Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

ייצור תאים בקנה מידה גדול המבוסס על מיקרו-נשאים נקבוביים נמסים ברמת GMP (תנאי ייצור נאותים)

Published: July 7, 2023 doi: 10.3791/65469
Automatic Translation
*1, *2, *2, 2, 2, 2, 2, 2, 1
1Department of Biomedical Engineering, School of Medicine, Tsinghua University, 2Beijing CytoNiche Biotechnology Co. Ltd.
* These authors contributed equally

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להשגת ייצור בקנה מידה גדול של תאים דבקים באמצעות מערכת סגורה לחלוטין המבוססת על מיקרו-נשאים נמסים ברמת GMP. הטיפוח של תאי גזע מזנכימליים אנושיים, תאי HEK293T ותאי ורו אומת ועמד הן בדרישות הכמות והן בקריטריוני האיכות של תעשיית התרפיה התאית והגנטית.

Abstract

חוקרים בתעשיית התרפיה התאית והגנטית (CGT) מתמודדים זה זמן רב עם אתגר עצום בהתרחבות יעילה ובקנה מידה גדול של תאים. כדי להתמודד עם החסרונות העיקריים של מערכת הטיפוח המישורית הדו-ממדית (2D), פיתחנו באופן חדשני פלטפורמה אוטומטית לייצור תאים בקנה מידה תעשייתי סגור (ACISCP) המבוססת על מיקרו-נשא בדרגה GMP, נמס ונקבובי עבור תרבית תלת-ממדית של תאים דבקים, כולל תאי גזע/סטרומה מזנכימליים אנושיים (hMSCs), תאי HEK293T ותאי ורו. כדי להשיג הרחבה בקנה מידה גדול, בוצעה הרחבה דו-שלבית עם ביוריאקטורים של 5 ליטר ו-15 ליטר עם מיכלי ערבוב כדי להניב 1.1 x10 10 hMSCs עם הרחבה כוללת של פי 128 תוך 9 ימים. התאים נקצרו על ידי המסה מוחלטת של המיקרו-נשאים, רוכזו, נשטפו ונוסחו באמצעות מערכת עיבוד תאים מבוססת צנטריפוגות בזרימה רציפה, ולאחר מכן הותאמו למערכת מילוי תאים. בהשוואה לתרבית מישורית דו-ממדית, אין הבדלים משמעותיים באיכות של hMSCs שנקטפו מתרבית תלת-ממדית. יישמנו גם מיקרו-נשאים נקבוביים נמסים אלה על סוגי תאים פופולריים אחרים במגזר CGT; באופן ספציפי, תאי HEK293T ותאי Vero טופחו לשיא צפיפות תאים של 1.68 x 10 7 תאים / מ"ל ו 1.08 x 107 תאים / מ"ל, בהתאמה. מחקר זה מספק פרוטוקול לשימוש בפלטפורמה של הנדסת תהליכים ביולוגיים הרותמת את המאפיינים של מיקרו-נשאים מתמוססים ברמת GMP וציוד סגור מתקדם להשגת ייצור בקנה מידה תעשייתי של תאים דבקים.

Introduction

תעשיית CGT הייתה עדה להתרחבות אקספוננציאלית בשני העשורים האחרונים. האבולוציה של תרופות הדור הבא צפויה לטפל ולרפא מחלות עקשנות רבות1. מאז האישור הראשון של מנהל המזון והתרופות האמריקאי (FDA) למוצר CGT, Kymriah, בשנת 2017, המחקר והפיתוח הקשורים ל-CGT בעולם המשיכו לצמוח בקצב מהיר, כאשר ה-FDA ראה בקשות לתרופות ניסיוניות חדשות פעילות עבור CGT גדל ל-500 בשנת 20182. על פי התחזיות, מספר האישורים של מוצרי CGT יעמוד ככל הנראה על 54-74 בארה"ב עד שנת 20302.

בעוד הצמיחה המהירה במחקר ובחדשנות של CGT מרגשת, עדיין קיים פער טכנולוגי גדול בין מחקר מעבדה לייצור בקנה מידה תעשייתי שיכול לספק תרופות מבטיחות אלה כדי להגיע לחולים רבים ככל שיידרש בעלויות סבירות. התהליכים הנוכחיים שאומצו עבור ניסויים קליניים אלה הוקמו במעבדות לניסויים בקנה מידה קטן, ונדרשים מאמצים משמעותיים כדי לשפר ולחדש בייצור CGT3. ישנם סוגים רבים של מוצרי CGT, רובם מבוססים על תאים חיים, שיכולים להיות אלוגנים, אוטולוגיים, מהונדסים או טבעיים. תרופות חיות אלה מורכבות הרבה יותר מישויות מולקולריות קטנות או ביולוגיות, ולכן הופכות ייצור בקנה מידה גדול לאתגר משמעותי 4,5,6. בעבודה זו, אנו מדגימים פרוטוקול ייצור תאים בקנה מידה גדול עבור שלושה תאים תלויי עיגון המיושמים באופן נרחב ב- CGTs. אלה כוללים תאי גזע מזנכימליים אנושיים / סטרומה (hMSCs), אשר שימשו לטיפול מבוסס תאים, ותאי HEK293T ותאי ורו, שניהם משמשים לייצור וירוסים להנדסה גנטית של המוצר הטיפולי הסופי. תאים תלויי עיגון מגודלים בדרך כלל בתרבית על מערכות מישוריות, הדורשות עיבוד ידני. עם זאת, שיטות תרבות ידנית דורשות כמות משמעותית של עבודה והן נוטות לזיהום, אשר יכול לסכן את איכות המוצר הסופי. יתר על כן, אין בקרת תהליך בתוך השורה, מה שמוביל לשונות משמעותית באיכות בין אצוות7. אם ניקח את הטיפול בתאי גזע כדוגמה, עם צנרת מבטיחה של מעל 200 מועמדים לטיפול בתאי גזע, ההערכה היא כי 300 טריליון hMSCs יהיה צורך בשנה כדי לענות על הדרישות של יישומים קליניים8. לפיכך, הייצור בקנה מידה גדול של תאים טיפוליים הפך לתנאי מוקדם לביצוע התערבויות טיפוליות אלה עם ביקוש תאים כה גבוה9.

כדי למנוע את המכשולים של מערכות מישוריות, נעשו מאמצים בפיתוח תהליכי ייצור בקנה מידה גדול בביוריאקטורים של מיכלי ערבוב עם מיקרו-נשאים קונבנציונליים שאינם ניתנים לפירוק 10,11,12,13, אך אלה סובלים מהליכי הכנה מסובכים ומיעילות קצירת תאים נמוכה 14. לאחרונה, חידשנו מיקרו-נשא נמס להרחבת תאי גזע, במטרה לעקוף את האתגרים של קצירת תאים ממיקרו-נשאים מסחריים קונבנציונליים שאינם נמסים15. 3D TableTrix זה, מיקרו-נשא נקבובי תלת-ממדי נמס בתקן GMP (תנאי ייצור נאותים), הראה פוטנציאל גדול לייצור תאים בקנה מידה גדול. ואכן, תרבית תלת-ממדית המבוססת על מיקרו-נשאים נקבוביים אלה עשויה ליצור מחדש מיקרו-סביבות ביומימטיות חיוביות כדי לקדם הידבקות, התפשטות, נדידה והפעלה של תאים16. המבנים הנקבוביים ורשתות הנקבוביות המחוברות זו לזו של מיקרו-נשאים יכולים ליצור שטח היצמדות תאים גדול יותר ולקדם את חילופי החמצן, חומרי המזון והמטבוליטים, ובכך ליצור מצע אופטימלי להתרחבות תאי מבחנה 17. הנקבוביות הגבוהה של מיקרו-נשאים נקבוביים תלת-ממדיים מומסים אלה בתקן GMP מאפשרת הרחבה בקנה מידה גדול של hMSCs, והיכולת של התאים להיות מומסים במלואם מאפשרת קציר יעיל של תאים מורחבים אלה18. זהו גם מוצר בדירוג GMP (תנאי ייצור נאותים) והוא נרשם כמוצר פרמצבטי במרכז הסיני להערכת תרופות (מספרי הגשה: F20210000003 ו-F20200000496)19 וב-FDA של ארה"ב (FDA, ארה"ב; מספר תיק מאסטר לסמים: 35481)20.

כאן, אנו מדגימים מערכת אוטומטית לייצור תאים בקנה מידה תעשייתי סגור (ACISCP)18 באמצעות מיקרו-נשאים נקבוביים אלה הניתנים לפיזור ולמסה עבור hMSC, תא HEK293T והרחבת תאי Vera. השגנו הרחבה דו-שכבתית מוצלחת של hMSCs (הרחבה של פי 128 במצטבר תוך 9 ימים) מביוריאקטור של 5 ליטר לביוריאקטור של 15 ליטר ולבסוף השגנו עד 1.1 x10 10 hMSCs מאצווה אחת של ייצור. התאים נקצרו על ידי המסה מוחלטת של המיקרו-נשאים, רוכזו, נשטפו ונוסחו באמצעות מערכת עיבוד תאים מבוססת צנטריפוגות בזרימה רציפה, ולאחר מכן הותאמו למערכת מילוי תאים. יתר על כן, הערכנו את האיכות של מוצרי hMSC כדי לאשר תאימות. הדגמנו גם את היישום של מיקרו-נשאים נמסים אלה לייצור מורחב של שני סוגים אחרים של תאי עיגון, תאי HEK293T ותאי ורו, המיושמים באופן נרחב בתעשיית ה-CGT. צפיפות השיא של תאי HEK293T הגיעה ל 1.68 x 10 7 תאים / מ"ל, ואילו צפיפות השיא של תאי Vero הגיעה ל 1.08 x 107 תאים / מ"ל. מערכת ACISCP יכולה להיות מותאמת לתרבית של מגוון תאים דבקים, והיא עשויה להפוך לפלטפורמה רבת עוצמה שתתרום לזירוז התיעוש של CGT.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

חבל הטבור האנושי התקבל מבית החולים צינגהואה צ'אנג-גנג בבייג'ינג. כל ההליכים והפרוטוקולים הנוגעים לרכישה, בידוד ותרבית של תאי גזע מזנכימליים מזנכימליים מחבל הטבור האנושיים (UCMSCs) נערכו בהסכמה מדעת ובאישור ועדת האתיקה של בית החולים צינגהואה צ'אנג-גנג בבייג'ינג (מספר הגשה 22035-4-02), והנהלים והפרוטוקולים עמדו בהצהרת הלסינקי משנת 1964 ותיקוניה המאוחרים יותר או בסטנדרטים אתיים דומים.

1. תרבית חד-שכבתית של hMSCs, תאי HEK293T ותאי Vero

  1. בודדו UCMSCs אנושיים ראשוניים מהג'לי של וורטון על פי השיטה המדווחת21. השתמש במדיום תרבית hMSC ללא סרום (SF) לבידוד וצמיחה של UCMSC ראשוניים, קצור את התאים במעבר 2 ושמור בהקפאה כבנק תאים ראשי (MCB).
  2. חסן 6 x 105 UCMSCs אנושיים (רצוי מעבר 2 או מעבר 3 תאים) בבקבוק T75 אחד (כלומר, צפיפות הזריעה על כלים מישוריים דו-ממדיים היא 8,000 תאים לסמ"ק2) לתרבית חד-שכבתית עם 15 מ"ל של מדיום תרבית SF hMSC שלם. הקפידו על זריעה אחידה באמצעות תנועה של הספרה שמונה של הצלוחית. תרבית ב 37 ° C באינקובטור תרבית תאים 5% CO2 למפגש 80%-90%.
  3. כדי לקצור, רוקנו את מדיום תרבית התא, ושטפו את התאים עם 3-5 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (PBS) פעמיים. לאחר מכן, הוסף 2 מ"ל של 0.25% טריפסין-EDTA, ודגר ב 37 ° C במשך 1-2 דקות עד שרוב התאים הפכו עגולים והתנתקו מן הצלוחית, כפי שנצפה תחת מיקרוסקופ הפוך שדה בהיר עם מטרה 4x. הוסף 3 מ"ל של מדיום תרבית SF hMSC כדי לסיים את העיכול.
  4. העבר את מתלה התא לצינור צנטריפוגה חרוטי 15 מ"ל, וצנטריפוגה ב 179 x גרם למשך 5 דקות. דקרו את הסופרנטנט, שטפו את כדורית התא עם PBS פעמיים, והשהו מחדש בסביבות 3-5 מ"ל של מדיום תרבית SF hMSC לזריעה למיקרו-נשאים בביוריאקטורים.
    הערה: בדוק את כדאיות התא וודא שהתאים בני קיימא ב- >90%. הכינו את התאים רק לאחר שכל עבודת ההכנה לביוריאקטורים הושלמה (שלבים 2.1-3.6).
  5. עבור תרבית חד-שכבתית של תאי HEK293T ותאי ורו, יש לחסן ב-2 x 10 6-3 x 106 תאים בכל בקבוק T75, ובתרבית עם DMEM המכיל 10% נסיוב בקר עוברי (FBS) ו-10% נסיוב עגל יילוד (NBS), בהתאמה.
  6. בצע את שלבים 1.3-1.4 לקצירת התאים. השעיה מחדש ב 3-5 מ"ל של DMEM המכיל 10% FBS.

2. הכנת הביוריאקטור המעורבב לפני זריעת התאים

  1. ביום הראשון יש לשטוף היטב את כלי הזכוכית במים זורמים שעברו דה-יוניזציה (DI) פעם אחת.
  2. יש לפרק את כל צינורות הנירוסטה והאימפלרים מלוח הראש, לטבול אותם במי DI ולבצע סוניקציה עם שואב על-קולי ב-40 קילו-הרץ וב-60 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת לניקוי יסודי.
    הערה: ההכנות והנהלים יהיו זהים עבור הרחבה מדרגה ראשונה בביוריאקטור 5 ליטר והרחבה מדרגה שנייה בביוריאקטור 15 ליטר. הפרמטרים עבור הביוריאקטור 15 ליטר ניתנים בסוגריים לכל אורכם. אם לא ניתנים פרמטרים בסוגריים, פרמטרים אלה זהים עבור הביוריאקטורים 5 L ו- 15 L.
  3. בדוק היטב שכל אורינגי ה- O שלמים ובמקומם, ולאחר מכן התקן את החלקים המפורקים בחזרה על לוחית הראש בהתאם להוראות היצרן.
    הערה: במידת הצורך, יש להחליף את כל האורינגים הבלויים או הקרועים לפני ההרכבה. טבעות O שחוקות יפגעו באטימות האוויר, ומכאן, בסטריליות של כלי השיט.
  4. הוסף 7 L (18 L עבור bioreactor 15 L) של תמיסת 0.5 M NaOH לתוך כלי 5 L, ומניחים את לוחית הראש עם צינורות התאספו על שפת הכלי כדי לטבול את הצינורות בתמיסת NaOH. תן לו לעמוד במשך 12 שעות או לילה כדי להסיר endotoxins מן צינורות וכלי זכוכית.
    הערה: אין לחרוג מ-7 ליטר (18 ליטר) מכיוון שזהו הנפח המרבי של כלי זכוכית בנפח 5 ליטר (15 ליטר). יש ללבוש ציוד מגן אישי מתאים בעת הטיפול בתמיסת NaOH, מכיוון שהיא קורוזיבית.
  5. הסר את לוחית הראש ורוקן את תמיסת NaOH לבקבוק פסולת מתאים. יש להשליך בהתאם לתקנות הבטיחות במעבדה. שטפו היטב את כלי השיט, את לוחית הראש ואת חלקיו במים DI נטולי אנדוטוקסין או במים להזרקה להסרת שאריות אלקליין.
  6. הוסף 2 L (5 L) של PBS לכלי, להרכיב מחדש את כל החלקים, ולהבריח את לוחית הראש למסגרת המתכת של הכלי בהתאם להוראות היצרן.
  7. התאם אריזה מתכלה של מערכת סגורה לחלקים/צינורות/יציאות מפלדת אל-חלד (SS) המתאימים על לוחית הראש בהתאם להוראות היצרן. מהדקים את כל מהדקי רוברט על הצינורות, וחיזוק על ידי הידוק עם המוסטטים מומלץ. השאירו את אחד הצינורות, עם מסנן אוורור 0.22 מיקרומטר בקצה המחובר למעבה, לא מהודק.
    הערה: יש להחליק את צינורות הסיליקון על הקצוות על ההמוסטטים כדי למנוע פירסינג של צינורות הסיליקון. הדקו רק את צינורות הסיליקון, והימנעו מהידוק צינורות C-flex הכלולים בערכה זו. השארת צינור אחד על המעבה לא מהודק תאפשר הקלה בלחץ במהלך אוטוקלאבינג.
  8. הכן 250 מ"ל של תמיסת NaOH 0.1 M בבקבוק זכוכית 500 מ"ל GL 45 הניתן להרכבה אוטומטית, והתאם למכסה בורג מחבר מרובה יציאות GL 45 עם שתי יציאות. חבר צינור סיליקון באורך 180 מ"מ, 0.13 אינץ' x 0.25 אינץ' (קוטר פנימי x קוטר חיצוני) לאחת היציאות בצד התחתון של המכסה; האורך צריך להיות ארוך מספיק רק כדי לגעת בתחתית הבקבוק.
  9. חבר חתיכת צינור סיליקון נוספת, באורך ארוך ב-500 מ"מ מקודמו, לאותה יציאה בצד העליון של המכסה, וחבר את הקצה השני ליציאת הזנה בטפטוף על לוחית ראש כלי השיט 5 ליטר. חבר מסנן פתחי אוורור בגודל 0.22 מיקרומטר ליציאה השנייה במכסה הבורג.
  10. בצע כיול דו-נקודתי בבדיקת ה- pH בהתאם להוראות היצרן. לאחר מכן, הכנס את ה- pH, החמצן המומס (DO) ובדיקות ספירת תאים חיים לתוך כלי השיט ביציאות PG13,5 המתאימות, והברג חזק על לוחית הראש.
  11. בצע בדיקת אטימות של הכלי המורכב במלואו בהתאם להוראות היצרן. שמור על לחץ של 0.4 בר ± 0.01 בר למשך 30 דקות לפחות. שחררו לאט את הלחץ לאחר שהמערכת עוברת את המבחן. אם בדיקת האטימות נכשלת, חפש בזהירות נקודות דליפה, וחזק את מכלול כלי השיט.
  12. Autoclave את הכלי התאספו במלואו עם הערכה מתכלה ב 15 psi ו 121 ° C במשך 60 דקות. לאחר האוטוקלאבינג, בדקו את כל מסנני פתחי האוורור כדי לוודא שהם שלמים ויבשים. הסר את כל hemostats.
    הערה: מסנן אוורור רטוב לא יסנן את הגז ביעילות ועלול לסכן את סטריליות הכלי במהלך תרבית התא. החליפו את מסנני פתחי האוורור אם הם רטובים, ובצעו שוב אוטוקלאבל של הכלי כולו.
  13. מעבירים את הכלי האוטומטי לחדר נקי, ומחכים שהוא יתקרר לחלוטין לטמפרטורת החדר. הכנס את בדיקת הטמפרטורה לצינור התרמוול, וחבר את הכבלים עבור המנוע, בדיקת ה- pH ובדיקת DO מהבקר לחלקים המתאימים בכלי השיט. עטפו היטב את שטיחון החום סביב הכלי.
  14. שחררו את מהדקי רוברט על הצינורות הגמישים במעבה גז הפליטה, דליל הטבעת, יציאת הזנת הטפטוף עבור NaOH ויציאת כיסוי האוויר. הפעל את הבקר, היכנס והזן את הפרמטרים המפורטים בטבלה 1 למערכת בהתאם להוראות היצרן. צינורות אלה לא צריך להיות מהדק בכל עת במהלך תהליך התרבית.
  15. לחץ על התחל, ותן שם לניסוי כדי להתחיל את הביוריאקטור. אפשרו לביוריאקטור לפעול על הגדרות אלה במשך 12 שעות לפחות, או למשך הלילה, כדי להרוות את PBS בחמצן על מנת לבצע כיול נקודתי אחד עבור הגשושית DO מאוחר יותר.
  16. כייל את מהירות נפח הטיפול בנוזל של משאבה 1 ומשאבה 2 בבקר הביוריאקטור. התקינו צינור סיליקון בגודל 0.13 אינץ' x 0.25 אינץ' על כל משאבה בנפרד, כאשר קצה אחד טובל בבקבוק מים והקצה השני של הצינור מוכנס לגליל מדידה.
  17. הגדר את מהירות סיבוב המשאבה ל- 300 סל"ד, וזמן לדקה. שימו לב לכמות המים המוזרמת לגליל המדידה עבור שתי המשאבות. מספרים אלה יידרשו לשלבים הבאים.
  18. הכינו 500 מ"ל של מדיום תרבית SF hMSC בהתאם להוראות היצרן, והחליפו את פקק הבקבוק הבינוני של תרבית התאים בסגירת מיכל C-Flex EZ Top חד פעמית ומכסה תואם. בצע את החלפת המכסה בתוך ארון בטיחות ביולוגית (BSC).
  19. רתכו את צינור היציאה על בקבוק המדיום לצינור C-flex הכניסה על בקבוק של 10 גרם של מיקרו-נשאים W01 מעוקרים מראש עבור MSC. התקינו קטע מהצינור במשאבה 1 של בקר הביוריאקטור, כוונו את סיבוב המשאבה ל-300 סל"ד, ושאבו את כל אמצעי התרבית מהבקבוק לבקבוק המיקרו-נשאים. אחסנו את המיקרו-נשאים האלה בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש ביום 0.
    הערה: יש להכין את המנשאים הזעירים ביום −1. עבור תרבית ביוריאקטור 15 ליטר, להכין ארבעה בקבוקים (כלומר, 40 גרם, עם 4 x 500 מ"ל של מדיום SF) בסך הכל.

3. זריעת תאים, תרבית וקציר בביוריאקטור 5 ליטר מיכל ערבוב

  1. ביום 0, בצע כיול נקודתי אחד, במיוחד 100%, עבור בדיקת DO בבקר הביוריאקטור בהתאם להוראות היצרן. הביוריאקטור המוקפץ מוכן כעת לתרבית תאים.
  2. הכינו בקבוק זכוכית בנפח 2 ליטר (5 ליטר) לאיסוף פסולת, התאימו לו מכסה בורג מחבר GL 45 Multiport עם שתי יציאות, עם צינורות C-Flex בקוטר 30 מ"מ, 0.25 אינץ' x 0.44 אינץ' המחוברים לשתי היציאות ואוטוקלאבה לעיקור. רתכו את צינור C-flex מאחת היציאות מבקבוק הפסולת לצינור הקציר על לוחית הראש של כלי הביוריאקטור באמצעות רתך צינור.
  3. עצור את בקרת הטמפרטורה, ה- pH וה- DO בבקר הביוריאקטור באופן זמני, התקן את צינור הסיליקון המחובר לצינור הקציר על משאבה פריסטלטית 2 בכיוון זרימת הנוזל הנכון, ושחרר באופן מלא את כל PBS מהכלי לבקבוק הפסולת. יש להוציא את הצינור מהמשאבה, ולאטום ולנתק את בקבוק הפסולת.
    הערה: יש לפתוח תמיד את מהדקי רוברט על הצינורות הגמישים המעורבים בזרימת נוזלים בכל שלב. יש להדק בחזרה לאחר השלמת העברת הנוזלים לפני האיטום והניתוק. הידקו קרוב יותר לכיוון צד לוחית הראש. יש לבצע את הסרת ההידוק וההידוק בכל השלבים הבאים, אלא אם צוין אחרת.
  4. הכן 7 ליטר (30 ליטר) של מדיום SF hMSC מלא, והחלף כל פקק בקבוק מקורי בסגירת מיכל C-Flex EZ Top חד פעמית ובפקק תואם. ריתך מודול סינון חד-פעמי לאחת היציאות בשקית האחסון החד-פעמית בנפח 10 ליטר (50 ליטר). בצע את הפעולה של החלפת הכובעים בתוך BSC.
  5. סננו והעבירו את מדיום התרבית לשקית האחסון, בקבוק אחד בכל פעם, על ידי ריתוך בקבוקי מדיום תרבית התאים לקצה השני של מסנן הקפסולה ושימוש במשאבה בבקר הביוריאקטור. ייעד כשק ההזנה.
  6. רתך יציאת יציאה אחת משקית ההזנה לצינור C-flex בצינור ההזנה של לוחית הראש, והתקן את הצינור לשאיבה 1 בבקר הביוריאקטור. רתכו את יציאת היציאה השנייה משקית ההזנה לצינור המדמם, והתקינו את הצינור כדי לשאוב 2 על בקר הביוריאקטור בכיוון הנכון של זרימת נוזלים.
    הערה: התקן את החלק בקו זרימת הנוזל, העשוי צינורות סיליקון, על המשאבה לעמידות טובה יותר בפני בלאי בהשוואה לצינורות C-Flex. ודא שהצינורות מותקנים בכיוון הנכון.
  7. הגדר את מהירות המשאבה 1 ל- 300 סל"ד, ועצור את המשאבה לאחר ניפוק 1 ליטר (5 ליטר) של מדיום משקיע ההזנה לתוך כלי השיט, בהתבסס על מהירות ניפוק הנפח שצוינה בשלב 2.17. הפעל שוב את בקרת הטמפרטורה, ה- pH וה- DO, עם אותן הגדרות כמתואר בשלב 2.14.
  8. אטמו ונתק את הצינור המחבר את שקית ההזנה לצינור ההזנה שעל לוחית הראש. רתכו את צינור C-Flex מהבקבוק של המיקרו-נשאים המפוזרים שהוכנו בשלב 2.18 לצינור ההזנה, ושאבו את כל התוכן מהבקבוק לתוך הכלי. אטמו ונתק את הבקבוק הריק של מתלה המיקרו-מוביל. יש לחטא את כל פני השטח של הבקבוק באתנול 75%, ולהניח בתוך BSC לשימוש כבקבוק העברת תרחיף תאים.
    הערה: השאירו חתיכה ארוכה יותר של צינור C-Flex בצד לוחית הראש בעת איטום וניתוק האביזרים החד פעמיים, מכיוון ששלבי ריתוך וניתוק מרובים יבוצעו על אותו צינור בשלבים הבאים.
  9. ודא כי הטמפרטורה המוצגת על הבקר מגיע למצב קבוע של 37 ° C, אשר בדרך כלל לוקח בערך 30 דקות, לפני שתמשיך להכין את תאי הזרע כמו בשלבים 1.3-1.4. השהה מחדש 2.5 x 108 hMSCs ב 500 מ"ל של מדיום SF, ולהעביר לבקבוק הריק שהכיל בעבר את מתלה המיקרו-מוביל.
    הערה: יש להכין את תאי הזרעים להרחבת הביוריאקטור 15 ליטר לפי שלב 3.21, במטרה לחסן 1.0 x 109 תאים ב 500 מ"ל.
  10. רתכו את צינור ה-C-Flex מהבקבוק המכיל כעת את תרחיף התא אל פתח ההזנה שעל לוחית הראש, ושאבו את כל התכולה מהבקבוק לתוך הכלי כדי ליזום חיסון תאים למיקרו-נשאים. יש לאטום ולנתק את הבקבוק הריק. רתכו מחדש את יציאת ההזנה משקית ההזנה לצינור ההזנה שעל לוחית הראש.
  11. התאם את הגדרות התסיסה בבקר כדי לאפשר תסיסה לסירוגין לשיפור יעילות החיסון של hMSCs על ידי הגדרת הפרמטרים הבאים: V1 = 35 (30) סל"ד/5 דקות; V2 = 0 סל"ד/25 דקות; מספר מחזורים = 12 (24); מהירות תסיסה סופית = 35 (30) סל"ד.
    הערה: ניתן לכוונן את מהירות התסיסה ל-40 (35) סל"ד או 45 (40) סל"ד אם נצפתה פיזור לא אחיד או שקיעה של המיקרו-נשאים במהלך תהליך התרבית.
  12. הגדר משטר אוטומטי של תוספים והחלפות בינוניים בבקר הביוריאקטור בממשק Medium Exchange. הגדר את הפרמטרים לגידול hMSC כאמור בטבלה 2.
    הערה: בטל את ההידוק של כל מהדקי רוברט על הצינורות הגמישים המעורבים בזרימת נוזלים בשלב זה, במיוחד עבור צינור ההזנה והדימום. שמור על אלה ללא הידוק לאורך כל תהליך התרבות.
  13. יש להוציא את הדגימות דרך צינור הדגימה על ידי חיבור שקיות הדגימה החד פעמיות באמצעות מחברי Luer בנקודות הזמן הרצויות, בדרך כלל אחת ליום, ולהכניס 10 מ"ל בכל פעם לשקית הדגימה. Aliquot 2-3 מ"ל של דגימה לתוך שקית הדגימה הראשונה, לזרוק, ולאחר מכן aliquot בפועל 10 מ"ל של הדגימה לתוך שקית דגימה חדשה בכל פעם.
    הערה: הדגימה הראשונית של 2-3 מ"ל יכולה להיות נוזלית שנותרה בצינור מנקודת זמן הדגימה הקודמת ועשויה שלא לייצג במדויק את המצב בכלי השיט. בצע תמיד שלבים אלה עם אמצעים אספטיים נוספים על ידי חיטוי מחברי Luer לפני ואחרי ביצוע או ניתוק חיבורים עם 75% אתנול.
  14. מעבירים את הדגימות שנלקחו לצינור צנטריפוגה חרוטי 15 מ"ל. בצע את הבדיקות הבאות על הדגימות.
    1. יש ליטול 200 μL של מתלה המיקרו-נשא עמוס התאים, ולהכתים עם צביעה כפולה של תאי Calcein-AM/PI בהתאם להוראות היצרן. התבוננו תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
    2. משקעים את המיקרו-נשאים על ידי כוח הכבידה, אשר בדרך כלל לוקח 5-10 דקות. שאפו את הסופרנטנט, ובדקו את ריכוז הגלוקוז עם מד סוכר בהתאם להוראות היצרן. התווה גרף רמת גלוקוז.
    3. דגרו על המיקרו-נשאים עמוסי התאים המשוקעים ב-3-5 מ"ל של תמיסת עיכול 1 מ"ג/מ"ל ב-37°C למשך 20-30 דקות כדי להמיס את המיקרו-נשאים במלואם. ספור את התאים לאחר צביעה עם AO/PI עם מנתח תאים פלואורסצנטי אוטומטי. התווה עקומת גדילת תאים. מתאם עם עקומת צמיחת תאים חיים בזמן אמת הנוצרת בבקר.
  15. ביום 4 או ביום 5 של התרבית, להכין 50 מ"ל (200 מ"ל) של פתרון לעיכול ב 30 מ"ג / מ"ל. יחס מסת העבודה בין תמיסת העיכול לבין מיקרו-נשאים נמסים נע בין 3:20 ל-5:20. מסנן סטרילי עם מסנן קפסולה של 0.22 מיקרומטר, ומדולל עוד יותר ב-500 מ"ל (2 ליטר) של תמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS) עם סידן ומגנזיום. מעבירים לשקית אחסון חד פעמית בנפח 3 ליטר.
    הערה: הכינו את תמיסת העיכול רק לפני קצירת התאים. נסה לכוון לפחות 1.0 x 10 9-1.2 x 109 תאים עבור הרחבת השכבה הראשונה ו- 1.0 x 1010 תאים עבור הרחבת השכבה השנייה. אם התאים גדלים מהר יותר, קציר ביום 4; אם לא, קציר ביום 5. לא מומלץ לחרוג מהיום החמישי.
  16. הגדר את מהירות התסיסה ל- 0 בבקר כדי שהמיקרו-נשאים יתיישבו, מה שקורה בדרך כלל תוך 20 דקות. כבה את פרוטוקול חילופי המדיום האוטומטי, ועצור את בקרת הטמפרטורה, ה- pH וה- DO בבקר הביוריאקטורים. הפעל ידנית את משאבה 2 ב -300 סל"ד על הבקר, ושחרר supernatant לתוך משטר ההזנה כדי להשאיר כ 1 L (2 L) של השעיית תרבית בכלי (באמצעות מהירות חלוקת נפח שצוינה בשלב 2.17 או מדידה מסימני הסיום על גוף הכלי). אטמו ונתק לחלוטין את שקית ההזנה.
  17. רתכו את שקית תמיסת העיכול הטרייה שהוכנה משלב 3.15 לצינור ההזנה, ושאבו את כל תכולתה לתוך הכלי. התחל את מהירות התסיסה ב 45 (40) סל"ד. ודא כי בקרת הטמפרטורה עדיין שומרת על הטמפרטורה ב 37 ° C. מיקרו-נשאים יתמוססו תוך 40-60 דקות. קח 1 מ"ל של הדגימה עם מזרק נעילה סטרילי Luer ב 30 דקות ולאחר מכן כל 5-10 דקות כדי לצפות תחת מיקרוסקופ שדה בהיר כדי לבדוק את המסה של microcarriers.
  18. לאחר המסת המיקרו-נשאים, רתכו שקית אחסון אחת של 3 ליטר (שתי שקיות אחסון של 3 ליטר עבור הביוריאקטור 15 ליטר) לצינור הקציר, ושאבו את מתלה התא לחלוטין באמצעות משאבה 2 ב-300 סל"ד. הכינו 1 ליטר (3.5 ליטר) של מי מלח המכילים 1% אלבומין בסרום אנושי (HSA) כחיץ שטיפה ו-500 מ"ל של מדיום SF מלא (500 מ"ל של חיץ שימור הקפאה של תאים, נוסחה של 10% דימתיל סולפט (DMSO) ו-90% מדיום SF נלקחת כדוגמה) בשקיות אחסון חד פעמיות נפרדות תוך שימוש בשיטות ובאביזרים שהוזכרו בשלבים קודמים להעברת נוזלים אחרים.
  19. הפעל את מערכת עיבוד התא, התקן ערכת עיבוד תאים חד פעמית למכשיר בהתאם להוראות היצרן, ריתך את שקיות מתלה התא, חיץ הכביסה ומדיום SF (חיץ הקפאה) לערכת עיבוד התאים החד פעמית, ופעל בקפידה אחר כל ההוראות המוצגות בממשק המשתמש כדי לאתחל ולבדוק את תקינות והתקנה תקינה של הערכה.
  20. לאחר השלמת ההתקנה, הזן את הפרמטרים המפורטים בטבלה 3 עבור שטיפת תאים עם חיץ שטיפה ומתלה בתווך SF (מאגר הקפאה) לתוכנה כדי להתחיל בתהליך השטיפה והמתלה. ההליך כולו יבוצע באופן אוטומטי עם מספר נקודות בדיקה ידניות.
  21. קח דגימה של התאים מתא הצנטריפוגה, כפי שצוין על ידי מערכת עיבוד התא, וחשב את צפיפות התא עם מנתח תאים אוטומטי על פי הוראות היצרן. כוונן את נפח המתלים לצפיפות של 2 x 106 תאים/מ"ל או לנפח כולל מרבי של 250 מ"ל.
  22. אטמו ונתק את שקית העברת התאים מערכת עיבוד התאים החד-פעמית לאחר שהמערכת הוציאה את התאים מהחדר. התאם מחדש את צפיפות התא ל- 2 x 106 תאים/מ"ל עם מדיום SF מלא בשקית העברת תאים גדולה יותר/שקית אחסון בינונית במידת הצורך. אלה יהיו תאי הזרע להרחבת השכבה השנייה בביוריאקטור 15 ליטר.

4. ניסוח תאים, מילוי וגימור

  1. התחל להכין את הביוריאקטור 15 L יום אחד לפני קציר התאים מהביוריאקטור 5 L. בצע את השלבים בסעיף פרוטוקול 2 ו -3 לחלוטין, למעט עם הפרמטרים עבור 15 L המצוינים בסוגריים.
  2. השהה מחדש את התאים ב-250 מ"ל של מאגר הקפאה, ואטם ונתק את שקית העברת התאים מערכת עיבוד התאים החד-פעמית לאחר שהמערכת שאפה את התאים החוצה מהחדר.
  3. העבר 2,000 מ"ל של חיץ הקפאה יחד עם 250 מ"ל של תאים מרחפים משלב 4.2 לשקית העברת תאים 3 ליטר. רתכו שקית העברה זו לערכה מתכלה חד פעמית מסוג Fill&Finish Consumable Kit.
    הערה: הנפח הנוסף של מאגר שימור הקפאה המשמש כאן צריך להיקבע על-ידי מפרט הניסוח וחישוב מספר התא הכולל בהתאם לתוצאות הספירה שהושגו בשלב 3.21
  4. הרכיבו את ערכת המילוי והגימור המתכלה החד פעמית למערכת מילוי התא, והפעילו את מערכת הקירור מראש בהתאם להוראות היצרן. בצע את ההוראות במערכת, והגדר למלא 20 מ"ל / שקית עם סך של 20 שקיות לכל אצווה. יש לאטום ולנתק שקיות אלה מהערכה, ולפעול לפי נהלי שימור הקפאה סטנדרטיים. השתמש שקיות cryostorage.
  5. רתכו סט חדש של 20 שקיות הקפאה לערכה המתכלה החד-פעמית Fill&Finish Consumable Kit, וחזרו על הליך המילוי והגימור עד שכל התאים יתעוררו. בצע הליכים סטנדרטיים כדי cryoלשמר תאים אלה.

5. אפיון איכות התא

  1. דגמו את ה-hMSCs שנקטפו מהמיקרו-נשאים הנמסים, והשתמשו במערכת עיבוד תאים לאפיון לפי ציטומטריית זרימה לקביעת זהות התא בהתאם לשיטות המתוארות בספרות18.
  2. הפשירו את התאים השמורים בהקפאה, ולוחמו מחדש על צלוחיות דו-ממדיות קונבנציונליות או מיקרו-צלחות לצורך אפיון נוסף של תכונות התא, כולל המורפולוגיה של התא ויכולת התמיינות תלת-שושלת, בהתאם לשיטות המתוארות בספרות18.

6. הרחבה HEK293T על מיקרו-נשאים G02 בביוריאקטור המוקפץ

  1. הכינו ביוריאקטור 5 ליטר כפי שהוזכר בשלב 2. עבור תאים HEK293T, תרבית את התאים עם מיקרו-נשאים סטריליים של G02 במקום W01. תהליך התרבות דומה לפרוטוקול סעיף 3, אם כי חלק מהפרמטרים שונים, כפי שיפורט בשלבים הבאים. התקן צינור זילוח מיוחד בביוריאקטור כתחליף לצינור הדימום, שכן יש צורך בזילוח לתרבית תאי HEK293T.
  2. בשונה מהפרוטוקול המפורט בסעיף 3 של הפרוטוקול, הכינו 20 גרם של מיקרו-נשאים G02 (כלומר, שני בקבוקים) ב-DMEM עם 10% FBS עבור הביוריאקטור 5 ליטר, כאשר נפח התרבית של יום 0 נקבע על 3.5 ליטר (כלומר, ריכוז סופי של כ-5.71 גרם לליטר). מוציאים 2 ליטר של תווך לתוך הכלי לפני שני בקבוקים של מיקרו-נשאים G02, ומחסנים 500 מ"ל של 1.75 x 109 תאי HEK293T (כלומר, בצפיפות סופית של 5 x 105 תאים / מ"ל).
  3. לבצע משטר תסיסה ומשטר חליפין בינוני (בהתבסס על כמות התווך הנדרשת להחלפה ליום, מבוטא כנפח תרבית ליום, CVD), השונה מפרוטוקול סעיף 3 ומפורט בטבלה 4.
    הערה: הפעל את משאבה 1 ואת משאבה 2 באופן ידני כדי ששתיהן יוכלו לשאוב ברציפות עד שתתרחש זילוח. כוונן את מהירות המשאבה מדי יום כדי לעמוד בקצב הזילוח בהתבסס על כיול מהירות ניפוק נפח המשאבות. בדרך כלל, זה יהיה בטווח חד ספרתי. עבור תאים HEK293T, השתמשו במדיום טרי כמזון, והשליכו את המדיום המשומש לחלוטין לבקבוק פסולת, בניגוד ל-hMSCs, שעבורם המדיום מופץ.
  4. עבור הרחבת השכבה השנייה לביוריאקטור 15 L, השתמש בהעברת חרוז לחרוז של תאי HEK293T במקום בפירוק מלא של המיקרו-נשאים כפי שנעשה שימוש עם hMSCs. באופן ספציפי, לעצור את התסיסה כדי לשקוע את המיקרו-נשאים לאחר שצפיפות התאים הרצויה הגיעה, ולאחר מכן לשאוף כמה שיותר supernatant מתוך צינור הזלוף, להזין PBS עם נפח גדול פי 3 של ההשעיה הנותרת פנימה כדי לשטוף את microcarriers, ולחזור על הפעולה שלוש פעמים. שאפו והשליכו כמה שיותר PBS בכביסה הסופית.
  5. הזינו 3.5 ליטר של טריפסין רקומביננטי 1x כדי לנתק את התאים מהמיקרו-נשאים בזמן שהמיקרו-נשאים של G02 נשארים שלמים. הגדר את הטמפרטורה ל 37 ° C ואת מהירות התסיסה ל 60 סל"ד. לסיים את הניתוק בתוך 45 דקות, כאשר יותר מ 80% של התאים התנתקו, עם כמות שווה של תווך שלם.
  6. העברה ישירות מנמל הקציר לספינה מוכנה של 15 ליטר להרחבה מדרגה שנייה.

7. התפשטות תאי Vero על מיקרו-נשאים V01 בביוריאקטור המיכל המעורבב

  1. הכינו מיקרו-נשאים V01 על ידי העברת המיקרו-נשאים הליופיליים לכלי הדם הביוריאקטורים יחד עם PBS לריכוז של 20 מ"ג/מ"ל. להרכיב ולעקר את הכלי כאמור בסעיף 2 פרוטוקול, אבל autoclave במשך 30 דקות במקום.
  2. לאחר העיקור, מיקרו-נשאים V01 מתיישבים באופן טבעי. החליפו את הסופרנאטנט ב-DMEM בסיסי פעמיים באמצעות שפופרות הדימום וההזנה, והוסיפו את ה-DMEM המלא המכיל 10% NBS ל-50%-75% מנפח הכלי לפני שהמשיכו לפרוטוקול סעיף 3 לחיסון תאים ותרבית.
  3. בשונה מהפרוטוקול המפורט בסעיף 3 של הפרוטוקול, השתמש ב-24 גרם של מיקרו-נשאים V01 עבור תרבית 4 ליטר של תאי Vero (כלומר, ריכוז סופי של 6 גרם / ליטר), וחסן 500 מ"ל של 4 x 109 תאי Vero (כלומר, בצפיפות סופית של 1 x 106 תאים / מ"ל).
  4. בצע את שלבים 6.3-6.6 עבור הפרמטרים של תהליך התרבית ומעבר להרחבה מדרגה שנייה בביוריאקטור 15 ליטר עם מיכל ערבוב.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

פלטפורמת ACISCP היא מערכת סגורה לחלוטין שמשתמשת בסדרה של ביוריאקטורים מוקפצים להרחבת קנה מידה, מערכת עיבוד תאים לקצירת תאים וניסוח אוטומטיים, ומערכת מילוי תאים (איור 1). תאים דבקים נצמדים למיקרו-נשאים הנקבוביים, אשר יכולים להתפזר לתוך הביוריאקטור, ובכך להשיג את הטיפוח המושעה של תאים דבקים.

בהתאם לפרוטוקול כמתואר, 2.5 x 108 hMSCs עם 10 גרם של מיקרו-נשאים W01 חוסנו תחילה בביוריאקטור 5 ליטר להרחבה ראשונית. בסביבות 2.9 x 109 תאים רוכזו ונשטפו על ידי מערכת עיבוד התאים ביום הרביעי, מתוכם 1.0 x 109 תאים שנקטפו הועברו לביוריאקטור 15 L עם 40 גרם של מיקרו-נשאים W01 לשלב השני של הגידול. בסופו של דבר, 1.1 x10 MSCs נקצרו, נוסחו וחוברו ליותר מ-70 שקיות פורמולציה ביום ה-9 (איור 2A). מספר התאים, הכדאיות וצריכת הסוכר נוטרו מדי יום (איור 2B,C). הושגה הרחבה מצטברת של פי 128; בינתיים, כדאיות התא נשמרה גבוהה מ-90%. צריכת גלוקוז הראתה מתאם שלילי עם התרחבות תאים, מראה מטבוליזם הקשור לצמיחת תאים בריאה.

המיקרו-נשאים הנקבוביים הנמסים יכולים לעבור עיקור מוקדם ולהגיע באריזת מערכת סגורה חד-פעמית, המתאימה ל-GMP (איור 3A). התאים יכלו להיצמד לפני השטח של המיקרו-נשאים ולדופן הפנימית של המקרו-נקבוביות (איור 3B). על-ידי שימוש בצבע פלואורסצנטי, כמו למשל Calcein-AM/PI Cell Double Staining Kit, ניתן היה לדמיין את התאים בתוך המיקרוספרות הנקבוביות (איור 3C). מיזוג תמונות שדה בהיר עם תמונות פלואורסצנטיות סייע לנתח את אחידות התפלגות התא. צביעת התאים החיים הראתה גם קשר חזק עם ספירת תאים שנמדדה על ידי דגימה ידנית או בדיקה מקוונת של ספירת תאים חיים.

בנוסף לביקוש העצום לכמויות תאים גבוהות, הערכות תכונות איכות קריטיות (CQA) ומבחני שחרור של MSCs הם הכרחיים, מכיוון שבלעדיהם, לא ניתן היה לעקר תאים או לטהר אותם באופן נרחב לאחר התרבית. כדי להבטיח את איכות התא, ניתן לדגום MSCs מורחבים בתלת-ממד בכל שלב של פלטפורמת ACISCP. MSCs שזה עתה נקטפו מפלטפורמת ACISCP שמרו על סמנים פנוטיפיים קלאסיים22, עם ביטוי של >95% ו-<2% עבור הסמנים החיוביים (CD73, CD90, CD105) והסמנים השליליים (HLA-DR, CD34, CD45, CD19, CD14), בהתאמה (איור 4A). התאים שמורים בהקפאה הופשרו וחוסנו לבקבוק מישורי דו-ממדי והראו יכולת היצמדות טובה, התנהגות התפשטות נורמלית (איור 4B) וצורת ציר טיפוסית עם צמיחה ספירלית (איור 4C). יתר על כן, התאים גם שמרו על יכולתם להתמיין לשושלות אוסטאוגניות, אדיפוגניות וכונדרוגניות (איור 4D).

יתר על כן, תאי HEK293T ותאי Vero נבדקו גם בפלטפורמת ACISCP. עבור תרבית תאים HEK293T, ריכוז תאי החיסון היה 5 x 10 5 תאים / מ"ל בביוריאקטור5 L. לאחר תהליך העברת חרוז לחרוז, ריכוז שיא התאים הגיע ל-1.68 x 107 תאים/מ"ל בביוריאקטור של 15 ליטר (איור 5A), ותאי HEK293T שמרו על כדאיות גבוהה (איור 5B). עבור תרבית תאי ורו, ריכוז תאי האינוקולום היה 2 x 105 תאים / מ"ל בביוריאקטור 5 L. לאחר תהליך העברת חרוז לחרוז, ריכוז התאים המרבי שהושג היה 1.08 x 107 תאים/מ"ל בביוריאקטור של 15 ליטר (איור 6A), וגם תאי ורו שמרו על כדאיות גבוהה (איור 6B).

Figure 1
איור 1: מפת דרכים סכמטית של ייצור hMSC באמצעות פלטפורמת ACISCP. נתון זה שונה מספרות שפורסמה18. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: התרחבות תאים של hMSCs באמצעות פלטפורמת ACISCP. (A) פלטפורמת ACISCP מורכבת מסדרה של ביוריאקטורים של מיכלי ערבוב, מערכת עיבוד תאים ומערכת מילוי תאים. (B) עקומת גדילה של hMSCs בתהליך ההתפשטות הדו-שכבתי, (C) וקצב צריכת הגלוקוז במהלך התהליך. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: אפיון צמיחת hMSC במיקרו-נשא W01. נתון זה שונה מספרות שפורסמה18. (A) מיקרו-נשאים W01 מוכנים באריזה חד-פעמית של מערכת סגורה. (B) סריקת תמונות של מיקרוסקופ אלקטרונים של מיקרו-נשאים ריקים ומיקרו-נשאים שגודלו בתרבית עם hMSCs דבקים. ראשי המשולש הלבנים מציינים תאים על פני השטח של מיקרו-נשאים; סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. (C) נציג מזג תמונות שדה בהיר ופלואורסצנטיות (צביעת תאים חיים) של hMSCs בתרבית על מיקרו-נשאים מהיום הראשון עד היום הרביעי; סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: הערכת זהות תאים של hMSCs שנקצרו מפלטפורמת ACISCP. (A) סמני פני השטח של hMSCs התאפיינו בציטומטריית זרימה. כל הסמנים החיוביים (>95%) והסמנים השליליים (<2%) עמדו בקריטריונים. (B) hMSCs מורחבים בתלת-ממד שמורים בהקפאה הציגו התנהגות התפשטות רגילה לאחר הפשרה וציפוי מחדש לצלוחיות דו-ממדיות. (C) מורפולוגיה של hMSCs מורחבים בתלת-ממד; סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. (D) הבחנה תלת-שושלת של hMSCs מורחבים בתלת-ממד. יכולות אוסטאוגניות, אדיפוגניות וכונדרוגניות הוערכו על ידי צביעה בצבע אדום אליזרין, אדום שמן וכחול אלסי, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: התרחבות תאים של תאים HEK293T באמצעות פלטפורמת ACISCP. (A) צפיפות תאים HEK293T בביוריאקטורים של 5 L ו-15 L. (B) תמונת שדה בהיר (BF), תאי HEK293T מוכתמים ב-Calcein-AM (חיים) ומוכתמים ב-PI (מתים) בתרבית על מיקרו-נשאים G02; סרגל קנה מידה = 1 מ"מ. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: התרחבות תאים של תאי Vero באמצעות פלטפורמת ACISCP . (A) צפיפות תאי Vero בביוריאקטורים של 5 L ו-15 L. (B) תמונת שדה בהיר (BF), תאי Vero מוכתמים ב-Calcein-AM (חיים) ומוכתמים ב-PI (מתים) בתרבית על מיקרו-נשאים V01; סרגל קנה מידה = 400 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: הגדרות הפרמטרים של הביוריאקטור המעורבב. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 2: הגדרות פרמטרים של חילופי מדיום אוטומטיים לטיפוח hMSC. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 3: הגדרות פרמטרים של מערכת עיבוד התאים עבור מעבר וניסוח hMSC. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 4: משטר חליפין בינוני ומשטר תסיסה לתאי HEK293T ו-Tורו. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הן אימונותרפיה והן טיפול בתאי גזע משתמשים בתאים חיים כתרופות; עם זאת, המוצרים הסופיים שלהם לא צריך להיות מטוהר או מעוקר באותו אופן כמו מולקולות קטנות או וירוסים. לכן, העיקרון של איכות על ידי עיצוב (QbD) צריך תמיד לזכור מיושם בפועל על תהליך ייצור כימי ובקרה (CMC) במהלך ייצור תאים23. מערכת תרבית תאים סגורה לחלוטין, כמו גם מערכת עיבוד ומערכת מילוי, נחשבים מועדפים כדי לענות על הדרישות. במחקר זה, הצגנו פרוטוקול לשימוש בפלטפורמת ACISCP המבוססת על מיקרו-נשאים תלת-ממדיים ברמת GMP, נמסים ונקבוביים לביצוע הרחבה דו-שכבתית של hMSCs. כמה חוקרים בחנו את ההיתכנות של שימוש בביוריאקטורים יחד עם מיקרו-נשאים כדי להרחיב hMSCs במבחנה, אך רוב המחקרים שדווחו הראו כי עלייה בקנה מידה תוביל לירידה בתפוקת hMSC, מ 6.1 x 10 5 תאים / מ"ל או אפילו 12.5 x 105 תאים / מ"ל ב 100 מ"ל של נפח עבודה ל 2.7 x 105 תאים / מ"ל ב 2 ליטר של נפח עבודה24, 25,26. אף על פי שביוריאקטורים של מיכלי ערבוב מפגינים את יכולת ההרחבה הגבוהה ביותר, יש לשקול ביסודיות סוגיות מפתח כגון המאפיינים המבניים של כלי השיט, סוג האימפלר, מהירות החוד, מקדם העברת המסה הנפחית, kLa, של חמצן ומספר ההספק,24. בניגוד לביוריאקטורים קודמים של מיכלי ערבוב, שתוכננו בדרך כלל לגידול מיקרובים או תאים מבויתים שאינם תלויים בעיגון כמו תאי CHO, הביוריאקטור ששימש במחקר זה תוכנן במיוחד עבור תרבית מבוססת מיקרו-נשאים ולכן הוא מסוגל לספק את צרכי התהליך השונים של אסטרטגיות חילופי חומרי מזון. בנוסף להבדלים בתהליך גידול התא, פלטפורמת ACISCP משתמשת במערכת עיבוד תאים מבוססת צנטריפוגות בזרימה רציפה יחד עם מערכת מילוי תאים, בניגוד להליכי קציר קונבנציונליים לייצור כמויות גדולות של תאים המבוצעים בעבודה ידנית חוזרת, ובכך מבטיחה יעילות טיפול גבוהה. למכשירים אוטומטיים מתקדמים יש תפוקה גבוהה בייצור אצווה אחת.

רוב תאי הגזע תלויים בעיגון; לכן, הם דורשים microcarriers לייצור תאים. באופן קונבנציונלי, מיקרו-נשאים מסחריים קודמים נוסחו כדי למנף מאפייני שטח שונים, ובכך להשיג מספרי קיפול שונים של התפשטות תאים. במחקר קודם, השימוש במיקרו-נשאים מסוג Cytodex מסוג 1 עבור MSCs מח עצם חזירי יצר צפיפות תאים של כ 4 x 105 תאים / מ"ל, בעוד שהשימוש ב- Cytodex type 3 מצופה ג'לטין יצר מספרי תאים דומים (3.8 x 105 תאים/מ"ל) ל- MSCs שליה אנושית27. עם זאת, Cytodex type 1 וסוג 3 אינם ניתנים להמסת, ולכן תהליך הטריפסיניזציה במהלך קצירת התאים משפיע לא רק על תפוקת התאוששות התא אלא גם על הכדאיות והאיכות. לפיכך, אין מקרים מוצלחים של שימוש במיקרו-נשאים קונבנציונליים עבור מוצרי CGT, שבהם תאים כתוצרים הסופיים אינם יכולים לעבור תהליכי טיהור נרחבים במורד הזרם כדי למנוע את הזיהום של מיקרו-נשאים שאינם ניתנים לפירוק28. לעומת זאת, מיקרו-נשאים W01 ניתנים להמסה מלאה, כלומר ניתן לקצור בקלות את תוצרי התאים על ידי פירוק המיקרו-נשא. מוצר מיקרו-מוביל זה מגיע גם באריזת מערכת סגורה לחלוטין, כלומר ניתן להשיג בקלות תהליך פעולה התואם ל- GMP. הראינו כי ניתן להשיג בקלות מעבר עם תהליך הרחבה דו-שכבתי עם מיקרו-נשאים W01, ועד 1.1 x10 10 תאים בסך הכל ניתן לקצור באצווה אחת; ואכן, ניתן היה להשיג זאת רק בביוריאקטורים של 50 ליטר בדוחות קודמים 29,30. בעבודה זו, צפיפות התאים השיא בתוך הביוריאקטור המעורבב הגיעה לכ-11.6 x 105 תאים למ"ל לפני הקציר. לפיכך, ניתן היה לצפות כי ניתן בקלות להשיג 1 x 1011 תאים לכל אצווה עם ביוריאקטור 100-200 L בפלטפורמת ACISCP, מה שאומר כי אלפי אצוות בשנה יכול בקלות לענות על הביקוש 300 טריליון hMSCs מדי שנה.

מכיוון שלתאים יש מאפיינים מגוונים, סוגים שונים של מיקרו-נשאים תלת-ממדיים מיוצרים וזמינים לבדיקת התאימות בין תא מסוים למיקרו-נשא. עבור מוצרים סופיים שאינם תאים ב-CGT, דווח כי התרחבות מבוססת מיקרו-נשא עבור תאי HEK293T ותאי Vero בביוריאקטורים מגיעה ל-1.5 x 106 תאים/מ"ל ו-3.3 x 106 תאים/מ"ל, בהתאמה31. השתמשנו במיקרו-נשאים נקבוביים נמסים, G02 ו-V01, בפלטפורמת ACISCP כדי להרחיב תאי HEK293T ותאי ורו, בהתאמה, וצפיפויות שיא התאים של שני התאים הגיעו ליותר מ-1 x 107 תאים/מ"ל. יתר על כן, יכולת ההתכלות של מיקרו-נשאים תלת-ממדיים יכולה להועיל לייצור מוצרים ביולוגיים של וירוסים תוך-תאיים, שכן ניתן להפריד בקלות את התאים מהמיקרו-נשאים. באופן קריטי, פלטפורמת ACISCP מייצגת תהליך ייצור ביולוגי חדש ומבוסס העונה הן על דרישות הכמות והן על דרישות האיכות עבור מוצרי תרפיה תאית וגנטית. אנו צופים כי פלטפורמת ייצור התאים בקנה מידה גדול שלנו תפעל ככלי חיוני כדי לאפשר פיתוח של טיפולים תאיים וגנים.

למרות היתרונות של הפלטפורמה שנדונו לעיל, נותרו מספר אילוצים שיש לעקוף בעתיד. ראשית, הביוריאקטורים המועסקים בפלטפורמת ACISCP במתכונתם הנוכחית עדיין מצוידים במיכלי זכוכית, הדורשים הליכי שטיפה מסובכים ואימות ניקוי כדי לעמוד בקריטריונים של GMP. מערכת ביוריאקטור חד-פעמית עשויה לשמש בעתיד לייצור מערך שלם של ערכות מתכלות חד-פעמיות. שנית, בשונה מקווי תאים מבויתים, hMSCs הם זני תאים ראשוניים שבודדו מתורמים בודדים ומרקמות מגוונות, מה שאומר ש-hMSCs מפגינים הטרוגניות. לכן, הפרוטוקול המתואר במאמר זה משמש כנקודת התייחסות, בעוד שנדרשים פיתוחי תהליכים שיטתיים כדי להשיג את ההגירה הטכנית של פלטפורמת ACISCP. שלישית, למרות שעמיתינו לעבודה בדקו באופן ראשוני את ההיתכנות של ייצור נגיף החיסון עם תאי Vero32, עדיין לא ברור אם ניתן להשיג ביצועים טובים לייצור נגיפי בהרחבה תלת-ממדית של תאי HEK293T. לסיכום, שיטת ייצור התאים בקנה מידה גדול של פלטפורמת ACISCP, המבוססת על מיקרו-נשאים נקבוביים נמסים וסדרה של מערכות סגורות אוטומטיות, מציעה הזדמנות לשפר את יעילות הייצור ולשכלל את בקרת האיכות בקנה מידה תעשייתי לייצור מוצרי CGT.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

י.ד. הוא יועץ מדעי, ו-H.X., Y.Z., L.G., M.L., Y.Y., W.L. ו-X.Y. הם עובדים של Beijing CytoNiche Biotechnology Co. Ltd. למחברים האחרים אין כל עניין מסחרי, קנייני או פיננסי במוצרים או בחברות המתוארים במאמר זה. כל שאר המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים מתחרים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה כספית על ידי הקרן הלאומית למדע לחוקרים צעירים מצטיינים (82125018).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% trypsin EDTA BasalMedia S310JV Used for 2D cell harvest.
3D FloTrix Digest CytoNiche Biotech R001-500 This is a reagent that specifically dissolves 3D TableTrix microcarriers.
3D FloTrix MSC Serum Free Medium CytoNiche Biotech RMZ112 This is a serum-free,animal-free medium for mesenchymal stem cell expansion and maintenance in 2D planar culture as well as 3D culture on 3D TableTrix microcarriers.
3D FloTrix Single-Use Filtration Module CytoNiche Biotech R020-00-10 This module contains 0.22 μm capsule filters used for filtration of culture medium and digest solution.
3D FloTrix Single-Use Storage Bag (10 L) CytoNiche Biotech R020-00-03 Used as feed bag for 5 L bioreactor.
3D FloTrix Single-Use Storage Bag (3 L) CytoNiche Biotech R020-00-01 Used as cell seeding or transfer bags.
3D FloTrix Single-Use Storage Bag (50 L) CytoNiche Biotech R020-00-04 Used as feed bag for 15 L bioreactor.
3D FloTrix vivaPACK Disposable Fill&Finish Consumable Kit CytoNiche Biotech PACK-01-01 This is a standard kit adapted to 3D vivaPACK fill and finish system.
3D FloTrix vivaPACK fill and finish system for cells CytoNiche Biotech vivaPACK This system is a closed liquid handling device, with automated mixing and gas exhausting functions. Cells resuspended in cryopreservation buffer can be rapidly and evenly aliquoted into 20 bags per batch.
3D FloTrix vivaPREP PLUS cell processing system CytoNiche Biotech vivaPREP PLUS This system is a continuous flow centrifuge-based device.Cells can be concentrated, washed, and resuspended under completely closed procedures.
3D FloTrix vivaPREP PLUS Disposable Cell Processing Kit CytoNiche Biotech PREP-PLUS-00 This is a standard kit adapted to 3D vivaPREP PLUS cell processing.
3D FloTrix vivaSPIN  bioreactor 15 L CytoNiche Biotech FTVS15 This bioreactor product employs a controller, a 15 L glass stirred-tank vessel, and assessories. A special perfusion tube is available.
3D FloTrix vivaSPIN  bioreactor 5 L CytoNiche Biotech FTVS05 This bioreactor product employs a controller, a 5 L glass stirred-tank vessel, and assessories.A special perfusion tube is available.
3D FloTrix vivaSPIN Closed System Consumable Pack (10/15 L) CytoNiche Biotech R020-10-10 This is a standard tubing kit adapted to 3D vivaSPIN bioreactor 15 L, containing sampling bags.
3D FloTrix vivaSPIN Closed System Consumable Pack (2/5 L) CytoNiche Biotech R020-05-10 This is a standard tubing kit adapted to 3D vivaSPIN bioreactor 5 L, containing sampling bags.
3D TableTrix microcarriers G02 CytoNiche Biotech G02-10-10g These porous and degradable microcarriers are suitable for HEK293T cell culture. They come pre-sterilized in 10g/bottle with C-Flex tubings for welding to tubes on bioreactors.
3D TableTrix microcarriers V01 CytoNiche Biotech V01-100-10g These porous and degradable microcarriers are suitable for adherent cell culture, they come as non-sterilized microcarriers that need to be autoclaved in PBS before use. They are especially suitable for vaccine production.
3D TableTrix microcarriers W01 CytoNiche Biotech W01-10-10g (single-use packaging);
W01-200 (tablets)		 These porous and degradable microcarriers are suitable for adherent cell culture, especially for cells that need to be harvested as end products. They come pre-sterilized in 10g/bottle with C-Flex tubings for welding to tubes on bioreactors.The product has obtained 2 qualifications for pharmaceutical excipients from CDE, with the registration numbers of [F20200000496; F20210000003]. It has also received DMF qualification for pharmaceutical excipients from FDA, with the registration number of [DMF:35481]
APC anti-human CD45 Antibody BioLegend 368512 Used in flow cytometry for MSC identity assessment
Calcein-AM/PI Double Staining Kit Dojindo C542 Calcein-AM/PI Double Staining Kit is utilized for simultaneous fluorescence staining of viable and dead cells. This kit contains Calcein-AM and Propidium Iodide (PI) solutions, which stain viable and dead cells, respectively.
Cap for EZ Top Container Closures for NALGENE-containers (500mL) Saint-Gobain CAP-38 Brands and catalogue numbers are only for example, similar products are available from various suppliers and as long as they have the same functionality, items could be substituted with other brands.
C-Flex Tubing, Formulation 374 (0.25 in x 0.44 in) Saint-Gobain 374-250-3 Used for tube welding and disconnection.
CryoMACS Freezing Bag 50 Miltenyi Biotec  200-074-400 Used for expanding the 3D FloTrix vivaPACK Disposable Fill&Finish Consumable Kit.
Dimethyl Sulfate (DMSO)  Sigma D2650-100mL Used for preparation of cryopreservation solution.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) BasalMedia L120KJ Used for cultivation of HEK293T and Vero cells.
DURAN Original GL 45 Laboratory bottle (2 L) DWK life sciences 218016357 Used for waste collection from the 5 L bioreactor.
DURAN Original GL 45 Laboratory bottle (5 L) DWK life sciences 218017353 Used for waste collection from the 15 L bioreactor.
DURAN Original GL 45 Laboratory bottle (500 mL) DWK life sciences 218014459 Used for supplementary bottle of 0.1 M NaOH.
EZ Top Container Closures for NALGENE-containers (500mL) Saint-Gobain EZ500 ML-38-2 Brands and catalogue numbers are only for example, similar products are available from various suppliers and as long as they have the same functionality, items could be substituted with other brands.
Fetal bovine serum (FBS) superior quality Wisent 086-150 Used for cultivation of HEK293T cells.
FITC anti-human CD14 Antibody BioLegend 301804 Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
FITC anti-human CD34 Antibody BioLegend 343504 Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
FITC anti-human CD90 (Thy1) Antibody BioLegend 328108 Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
Flow cytometry Beckman Coulter CytoFLEX Used for cell identity assessment.
Fluorescence Cell Analyzer Alit life science Countstar Rigel S2 Used for cell counting. Cell viability can be calculated by staining with AO/PI dyes.
GL 45 Multiport Connector Screw Cap with 2 ports  DWK life sciences 292632806 Brands and catalogue numbers are only for example, similar products are available from various suppliers and as long as they have the same functionality, items could be substituted with other brands.
Glucose Meter Sinocare 6243578 Used for detecting glucose concentration in cell culture medium and supernatant.
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), with calcium and magnesium Gibco 14025092 Used for preparation of digest solution.
Human Albumin 20% Behring (HSA) CSL Behring N/A Used for preparation of wash buffer.
Inverted fluorescent microscope OLYMBUS CKX53SF Used for brifgt field and fluorescent observation and imaging.
Nalgene Measuring Cylinder (500 mL) Thermo Scientific 3662-0500PK Used for calibrating the liquid handling volume speed of peristaltic pumps.
Newborn calf serum (NBS) superfine MINHAI BIO SC101.02 Used for cultivation of Vero cells.
OriCell human mesenchymal stem cell adipogenic differentiation and characterization kit Cyagen HUXUC-90031 Used for tri-lineage differentiation of hUCMSCs.
OriCell human mesenchymal stem cell chondrogenic differentiation and characterization kit Cyagen HUXUC-90041 Used for tri-lineage differentiation of hUCMSCs.
OriCell human mesenchymal stem cell osteogenic differentiation and characterization kit Cyagen HUXUC-90021 Used for tri-lineage differentiation of hUCMSCs.
PE anti-human CD105 Antibody BioLegend 800504 Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
PE anti-human CD19 Antibody BioLegend 302208 Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
PE anti-human CD73 (Ecto-5'-nucleotidase) Antibody BioLegend 344004 Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
PE anti-human HLA-DR Antibody BioLegend 307605 Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
Phosphate Buffered Saline (PBS) Wisent 311-010-CL Used in autoclaving of glass vessel and V01 microcarriers, and replacement of culture medium.
Sani-Tech Platinum Cured Sanitary Silicone Tubing (0.13 in x 0.25 in) Saint-Gobain ULTRA-C-125-2F Used for solution transfering driven by peristaltic pumps.
Sterile Saline Hopebiol HBPP008-500 Used for preparation of wash buffer.
Trypzyme Recombinant Trypsin BasalMedia S342JV This reagent is used for bead-to-bead transfer of HEK293T and Vero cells.
Tube Sealer Yingqi Biotech Tube Sealer I This sealer is compatible with both C-Flex tubing and PVC tubing.
Tube Welder for PVC tubing Chu Biotech Tube Welder Micro I Used for welding of PVC tubing.
Tube Welder for TPE tubing Yingqi Biotech Tube Welder I-V2 Used for welding of TPE tubing.
ViaStain AO / PI Viability Stains Nexcelom CS2-0106-25mL Dual-Fluorescence Viability, using acridine orange (AO) and propidium iodide (PI), is the recommended method for accurate viability analysis of primary cells, such as PBMCs, and stem cells in samples containing debris.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Golchin, A., Farahany, T. Z. Biological products: Cellular therapy and FDA approved products. Stem Cell Reviews and Reports. 15 (2), 166-175 (2019).
  2. Young, C. M., Quinn, C., Trusheim, M. R. Durable cell and gene therapy potential patient and financial impact: US projections of product approvals, patients treated, and product revenues. Drug Discovery Today. 27 (1), 17-30 (2022).
  3. Elverum, K., Whitman, M. Delivering cellular and gene therapies to patients: solutions for realizing the potential of the next generation of medicine. Gene Therapy. 27 (12), 537-544 (2020).
  4. Blache, U., Popp, G., Dünkel, A., Koehl, U., Fricke, S. Potential solutions for manufacture of CAR T cells in cancer immunotherapy. Nature Communications. 13 (1), 5225 (2022).
  5. Lee, B., et al. Cell culture process scale-up challenges for commercial-scale manufacturing of allogeneic pluripotent stem cell products. Bioengineering. 9 (3), 92 (2022).
  6. Emerson, J., Glassey, J. Bioprocess monitoring and control: Challenges in cell and gene therapy. Current Opinion in Chemical Engineering. 34, 100722 (2021).
  7. Robb, K. P., Fitzgerald, J. C., Barry, F., Viswanathan, S. Mesenchymal stromal cell therapy: progress in manufacturing and assessments of potency. Cytotherapy. 21 (3), 289-306 (2019).
  8. Olsen, T. R., Ng, K. S., Lock, L. T., Ahsan, T., Rowley, J. A. Peak MSC-Are we there yet. Frontiers in Medicine. 5, 178 (2018).
  9. Roots Analysis. Stem Cell Therapy Contract Manufacturing (CMO) Market, 2019 - 2030. , Available from: https://www.rootsanalysis.com/reports/view_document/stem-cell-therapy-contract-manufacturing-market-2019-2030/271.html (2019).
  10. Elseberg, C. L., et al. Microcarrier-based expansion process for hMSCs with high vitality and undifferentiated characteristics. The International Journal of Artificial Organs. 35 (2), 93-107 (2012).
  11. de Soure, A. M., Fernandes-Platzgummer, A., Silva, da, L, C., Cabral, J. M. Scalable microcarrier-based manufacturing of mesenchymal stem/stromal cells. Journal of Biotechnology. 236, 88-109 (2016).
  12. Rafiq, Q. A., Coopman, K., Nienow, A. W., Hewitt, C. J. Systematic microcarrier screening and agitated culture conditions improves human mesenchymal stem cell yield in bioreactors. Biotechnology Journal. 11 (4), 473-486 (2016).
  13. Tavassoli, H., et al. Large-scale production of stem cells utilizing microcarriers: A biomaterials engineering perspective from academic research to commercialized products. Biomaterials. 181, 333-346 (2018).
  14. Mizukami, A., et al. Technologies for large-scale umbilical cord-derived MSC expansion: Experimental performance and cost of goods analysis. Biochemical Engineering Journal. 135, 36-48 (2018).
  15. Yan, X., et al. Dispersible and dissolvable porous microcarrier tablets enable efficient large-scale human mesenchymal stem cell expansion. Tissue Engineering. Part C, Methods. 26 (5), 263-275 (2020).
  16. Carletti, E., Motta, A., Migliaresi, C. Scaffolds for tissue engineering and 3D cell culture. 3D Cell Culture: Methods and Protocols. Haycock, J. W. , Humana Press. Totowa, NJ. 17-39 (2011).
  17. Loh, Q. L., Choong, C. Three-dimensional scaffolds for tissue engineering applications: Role of porosity and pore size. Tissue Engineering. Part B Reviews. 19 (6), 485-502 (2013).
  18. Zhang, Y., et al. GMP-grade microcarrier and automated closed industrial scale cell production platform for culture of MSCs. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 16 (10), 934-944 (2022).
  19. NMPA. Pharmaceutical Excipient Registration Database: Microcarrier tablets for cells. Center for Drug Evaluation. , Available from: https://www.cde.org.cn/main/xxgk/listpage/ba7aed094c29ae314670a3563a716e (2023).
  20. List of Drug Master Files (DMFs). US Food and Drug Administration. , Available from: https://www.fda.gov/drug-mater-files-dmfs/list-drug-master-files-dmfs (2023).
  21. Beeravolu, N., et al. Isolation and characterization of mesenchymal stromal cells from human umbilical cord and fetal placenta. Journal of Visualized Experiments. (122), e55224 (2017).
  22. Xie, Y., et al. The quality evaluation system establishment of mesenchymal stromal cells for cell-based therapy products. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 176 (2020).
  23. Maillot, C., Sion, C., De Isla, N., Toye, D., Olmos, E. Quality by design to define critical process parameters for mesenchymal stem cell expansion. Biotechnology Advances. 50, 107765 (2021).
  24. Silva Couto, P., et al. Expansion of human mesenchymal stem/stromal cells (hMSCs) in bioreactors using microcarriers: Lessons learnt and what the future holds. Biotechnology Advances. 45, 107636 (2020).
  25. Chen, S., et al. Facile bead-to-bead cell-transfer method for serial subculture and large-scale expansion of human mesenchymal stem cells in bioreactors. Stem Cells Translational Medicine. 10 (9), 1329-1342 (2021).
  26. Tsai, A. C., Pacak, C. A. Bioprocessing of human mesenchymal stem cells: From planar culture to microcarrier-based bioreactors. Bioengineering. 8 (7), 96 (2021).
  27. Hewitt, C. J., et al. Expansion of human mesenchymal stem cells on microcarriers. Biotechnology Letters. 33 (11), 2325-2335 (2011).
  28. Mawji, I., Roberts, E. L., Dang, T., Abraham, B., Kallos, M. S. Challenges and opportunities in downstream separation processes for mesenchymal stromal cells cultured in microcarrier-based stirred suspension bioreactors. Biotechnology and Bioengineering. 119 (11), 3062-3078 (2022).
  29. Schirmaier, C., et al. Scale-up of adipose tissue-derived mesenchymal stem cell production in stirred single-use bioreactors under low-serum conditions. Engineering in Life Sciences. 14 (3), 292-303 (2014).
  30. Lawson, T., et al. Process development for expansion of human mesenchymal stromal cells in a 50L single-use stirred tank bioreactor. Biochemical Engineering Journal. 120, 49-62 (2017).
  31. Yang, J., et al. Large-scale microcarrier culture of HEK293T cells and Vero cells in single-use bioreactors. AMB Express. 9 (1), 70 (2019).
  32. Fang, Z., et al. Development of scalable vaccinia virus-based vector production process using dissolvable porous microcarriers. 25th Annual Meeting of the American Society of Gene & Cell Therapy. Molecular Therapy. 30, 195-196 (2022).

Tags

ייצור תאים בקנה מידה גדול מיקרו-נשאים נקבוביים נמסים בדרגת GMP תרפיה תאית וגנטית תרבית תלת-ממדית תאים דבקים HMSCs תאי HEK293T תאי ורו מערכת תרבית מישורית דו-ממדית פלטפורמת ACISCP ביוריאקטורים של מיכלי ערבוב הרחבה קציר מערכת עיבוד תאים מערכת מילוי תאים הערכת איכות הנדסת תהליכים ביולוגיים
ייצור תאים בקנה מידה גדול המבוסס על מיקרו-נשאים נקבוביים נמסים ברמת GMP (תנאי ייצור נאותים)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, Y., Xu, H., Zhang, Y., Guo,… More

Chen, Y., Xu, H., Zhang, Y., Guo, L., Lan, M., Yang, Y., Liu, W., Yan, X., Du, Y. Large-Scale Cell Production Based on GMP-Grade Dissolvable Porous Microcarriers. J. Vis. Exp. (197), e65469, doi:10.3791/65469 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter