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JoVE Journal Bioengineering
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Bioengineering

Großtechnische Zellproduktion auf Basis von auflösbaren porösen Mikroträgern in GMP-Qualität

Published: July 7, 2023 doi: 10.3791/65469
Automatic Translation
*1, *2, *2, 2, 2, 2, 2, 2, 1
1Department of Biomedical Engineering, School of Medicine, Tsinghua University, 2Beijing CytoNiche Biotechnology Co. Ltd.
* These authors contributed equally

Summary

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um die Herstellung von adhärenten Zellen in großem Maßstab durch ein vollständig geschlossenes System auf der Basis von auflösbaren Mikroträgern in GMP-Qualität zu erreichen. Die Kultivierung von humanen mesenchymalen Stammzellen, HEK293T Zellen und Vero-Zellen wurde validiert und erfüllte sowohl die Quantitätsanforderungen als auch die Qualitätskriterien für die Zell- und Gentherapieindustrie.

Abstract

Forscher in der Zell- und Gentherapie-Industrie (CGT) stehen seit langem vor einer gewaltigen Herausforderung bei der effizienten und großflächigen Vermehrung von Zellen. Um die primären Mängel des zweidimensionalen (2D) planaren Kultivierungssystems zu beheben, haben wir auf innovative Weise eine automatisierte Plattform für die geschlossene Zellproduktion im industriellen Maßstab (ACISCP) entwickelt, die auf einem GMP-tauglichen, auflösbaren und porösen Mikroträger für die 3D-Kultur adhärenter Zellen basiert, einschließlich humaner mesenchymaler Stamm-/Stromazellen (hMSCs), HEK293T Zellen und Vero-Zellen. Um eine großflächige Expansion zu erreichen, wurde eine zweistufige Expansion mit 5 L und 15 L Rührkessel-Bioreaktoren durchgeführt, um 1,1 x10 10 hMSCs mit einer insgesamt 128-fachen Expansion innerhalb von 9 Tagen zu erhalten. Die Zellen wurden geerntet, indem die Mikroträger vollständig aufgelöst wurden, konzentriert, gewaschen und mit einem auf einer kontinuierlichen Zentrifuge basierenden Zellverarbeitungssystem formuliert und dann mit einem Zellfüllsystem aliquotiert. Im Vergleich zu planaren 2D-Kulturen gibt es keine signifikanten Unterschiede in der Qualität von hMSCs, die aus 3D-Kulturen gewonnen werden. Wir haben diese auflösbaren porösen Mikroträger auch auf andere beliebte Zelltypen im CGT-Bereich angewendet; Insbesondere wurden HEK293T Zellen und Vero-Zellen zu Spitzenzelldichten von 1,68 x 10 7 Zellen/ml bzw. 1,08 x 107 Zellen/ml kultiviert. Diese Studie liefert ein Protokoll für den Einsatz einer bioverfahrenstechnischen Plattform, die die Eigenschaften von auflösbaren Mikroträgern in GMP-Qualität und fortschrittlichen geschlossenen Geräten nutzt, um die Herstellung adhärenter Zellen im industriellen Maßstab zu erreichen.

Introduction

Die CGT-Branche hat in den letzten zwei Jahrzehnten eine exponentielle Expansion erlebt. Es wird erwartet, dass die Entwicklung von Medikamenten der nächsten Generation zahlreiche refraktäre Erkrankungen behandeln und heilen wird1. Seit der ersten Zulassung eines CGT-Produkts, Kymriah, durch die Food and Drug Administration (FDA) im Jahr 2017 ist die CGT-bezogene Forschung und Entwicklung weltweit weiterhin rasant gewachsen, wobei die FDA einen Anstieg der aktiven Anträge auf neue Prüfpräparate für CGT auf 500 im Jahr 2018 verzeichnete2. Es wurde prognostiziert, dass die Zahl der Zulassungen von CGT-Produkten in den Vereinigten Staaten bis 2030 wahrscheinlich 54-74 betragen wird2.

Während das schnelle Wachstum der CGT-Forschung und -Innovation aufregend ist, gibt es immer noch eine große technologische Lücke zwischen der Laborforschung und der Herstellung im industriellen Maßstab, die diese vielversprechenden Medikamente liefern könnte, um so viele Patienten wie nötig zu erschwinglichen Kosten zu erreichen. Die aktuellen Prozesse, die für diese klinischen Studien verwendet werden, wurden in Labors für Experimente in kleinem Maßstab etabliert, und es sind erhebliche Anstrengungen erforderlich, um die CGT-Herstellung zu verbessern und zu erneuern3. Es gibt viele Arten von CGT-Produkten, von denen die meisten auf lebenden Zellen basieren, die allogen, autolog, technisch verändert oder natürlich sein können. Diese lebenden Arzneimittel sind viel komplexer als kleine molekulare Einheiten oder Biologika, was die Herstellung in großem Maßstab zu einer großen Herausforderung macht 4,5,6. In dieser Arbeit demonstrieren wir ein großflächiges Zellproduktionsprotokoll für drei verankerungsabhängige Zellen, die in CGTs weit verbreitet sind. Dazu gehören humane mesenchymale Stamm-/Stromazellen (hMSCs), die für die zellbasierte Therapie verwendet wurden, sowie HEK293T- und Vero-Zellen, die beide zur Herstellung von Viren für die Gentechnik des endgültigen therapeutischen Zellprodukts verwendet werden. Verankerungsabhängige Zellen werden üblicherweise auf planaren Systemen kultiviert, die eine manuelle Verarbeitung erfordern. Manuelle Kultivierungsmethoden erfordern jedoch einen erheblichen Arbeitsaufwand und sind anfällig für Verunreinigungen, die die Qualität des Endprodukts beeinträchtigen können. Darüber hinaus gibt es keine Inline-Prozesskontrolle, was zu erheblichen Qualitätsschwankungen zwischen den Chargenführt 7. Am Beispiel der Stammzelltherapie mit einer vielversprechenden Pipeline von über 200 Stammzelltherapiekandidaten wird geschätzt, dass 300 Billionen hMSCs pro Jahr benötigt würden, um den Anforderungen klinischer Anwendungen gerecht zu werden8. Daher ist die Herstellung von therapeutischen Zellen in großem Maßstab zu einer Voraussetzung geworden, um diese therapeutischen Eingriffe mit einem so hohen Zellbedarf durchzuführen9.

Um die Rückschläge planarer Systeme auszuschließen, wurden Anstrengungen unternommen, um großtechnische Herstellungsprozesse in Rührkessel-Bioreaktoren mit konventionellen, nicht löslichen Mikroträgern zu entwickeln 10,11,12,13, aber diese leiden unter komplizierten Präparationsverfahren und geringer Zellernteeffizienz 14. Kürzlich haben wir einen auflösbaren Mikroträger für die Stammzellexpansion entwickelt, der darauf abzielt, die Herausforderungen der Zellernte aus herkömmlichen, nicht löslichen kommerziellen Mikroträgern zu umgehen15. Dieser neuartige, kommerziell erhältliche 3D-poröse 3D-Mikroträger in GMP-Qualität, 3D TableTrix, hat ein großes Potenzial für die Produktion von Zellen im großen Maßstab gezeigt. In der Tat könnte eine 3D-Kultur, die auf diesen porösen Mikroträgern basiert, potenziell günstige biomimetische Mikroumgebungen nachbilden, um die Adhäsion, Proliferation, Migration und Aktivierung von Zellen zu fördern16. Die porösen Strukturen und miteinander verbundenen Porennetzwerke von Mikrocarriern könnten eine größere Zelladhäsionsfläche schaffen und den Austausch von Sauerstoff, Nährstoffen und Metaboliten fördern, wodurch ein optimales Substrat für die In-vitro-Zellexpansion geschaffenwird 17. Die hohe Porosität dieser löslichen porösen 3D-Mikroträger in GMP-Qualität ermöglicht eine großflächige Expansion von hMSCs, und die Fähigkeit, die Zellen vollständig aufzulösen, ermöglicht die effiziente Ernte dieser expandierten Zellen18. Es ist auch ein GMP-Produkt und wurde als pharmazeutischer Hilfsstoff beim chinesischen Zentrum für Arzneimittelbewertung (Anmeldenummern: F20210000003 und F20200000496)19 und der FDA der Vereinigten Staaten (FDA, USA; Nummer der Arzneimittelstammdatei: 35481)20.

Hier veranschaulichen wir ein automatisiertes geschlossenes Zellproduktionssystem im industriellen Maßstab (ACISCP)18, das diese dispergierbaren und auflösbaren porösen Mikroträger für die Expansion von hMSC-, HEK293T-Zellen und Vero-Zellen verwendet. Wir erreichten eine erfolgreiche zweistufige Expansion von hMSCs (128 kumulative Fold Expansion in 9 Tagen) von einem 5-l-Bioreaktor zu einem 15-l-Bioreaktor und erhielten schließlich bis zu 1,1 x10 10 hMSCs aus einer einzigen Produktionscharge. Die Zellen wurden geerntet, indem die Mikroträger vollständig aufgelöst wurden, konzentriert, gewaschen und mit einem auf einer kontinuierlichen Flusszentrifuge basierenden Zellverarbeitungssystem formuliert und dann mit einem Zellfüllsystem aliquotiert. Darüber hinaus haben wir die Qualität der hMSC-Produkte bewertet, um die Einhaltung der Vorschriften zu bestätigen. Wir demonstrierten auch die Anwendung dieser auflösbaren Mikroträger für die skalierte Produktion von zwei anderen Arten von Verankerungszellen, HEK293T Zellen und Vero-Zellen, die in der CGT-Industrie weit verbreitet sind. Die maximale Zelldichte von HEK293T Zellen erreichte 1,68 x 10 7 Zellen/ml, während die maximale Dichte der Vero-Zellen 1,08 x 107 Zellen/ml erreichte. Das ACISCP-System könnte für die Kultivierung einer Vielzahl von adhärenten Zellen angepasst werden und könnte möglicherweise zu einer leistungsstarken Plattform werden, die dazu beiträgt, die Industrialisierung von CGT zu beschleunigen.

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Protocol

Die menschliche Nabelschnur wurde aus dem Pekinger Tsinghua Changgeng Krankenhaus entnommen. Alle Verfahren und Protokolle in Bezug auf die Gewinnung, Isolierung und Kultur von mesenchymalen Stammzellen der menschlichen Nabelschnur (UCMSCs) wurden mit informierter Zustimmung und mit Genehmigung der Ethikkommission des Beijing Tsinghua Changgeng Hospital (Aktenzeichen 22035-4-02) durchgeführt, und die Verfahren und Protokolle entsprachen der Deklaration von Helsinki von 1964 und ihren späteren Änderungen oder vergleichbaren ethischen Standards.

1. Monolayer-Kultur von hMSCs, HEK293T Zellen und Vero-Zellen

  1. Isolierung primärer humaner UCMSCs aus Wharton-Gelee gemäß der berichteten Methode21. Verwenden Sie serumfreies (SF) hMSC-Kulturmedium für die Isolierung und das Wachstum von primären UCMSCs, ernten Sie die Zellen auf Passage 2 und konservieren Sie sie als Masterzellbank (MCB).
  2. Inokulieren Sie 6 x 105 humane UCMSCs (vorzugsweise Passage 2 oder Passage 3 Zellen) in einem T75-Kolben (d. h. die Aussaatdichte auf planaren 2D-Gefäßen beträgt 8.000 Zellen/cm2) für die Monoschichtkultur mit 15 ml vollständigem SF hMSC-Kulturmedium. Sorgen Sie für eine gleichmäßige Aussaat durch eine Achterbewegung des Kolbens. Kultivierung bei 37 °C in einem 5%igen CO2 -Zellkultur-Inkubator auf 80%-90% Konfluenz.
  3. Zur Ernte wird das Zellkulturmedium dekantiert und die Zellen zweimal mit 3-5 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gespült. Dann werden 2 ml 0,25%iges Trypsin-EDTA zugegeben und bei 37 °C für 1-2 Minuten inkubiert, bis die meisten Zellen rund geworden sind und sich vom Kolben gelöst haben, wie unter einem inversen Hellfeldmikroskop mit einem 4x-Objektiv beobachtet. Fügen Sie 3 ml SF hMSC-Nährmedium hinzu, um den Aufschluss zu beenden.
  4. Die Zellsuspension wird in ein konisches 15-ml-Zentrifugenröhrchen überführt und 5 Minuten lang bei 179 x g zentrifugiert. Dekantieren Sie den Überstand, spülen Sie das Zellpellet zweimal mit PBS und resuspendieren Sie es in etwa 3-5 ml SF hMSC-Kulturmedium für die Aussaat auf Mikroträger in Bioreaktoren.
    HINWEIS: Überprüfen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen und stellen Sie sicher, dass die Zellen zu >90 % lebensfähig sind. Bereiten Sie die Zellen erst vor, nachdem alle Vorbereitungsarbeiten für die Bioreaktoren abgeschlossen sind (Schritte 2.1-3.6).
  5. Für die Monolayer-Kultur von HEK293T-Zellen und Vero-Zellen werden 2 x 10 6-3-3 x 106 Zellen in jeden T75-Kolben inokuliert und mit DMEM kultiviert, das 10 % fötales Kälberserum (FBS) bzw. 10 % Neugeborenen-Kälberserum (NBS) enthält.
  6. Befolgen Sie die Schritte 1.3 bis 1.4, um die Zellen zu ernten. Resuspendieren in 3-5 ml DMEM mit 10% FBS.

2. Vorbereitung des Rührkessel-Bioreaktors vor der Zellaussaat

  1. Spülen Sie das Glasgefäß an Tag −1 einmal gründlich mit fließendem deionisiertem Wasser (DI) aus.
  2. Demontieren Sie alle rostfreien Rohre und Laufräder von der Kopfplatte, tauchen Sie sie in DI-Wasser und beschallen Sie sie 1 h lang mit einem Ultraschallreiniger bei 40 kHz und 60 °C, um sie gründlich zu reinigen.
    HINWEIS: Die Vorbereitungen und Verfahren sind für die erste Stufe der Expansion im 5-Liter-Bioreaktor und die zweite Stufe der Expansion im 15-L-Bioreaktor identisch. Die Parameter für den 15-Liter-Bioreaktor sind durchgehend in Klammern angegeben. Wenn keine Parameter in Klammern angegeben sind, sind diese Parameter für die 5-l- und 15-l-Bioreaktoren identisch.
  3. Überprüfen Sie sorgfältig, ob alle O-Ringe intakt und an Ort und Stelle sind, und montieren Sie dann die demontierten Teile gemäß den Anweisungen des Herstellers wieder auf der Kopfplatte.
    HINWEIS: Verschlissene oder gerissene O-Ringe vor der Montage bei Bedarf ersetzen. Verschlissene O-Ringe beeinträchtigen die Luftdichtheit und damit die Sterilität des Gefäßes.
  4. Geben Sie 7 l (18 l für den 15-l-Bioreaktor) 0,5 M NaOH-Lösung in das 5-l-Gefäß und platzieren Sie die Kopfplatte mit den montierten Röhrchen am Rand des Gefäßes, um die Röhrchen in die NaOH-Lösung einzutauchen. Lassen Sie es 12 Stunden oder über Nacht stehen, um Endotoxine aus den Röhrchen und dem Glasgefäß zu entfernen.
    HINWEIS: Überschreiten Sie nicht 7 l (18 l), da dies das maximale Volumen des 5 l (15 l) Glasgefäßes ist. Tragen Sie beim Umgang mit der NaOH-Lösung eine geeignete persönliche Schutzausrüstung, da diese korrosiv ist.
  5. Entfernen Sie die Kopfplatte und füllen Sie die NaOH-Lösung in eine geeignete Abfallflasche um. Gemäß den Sicherheitsvorschriften des Labors entsorgen. Spülen Sie das Gefäß, die Kopfplatte und ihre Teile gründlich mit endotoxinfreiem DI-Wasser oder Wasser für Injektionszwecke, um alkalische Reste zu entfernen.
  6. Geben Sie 2 l (5 l) PBS in das Gefäß, bauen Sie alle Teile wieder zusammen und schrauben Sie die Kopfplatte gemäß den Anweisungen des Herstellers an den Metallrahmen des Behälters.
  7. Montieren Sie ein Closed System Consumable Pack gemäß den Anweisungen des Herstellers an den entsprechenden Teilen/Rohren/Anschlüssen aus Edelstahl (SS) an der Kopfplatte. Klemmen Sie alle Robert-Klemmen an die Rohre, und es wird empfohlen, sie durch Klemmen mit Hämostaten zu verstärken. Lassen Sie eines der Rohre mit einem 0,22 μm Entlüftungsfilter am Ende, der mit dem Kondensator verbunden ist, offen.
    HINWEIS: Schieben Sie die Silikonschläuche auf die Spitzen der Hämostate, um ein Durchstechen der Silikonschläuche zu verhindern. Klemmen Sie nur an den Silikonschläuchen und vermeiden Sie es, die in diesem Kit enthaltenen C-Flex-Schläuche einzuklemmen. Wenn Sie einen Schlauch am Kondensator nicht klemmen, können Sie den Druck während des Autoklavierens verringern.
  8. Bereiten Sie 250 ml 0,1 M NaOH-Lösung in einer autoklavierbaren 500-ml-GL 45-Glasflasche vor und montieren Sie sie mit einem GL 45 Multiport-Anschluss-Schraubverschluss mit zwei Anschlüssen. Schließen Sie einen 180 mm langen, 0,13 Zoll x 0,25 Zoll (Innendurchmesser x Außendurchmesser) Silikonschlauch an einen der Anschlüsse an der Unterseite der Kappe an. Die Länge sollte lang genug sein, um gerade noch den Boden der Flasche zu berühren.
  9. Schließen Sie ein weiteres Stück Silikonschlauch mit einer Länge von 500 mm länger als das vorherige an die gleiche Öffnung auf der Oberseite der Kappe an und verbinden Sie das andere Ende mit einer Tropfzufuhröffnung an der Kopfplatte des 5-Liter-Gefäßes. Schließen Sie einen 0,22-μm-Entlüftungsfilter an den anderen Anschluss des Schraubverschlusses an.
  10. Führen Sie eine Zwei-Punkt-Kalibrierung an der pH-Sonde gemäß den Anweisungen des Herstellers durch. Führen Sie dann die Sonden für den pH-Wert, den gelösten Sauerstoff (DO) und die Lebendzellzahl in das Gefäß in die entsprechenden PG13,5-Anschlüsse ein und schrauben Sie sie fest auf die Kopfplatte.
  11. Führen Sie eine Luftdichtheitsprüfung des fertig montierten Behälters gemäß den Anweisungen des Herstellers durch. Halten Sie einen Druck von 0,4 bar ± 0,01 bar für mindestens 30 Minuten aufrecht. Lassen Sie den Druck langsam ab, nachdem das System den Test bestanden hat. Wenn die Luftdichtheitsprüfung fehlschlägt, suchen Sie sorgfältig nach Leckstellen und verstärken Sie die Behälterbaugruppe.
  12. Autoklavieren Sie den fertig montierten Behälter mit dem Verbrauchsmaterial-Kit bei 15 psi und 121 °C für 60 Minuten. Überprüfen Sie nach dem Autoklavieren alle Entlüftungsfilter, um sicherzustellen, dass sie intakt und trocken sind. Entfernen Sie alle Hämostatika.
    HINWEIS: Ein Nassluftfilter filtert das Gas nicht effizient und kann die Sterilität des Gefäßes während der Zellkultur beeinträchtigen. Tauschen Sie die Entlüftungsfilter aus, wenn sie nass sind, und autoklavieren Sie den gesamten Behälter erneut.
  13. Bringen Sie das autoklavierte Gefäß in einen Reinraum und warten Sie, bis es vollständig auf Raumtemperatur abgekühlt ist. Stecken Sie den Temperaturfühler in das Schutzrohrrohr und verbinden Sie die Kabel für den Motor, die pH-Sonde und die Sauerstoffsonde vom Regler mit den entsprechenden Teilen des Behälters. Wickeln Sie die Heizmatte fest um das Gefäß.
  14. Lösen Sie die Robert-Klemmen an den flexiblen Schläuchen des Abgaskondensators, des Ringspargers, der Tropfzuführung für NaOH und des Luftüberlagerungsanschlusses. Schalten Sie den Controller ein, melden Sie sich an und geben Sie die in Tabelle 1 aufgeführten Parameter gemäß den Anweisungen des Herstellers in das System ein. Diese Röhrchen sollten zu keinem Zeitpunkt während des Kulturprozesses eingespannt werden.
  15. Klicken Sie auf Start und benennen Sie das Experiment, um den Bioreaktor zu starten. Lassen Sie den Bioreaktor mindestens 12 Stunden oder über Nacht mit diesen Einstellungen laufen, um den PBS mit Sauerstoff zu sättigen, um später eine Ein-Punkt-Kalibrierung für die DO-Sonde durchzuführen.
  16. Kalibrieren Sie die Liquid-Handling-Volumendrehzahl von Pumpe 1 und Pumpe 2 am Bioreaktorregler. Installieren Sie einen 0,13 Zoll x 0,25 Zoll Silikonschlauch an jeder Pumpe separat, wobei ein Ende in eine Wasserflasche und das andere Ende des Schlauchs in einen Messzylinder eingeführt wird.
  17. Stellen Sie die Drehzahl der Pumpe auf 300 U/min und die Zeit auf 1 Minute ein. Beachten Sie die Wassermenge, die bei beiden Pumpen in den Messzylinder abgegeben wird. Diese Nummern werden für die nachfolgenden Schritte benötigt.
  18. Bereiten Sie 500 ml SF hMSC-Kulturmedium gemäß den Anweisungen des Herstellers vor und ersetzen Sie die Kappe der Zellkulturmediumflasche durch einen Einweg-C-Flex EZ Top-Behälterverschluss und eine kompatible Kappe. Führen Sie den Kappenwechsel in einer Biosicherheitswerkbank (BSC) durch.
  19. Schweißen Sie das Auslassrohr an der Flasche mit dem Medium an das C-Flex-Einlassrohr an der Flasche mit 10 g vorsterilisierten W01-Mikroträgern für MSC. Installieren Sie einen Teil des Schlauchs auf Pumpe 1 des Bioreaktor-Controllers, stellen Sie die Pumpendrehzahl auf 300 U/min ein und pumpen Sie das gesamte Nährmedium aus der Flasche in die Flasche mit den Mikroträgern. Lagern Sie diese Mikroträger bis zur Verwendung an Tag 0 bei 4 °C.
    HINWEIS: Die Mikroträger sollten am Tag −1 vorbereitet werden. Für eine 15-Liter-Bioreaktorkultur werden insgesamt vier Flaschen (d. h. 40 g mit 4 x 500 ml SF-Medium) vorbereitet.

3. Zellaussaat, -kultur und -ernte in einem 5-Liter-Rührtank-Bioreaktor

  1. Führen Sie an Tag 0 eine Ein-Punkt-Kalibrierung durch, insbesondere 100 % für die DO-Sonde am Bioreaktor-Controller gemäß den Anweisungen des Herstellers. Der Rührkessel-Bioreaktor ist nun bereit für die Zellkultur.
  2. Bereiten Sie eine 2-Liter-Glasflasche (5 l) für die Abfallsammlung vor, statten Sie sie mit einem GL 45 Multiport-Anschluss-Schraubverschluss mit zwei Anschlüssen aus, mit 30 mm, 0,25 Zoll x 0,44 Zoll C-Flex-Röhrchen, die an beide Anschlüsse angeschlossen sind, und autoklavieren Sie sie zum Sterilisieren. Schweißen Sie das C-Flex-Rohr von einem der Anschlüsse von der Abfallflasche mit einem Rohrschweißgerät an das Ernterohr an der Kopfplatte des Bioreaktorbehälters.
  3. Stoppen Sie vorübergehend die Temperatur-, pH- und Sauerstoffkontrolle am Bioreaktorregler, installieren Sie den Silikonschlauch, der am Ernteröhrchen befestigt ist, in der richtigen Durchflussrichtung der Flüssigkeit an der Peristaltikpumpe 2 und geben Sie das gesamte PBS vollständig aus dem Gefäß in die Abfallflasche ab. Lösen Sie den Schlauch von der Pumpe, verschließen Sie die Abfallflasche und trennen Sie sie.
    HINWEIS: Lösen Sie bei jedem Schritt immer alle Robert-Klemmen an den flexiblen Schläuchen, die am Flüssigkeitsfluss beteiligt sind. Klemmen Sie das Gerät zurück, nachdem der Flüssigkeitstransfer abgeschlossen ist, bevor Sie versiegeln und trennen. Klemmen Sie näher an der Seite der Kopfplatte. Das Lösen und Spannen sollte für alle nachfolgenden Schritte durchgeführt werden, sofern nicht anders angegeben.
  4. Bereiten Sie 7 l (30 l) des kompletten SF hMSC-Mediums vor und ersetzen Sie jeden Original-Flaschenverschluss durch einen Einweg-C-Flex EZ Top-Behälterverschluss und eine kompatible Kappe. Schweißen Sie ein Einweg-Filtermodul an einen der Anschlüsse des 10 l (50 l) Einweg-Aufbewahrungsbeutels. Führen Sie den Vorgang des Austauschs der Kappen in einer BSC durch.
  5. Filtern Sie das Nährmedium und füllen Sie es in den Aufbewahrungsbeutel um, eine Flasche nach der anderen, indem Sie die Flaschen mit dem Zellkulturmedium an das andere Ende des Kapselfilters schweißen und die Pumpe an der Bioreaktorsteuerung verwenden. Als Futterbeutel festlegen.
  6. Schweißen Sie eine Auslassöffnung vom Zuführbeutel an das C-Flex-Rohr am Zuführrohr der Kopfplatte und installieren Sie das Rohr zur Pumpe 1 an der Bioreaktorsteuerung. Schweißen Sie die andere Auslassöffnung vom Zuführbeutel an das Entlüftungsrohr und installieren Sie das Rohr zur Pumpe 2 am Bioreaktorregler in der richtigen Richtung des Flüssigkeitsflusses.
    HINWEIS: Montieren Sie den Abschnitt an der Flüssigkeitsdurchflussleitung, die aus Silikonschläuchen besteht, an der Pumpe, um eine bessere Verschleißfestigkeit im Vergleich zu C-Flex-Schläuchen zu erzielen. Stellen Sie sicher, dass die Rohre in der richtigen Richtung verlegt sind.
  7. Stellen Sie die Drehzahl der Pumpe 1 auf 300 U/min ein und stoppen Sie die Pumpe, nachdem Sie 1 l (5 l) Medium aus dem Zuführbeutel in den Behälter abgegeben haben, basierend auf der in Schritt 2.17 angegebenen Volumendosiergeschwindigkeit. Starten Sie die Temperatur-, pH- und DO-Kontrolle erneut mit den gleichen Einstellungen wie in Schritt 2.14 beschrieben.
  8. Versiegeln und trennen Sie den Schlauch, der den Zuführbeutel mit dem Zuführschlauch auf der Kopfplatte verbindet. Schweißen Sie das C-Flex-Röhrchen aus der Flasche der dispergierten Mikroträger, die in Schritt 2.18 hergestellt wurden, an das Zuführrohr und pumpen Sie den gesamten Inhalt aus der Flasche in das Gefäß. Versiegeln und trennen Sie die leere Flasche mit der Mikroträgeraufhängung. Desinfizieren Sie die gesamte Oberfläche der Flasche mit 75%igem Ethanol und legen Sie sie in eine BSC, um sie als Zellsuspensionstransferflasche zu verwenden.
    HINWEIS: Lassen Sie beim Versiegeln und Trennen des Einwegzubehörs ein längeres Stück C-Flex-Schlauch auf der Seite der Steuerplatte, da in den folgenden Schritten mehrere Schweiß- und Trennschritte an demselben Schlauch durchgeführt werden.
  9. Stellen Sie sicher, dass die auf dem Regler angezeigte Temperatur einen konstanten Zustand von 37 °C erreicht, was normalerweise etwa 30 Minuten dauert, bevor Sie mit der Vorbereitung der Saatzellen wie in den Schritten 1.3-1.4 fortfahren. Resuspendieren Sie 2,5 x 108 hMSCs in 500 ml SF-Medium und überführen Sie sie in die leere Flasche, die zuvor die Mikroträgersuspension enthielt.
    HINWEIS: Die Samenzellen für die 15-Liter-Bioreaktorerweiterung sollten gemäß Schritt 3.21 vorbereitet werden, mit dem Ziel, 1,0 x 109 Zellen in 500 ml zu inokulieren.
  10. Schweißen Sie den C-Flex-Schlauch von der Flasche, die jetzt die Zellsuspension enthält, an die Zuführöffnung auf der Kopfplatte und pumpen Sie den gesamten Inhalt aus der Flasche in das Gefäß, um die Zellinokulation zu den Mikroträgern einzuleiten. Verschließen Sie die leere Flasche und trennen Sie sie. Schweißen Sie die Zuführöffnung vom Zuführbeutel wieder an das Zuführrohr an der Kopfplatte.
  11. Passen Sie die Rühreinstellungen am Regler an, um intermittierendes Rühren für eine verbesserte Impfeffizienz von hMSCs zu ermöglichen, indem Sie die folgenden Parameter einstellen: V1 = 35 (30) U/min/5 min; V2 = 0 U/min/25 min; Anzahl der Zyklen = 12 (24); Endrührgeschwindigkeit = 35 (30) U/min.
    ANMERKUNG: Die Rührgeschwindigkeit kann auf 40 (35) U/min oder 45 (40) U/min eingestellt werden, wenn während des Kulturprozesses eine ungleichmäßige Verteilung oder Sedimentation der Mikroträger beobachtet wird.
  12. Richten Sie ein automatisiertes Mediumergänzungs- und Austauschregime auf dem Bioreaktor-Controller in der Medium-Exchange-Schnittstelle ein. Stellen Sie die Parameter für die hMSC-Kultivierung wie in Tabelle 2 angegeben ein.
    HINWEIS: Lösen Sie in dieser Phase alle Robert-Klemmen an den flexiblen Schläuchen, die am Flüssigkeitsfluss beteiligt sind, insbesondere für den Zufuhr- und Entlüftungsschlauch. Halten Sie diese während des gesamten Kulturprozesses frei.
  13. Entnehmen Sie die Proben durch das Probenahmeröhrchen, indem Sie die Einweg-Probenahmebeutel über Luer-Konnektoren zu den gewünschten Zeitpunkten, in der Regel einmal täglich, anschließen und jedes Mal 10 ml in den Probenahmebeutel aliquotieren. Aliquotieren Sie 2-3 ml der Probe in den ersten Probenahmebeutel, verwerfen Sie sie und aliquotieren Sie dann jedes Mal die tatsächlichen 10 ml der Probe in einen neuen Probenahmebeutel.
    HINWEIS: Die erste 2-3-ml-Probe könnte eine Flüssigkeit sein, die vom vorherigen Probenahmezeitpunkt im Röhrchen verblieben ist und den Zustand im Gefäß möglicherweise nicht genau wiedergibt. Führen Sie diese Schritte immer mit zusätzlichen aseptischen Maßnahmen durch, indem Sie die Luer-Konnektoren vor und nach dem Herstellen oder Trennen von Verbindungen mit 75%igem Ethanol desinfizieren.
  14. Die entnommenen Proben werden in ein konisches 15-ml-Zentrifugenröhrchen überführt. Führen Sie die folgenden Tests an den Proben durch.
    1. Nehmen Sie 200 μl der zellbeladenen Mikroträgersuspension und färben Sie sie mit Calcein-AM/PI Cell Double Staining gemäß den Anweisungen des Herstellers. Unter dem Fluoreszenzmikroskop beobachten.
    2. Sedimentieren Sie die Mikroträger durch Schwerkraft, was in der Regel 5-10 Minuten dauert. Saugen Sie den Überstand an und testen Sie die Glukosekonzentration mit einem Glukosemessgerät gemäß den Anweisungen des Herstellers. Zeichnen Sie ein Glukosespiegeldiagramm.
    3. Die sedimentierten zellbeladenen Mikroträger werden mit einer frisch zubereiteten 3-5 ml 1 mg/ml Aufschlusslösung bei 37 °C für 20-30 Minuten inkubiert, um die Mikroträger vollständig aufzulösen. Zählen Sie die Zellen nach der Färbung mit AO/PI mit einem automatisierten Fluoreszenzzellanalysator. Zeichnen Sie eine Zellwachstumskurve auf. Korrelieren Sie mit der Echtzeit-Wachstumskurve lebender Zellen, die auf dem Controller generiert wird.
  15. An Tag 4 oder Tag 5 der Kultur werden 50 ml (200 ml) Aufschlusslösung mit 30 mg/ml zubereitet. Das Verhältnis der Arbeitsmasse zwischen der Aufschlusslösung und den löslichen Mikroträgern liegt zwischen 3:20 und 5:20. Sterilfilter mit einem 0,22-μm-Kapselfilter und weiter verdünnt in 500 ml (2 l) Hank's ausgewogener Salzlösung (HBSS) mit Kalzium und Magnesium. In einen 3-Liter-Einwegbeutel umfüllen.
    HINWEIS: Bereiten Sie die Digest-Lösung nur kurz vor der Zellernte zu. Versuchen Sie, mindestens 1,0 x 10 9-1,2 x 109 Zellen für die Erweiterung der ersten Ebene und 1,0 x10 10 Zellen für die Erweiterung der zweiten Ebene anzustreben. Wenn die Zellen schneller wachsen, ernten Sie an Tag 4; Wenn nicht, ernte am 5. Tag. Es wird nicht empfohlen, über Tag 5 hinauszugehen.
  16. Stellen Sie die Rührgeschwindigkeit am Controller auf 0 ein, damit sich die Mikroträger einpendeln können, was in der Regel innerhalb von 20 Minuten geschieht. Schalten Sie das automatische Medienaustauschprotokoll aus und stoppen Sie die Temperatur-, pH- und Sauerstoffkontrolle am Bioreaktorregler. Die Pumpe 2 wird manuell mit 300 U/min am Regler gestartet und der Überstand in das Zuführregime abgegeben, um etwa 1 l (2 l) Kultursuspension im Gefäß zu belassen (unter Verwendung der in Schritt 2.17 angegebenen Volumendosiergeschwindigkeit oder anhand der Graduierungsmarkierungen auf dem Gefäßkörper). Versiegeln Sie den Futterbeutel und trennen Sie ihn vollständig.
  17. Schweißen Sie den Beutel mit der frisch zubereiteten Aufschlusslösung aus Schritt 3.15 mit dem Zufuhrrohr und pumpen Sie den gesamten Inhalt in den Behälter. Starten Sie die Rührgeschwindigkeit bei 45 (40) U/min. Stellen Sie sicher, dass der Temperaturregler die Temperatur immer noch bei 37 °C hält. Mikroträger lösen sich innerhalb von 40-60 Minuten auf. Entnehmen Sie 1 ml der Probe mit einer sterilen Luer-Lock-Spritze nach 30 Minuten und anschließend alle 5-10 Minuten, um die Auflösung der Mikroträger unter einem Hellfeldmikroskop zu überprüfen.
  18. Nachdem sich die Mikroträger aufgelöst haben, schweißen Sie einen 3-Liter-Vorratsbeutel (zwei 3-Liter-Vorratsbeutel für den 15-Liter-Bioreaktor) an das Ernteröhrchen und pumpen Sie die Zellsuspension mit Pumpe 2 bei 300 U/min vollständig ab. Bereiten Sie 1 l (3,5 l) Kochsalzlösung mit 1 % humanem Serumalbumin (HSA) als Waschpuffer und 500 ml vollständiges SF-Medium (500 ml Kryokonservierungspuffer für die Zelle, eine Formulierung aus 10 % Dimethylsulfat (DMSO) und 90 % SF-Medium als Beispiel) in separaten Einweg-Aufbewahrungsbeuteln unter Verwendung der in den vorherigen Schritten genannten Methoden und des Zubehörs für andere Flüssigkeitstransfers vor.
  19. Schalten Sie das Zellverarbeitungssystem ein, installieren Sie ein Einweg-Zellverarbeitungskit gemäß den Anweisungen des Herstellers am Gerät, schweißen Sie die Beutel mit der Zellsuspension, dem Waschpuffer und dem SF-Medium (Kryokonservierungspuffer) an das Einweg-Zellverarbeitungskit und befolgen Sie sorgfältig alle auf der Benutzeroberfläche angezeigten Anweisungen, um die Integrität und ordnungsgemäße Installation des Kits zu initialisieren und zu überprüfen.
  20. Sobald die Installation abgeschlossen ist, geben Sie die in Tabelle 3 aufgeführten Parameter für die Zellwäsche mit Waschpuffer und Resuspension in SF-Medium (Kryokonservierungspuffer) in die Software ein, um den Wasch- und Resuspensionsprozess zu starten. Die gesamte Prozedur wird automatisch mit mehreren manuellen Prüfpunkten durchgeführt.
  21. Entnehmen Sie eine Probe der Zellen aus der Zentrifugenkammer, wie vom Zellverarbeitungssystem angegeben, und berechnen Sie die Zelldichte mit einem automatischen Zellanalysator gemäß den Anweisungen des Herstellers. Stellen Sie das Resuspensionsvolumen auf eine Dichte von 2 x 106 Zellen/ml oder ein maximales Gesamtvolumen von 250 ml ein.
  22. Versiegeln und trennen Sie den Zelltransferbeutel vom Einweg-Zellverarbeitungskit, nachdem das System die Zellen aus der Kammer abgesaugt hat. Stellen Sie die Zelldichte bei Bedarf auf 2 x 106 Zellen/ml mit vollständigem SF-Medium in einem größeren Zelltransferbeutel/Medium-Aufbewahrungsbeutel ein. Dies werden die Saatzellen für die Second-Tier-Erweiterung im 15-Liter-Bioreaktor sein.

4. Zellformulierung, -füllung und -finish

  1. Beginnen Sie 1 Tag vor der Zellernte aus dem 5-Liter-Bioreaktor mit der Vorbereitung des 15-Liter-Bioreaktors. Befolgen Sie die Schritte in den Protokollabschnitten 2 und 3 vollständig, mit Ausnahme der in Klammern angegebenen Parameter für 15 l.
  2. Resuspendieren Sie die Zellen in 250 ml Kryokonservierungspuffer, versiegeln Sie den Zelltransferbeutel und trennen Sie ihn vom Einweg-Zellverarbeitungskit, nachdem das System die Zellen aus der Kammer abgesaugt hat.
  3. 2.000 ml Kryokonservierungspuffer zusammen mit den 250 ml resuspendierten Zellen aus Schritt 4.2 in einen 3-Liter-Zelltransferbeutel überführen. Schweißen Sie diesen Transferbeutel an ein Einweg-Fill&Finish-Verbrauchsmaterial-Kit.
    ANMERKUNG: Das zusätzliche Volumen des hier verwendeten Kryokonservierungspuffers sollte durch die Spezifikation der Formulierung und die Berechnung der Gesamtzellzahl gemäß den in Schritt 3.21 erzielten Zählergebnissen bestimmt werden
  4. Montieren Sie das Einweg-Fill&Finish-Verbrauchsmaterial-Kit mit dem Zellenfüllsystem und schalten Sie das Vorkühlsystem gemäß den Anweisungen des Herstellers ein. Befolgen Sie die Anweisungen auf dem System und stellen Sie ein, dass 20 ml/Beutel mit insgesamt 20 Beuteln pro Charge gefüllt werden. Versiegeln und trennen Sie diese Beutel vom Kit und befolgen Sie die Standardverfahren für die Kryokonservierung. Verwenden Sie Kryoaufbewahrungsbeutel.
  5. Schweißen Sie einen neuen Satz von 20 Kryokonservierungsbeuteln an das Einweg-Fill&Finish-Verbrauchsmaterial und wiederholen Sie den Füll- und Finish-Vorgang, bis alle Zellen aliquotiert sind. Befolgen Sie die Standardverfahren zur Kryokonservierung dieser Zellen.

5. Charakterisierung der Zellqualität

  1. Die geernteten hMSCs werden von den auflösbaren Mikroträgern entnommen und ein Zellverarbeitungssystem zur Charakterisierung durch Durchflusszytometrie zur Bestimmung der Zellidentität gemäß den in der Literatur18 beschriebenen Methoden verwendet.
  2. Auftauen der kryokonservierten Zellen und erneutes Auftragen auf konventionelle 2D-Kolben oder Mikrotiterplatten zur weiteren Charakterisierung der Zellmerkmale, einschließlich der Zellmorphologie und der Tri-Lineage-Differenzierungsfähigkeit, gemäß den in der Literatur18 beschriebenen Methoden.

6. HEK293T Expansion auf G02-Mikroträgern im Rührkessel-Bioreaktor

  1. Bereiten Sie einen 5-Liter-Bioreaktor vor, wie in Schritt 2 beschrieben. Für HEK293T Zellen werden die Zellen mit sterilen G02-Mikroträgern anstelle von W01 kultiviert. Der Kulturprozess ähnelt dem in Protokollabschnitt 3, obwohl einige Parameter unterschiedlich sind, wie in den folgenden Schritten erläutert wird. Installieren Sie einen speziellen Perfusionsschlauch im Bioreaktor als Ersatz für den Entlüftungsschlauch, da Perfusion für die Kultur von HEK293T Zellen benötigt wird.
  2. Abweichend von dem in Protokollabschnitt 3 beschriebenen Protokoll werden 20 g G02-Mikroträger (d. h. zwei Flaschen) in DMEM mit 10 % FBS für den 5-Liter-Bioreaktor hergestellt, wobei das Tag-0-Kulturvolumen auf 3,5 l eingestellt ist (d. h. eine Endkonzentration von etwa 5,71 g/l). 2 l Medium in das Gefäß vor den beiden Flaschen mit G02-Mikroträgern geben und 500 ml 1,75 x 109 HEK293T Zellen (d. h. mit einer Enddichte von 5 x 105 Zellen/ml) inokulieren.
  3. Es wird ein Rühr- und Mediumaustauschregime (basierend auf der Menge des pro Tag auszutauschenden Mediums, ausgedrückt als Kulturvolumen pro Tag, CVD) durchgeführt, das sich von Protokollabschnitt 3 unterscheidet und in Tabelle 4 detailliert beschrieben ist.
    HINWEIS: Aktivieren Sie Pumpe 1 und Pumpe 2 manuell, damit beide kontinuierlich pumpen können, damit die Perfusion stattfinden kann. Passen Sie die Pumpendrehzahl täglich an die Perfusionsrate an, die auf der Kalibrierung der Volumendosiergeschwindigkeit der Pumpen basiert. In der Regel liegt dieser im einstelligen Bereich. Verwenden Sie für HEK293T Zellen frisches Medium als Futter und entsorgen Sie das verbrauchte Medium vollständig in eine Abfallflasche, im Gegensatz zu hMSCs, bei denen das Medium zirkuliert.
  4. Für die zweite Stufe der Erweiterung auf den 15-Liter-Bioreaktor ist der Bead-to-Bead-Transfer der HEK293T Zellen anstelle der vollständigen Auflösung der Mikrocarrier zu verwenden, wie dies bei hMSCs der Fall ist. Stoppen Sie insbesondere die Bewegung, um die Mikroträger zu sedimentieren, nachdem die gewünschte Zelldichte erreicht ist, und saugen Sie dann so viel Überstand wie möglich aus dem Perfusionsschlauch ab, führen Sie PBS mit dem 3-fachen Volumen der verbleibenden Suspension zu, um die Mikroträger zu waschen, und wiederholen Sie dies dreimal. Saugen Sie so viel PBS wie möglich an und entsorgen Sie es in der letzten Wäsche.
  5. Füttern Sie 3,5 l 1x rekombinantes Trypsin, um die Zellen von den Mikroträgern zu lösen, während die G02-Mikroträger intakt bleiben. Stellen Sie die Temperatur auf 37 °C und die Rührgeschwindigkeit auf 60 U/min ein. Beenden Sie die Ablösung innerhalb von 45 Minuten, wenn sich mehr als 80 % der Zellen abgelöst haben, mit der gleichen Menge des vollständigen Mediums.
  6. Transfer direkt vom Erntehafen in ein vorbereitetes 15-Liter-Gefäß für die Erweiterung der zweiten Etage.

7. Vero-Zellexpansion auf V01-Mikroträgern im Rührkessel-Bioreaktor

  1. Bereiten Sie V01-Mikroträger vor, indem Sie die lyophilisierten Mikroträger zusammen mit PBS in das Bioreaktorgefäß auf eine Konzentration von 20 mg/ml überführen. Montieren und sterilisieren Sie das Gefäß wie in Protokollabschnitt 2 beschrieben, aber autoklavieren Sie es stattdessen 30 Minuten lang.
  2. Nach der Sterilisation setzen sich V01-Mikroträger auf natürliche Weise ab. Tauschen Sie den Überstand zweimal mit basischem DMEM unter Verwendung der Entlüftungs- und Zuführschläuche aus und fügen Sie das komplette DMEM mit 10 % NBS auf 50 % bis 75 % des Volumens des Gefäßes hinzu, bevor Sie mit Protokollabschnitt 3 für die Zellinokulation und -kultur fortfahren.
  3. Abweichend von dem in Protokollabschnitt 3 beschriebenen Protokoll werden 24 g V01-Mikroträger für eine 4-Liter-Kultur von Vero-Zellen (d. h. eine Endkonzentration von 6 g/l) verwendet und 500 ml 4 x 109 Vero-Zellen (d. h. bei einer Enddichte von 1 x 106 Zellen/ml) inokuliert.
  4. Befolgen Sie die Schritte 6.3-6.6 für die Parameter des Kulturprozesses und den Übergang zur zweiten Expansionsstufe im 15-Liter-Rührkessel-Bioreaktor.

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Representative Results

Bei der ACISCP-Plattform handelt es sich um ein vollständig geschlossenes System, das eine Reihe von Rührkessel-Bioreaktoren für die Scale-up-Expansion, ein Zellverarbeitungssystem für die automatisierte Zellernte und -formulierung sowie ein Zellfüllsystem verwendet (Abbildung 1). Adhärente Zellen heften sich an die porösen Mikrocarrier, die in den Bioreaktor dispergiert werden können, wodurch die suspendierte Kultivierung adhärenter Zellen erreicht wird.

Dem beschriebenen Protokoll folgend, wurden zunächst 2,5 x 108 hMSCs mit 10 g W01-Mikroträgern in einem 5-Liter-Rührkessel-Bioreaktor für eine erste Expansion inokuliert. Etwa 2,9 x 10 9 Zellen wurden konzentriert und am Tag 4 durch das Zellverarbeitungssystem gewaschen, von denen 1,0 x 109 geerntete Zellen in den 15-Liter-Rührtank-Bioreaktor mit 40 g W01-Mikroträgern für die zweite Phase der Kultivierung geleitet wurden. Schließlich wurden 1,1 x 1010 MSCs geerntet, formuliert und am 9. Tag in über 70 Formulierungsbeutel aliquotiert (Abbildung 2A). Die Zellzahl, die Lebensfähigkeit und der Glukoseverbrauch wurden täglich überwacht (Abbildung 2B,C). Es wurde eine kumulative 128-fache Expansion erreicht; In der Zwischenzeit wurde die Zelllebensfähigkeit über 90% gehalten. Die Aufnahme von Glukose wies eine negative Korrelation mit der Zellexpansion auf, was auf einen Stoffwechsel hindeutet, der mit einem gesunden Zellwachstum verbunden ist.

Die löslichen porösen Mikroträger können vorsterilisiert werden und werden in einer Einwegverpackung mit geschlossenem System geliefert, die für GMP geeignet ist (Abbildung 3A). Die Zellen konnten sich an die Oberfläche der Mikrocarrier und die Innenwand der Makroporen anheften (Abbildung 3B). Durch die Verwendung eines Fluoreszenzfarbstoffs, wie z. B. Calcein-AM/PI Cell Double Staining Kit, konnten die Zellen in den porösen Mikrosphären sichtbar gemacht werden (Abbildung 3C). Die Zusammenführung von Hellfeldbildern mit Fluoreszenzbildern half dabei, die Gleichmäßigkeit der Zellverteilung zu analysieren. Die Lebendzellfärbung zeigte auch eine starke Assoziation mit der Zellzählung, die entweder durch manuelle Probenahme oder die Online-Lebendzellzählsonde gemessen wurde.

Neben der enormen Nachfrage nach hohen Zellmengen sind Critical Quality Attribute (CQA)-Bewertungen und Freigabetests von MSCs unabdingbar, da ohne diese Zellen nach der Kultivierung nicht sterilisiert oder aufwendig gereinigt werden könnten. Um die Zellqualität zu gewährleisten, können 3D-expandierte MSCs in jeder Phase der ACISCP-Plattform beprobt werden. MSCs, die frisch von der ACISCP-Plattform geerntet wurden, behielten die klassischen phänotypischen Marker22 bei, mit einer Expression von >95 % bzw. <2 % für die positiven Marker (CD73, CD90, CD105) bzw. negativen Marker (HLA-DR, CD34, CD45, CD19, CD14) (Abbildung 4A). Die kryokonservierten Zellen wurden aufgetaut und in einen planaren 2D-Kolben inokuliert und zeigten eine gute Adhäsionsfähigkeit, ein normales Expansionsverhalten (Abbildung 4B) und eine typische Spindelform mit spiralförmigem Wachstum (Abbildung 4C). Darüber hinaus behielten die Zellen auch ihre Fähigkeit bei, sich in osteogene, adipogene und chondrogene Linien zu differenzieren (Abbildung 4D).

Darüber hinaus wurden auch HEK293T Zellen und Vero-Zellen in der ACISCP-Plattform getestet. Für HEK293T Zellkultur betrug die Inokulumzellkonzentration 5 x 10 5 Zellen/ml im 5-l-Bioreaktor. Nach dem Bead-to-Bead-Transfer erreichte die Spitzenzellkonzentration im 15-Liter-Bioreaktor 1,68 x 107 Zellen/ml (Abbildung 5A), und die HEK293T Zellen behielten eine hohe Lebensfähigkeit bei (Abbildung 5B). Für die Vero-Zellkultur betrug die Inokulum-Zellkonzentration 2 x 10 5 Zellen/ml im 5-Liter-Bioreaktor. Nach dem Bead-to-Bead-Transferprozess betrug die Spitzenzellkonzentration im 15-Liter-Bioreaktor 1,08 x 107 Zellen/ml (Abbildung 6A), und die Vero-Zellen behielten ebenfalls eine hohe Lebensfähigkeit bei (Abbildung 6B).

Figure 1
Abbildung 1: Schematische Roadmap der hMSC-Produktion über die ACISCP-Plattform. Diese Zahl wurde gegenüber der veröffentlichten Literatur modifiziert18. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Zellexpansion von hMSCs über die ACISCP-Plattform. (A) Die ACISCP-Plattform besteht aus einer Reihe von Rührkessel-Bioreaktoren, einem Zellverarbeitungssystem und einem Zellfüllsystem. (B) Wachstumskurve von hMSCs im zweistufigen Expansionsprozess, (C) und die Glukoseverbrauchsrate während des Prozesses. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Charakterisierung des hMSC-Wachstums auf dem W01-Mikroträger. Diese Zahl wurde gegenüber der veröffentlichten Literatur modifiziert18. (A) W01-Mikroträger werden mit Einwegverpackungen in geschlossenen Systemen hergestellt. (B) Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen von leeren Mikroträgern und Mikroträgern, die mit adhärenten hMSCs kultiviert wurden. Die weißen dreieckigen Köpfe deuten auf Zellen auf der Oberfläche von Mikroträgern hin; Maßstabsbalken = 100 μm. (C) Repräsentative verschmolzene Hellfeld- und Fluoreszenzbilder (Lebendzellfärbung) von hMSCs, die von Tag 1 bis Tag 4 auf Mikroträgern kultiviert wurden; Maßstab = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Bewertung der Zellidentität von hMSCs, die von der ACISCP-Plattform gewonnen wurden . (A) Die Oberflächenmarker von hMSCs wurden mittels Durchflusszytometrie charakterisiert. Alle positiven (>95 %) und negativen Marker (<2 %) erfüllten die Kriterien. (B) Kryokonservierte 3D-expandierte hMSCs zeigten ein normales Expansionsverhalten nach dem Auftauen und Umplattieren in 2D-Kolben. (C) Morphologie der 3D-expandierten hMSCs; Maßstabsbalken = 50 μm. (D) Tri-Lineage-Differenzierung der 3D-expandierten hMSCs. Die osteogenen, adipogenen und chondrogenen Fähigkeiten wurden durch Alizarinrot-, Ölrot- bzw. Alcianblau-Färbung beurteilt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Zellexpansion von HEK293T Zellen über die ACISCP-Plattform. (A) HEK293T Zelldichte in den 5-Liter- und 15-Liter-Bioreaktoren. (B) Hellfeld-Bild (BF), Calcein-AM-gefärbte (Lebend) und PI-gefärbte (tote) HEK293T Zellen, die auf G02-Mikroträgern kultiviert wurden; Maßstabsbalken = 1 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 6
Abbildung 6: Zellexpansion von Vero-Zellen über die ACISCP-Plattform . (A) Vero-Zelldichte in den 5-L- und 15-L-Bioreaktoren. (B) Hellfeldbild (BF), Calcein-AM-gefärbte (Lebend) und PI-gefärbte (tote) Vero-Zellen, die auf V01-Mikroträgern kultiviert wurden; Maßstabsbalken = 400 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: Parametereinstellungen des Rührkessel-Bioreaktors. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 2: Parametereinstellungen des automatisierten Mediumwechsels für die hMSC-Kultivierung. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 3: Parametereinstellungen des Zellverarbeitungssystems für die hMSC-Passage und -Formulierung. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 4: Mediumsaustausch- und Rührregime für HEK293T- und Vero-Zellen. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

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Discussion

Sowohl bei der Immuntherapie als auch bei der Stammzelltherapie werden lebende Zellen als Medikamente verwendet. Ihre Endprodukte sollten jedoch nicht auf die gleiche Weise gereinigt oder sterilisiert werden wie kleine Moleküle oder Viren. Daher sollte das Prinzip von Quality by Design (QbD) immer im Hinterkopf behalten und praktisch auf den Prozess der chemischen Herstellung und Kontrolle (CMC) während der Zellproduktion angewendet werden23. Ein vollständig geschlossenes Zellkultursystem sowie ein Verarbeitungssystem und ein Abfüllsystem werden bevorzugt in Betracht gezogen, um die Anforderungen zu erfüllen. In dieser Studie haben wir ein Protokoll für die Verwendung einer ACISCP-Plattform vorgestellt, die auf löslichen und porösen 3D-Mikroträgern in GMP-Qualität basiert, um eine zweistufige Expansion von hMSCs durchzuführen. Einige Forscher haben die Durchführbarkeit der Verwendung von Bioreaktoren zusammen mit Mikroträgern zur Expansion von hMSCs in vitro untersucht, aber die Mehrheit der berichteten Studien hat gezeigt, dass eine Vergrößerung des Maßstabs zu einer Verringerung der hMSC-Ausbeute führen würde, von 6,1 x 10 5 Zellen/ml oder sogar 12,5 x 10 5 Zellen/ml in 100 ml Arbeitsvolumen auf 2,7 x 10 5 Zellen/ml in 2 l Arbeitsvolumen24, 25,26. Auch wenn Rührkessel-Bioreaktoren die höchste Skalierbarkeit aufweisen, sollten Schlüsselfragen wie die strukturellen Eigenschaften des Behälters, der Laufradtyp, die Spitzengeschwindigkeit, der volumetrische Stoffaustauschkoeffizient kLa von Sauerstoff und die Potenzzahl gründlich berücksichtigt werden24. Im Gegensatz zu früheren Rührkessel-Bioreaktoren, die in der Regel für die Kultivierung von Mikroben oder domestizierten verankerungsunabhängigen Zellen wie CHO-Zellen konzipiert wurden, wurde der in dieser Studie verwendete Bioreaktor speziell für Mikrocarrier-basierte Kulturen konzipiert und ist daher in der Lage, die unterschiedlichen Prozessanforderungen von Nährstoffaustauschstrategien zu erfüllen. Zusätzlich zu den Unterschieden im Prozess der Zellkultivierung verwendet die ACISCP-Plattform ein auf einer kontinuierlichen Zentrifuge basierendes Zellverarbeitungssystem zusammen mit einem Zellfüllsystem, im Gegensatz zu herkömmlichen Ernteverfahren zur Herstellung großer Mengen von Zellen, die durch wiederholte manuelle Arbeit durchgeführt werden, wodurch eine hohe Handhabungseffizienz gewährleistet wird. Fortschrittliche automatisierte Geräte haben eine hohe Ausbeute in der Einzelchargenproduktion.

Die meisten Stammzellen sind von der Verankerung abhängig; Daher benötigen sie Mikrocarrier für die Zellherstellung. Bisher wurden kommerzielle Mikrocarrier so formuliert, dass sie unterschiedliche Oberflächeneigenschaften nutzen und so unterschiedliche Zellexpansionsfaltenzahlen erreichen. In früheren Untersuchungen führte die Verwendung von Cytodex Typ 1 Mikrocarriern für porcine Knochenmark-MSCs zu einer Zelldichte von etwa 4 x 10 5 Zellen/ml, während die Verwendung von gelatinebeschichtetem Cytodex Typ 3 eine vergleichbare Zellzahl (3,8 x 105 Zellen/ml) wie menschliche plazentare MSCserzeugte 27. Cytodex Typ 1 und Typ 3 sind jedoch nicht löslich, so dass der Trypsinisierungsprozess während der Zellernte nicht nur die Zellregenerationsausbeute, sondern auch die Lebensfähigkeit und Qualität beeinflusst. Daher gibt es keine erfolgreichen Fälle der Verwendung konventioneller Mikroträger für CGT-Produkte, bei denen Zellen als Endprodukte keine umfangreichen nachgeschalteten Reinigungsprozesse durchlaufen können, um die Kontamination von nicht löslichen Mikroträgern zu eliminieren28. Im Gegensatz dazu sind W01-Mikroträger vollständig auflösbar, was bedeutet, dass die Zellprodukte durch Abbau des Mikroträgers leicht geerntet werden können. Dieses Microcarrier-Produkt wird auch in einer vollständig geschlossenen Systemverpackung geliefert, was bedeutet, dass ein GMP-konformer Betriebsprozess problemlos erreicht werden kann. Wir haben gezeigt, dass die Passage mit einem zweistufigen Expansionsprozess mit W01-Mikroträgern leicht erreicht werden kann und bis zu 1,1 x10 10 Gesamtzellen in einer einzigen Charge geerntet werden können; In früheren Berichten29,30 konnte dies nur in 50-Liter-Bioreaktoren erreicht werden. In dieser Arbeit erreichte die maximale Zelldichte im Rührtank-Bioreaktor vor der Ernte etwa 11,6 x 105 Zellen/ml. So könnte man erwarten, dass man mit einem 100-200 L Bioreaktor in der ACISCP-Plattform leicht 1 x 1011 Zellen pro Charge erreichen könnte, was bedeuten würde, dass tausend Chargen pro Jahr den Bedarf an 300 Billionen hMSCs pro Jahr problemlos decken könnten.

Da Zellen unterschiedliche Eigenschaften haben, werden verschiedene Arten von 3D-Mikroträgern hergestellt, die für die Prüfung der Kompatibilität zwischen einer bestimmten Zelle und einem Mikroträger zur Verfügung stehen. Für Nicht-Zell-Endprodukte in CGT wurde berichtet, dass Microcarrier-basierte Scale-ups für HEK293T-Zellen und Vero-Zellen in Bioreaktoren 1,5 x 10 6 Zellen/ml bzw. 3,3 x 106 Zellen/ml erreichen31. Wir verwendeten auflösbare poröse Mikroträger, G02 und V01, in der ACISCP-Plattform, um HEK293T Zellen bzw. Vero-Zellen zu expandieren, und die Spitzenzelldichten beider Zellen erreichten über 1 x 107 Zellen/ml. Darüber hinaus kann die Abbaubarkeit von 3D-Mikroträgern für die Produktion biologischer Produkte intrazellulärer Viren von Vorteil sein, da die Zellen leicht von den Mikroträgern getrennt werden können. Entscheidend ist, dass die ACISCP-Plattform ein etabliertes neues Bioproduktionsverfahren darstellt, das sowohl die Quantitäts- als auch die Qualitätsanforderungen für Zell- und Gentherapieprodukte erfüllt. Wir gehen davon aus, dass unsere groß angelegte Zellproduktionsplattform ein wesentliches Werkzeug für die Entwicklung von Zell- und Gentherapien sein wird.

Trotz der oben genannten Vorteile der Plattform gibt es in Zukunft noch einige Einschränkungen, die umgangen werden müssen. Zum einen sind die Bioreaktoren, die in der ACISCP-Plattform in ihrer jetzigen Form eingesetzt werden, noch mit Glastanks ausgestattet, die komplizierte Waschverfahren und Reinigungsnachweise erfordern, um die GMP-Kriterien zu erfüllen. Ein Einweg-Rührkessel-Bioreaktorsystem könnte in Zukunft möglicherweise eingesetzt werden, um einen intakten Satz von Einweg-Verbrauchsmaterialien herzustellen. Zweitens handelt es sich bei hMSCs im Gegensatz zu domestizierten Zelllinien um primäre Zellstämme, die von einzelnen Spendern und unterschiedlichen Geweben isoliert wurden, was bedeutet, dass hMSCs Heterogenität aufweisen. Daher dient das in diesem Beitrag beschriebene Protokoll als Referenz, während systematische Prozessentwicklungen erforderlich sind, um die technische Migration der ACISCP-Plattform zu erreichen. Drittens: Auch wenn unsere Mitarbeiter vorläufig die Machbarkeit der Herstellung des Vaccinia-Virus mit Vero-Zellen32 getestet haben, muss noch weiter validiert werden, ob eine gute Leistung für die Virusproduktion bei der 3D-Expansion von HEK293T Zellen erzielt werden kann. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die großtechnische Zellproduktionsmethode der ACISCP-Plattform, die auf löslichen porösen Mikroträgern und einer Reihe automatisierter geschlossener Systeme basiert, die Möglichkeit bietet, die Produktionseffizienz zu steigern und die Qualitätskontrolle im industriellen Maßstab für die Herstellung von CGT-Produkten zu verfeinern.

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Disclosures

Y.D. ist wissenschaftlicher Berater, und H.X., Y.Z., L.G., M.L., Y.Y., W.L. und X.Y. sind Mitarbeiter von Beijing CytoNiche Biotechnology Co. Ltd. Die anderen Autoren haben kein kommerzielles, proprietäres oder finanzielles Interesse an den in diesem Artikel beschriebenen Produkten oder Unternehmen. Alle anderen Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von der National Science Foundation for Distinguished Young Scholars (82125018) finanziell unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% trypsin EDTA BasalMedia S310JV Used for 2D cell harvest.
3D FloTrix Digest CytoNiche Biotech R001-500 This is a reagent that specifically dissolves 3D TableTrix microcarriers.
3D FloTrix MSC Serum Free Medium CytoNiche Biotech RMZ112 This is a serum-free,animal-free medium for mesenchymal stem cell expansion and maintenance in 2D planar culture as well as 3D culture on 3D TableTrix microcarriers.
3D FloTrix Single-Use Filtration Module CytoNiche Biotech R020-00-10 This module contains 0.22 μm capsule filters used for filtration of culture medium and digest solution.
3D FloTrix Single-Use Storage Bag (10 L) CytoNiche Biotech R020-00-03 Used as feed bag for 5 L bioreactor.
3D FloTrix Single-Use Storage Bag (3 L) CytoNiche Biotech R020-00-01 Used as cell seeding or transfer bags.
3D FloTrix Single-Use Storage Bag (50 L) CytoNiche Biotech R020-00-04 Used as feed bag for 15 L bioreactor.
3D FloTrix vivaPACK Disposable Fill&Finish Consumable Kit CytoNiche Biotech PACK-01-01 This is a standard kit adapted to 3D vivaPACK fill and finish system.
3D FloTrix vivaPACK fill and finish system for cells CytoNiche Biotech vivaPACK This system is a closed liquid handling device, with automated mixing and gas exhausting functions. Cells resuspended in cryopreservation buffer can be rapidly and evenly aliquoted into 20 bags per batch.
3D FloTrix vivaPREP PLUS cell processing system CytoNiche Biotech vivaPREP PLUS This system is a continuous flow centrifuge-based device.Cells can be concentrated, washed, and resuspended under completely closed procedures.
3D FloTrix vivaPREP PLUS Disposable Cell Processing Kit CytoNiche Biotech PREP-PLUS-00 This is a standard kit adapted to 3D vivaPREP PLUS cell processing.
3D FloTrix vivaSPIN  bioreactor 15 L CytoNiche Biotech FTVS15 This bioreactor product employs a controller, a 15 L glass stirred-tank vessel, and assessories. A special perfusion tube is available.
3D FloTrix vivaSPIN  bioreactor 5 L CytoNiche Biotech FTVS05 This bioreactor product employs a controller, a 5 L glass stirred-tank vessel, and assessories.A special perfusion tube is available.
3D FloTrix vivaSPIN Closed System Consumable Pack (10/15 L) CytoNiche Biotech R020-10-10 This is a standard tubing kit adapted to 3D vivaSPIN bioreactor 15 L, containing sampling bags.
3D FloTrix vivaSPIN Closed System Consumable Pack (2/5 L) CytoNiche Biotech R020-05-10 This is a standard tubing kit adapted to 3D vivaSPIN bioreactor 5 L, containing sampling bags.
3D TableTrix microcarriers G02 CytoNiche Biotech G02-10-10g These porous and degradable microcarriers are suitable for HEK293T cell culture. They come pre-sterilized in 10g/bottle with C-Flex tubings for welding to tubes on bioreactors.
3D TableTrix microcarriers V01 CytoNiche Biotech V01-100-10g These porous and degradable microcarriers are suitable for adherent cell culture, they come as non-sterilized microcarriers that need to be autoclaved in PBS before use. They are especially suitable for vaccine production.
3D TableTrix microcarriers W01 CytoNiche Biotech W01-10-10g (single-use packaging);
W01-200 (tablets)		 These porous and degradable microcarriers are suitable for adherent cell culture, especially for cells that need to be harvested as end products. They come pre-sterilized in 10g/bottle with C-Flex tubings for welding to tubes on bioreactors.The product has obtained 2 qualifications for pharmaceutical excipients from CDE, with the registration numbers of [F20200000496; F20210000003]. It has also received DMF qualification for pharmaceutical excipients from FDA, with the registration number of [DMF:35481]
APC anti-human CD45 Antibody BioLegend 368512 Used in flow cytometry for MSC identity assessment
Calcein-AM/PI Double Staining Kit Dojindo C542 Calcein-AM/PI Double Staining Kit is utilized for simultaneous fluorescence staining of viable and dead cells. This kit contains Calcein-AM and Propidium Iodide (PI) solutions, which stain viable and dead cells, respectively.
Cap for EZ Top Container Closures for NALGENE-containers (500mL) Saint-Gobain CAP-38 Brands and catalogue numbers are only for example, similar products are available from various suppliers and as long as they have the same functionality, items could be substituted with other brands.
C-Flex Tubing, Formulation 374 (0.25 in x 0.44 in) Saint-Gobain 374-250-3 Used for tube welding and disconnection.
CryoMACS Freezing Bag 50 Miltenyi Biotec  200-074-400 Used for expanding the 3D FloTrix vivaPACK Disposable Fill&Finish Consumable Kit.
Dimethyl Sulfate (DMSO)  Sigma D2650-100mL Used for preparation of cryopreservation solution.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) BasalMedia L120KJ Used for cultivation of HEK293T and Vero cells.
DURAN Original GL 45 Laboratory bottle (2 L) DWK life sciences 218016357 Used for waste collection from the 5 L bioreactor.
DURAN Original GL 45 Laboratory bottle (5 L) DWK life sciences 218017353 Used for waste collection from the 15 L bioreactor.
DURAN Original GL 45 Laboratory bottle (500 mL) DWK life sciences 218014459 Used for supplementary bottle of 0.1 M NaOH.
EZ Top Container Closures for NALGENE-containers (500mL) Saint-Gobain EZ500 ML-38-2 Brands and catalogue numbers are only for example, similar products are available from various suppliers and as long as they have the same functionality, items could be substituted with other brands.
Fetal bovine serum (FBS) superior quality Wisent 086-150 Used for cultivation of HEK293T cells.
FITC anti-human CD14 Antibody BioLegend 301804 Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
FITC anti-human CD34 Antibody BioLegend 343504 Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
FITC anti-human CD90 (Thy1) Antibody BioLegend 328108 Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
Flow cytometry Beckman Coulter CytoFLEX Used for cell identity assessment.
Fluorescence Cell Analyzer Alit life science Countstar Rigel S2 Used for cell counting. Cell viability can be calculated by staining with AO/PI dyes.
GL 45 Multiport Connector Screw Cap with 2 ports  DWK life sciences 292632806 Brands and catalogue numbers are only for example, similar products are available from various suppliers and as long as they have the same functionality, items could be substituted with other brands.
Glucose Meter Sinocare 6243578 Used for detecting glucose concentration in cell culture medium and supernatant.
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), with calcium and magnesium Gibco 14025092 Used for preparation of digest solution.
Human Albumin 20% Behring (HSA) CSL Behring N/A Used for preparation of wash buffer.
Inverted fluorescent microscope OLYMBUS CKX53SF Used for brifgt field and fluorescent observation and imaging.
Nalgene Measuring Cylinder (500 mL) Thermo Scientific 3662-0500PK Used for calibrating the liquid handling volume speed of peristaltic pumps.
Newborn calf serum (NBS) superfine MINHAI BIO SC101.02 Used for cultivation of Vero cells.
OriCell human mesenchymal stem cell adipogenic differentiation and characterization kit Cyagen HUXUC-90031 Used for tri-lineage differentiation of hUCMSCs.
OriCell human mesenchymal stem cell chondrogenic differentiation and characterization kit Cyagen HUXUC-90041 Used for tri-lineage differentiation of hUCMSCs.
OriCell human mesenchymal stem cell osteogenic differentiation and characterization kit Cyagen HUXUC-90021 Used for tri-lineage differentiation of hUCMSCs.
PE anti-human CD105 Antibody BioLegend 800504 Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
PE anti-human CD19 Antibody BioLegend 302208 Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
PE anti-human CD73 (Ecto-5'-nucleotidase) Antibody BioLegend 344004 Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
PE anti-human HLA-DR Antibody BioLegend 307605 Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
Phosphate Buffered Saline (PBS) Wisent 311-010-CL Used in autoclaving of glass vessel and V01 microcarriers, and replacement of culture medium.
Sani-Tech Platinum Cured Sanitary Silicone Tubing (0.13 in x 0.25 in) Saint-Gobain ULTRA-C-125-2F Used for solution transfering driven by peristaltic pumps.
Sterile Saline Hopebiol HBPP008-500 Used for preparation of wash buffer.
Trypzyme Recombinant Trypsin BasalMedia S342JV This reagent is used for bead-to-bead transfer of HEK293T and Vero cells.
Tube Sealer Yingqi Biotech Tube Sealer I This sealer is compatible with both C-Flex tubing and PVC tubing.
Tube Welder for PVC tubing Chu Biotech Tube Welder Micro I Used for welding of PVC tubing.
Tube Welder for TPE tubing Yingqi Biotech Tube Welder I-V2 Used for welding of TPE tubing.
ViaStain AO / PI Viability Stains Nexcelom CS2-0106-25mL Dual-Fluorescence Viability, using acridine orange (AO) and propidium iodide (PI), is the recommended method for accurate viability analysis of primary cells, such as PBMCs, and stem cells in samples containing debris.

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Zellproduktion im großen Maßstab GMP-Qualität auflösbare poröse Mikroträger Zell- und Gentherapie 3D-Kultur adhärente Zellen HMSCs HEK293T Zellen Vero-Zellen zweidimensionales planares Kultivierungssystem ACISCP-Plattform Rührtank-Bioreaktoren Expansion Ernte Zellverarbeitungssystem Zellfüllsystem Qualitätsbewertung Bioverfahrenstechnik
Großtechnische Zellproduktion auf Basis von auflösbaren porösen Mikroträgern in GMP-Qualität
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Chen, Y., Xu, H., Zhang, Y., Guo, L., Lan, M., Yang, Y., Liu, W., Yan, X., Du, Y. Large-Scale Cell Production Based on GMP-Grade Dissolvable Porous Microcarriers. J. Vis. Exp. (197), e65469, doi:10.3791/65469 (2023).

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