerde mediumuitwisseling voor hMSC-teelt. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 3: Parameterinstellingen van het celverwerkingssysteem voor hMSC-passage en -formulering. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 4: Mediumuitwisselingsregime en agitatieregime voor HEK293T- en Vero-cellen. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Zowel immunotherapie als stamceltherapie maken gebruik van levende cellen als medicijnen; Hun eindproducten mogen echter niet op dezelfde manier worden gezuiverd of gesteriliseerd als kleine moleculen of virussen. Daarom moet het principe van Quality by Design (QbD) altijd in gedachten worden gehouden en praktisch worden toegepast op het Chemical Manufacturing and Control (CMC)-proces tijdens de celproductie23. Een volledig gesloten celkweeksysteem, evenals een verwerkingssysteem en een vulsysteem, worden bij voorkeur beschouwd om aan de eisen te voldoen. In deze studie hebben we een protocol gepresenteerd voor het gebruik van een ACISCP-platform op basis van GMP-kwaliteit, oplosbare en poreuze 3D-microcarriers om een tweeledige uitbreiding van hMSC's uit te voeren. Sommige onderzoekers hebben de haalbaarheid onderzocht van het gebruik van bioreactoren samen met microcarriers om hMSC's in vitro uit te breiden, maar de meerderheid van de gerapporteerde studies heeft aangetoond dat een schaalvergroting zou leiden tot een afname van de hMSC-opbrengst, van 6,1 x 10 5 cellen/ml of zelfs 12,5 x 10 5 cellen/ml in 100 ml werkvolume tot 2,7 x 10 5 cellen/ml in 2 L werkvolume24, 25,26. Hoewel bioreactoren met geroerde tanks de hoogste schaalbaarheid vertonen, moeten belangrijke kwesties zoals de structurele kenmerken van het vat, het waaiertype, de tipsnelheid, de volumetrische massaoverdrachtscoëfficiënt, kLa, van zuurstof en het vermogensgetal grondig worden overwogen24. In tegenstelling tot eerdere bioreactoren met geroerde tanks, die meestal werden ontworpen voor de kweek van microben of gedomesticeerde verankeringsonafhankelijke cellen zoals CHO-cellen, is de bioreactor die in deze studie wordt gebruikt specifiek ontworpen voor op microcarriers gebaseerde kweek en is dus in staat om te voldoen aan de verschillende procesbehoeften van strategieën voor de uitwisseling van voedingsstoffen. Naast verschillen in het proces van celkweek, maakt het ACISCP-platform gebruik van een celverwerkingssysteem op basis van een continue stroomcentrifuge in combinatie met een celvulsysteem, in tegenstelling tot conventionele oogstprocedures voor het produceren van grote hoeveelheden cellen die worden uitgevoerd door herhaald handmatig werk, waardoor een hoge verwerkingsefficiëntie wordt gegarandeerd. Geavanceerde geautomatiseerde apparaten hebben een hoog rendement in productie in één batch.

De meeste stamcellen zijn afhankelijk van de verankering; Daarom eisen ze microcarriers voor de productie van cellen. Conventioneel werden eerdere commerciële microcarriers geformuleerd om gebruik te maken van verschillende oppervlakte-eigenschappen, waardoor verschillende celexpansievouwen werden bereikt. In eerder onderzoek produceerde het gebruik van Cytodex type 1 microcarriers voor MSC's in het beenmerg van varkens een celdichtheid van ongeveer 4 x 10 5 cellen/ml, terwijl het gebruik van met gelatine gecoate Cytodex type 3 vergelijkbare celaantallen (3,8 x 105 cellen/ml) produceerde als menselijke placenta MSC's27. Desalniettemin zijn Cytodex type 1 en type 3 niet oplosbaar, en dus heeft het trypsinisatieproces tijdens het oogsten van cellen niet alleen invloed op de opbrengst van celherstel, maar ook op de levensvatbaarheid en kwaliteit. Er zijn dan ook geen succesvolle gevallen van het gebruik van conventionele microcarriers voor CGT-producten, waarbij cellen als eindproduct geen uitgebreide stroomafwaartse zuiveringsprocessen kunnen ondergaan om de verontreiniging van niet-oplosbare microcarriers te elimineren28. W01-microcarriers daarentegen zijn volledig oplosbaar, wat betekent dat de celproducten gemakkelijk kunnen worden geoogst door afbraak van de microcarrier. Dit microcarrier-product wordt ook geleverd in een volledig gesloten systeemverpakking, wat betekent dat een verwerkingsproces dat voldoet aan GMP gemakkelijk kan worden bereikt. We hebben aangetoond dat passaging met een tweeledig expansieproces gemakkelijk kan worden bereikt met W01-microdragers, en dat in totaal 1,1 x10 10 cellen in één batch kunnen worden geoogst; dit kon inderdaad alleen worden bereikt in bioreactoren van 50 L in eerdere rapporten29,30. In dit werk bereikte de piekceldichtheid in de bioreactor met geroerde tank ongeveer 11,6 x 105 cellen/ml vóór de oogst. Men zou dus kunnen verwachten dat men gemakkelijk 1 x 1011 cellen per batch zou kunnen bereiken met een bioreactor van 100-200 L in het ACISCP-platform, wat zou betekenen dat duizend batches per jaar gemakkelijk aan de vraag naar 300 biljoen hMSC's per jaar zouden kunnen voldoen.

Omdat cellen verschillende eigenschappen hebben, worden verschillende soorten 3D-microdragers geproduceerd en zijn ze beschikbaar om de compatibiliteit tussen een specifieke cel en een microdrager te testen. Voor niet-cellige eindproducten in CGT is gemeld dat op microcarriers gebaseerde scale-ups voor HEK293T cellen en Vero-cellen in bioreactoren respectievelijk 1,5 x 10 6 cellen/ml en 3,3 x 106 cellen/ml31 bereiken. We gebruikten oplosbare poreuze microdragers, G02 en V01, in het ACISCP-platform om respectievelijk HEK293T cellen en Vero-cellen uit te breiden, en de piekceldichtheden van beide cellen bereikten meer dan 1 x 107 cellen/ml. Bovendien kan de afbreekbaarheid van 3D-microdragers gunstig zijn voor de productie van biologische producten van intracellulaire virussen, omdat de cellen gemakkelijk kunnen worden gescheiden van de microdragers. Van cruciaal belang is dat het ACISCP-platform een gevestigd nieuw bioproductieproces vertegenwoordigt dat voldoet aan zowel de kwantiteits- als kwaliteitseisen voor cel- en gentherapieproducten. We verwachten dat ons grootschalige celproductieplatform zal fungeren als een essentieel hulpmiddel om de ontwikkeling van cel- en gentherapieën mogelijk te maken.

Ondanks de hierboven besproken voordelen van het platform, moeten er in de toekomst nog verschillende beperkingen worden omzeild. Ten eerste zijn de bioreactoren die in de huidige vorm in het ACISCP-platform worden gebruikt, nog steeds uitgerust met glazen tanks, die ingewikkelde wasprocedures en reinigingsverificatie vereisen om aan de criteria van GMP te voldoen. Een bioreactorsysteem met geroerde tanks voor eenmalig gebruik zou in de toekomst mogelijk kunnen worden gebruikt om een intacte set verbruiksartikelen voor eenmalig gebruik te produceren. Ten tweede zijn hMSC's, anders dan gedomesticeerde cellijnen, primaire celstammen geïsoleerd uit individuele donoren en gevarieerde weefsels, wat betekent dat hMSC's heterogeniteit vertonen. Daarom dient het in dit document beschreven protocol als referentie, terwijl systematische procesontwikkelingen nodig zijn om de technische migratie van het ACISCP-platform te realiseren. Ten derde, hoewel onze collega's voorlopig de haalbaarheid hebben getest van de productie van het vacciniavirus met Vero-cellen32, moet nog verder worden gevalideerd of goede prestaties voor virale productie in de 3D-expansie van HEK293T cellen kunnen worden bereikt. Concluderend biedt de grootschalige celproductiemethode van het ACISCP-platform, gebaseerd op oplosbare poreuze microdragers en een reeks geautomatiseerde gesloten systemen, een kans om de productie-efficiëntie te verbeteren en de kwaliteitscontrole op industriële schaal te verfijnen voor de productie van CGT-producten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Y.D. is een wetenschappelijk adviseur en H.X., Y.Z., L.G., M.L., Y.Y., W.L. en X.Y. zijn werknemers van Beijing CytoNiche Biotechnology Co. Ltd. De andere auteurs hebben geen commercieel, eigendomsrechtelijk of financieel belang in de producten of bedrijven die in dit artikel worden beschreven. Alle andere auteurs verklaren dat zij geen tegenstrijdige belangen hebben.

Acknowledgments

Dit werk werd financieel ondersteund door de National Science Foundation for Distinguished Young Scholars (82125018).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% trypsin EDTA BasalMedia S310JV Used for 2D cell harvest.
3D FloTrix Digest CytoNiche Biotech R001-500 This is a reagent that specifically dissolves 3D TableTrix microcarriers.
3D FloTrix MSC Serum Free Medium CytoNiche Biotech RMZ112 This is a serum-free,animal-free medium for mesenchymal stem cell expansion and maintenance in 2D planar culture as well as 3D culture on 3D TableTrix microcarriers.
3D FloTrix Single-Use Filtration Module CytoNiche Biotech R020-00-10 This module contains 0.22 μm capsule filters used for filtration of culture medium and digest solution.
3D FloTrix Single-Use Storage Bag (10 L) CytoNiche Biotech R020-00-03 Used as feed bag for 5 L bioreactor.
3D FloTrix Single-Use Storage Bag (3 L) CytoNiche Biotech R020-00-01 Used as cell seeding or transfer bags.
3D FloTrix Single-Use Storage Bag (50 L) CytoNiche Biotech R020-00-04 Used as feed bag for 15 L bioreactor.
3D FloTrix vivaPACK Disposable Fill&Finish Consumable Kit CytoNiche Biotech PACK-01-01 This is a standard kit adapted to 3D vivaPACK fill and finish system.
3D FloTrix vivaPACK fill and finish system for cells CytoNiche Biotech vivaPACK This system is a closed liquid handling device, with automated mixing and gas exhausting functions. Cells resuspended in cryopreservation buffer can be rapidly and evenly aliquoted into 20 bags per batch.
3D FloTrix vivaPREP PLUS cell processing system CytoNiche Biotech vivaPREP PLUS This system is a continuous flow centrifuge-based device.Cells can be concentrated, washed, and resuspended under completely closed procedures.
3D FloTrix vivaPREP PLUS Disposable Cell Processing Kit CytoNiche Biotech PREP-PLUS-00 This is a standard kit adapted to 3D vivaPREP PLUS cell processing.
3D FloTrix vivaSPIN  bioreactor 15 L CytoNiche Biotech FTVS15 This bioreactor product employs a controller, a 15 L glass stirred-tank vessel, and assessories. A special perfusion tube is available.
3D FloTrix vivaSPIN  bioreactor 5 L CytoNiche Biotech FTVS05 This bioreactor product employs a controller, a 5 L glass stirred-tank vessel, and assessories.A special perfusion tube is available.
3D FloTrix vivaSPIN Closed System Consumable Pack (10/15 L) CytoNiche Biotech R020-10-10 This is a standard tubing kit adapted to 3D vivaSPIN bioreactor 15 L, containing sampling bags.
3D FloTrix vivaSPIN Closed System Consumable Pack (2/5 L) CytoNiche Biotech R020-05-10 This is a standard tubing kit adapted to 3D vivaSPIN bioreactor 5 L, containing sampling bags.
3D TableTrix microcarriers G02 CytoNiche Biotech G02-10-10g These porous and degradable microcarriers are suitable for HEK293T cell culture. They come pre-sterilized in 10g/bottle with C-Flex tubings for welding to tubes on bioreactors.
3D TableTrix microcarriers V01 CytoNiche Biotech V01-100-10g These porous and degradable microcarriers are suitable for adherent cell culture, they come as non-sterilized microcarriers that need to be autoclaved in PBS before use. They are especially suitable for vaccine production.
3D TableTrix microcarriers W01 CytoNiche Biotech W01-10-10g (single-use packaging);
W01-200 (tablets)		 These porous and degradable microcarriers are suitable for adherent cell culture, especially for cells that need to be harvested as end products. They come pre-sterilized in 10g/bottle with C-Flex tubings for welding to tubes on bioreactors.The product has obtained 2 qualifications for pharmaceutical excipients from CDE, with the registration numbers of [F20200000496; F20210000003]. It has also received DMF qualification for pharmaceutical excipients from FDA, with the registration number of [DMF:35481]
APC anti-human CD45 Antibody BioLegend 368512 Used in flow cytometry for MSC identity assessment
Calcein-AM/PI Double Staining Kit Dojindo C542 Calcein-AM/PI Double Staining Kit is utilized for simultaneous fluorescence staining of viable and dead cells. This kit contains Calcein-AM and Propidium Iodide (PI) solutions, which stain viable and dead cells, respectively.
Cap for EZ Top Container Closures for NALGENE-containers (500mL) Saint-Gobain CAP-38 Brands and catalogue numbers are only for example, similar products are available from various suppliers and as long as they have the same functionality, items could be substituted with other brands.
C-Flex Tubing, Formulation 374 (0.25 in x 0.44 in) Saint-Gobain 374-250-3 Used for tube welding and disconnection.
CryoMACS Freezing Bag 50 Miltenyi Biotec  200-074-400 Used for expanding the 3D FloTrix vivaPACK Disposable Fill&Finish Consumable Kit.
Dimethyl Sulfate (DMSO)  Sigma D2650-100mL Used for preparation of cryopreservation solution.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) BasalMedia L120KJ Used for cultivation of HEK293T and Vero cells.
DURAN Original GL 45 Laboratory bottle (2 L) DWK life sciences 218016357 Used for waste collection from the 5 L bioreactor.
DURAN Original GL 45 Laboratory bottle (5 L) DWK life sciences 218017353 Used for waste collection from the 15 L bioreactor.
DURAN Original GL 45 Laboratory bottle (500 mL) DWK life sciences 218014459 Used for supplementary bottle of 0.1 M NaOH.
EZ Top Container Closures for NALGENE-containers (500mL) Saint-Gobain EZ500 ML-38-2 Brands and catalogue numbers are only for example, similar products are available from various suppliers and as long as they have the same functionality, items could be substituted with other brands.
Fetal bovine serum (FBS) superior quality Wisent 086-150 Used for cultivation of HEK293T cells.
FITC anti-human CD14 Antibody BioLegend 301804 Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
FITC anti-human CD34 Antibody BioLegend 343504 Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
FITC anti-human CD90 (Thy1) Antibody BioLegend 328108 Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
Flow cytometry Beckman Coulter CytoFLEX Used for cell identity assessment.
Fluorescence Cell Analyzer Alit life science Countstar Rigel S2 Used for cell counting. Cell viability can be calculated by staining with AO/PI dyes.
GL 45 Multiport Connector Screw Cap with 2 ports  DWK life sciences 292632806 Brands and catalogue numbers are only for example, similar products are available from various suppliers and as long as they have the same functionality, items could be substituted with other brands.
Glucose Meter Sinocare 6243578 Used for detecting glucose concentration in cell culture medium and supernatant.
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), with calcium and magnesium Gibco 14025092 Used for preparation of digest solution.
Human Albumin 20% Behring (HSA) CSL Behring N/A Used for preparation of wash buffer.
Inverted fluorescent microscope OLYMBUS CKX53SF Used for brifgt field and fluorescent observation and imaging.
Nalgene Measuring Cylinder (500 mL) Thermo Scientific 3662-0500PK Used for calibrating the liquid handling volume speed of peristaltic pumps.
Newborn calf serum (NBS) superfine MINHAI BIO SC101.02 Used for cultivation of Vero cells.
OriCell human mesenchymal stem cell adipogenic differentiation and characterization kit Cyagen HUXUC-90031 Used for tri-lineage differentiation of hUCMSCs.
OriCell human mesenchymal stem cell chondrogenic differentiation and characterization kit Cyagen HUXUC-90041 Used for tri-lineage differentiation of hUCMSCs.
OriCell human mesenchymal stem cell osteogenic differentiation and characterization kit Cyagen HUXUC-90021 Used for tri-lineage differentiation of hUCMSCs.
PE anti-human CD105 Antibody BioLegend 800504 Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
PE anti-human CD19 Antibody BioLegend 302208 Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
PE anti-human CD73 (Ecto-5'-nucleotidase) Antibody BioLegend 344004 Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
PE anti-human HLA-DR Antibody BioLegend 307605 Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
Phosphate Buffered Saline (PBS) Wisent 311-010-CL Used in autoclaving of glass vessel and V01 microcarriers, and replacement of culture medium.
Sani-Tech Platinum Cured Sanitary Silicone Tubing (0.13 in x 0.25 in) Saint-Gobain ULTRA-C-125-2F Used for solution transfering driven by peristaltic pumps.
Sterile Saline Hopebiol HBPP008-500 Used for preparation of wash buffer.
Trypzyme Recombinant Trypsin BasalMedia S342JV This reagent is used for bead-to-bead transfer of HEK293T and Vero cells.
Tube Sealer Yingqi Biotech Tube Sealer I This sealer is compatible with both C-Flex tubing and PVC tubing.
Tube Welder for PVC tubing Chu Biotech Tube Welder Micro I Used for welding of PVC tubing.
Tube Welder for TPE tubing Yingqi Biotech Tube Welder I-V2 Used for welding of TPE tubing.
ViaStain AO / PI Viability Stains Nexcelom CS2-0106-25mL Dual-Fluorescence Viability, using acridine orange (AO) and propidium iodide (PI), is the recommended method for accurate viability analysis of primary cells, such as PBMCs, and stem cells in samples containing debris.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Golchin, A., Farahany, T. Z. Biological products: Cellular therapy and FDA approved products. Stem Cell Reviews and Reports. 15 (2), 166-175 (2019).
  2. Young, C. M., Quinn, C., Trusheim, M. R. Durable cell and gene therapy potential patient and financial impact: US projections of product approvals, patients treated, and product revenues. Drug Discovery Today. 27 (1), 17-30 (2022).
  3. Elverum, K., Whitman, M. Delivering cellular and gene therapies to patients: solutions for realizing the potential of the next generation of medicine. Gene Therapy. 27 (12), 537-544 (2020).
  4. Blache, U., Popp, G., Dünkel, A., Koehl, U., Fricke, S. Potential solutions for manufacture of CAR T cells in cancer immunotherapy. Nature Communications. 13 (1), 5225 (2022).
  5. Lee, B., et al. Cell culture process scale-up challenges for commercial-scale manufacturing of allogeneic pluripotent stem cell products. Bioengineering. 9 (3), 92 (2022).
  6. Emerson, J., Glassey, J. Bioprocess monitoring and control: Challenges in cell and gene therapy. Current Opinion in Chemical Engineering. 34, 100722 (2021).
  7. Robb, K. P., Fitzgerald, J. C., Barry, F., Viswanathan, S. Mesenchymal stromal cell therapy: progress in manufacturing and assessments of potency. Cytotherapy. 21 (3), 289-306 (2019).
  8. Olsen, T. R., Ng, K. S., Lock, L. T., Ahsan, T., Rowley, J. A. Peak MSC-Are we there yet. Frontiers in Medicine. 5, 178 (2018).
  9. Roots Analysis. Stem Cell Therapy Contract Manufacturing (CMO) Market, 2019 - 2030. , Available from: https://www.rootsanalysis.com/reports/view_document/stem-cell-therapy-contract-manufacturing-market-2019-2030/271.html (2019).
  10. Elseberg, C. L., et al. Microcarrier-based expansion process for hMSCs with high vitality and undifferentiated characteristics. The International Journal of Artificial Organs. 35 (2), 93-107 (2012).
  11. de Soure, A. M., Fernandes-Platzgummer, A., Silva, da, L, C., Cabral, J. M. Scalable microcarrier-based manufacturing of mesenchymal stem/stromal cells. Journal of Biotechnology. 236, 88-109 (2016).
  12. Rafiq, Q. A., Coopman, K., Nienow, A. W., Hewitt, C. J. Systematic microcarrier screening and agitated culture conditions improves human mesenchymal stem cell yield in bioreactors. Biotechnology Journal. 11 (4), 473-486 (2016).
  13. Tavassoli, H., et al. Large-scale production of stem cells utilizing microcarriers: A biomaterials engineering perspective from academic research to commercialized products. Biomaterials. 181, 333-346 (2018).
  14. Mizukami, A., et al. Technologies for large-scale umbilical cord-derived MSC expansion: Experimental performance and cost of goods analysis. Biochemical Engineering Journal. 135, 36-48 (2018).
  15. Yan, X., et al. Dispersible and dissolvable porous microcarrier tablets enable efficient large-scale human mesenchymal stem cell expansion. Tissue Engineering. Part C, Methods. 26 (5), 263-275 (2020).
  16. Carletti, E., Motta, A., Migliaresi, C. Scaffolds for tissue engineering and 3D cell culture. 3D Cell Culture: Methods and Protocols. Haycock, J. W. , Humana Press. Totowa, NJ. 17-39 (2011).
  17. Loh, Q. L., Choong, C. Three-dimensional scaffolds for tissue engineering applications: Role of porosity and pore size. Tissue Engineering. Part B Reviews. 19 (6), 485-502 (2013).
  18. Zhang, Y., et al. GMP-grade microcarrier and automated closed industrial scale cell production platform for culture of MSCs. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 16 (10), 934-944 (2022).
  19. NMPA. Pharmaceutical Excipient Registration Database: Microcarrier tablets for cells. Center for Drug Evaluation. , Available from: https://www.cde.org.cn/main/xxgk/listpage/ba7aed094c29ae314670a3563a716e (2023).
  20. List of Drug Master Files (DMFs). US Food and Drug Administration. , Available from: https://www.fda.gov/drug-mater-files-dmfs/list-drug-master-files-dmfs (2023).
  21. Beeravolu, N., et al. Isolation and characterization of mesenchymal stromal cells from human umbilical cord and fetal placenta. Journal of Visualized Experiments. (122), e55224 (2017).
  22. Xie, Y., et al. The quality evaluation system establishment of mesenchymal stromal cells for cell-based therapy products. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 176 (2020).
  23. Maillot, C., Sion, C., De Isla, N., Toye, D., Olmos, E. Quality by design to define critical process parameters for mesenchymal stem cell expansion. Biotechnology Advances. 50, 107765 (2021).
  24. Silva Couto, P., et al. Expansion of human mesenchymal stem/stromal cells (hMSCs) in bioreactors using microcarriers: Lessons learnt and what the future holds. Biotechnology Advances. 45, 107636 (2020).
  25. Chen, S., et al. Facile bead-to-bead cell-transfer method for serial subculture and large-scale expansion of human mesenchymal stem cells in bioreactors. Stem Cells Translational Medicine. 10 (9), 1329-1342 (2021).
  26. Tsai, A. C., Pacak, C. A. Bioprocessing of human mesenchymal stem cells: From planar culture to microcarrier-based bioreactors. Bioengineering. 8 (7), 96 (2021).
  27. Hewitt, C. J., et al. Expansion of human mesenchymal stem cells on microcarriers. Biotechnology Letters. 33 (11), 2325-2335 (2011).
  28. Mawji, I., Roberts, E. L., Dang, T., Abraham, B., Kallos, M. S. Challenges and opportunities in downstream separation processes for mesenchymal stromal cells cultured in microcarrier-based stirred suspension bioreactors. Biotechnology and Bioengineering. 119 (11), 3062-3078 (2022).
  29. Schirmaier, C., et al. Scale-up of adipose tissue-derived mesenchymal stem cell production in stirred single-use bioreactors under low-serum conditions. Engineering in Life Sciences. 14 (3), 292-303 (2014).
  30. Lawson, T., et al. Process development for expansion of human mesenchymal stromal cells in a 50L single-use stirred tank bioreactor. Biochemical Engineering Journal. 120, 49-62 (2017).
  31. Yang, J., et al. Large-scale microcarrier culture of HEK293T cells and Vero cells in single-use bioreactors. AMB Express. 9 (1), 70 (2019).
  32. Fang, Z., et al. Development of scalable vaccinia virus-based vector production process using dissolvable porous microcarriers. 25th Annual Meeting of the American Society of Gene & Cell Therapy. Molecular Therapy. 30, 195-196 (2022).

Tags

Grootschalige celproductie GMP-kwaliteit oplosbare poreuze microdragers cel- en gentherapie 3D-cultuur hechtende cellen HMSC's HEK293T cellen Vero-cellen tweedimensionaal planair kweeksysteem ACISCP-platform geroerde tankbioreactoren uitbreiding oogst celverwerkingssysteem celvulsysteem kwaliteitsbeoordeling bioprocestechnologie
Grootschalige celproductie op basis van GMP-kwaliteit oplosbare poreuze microdragers
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, Y., Xu, H., Zhang, Y., Guo,… More

Chen, Y., Xu, H., Zhang, Y., Guo, L., Lan, M., Yang, Y., Liu, W., Yan, X., Du, Y. Large-Scale Cell Production Based on GMP-Grade Dissolvable Porous Microcarriers. J. Vis. Exp. (197), e65469, doi:10.3791/65469 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter