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Bioengineering

जीएमपी-ग्रेड विघटित छिद्रपूर्ण माइक्रोकैरियर्स पर आधारित बड़े पैमाने पर सेल उत्पादन

Published: July 7, 2023 doi: 10.3791/65469
Automatic Translation
*1, *2, *2, 2, 2, 2, 2, 2, 1
1Department of Biomedical Engineering, School of Medicine, Tsinghua University, 2Beijing CytoNiche Biotechnology Co. Ltd.
* These authors contributed equally

Summary

यहां, हम जीएमपी-ग्रेड विघटित माइक्रोकैरियर ्स पर आधारित पूरी तरह से बंद प्रणाली के माध्यम से अनुयायी कोशिकाओं के बड़े पैमाने पर निर्माण को प्राप्त करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। मानव मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं, HEK293T कोशिकाओं और वेरो कोशिकाओं की खेती को मान्य किया गया था और सेल और जीन थेरेपी उद्योग के लिए मात्रा की मांग और गुणवत्ता मानदंड दोनों को पूरा किया गया था।

Abstract

सेल और जीन थेरेपी (सीजीटी) उद्योग में शोधकर्ताओं को लंबे समय से कोशिकाओं के कुशल और बड़े पैमाने पर विस्तार में एक दुर्जेय चुनौती का सामना करना पड़ा है। दो-आयामी (2 डी) प्लानर संवर्धन प्रणाली की प्राथमिक कमियों को दूर करने के लिए, हमने मानव मेसेनकाइमल स्टेम / स्ट्रोमल कोशिकाओं (एचएमएससी), HEK293T कोशिकाओं और वेरो कोशिकाओं सहित अनुयायी कोशिकाओं की 3 डी संस्कृति के लिए जीएमपी-ग्रेड, विघटित और छिद्रपूर्ण माइक्रोकैरियर पर आधारित एक स्वचालित बंद औद्योगिक पैमाने सेल उत्पादन (एसीआईएससीपी) मंच विकसित किया है। बड़े पैमाने पर विस्तार प्राप्त करने के लिए, 5 एल और 15 एल हलचल-टैंक बायोरिएक्टर के साथ दो-चरण विस्तार आयोजित किया गया था ताकि 9 दिनों के भीतर कुल 128 गुना विस्तार के साथ 1.1 x 1010 एचएमएससी का उत्पादन किया जा सके। कोशिकाओं को माइक्रोकैरियर्स को पूरी तरह से भंग करके काटा गया था, एक निरंतर-प्रवाह सेंट्रीफ्यूज-आधारित सेल प्रोसेसिंग सिस्टम के साथ केंद्रित, धोया और तैयार किया गया था, और फिर सेल भरने की प्रणाली के साथ एलिकोट किया गया था। 2 डी प्लानर संस्कृति की तुलना में, 3 डी संस्कृति से काटे गए एचएमएससी की गुणवत्ता में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं है। हमने सीजीटी क्षेत्र में अन्य लोकप्रिय सेल प्रकारों के लिए इन घुलने योग्य छिद्रपूर्ण माइक्रोकैरियर्स को भी लागू किया है; विशेष रूप से, HEK293T कोशिकाओं और वेरो कोशिकाओं को क्रमशः 1.68 x 10 7 कोशिकाओं / एमएल और 1.08 x 107 कोशिकाओं / एमएल के चरम सेल घनत्व के लिए खेती की गई है। यह अध्ययन एक बायोप्रोसेस इंजीनियरिंग प्लेटफॉर्म का उपयोग करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करता है जो जीएमपी-ग्रेड घुलने योग्य माइक्रोकैरियर ्स और उन्नत बंद उपकरणों की विशेषताओं का उपयोग करता है ताकि अनुयायी कोशिकाओं के औद्योगिक पैमाने पर निर्माण को प्राप्त किया जा सके।

Introduction

सीजीटी उद्योग ने पिछले दो दशकों में तेजी से विस्तार देखा है। अगली पीढ़ी की दवाओं का विकास कई दुर्दम्यरोगों के इलाज और इलाज के लिए प्रत्याशित है। 2017 में सीजीटी उत्पाद, किम्रिया के पहले खाद्य और औषधि प्रशासन (एफडीए) अनुमोदन के बाद से, दुनिया में सीजीटी से संबंधित अनुसंधान और विकास तेजी से बढ़ रहा है, एफडीए ने सीजीटी के लिए सक्रिय जांच नई दवा अनुप्रयोगों को 2018 में 500 तक बढ़ा दियाहै। यह भविष्यवाणी की गई थी कि 2030 तक संयुक्त राज्य अमेरिका में सीजीटी उत्पादों के अनुमोदन की संख्या 54-74होगी।

जबकि सीजीटी अनुसंधान और नवाचार में तेजी से वृद्धि रोमांचक है, फिर भी प्रयोगशाला अनुसंधान और औद्योगिक पैमाने पर विनिर्माण के बीच एक बड़ा तकनीकी अंतर है जो इन आशाजनक दवाओं को सस्ती लागत पर आवश्यकतानुसार अधिक से अधिक रोगियों तक पहुंचा सकता है। इन नैदानिक परीक्षणों के लिए अपनाई गई वर्तमान प्रक्रियाओं को छोटे पैमाने पर प्रयोगों के लिए प्रयोगशालाओं में स्थापित किया गया था, और सीजीटी विनिर्माण3 पर सुधार और नवाचार के लिए महत्वपूर्ण प्रयासों की आवश्यकता है। सीजीटी उत्पादों के कई प्रकार हैं, उनमें से अधिकांश जीवित कोशिकाओं पर आधारित हैं, जो एलोजेनिक, ऑटोलॉगस, इंजीनियर या प्राकृतिक हो सकते हैं। ये जीवित दवाएं छोटे आणविक संस्थाओं या जीवविज्ञान की तुलना में बहुत अधिक जटिल हैं, इसलिए बड़े पैमाने पर विनिर्माण को एक महत्वपूर्ण चुनौतीबनाते हैं 4,5,6. इस काम में, हम तीन एंकरेज-निर्भर कोशिकाओं के लिए एक बड़े पैमाने पर सेल उत्पादन प्रोटोकॉल का प्रदर्शन करते हैं जो सीजीटी में व्यापक रूप से लागू होते हैं। स्ट्रोमल कोशिकाएं (एचएमएससी) शामिल हैं, जिनका उपयोग सेल-आधारित चिकित्सा के लिए किया गया है, और HEK293T कोशिकाएं और वेरो कोशिकाएं, जिनमें से दोनों का उपयोग अंतिम चिकित्सीय सेल उत्पाद की आनुवंशिक इंजीनियरिंग के लिए वायरस का उत्पादन करने के लिए किया जाता है। एंकोरेज-निर्भर कोशिकाओं को आमतौर पर प्लानर सिस्टम पर सुसंस्कृत किया जाता है, जिन्हें मैन्युअल प्रसंस्करण की आवश्यकता होती है। हालांकि, मैनुअल संस्कृति विधियों को श्रम की एक महत्वपूर्ण मात्रा की आवश्यकता होती है और संदूषण का खतरा होता है, जो अंतिम उत्पाद की गुणवत्ता से समझौता कर सकता है। इसके अलावा, कोई इन-लाइन प्रक्रिया नियंत्रण नहीं है, जिससे बैच7 के बीच गुणवत्ता में पर्याप्त परिवर्तनशीलता होती है। एक उदाहरण के रूप में स्टेम सेल थेरेपी लेते हुए, 200 से अधिक स्टेम-सेल थेरेपी उम्मीदवारों की एक आशाजनक पाइपलाइन के साथ, यह अनुमान लगाया गया है किनैदानिक अनुप्रयोगों की मांगों को पूरा करने के लिए प्रति वर्ष 300 ट्रिलियन एचएमएससी की आवश्यकता होगी। इसलिए, चिकित्सीय कोशिकाओं का बड़े पैमाने पर निर्माण इस तरह की उच्च सेल मांग के साथ इन चिकित्सीय हस्तक्षेपों को करने के लिए एक शर्त बन गयाहै।

प्लानर प्रणालियों के असफलताओं को दूर करने के लिए, पारंपरिक गैर-विघटित माइक्रोकैरियर10,11,12,13 के साथ हलचल-टैंक बायोरिएक्टरों में बड़े पैमाने पर विनिर्माण प्रक्रियाओं को विकसित करने के प्रयास किए गए हैं, लेकिन ये जटिल तैयारी प्रक्रियाओं और कम सेल-कटाईदक्षता से ग्रस्त हैं।. हाल ही में, हमने स्टेम सेल विस्तार के लिए एक विघटित माइक्रोकैरियर का नवाचार किया है, जिसका उद्देश्य पारंपरिक गैर-विघटित वाणिज्यिक माइक्रोकैरियर15 से सेल कटाई की चुनौतियों को दरकिनार करना है। यह उपन्यास, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध जीएमपी-ग्रेड 3 डी घुलने योग्य छिद्रपूर्ण माइक्रोकैरियर, 3 डी टेबलट्रिक्स ने बड़े पैमाने पर सेल उत्पादन के लिए बड़ी क्षमता दिखाई है। दरअसल, इन छिद्रपूर्ण माइक्रोकैरियर्स पर आधारित 3 डी संस्कृति संभावित रूप से सेल आसंजन, प्रसार, प्रवासन और सक्रियण को बढ़ावा देने के लिए अनुकूल बायोमिमेटिक माइक्रोएन्वायरमेंटको फिर से बना सकती है। माइक्रोकैरियर्स की छिद्रपूर्ण संरचनाएं और परस्पर छिद्र नेटवर्क एक बड़ा सेल आसंजन क्षेत्र बना सकते हैं और ऑक्सीजन, पोषक तत्वों और मेटाबोलाइट्स के आदान-प्रदान को बढ़ावा दे सकते हैं, इस प्रकार इन विट्रो सेल विस्तारके लिए एक इष्टतम सब्सट्रेट बना सकते हैं। इन जीएमपी-ग्रेड 3 डी घुलने योग्य छिद्रपूर्ण माइक्रोकैरियर्स की उच्च छिद्रता एचएमएससी के बड़े पैमाने पर विस्तार को सक्षम बनाती है, और कोशिकाओं को पूरी तरह से भंग करने की क्षमता इनविस्तारित कोशिकाओं की कुशल कटाई की अनुमति देती है। यह एक जीएमपी-ग्रेड उत्पाद भी है और इसे चाइनीज सेंटर फॉर ड्रग इवैल्यूएशन (फाइलिंग नंबर: F20210000003 और F20200000496) 19 और संयुक्त राज्य अमेरिका के एफडीए (एफडीए, यूएसए) के साथ एक फार्मास्युटिकल एक्सिपिएंट के रूप में पंजीकृत किया गया है। ड्रग मास्टर फ़ाइल नंबर: 35481)20.

यहां, हम एचएमएससी, HEK293T सेल और वेरो सेल विस्तार के लिए इन फैलाने योग्य और विघटित छिद्रपूर्ण माइक्रोकैरियर्स का उपयोग करके एक स्वचालित बंद औद्योगिक पैमाने सेल उत्पादन (एसीआईएससीपी) सिस्टम18 का वर्णन करते हैं। हमने 5 एल बायोरिएक्टर से 15 एल बायोरिएक्टर तक एचएमएससी (9 दिनों में 128 संचयी गुना विस्तार) का सफल दो-स्तरीय विस्तार हासिल किया और अंत में उत्पादन के एक बैच से 1.1 x 1010 एचएमएससी तक प्राप्त किया। कोशिकाओं को माइक्रोकैरियर्स को पूरी तरह से भंग करके काटा गया था, एक निरंतर प्रवाह सेंट्रीफ्यूज-आधारित सेल प्रोसेसिंग सिस्टम के साथ केंद्रित, धोया और तैयार किया गया था, और फिर सेल भरने की प्रणाली के साथ अलीकोट किया गया था। इसके अलावा, हमने अनुपालन की पुष्टि करने के लिए एचएमएससी उत्पादों की गुणवत्ता का आकलन किया। हमने दो अन्य प्रकार की एंकरेज कोशिकाओं, HEK293T कोशिकाओं और वेरो कोशिकाओं के स्केल-अप उत्पादन के लिए इन विघटित माइक्रोकैरियर्स के आवेदन का भी प्रदर्शन किया, जो सीजीटी उद्योग में बड़े पैमाने पर लागू होते हैं। HEK293T कोशिकाओं का पीक सेल घनत्व 1.68 x 10 7 सेल / एमएल तक पहुंच गया, जबकि वेरो कोशिकाओं का चरम घनत्व 1.08 x 107 सेल / एमएल तक पहुंच गया। एसीआईएससीपी प्रणाली को विभिन्न प्रकार के अनुयायी कोशिकाओं को कल्चर करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, और यह संभावित रूप से सीजीटी के औद्योगिकीकरण में तेजी लाने में योगदान देने वाला एक शक्तिशाली मंच बन सकता है।

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Protocol

मानव गर्भनाल बीजिंग सिंघुआ चांगगेंग अस्पताल से प्राप्त किया गया था। मानव गर्भनाल मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं (यूसीएमएससी) के अधिग्रहण, अलगाव और संस्कृति के बारे में सभी प्रक्रियाओं और प्रोटोकॉल को सूचित सहमति के साथ और बीजिंग सिंघुआ चांगगेंग अस्पताल की आचार समिति (फाइलिंग नंबर 22035-4-02) के अनुमोदन के साथ आयोजित किया गया था, और प्रक्रियाओं और प्रोटोकॉल ने 1964 हेलसिंकी घोषणा और इसके बाद के संशोधनों या तुलनीय नैतिक मानकों का अनुपालन किया था।

1. एचएमएससी, HEK293T कोशिकाओं और वेरो कोशिकाओं की मोनोलेयर संस्कृति

  1. रिपोर्ट की गई विधि21 के अनुसार व्हार्टन की जेली से प्राथमिक मानव यूसीएमएससी को अलग करें। प्राथमिक यूसीएमएससी के अलगाव और वृद्धि के लिए सीरम-मुक्त (एसएफ) एचएमएससी संस्कृति माध्यम का उपयोग करें, मार्ग 2 पर कोशिकाओं की कटाई करें, और एक मास्टर सेल बैंक (एमसीबी) के रूप में क्रायोप्रिजर्व करें।
  2. एक टी 75 फ्लास्क में 6 x 105 मानव यूसीएमएससी (अधिमानतः मार्ग 2 या मार्ग 3 कोशिकाएं) को टीका लगाएं (यानी, 2 डी प्लानर वाहिकाओं पर सीडिंग घनत्व 8,000 कोशिकाओं / सेमी2 है) मोनोलेयर कल्चर के लिए 15 एमएल पूर्ण एसएफ एचएमएससी संस्कृति माध्यम के साथ। फ्लास्क के चित्र-आठ आंदोलन के माध्यम से एक समान सीडिंग सुनिश्चित करें। 5% सीओ2 सेल कल्चर इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 80% -90% कंफ्लुएंसी तक कल्चर करें।
  3. फसल काटने के लिए, सेल कल्चर माध्यम को हटा दें, और कोशिकाओं को 3-5 मिलीलीटर फॉस्फेट बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) के साथ दो बार कुल्ला करें। फिर, 0.25% ट्रिप्सिन-ईडीटीए के 2 एमएल जोड़ें, और 1-2 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें जब तक कि अधिकांश कोशिकाएं गोल न हो जाएं और फ्लास्क से अलग न हो जाएं, जैसा कि 4x उद्देश्य के साथ एक उज्ज्वल-क्षेत्र उल्टे माइक्रोस्कोप के तहत देखा गया है। पाचन को समाप्त करने के लिए एसएफ एचएमएससी संस्कृति माध्यम के 3 मिलीलीटर जोड़ें।
  4. सेल निलंबन को 15 एमएल शंक्वाकार सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें, और 5 मिनट के लिए 179 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरने वाले को अलग करें, सेल गोली को पीबीएस के साथ दो बार धोएं, और बायोरिएक्टर में माइक्रोकैरियर्स को सीडिंग के लिए एसएफ एचएमएससी कल्चर माध्यम के लगभग 3-5 मिलीलीटर में फिर से निलंबित करें।
    नोट: सेल व्यवहार्यता की जांच करें, और सुनिश्चित करें कि कोशिकाएं >90% व्यवहार्य हैं। बायोरिएक्टर के लिए सभी तैयारी कार्य पूरा होने के बाद ही कोशिकाओं को तैयार करें (चरण 2.1-3.6)।
  5. HEK293T कोशिकाओं और वेरो कोशिकाओं की मोनोलेयर संस्कृति के लिए, प्रत्येक टी 75 फ्लास्क में 2 x 10 6-3 x 106 कोशिकाओं को टीका लगाएं, और डीएमईएम के साथ कल्चर करें जिसमें क्रमशः 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और 10% नवजात बछड़ा सीरम (एनबीएस) शामिल हैं।
  6. कोशिकाओं की कटाई के लिए चरण 1.3-1.4 का पालन करें। 10% एफबीएस युक्त डीएमईएम के 3-5 एमएल में पुन: निलंबित करें।

2. सेल सीडिंग से पहले हलचल टैंक बायोरिएक्टर की तैयारी

  1. दिन -1 पर, कांच के बर्तन को एक बार विआयनीकृत (डीआई) पानी से अच्छी तरह से धो लें।
  2. हेडप्लेट से सभी स्टेनलेस ट्यूबों और इंपेलर्स को अलग करें, उन्हें डीआई पानी में डुबोएं, और 1 घंटे के लिए 40 kHz और 60 °C पर एक अल्ट्रासोनिक क्लीनर के साथ सोनिकेट करें ताकि अच्छी तरह से साफ किया जा सके।
    नोट: 5 एल बायोरिएक्टर में पहले स्तर के विस्तार और 15 एल बायोरिएक्टर में दूसरे स्तर के विस्तार के लिए तैयारी और प्रक्रियाएं समान होंगी। 15 एल बायोरिएक्टर के लिए पैरामीटर पूरे कोष्ठक में दिए गए हैं। यदि कोष्ठक में कोई पैरामीटर नहीं दिया जाता है, तो ये पैरामीटर 5 एल और 15 एल बायोरिएक्टर के लिए समान हैं।
  3. ध्यान से जांचें कि सभी ओ-रिंग बरकरार और जगह में हैं, और फिर निर्माता के निर्देशों के अनुसार अलग-अलग हिस्सों को हेडप्लेट पर वापस स्थापित करें।
    नोट: यदि आवश्यक हो तो असेंबली से पहले किसी भी घिसे हुए या फटे ओ-रिंग को बदलें। पहने हुए ओ-रिंग्स एयरटाइटनेस से समझौता करेंगे और इसलिए, पोत की बाँझपन।
  4. 0.5 एम एनओएच समाधान के 7 एल (15 एल बायोरिएक्टर के लिए 18 एल) को 5 एल पोत में जोड़ें, और ट्यूबों को एनएओएच समाधान में डुबोने के लिए पोत के रिम पर इकट्ठे ट्यूबों के साथ हेडप्लेट रखें। ट्यूबों और कांच के बर्तन से एंडोटॉक्सिन को हटाने के लिए इसे 12 घंटे या रात भर खड़े रहने दें।
    नोट: 7 एल (18 एल) से अधिक न करें क्योंकि यह 5 एल (15 एल) ग्लास पोत की अधिकतम मात्रा है। एनएओएच समाधान को संभालते समय उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनें, क्योंकि यह संक्षारक है।
  5. हेडप्लेट को हटा दें और एनएओएच समाधान को एक उचित अपशिष्ट बोतल में बदल दें। प्रयोगशाला सुरक्षा नियमों के अनुसार छोड़ दें। अवशिष्ट क्षारीय को हटाने के लिए इंजेक्शन के लिए पोत, हेडप्लेट और उसके हिस्सों को एंडोटॉक्सिन-मुक्त डीआई पानी या पानी से अच्छी तरह से धोएं।
  6. पोत में पीबीएस के 2 एल (5 एल) जोड़ें, सभी भागों को फिर से इकट्ठा करें, और निर्माता के निर्देशों के अनुसार हेडप्लेट को पोत के धातु फ्रेम में बोल्ट करें।
  7. निर्माता के निर्देशों के अनुसार हेडप्लेट पर उपयुक्त स्टेनलेस स्टील (एसएस) भागों / ट्यूबों / बंदरगाहों के लिए एक बंद सिस्टम उपभोग्य पैक फिट करें। ट्यूबों पर सभी रॉबर्ट क्लैंप को दबाएं, और हेमोस्टैट्स के साथ क्लैंप करके मजबूत करने की सिफारिश की जाती है। ट्यूबों में से एक को छोड़ दें, अंत में 0.22 μm एयर वेंट फ़िल्टर के साथ जो कंडेनसर से जुड़ा हुआ है, अनलैम्प्ड है।
    नोट: सिलिकॉन ट्यूबों को छेदने से रोकने के लिए हेमोस्टैट्स पर युक्तियों पर सिलिकॉन ट्यूबों को फिसलें। केवल सिलिकॉन ट्यूबों पर क्लैंप करें, और इस किट में शामिल सी-फ्लेक्स ट्यूबों को दबाने से बचें। कंडेनसर पर एक ट्यूब छोड़ने से ऑटोक्लेविंग के दौरान दबाव से राहत मिलेगी।
  8. एक ऑटोक्लेवेबल 500 एमएल जीएल 45 ग्लास बोतल में 0.1 एम एनएओएच समाधान के 250 एमएल तैयार करें, और दो पोर्ट के साथ जीएल 45 मल्टीपोर्ट कनेक्टर स्क्रू कैप के साथ फिट हों। टोपी के निचले हिस्से में बंदरगाहों में से एक पर 180 मिमी लंबा, 0.13 इंच x 0.25 इंच (आंतरिक व्यास x बाहरी व्यास) सिलिकॉन ट्यूब कनेक्ट करें; बोतल के निचले हिस्से को छूने के लिए लंबाई काफी लंबी होनी चाहिए।
  9. सिलिकॉन ट्यूब के एक और टुकड़े को कनेक्ट करें, जिसकी लंबाई पिछले एक की तुलना में 500 मिमी लंबी है, टोपी के ऊपरी तरफ उसी पोर्ट से, और दूसरे छोर को 5 एल पोत हेडप्लेट पर ड्रिप फीड पोर्ट से कनेक्ट करें। स्क्रू कैप पर दूसरे पोर्ट के लिए 0.22 μm एयर वेंट फ़िल्टर कनेक्ट करें।
  10. निर्माता के निर्देशों के अनुसार पीएच जांच पर दो-बिंदु अंशांकन करें। फिर, पीएच, घुलित ऑक्सीजन (डीओ), और लाइव सेल काउंट जांच को उपयुक्त पीजी 13,5 पोर्ट में पोत में डालें, और हेडप्लेट पर कसकर पेंच करें।
  11. निर्माता के निर्देशों के अनुसार पूरी तरह से इकट्ठे पोत की एयरटाइटनेस जांच करें। कम से कम 30 मिनट के लिए 0.4 बार ± 0.01 बार का दबाव बनाए रखें। सिस्टम के परीक्षण पास करने के बाद धीरे-धीरे दबाव छोड़ें। यदि एयरटाइटनेस परीक्षण विफल हो जाता है, तो रिसाव बिंदुओं की सावधानीपूर्वक खोज करें, और पोत असेंबली को सुदृढ़ करें।
  12. 60 मिनट के लिए 15 पीएसआई और 121 डिग्री सेल्सियस पर उपभोग्य किट के साथ पूरी तरह से इकट्ठे पोत को आटोक्लेव करें। ऑटोक्लेविंग के बाद, यह सुनिश्चित करने के लिए सभी एयर वेंट फिल्टर की जांच करें कि वे बरकरार और सूखे हैं। सभी हेमोस्टेट्स को हटा दें।
    नोट: एक गीला एयर वेंट फिल्टर गैस को कुशलता से फ़िल्टर नहीं करेगा और सेल कल्चर के दौरान पोत की बाँझपन से समझौता कर सकता है। यदि वे गीले हैं तो एयर वेंट फिल्टर बदलें, और पूरे पोत को फिर से आटोक्लेव करें।
  13. आटोक्लेव वाले बर्तन को एक क्लीनरूम में स्थानांतरित करें, और कमरे के तापमान पर इसे पूरी तरह से ठंडा होने की प्रतीक्षा करें। थर्मोवेल ट्यूब में तापमान जांच डालें, और मोटर, पीएच जांच और डीओ जांच के लिए केबलों को नियंत्रक से पोत पर संबंधित भागों में कनेक्ट करें। हीट मैट को बर्तन के चारों ओर कसकर लपेटें।
  14. निकास गैस कंडेनसर, रिंग स्पर्जर, एनएओएच के लिए ड्रिप फीड पोर्ट और एयर ओवरले पोर्ट पर लचीली ट्यूबों पर रॉबर्ट क्लैंप को अनलैंप करें। नियंत्रक चालू करें, लॉग इन करें, और निर्माता के निर्देशों के अनुसार सिस्टम में तालिका 1 में सूचीबद्ध पैरामीटर दर्ज करें। संस्कृति प्रक्रिया के दौरान इन ट्यूबों को किसी भी समय दबाया नहीं जाना चाहिए।
  15. स्टार्ट पर क्लिक करें, और बायोरिएक्टर शुरू करने के लिए प्रयोग को नाम दें। बायोरिएक्टर को कम से कम 12 घंटे या रात भर के लिए इन सेटिंग्स पर चलने की अनुमति दें, ताकि पीबीएस को ऑक्सीजन के साथ संतृप्त किया जा सके ताकि बाद में डीओ जांच के लिए एक-बिंदु अंशांकन किया जा सके।
  16. बायोरिएक्टर नियंत्रक पर पंप 1 और पंप 2 की तरल हैंडलिंग वॉल्यूम गति को कैलिब्रेट करें। प्रत्येक पंप पर सिलिकॉन ट्यूब में 0.13 इंच x 0.25 को अलग से स्थापित करें, जिसमें एक छोर पानी की बोतल में डुबोया जाए और ट्यूब के दूसरे छोर को मापने वाले सिलेंडर में डाला जाए।
  17. पंप रोटेशन गति को 300 आरपीएम पर सेट करें, और 1 मिनट के लिए समय। दोनों पंपों के लिए मापने वाले सिलेंडर में दिए गए पानी की मात्रा पर ध्यान दें। इन नंबरों की आवश्यकता अगले चरणों के लिए होगी।
  18. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एसएफ एचएमएससी संस्कृति माध्यम के 500 एमएल तैयार करें, और सेल कल्चर मध्यम बोतल की कैप को डिस्पोजेबल सी-फ्लेक्स ईजेड टॉप कंटेनर क्लोजर और संगत कैप के साथ बदलें। एक जैव सुरक्षा कैबिनेट (बीएससी) के अंदर कैप प्रतिस्थापन करें।
  19. एमएससी के लिए पूर्व-निष्फल डब्ल्यू 01 माइक्रोकैरियर ्स की 10 ग्राम की बोतल पर मध्यम की बोतल पर आउटलेट ट्यूब को इनलेट सी-फ्लेक्स ट्यूब पर वेल्ड करें। बायोरिएक्टर नियंत्रक के पंप 1 पर ट्यूब का एक खंड स्थापित करें, पंप रोटेशन को 300 आरपीएम पर सेट करें, और बोतल से माइक्रोकैरियर्स की बोतल में सभी संस्कृति माध्यम में पंप करें। दिन 0 पर उपयोग तक इन माइक्रोकैरियर ्स को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: माइक्रोकैरियर दिन -1 पर तैयार किया जाना चाहिए। 15 एल बायोरिएक्टर संस्कृति के लिए, कुल मिलाकर चार बोतलें (यानी, 40 ग्राम, एसएफ माध्यम के 4 x 500 एमएल के साथ) तैयार करें।

3. 5 एल हलचल-टैंक बायोरिएक्टर में सेल सीडिंग, कल्चर और फसल।

  1. दिन 0 पर, निर्माता के निर्देशों के अनुसार बायोरिएक्टर नियंत्रक पर डीओ जांच के लिए एक-बिंदु अंशांकन, विशेष रूप से 100% करें। हलचल टैंक बायोरिएक्टर अब सेल कल्चर के लिए तैयार है।
  2. अपशिष्ट संग्रह के लिए एक 2 एल (5 एल) कांच की बोतल तैयार करें, इसे दो पोर्ट के साथ जीएल 45 मल्टीपोर्ट कनेक्टर स्क्रू कैप के साथ फिट करें, जिसमें 30 मिमी, दोनों बंदरगाहों से जुड़े सी-फ्लेक्स ट्यूबों में 0.25 x 0.44 और बाँझ करने के लिए आटोक्लेव हो। सी-फ्लेक्स ट्यूब को एक ट्यूब वेल्डर के साथ बायोरिएक्टर पोत की हेडप्लेट पर अपशिष्ट बोतल से फसल ट्यूब तक एक बंदरगाह से वेल्ड करें।
  3. अस्थायी रूप से बायोरिएक्टर नियंत्रक पर तापमान, पीएच और डीओ नियंत्रण को रोकें, फसल ट्यूब से जुड़ी सिलिकॉन ट्यूब को सही तरल प्रवाह दिशा में पेरिस्टालिक पंप 2 पर स्थापित करें, और पोत से सभी पीबीएस को पूरी तरह से अपशिष्ट बोतल में वितरित करें। पंप से ट्यूब को हटा दें, और अपशिष्ट बोतल को सील और डिस्कनेक्ट करें।
    नोट: हमेशा प्रत्येक चरण में तरल प्रवाह में शामिल लचीली ट्यूबों पर किसी भी रॉबर्ट क्लैंप को अनलैम्प करें। सील करने और डिस्कनेक्ट करने से पहले तरल हस्तांतरण पूरा होने के बाद क्लैंप बैक करें। हेडप्लेट की तरफ झुकें। जब तक अन्यथा नहीं कहा गया हो, तब तक बाद के सभी चरणों के लिए अनलैम्पिंग और क्लैंपिंग का प्रदर्शन किया जाना चाहिए।
  4. पूर्ण एसएफ एचएमएससी माध्यम के 7 एल (30 एल) तैयार करें, और प्रत्येक मूल बोतल कैप को डिस्पोजेबल सी-फ्लेक्स ईजेड टॉप कंटेनर क्लोजर और संगत कैप के साथ बदलें। 10 एल (50 एल) एकल-उपयोग भंडारण बैग पर बंदरगाहों में से एक के लिए एक एकल-उपयोग निस्पंदन मॉड्यूल वेल्ड करें। बीएससी के अंदर टोपी को बदलने का ऑपरेशन करें।
  5. सेल कल्चर माध्यम की बोतलों को कैप्सूल फिल्टर के दूसरे छोर पर वेल्डिंग करके और बायोरिएक्टर नियंत्रक पर पंप का उपयोग करके कल्चर माध्यम को स्टोरेज बैग में फ़िल्टर और स्थानांतरित करें। फ़ीड बैग के रूप में नामित करें।
  6. हेडप्लेट की फीड ट्यूब पर फीड बैग से सी-फ्लेक्स ट्यूब तक एक आउटलेट पोर्ट वेल्ड करें, और बायोरिएक्टर नियंत्रक पर 1 पंप करने के लिए ट्यूब स्थापित करें। फीड बैग से ब्लीड ट्यूब तक दूसरे आउटलेट पोर्ट को वेल्ड करें, और तरल प्रवाह की सही दिशा में बायोरिएक्टर नियंत्रक पर 2 पंप करने के लिए ट्यूब स्थापित करें।
    नोट: सी-फ्लेक्स ट्यूबों की तुलना में टूट-फूट के बेहतर प्रतिरोध के लिए पंप पर द्रव प्रवाह लाइन पर अनुभाग स्थापित करें, जो सिलिकॉन टयूबिंग से बना है। सुनिश्चित करें कि ट्यूब सही दिशा में स्थापित हैं।
  7. पंप 1 की गति को 300 आरपीएम पर सेट करें, और चरण 2.17 में उल्लिखित मात्रा वितरण गति के आधार पर फ़ीड बैग से बर्तन में 1 एल (5 एल) माध्यम निकालने के बाद पंप को रोक दें। चरण 2.14 में वर्णित समान सेटिंग्स के साथ तापमान, पीएच, और डीओ नियंत्रण फिर से प्रारंभ करें।
  8. फीड बैग को हेडप्लेट पर फीड ट्यूब से जोड़ने वाली ट्यूब को सील और डिस्कनेक्ट करें। चरण 2.18 में तैयार किए गए बिखरे हुए माइक्रोकैरियर्स की बोतल से सी-फ्लेक्स ट्यूब को फ़ीड ट्यूब में वेल्ड करें, और बोतल से सभी सामग्री को बर्तन में पंप करें। माइक्रोकैरियर सस्पेंशन की खाली बोतल को सील और डिस्कनेक्ट करें। 75% इथेनॉल के साथ बोतल की पूरी सतह को कीटाणुरहित करें, और सेल निलंबन हस्तांतरण बोतल के रूप में उपयोग करने के लिए बीएससी में रखें।
    नोट: डिस्पोजेबल सामान को सील और डिस्कनेक्ट करते समय हेडप्लेट साइड पर सी-फ्लेक्स ट्यूब का एक लंबा टुकड़ा छोड़ दें, क्योंकि निम्नलिखित चरणों में एक ही ट्यूब पर कई वेल्डिंग और डिस्कनेक्ट चरण किए जाएंगे।
  9. सुनिश्चित करें कि नियंत्रक पर दिखाया गया तापमान 37 डिग्री सेल्सियस की स्थिर स्थिति तक पहुंचता है, जिसमें आमतौर पर लगभग 30 मिनट लगते हैं, चरण 1.3-1.4 के रूप में बीज कोशिकाओं को तैयार करने के लिए आगे बढ़ने से पहले। एसएफ माध्यम के 500 एमएल में 2.5 x 108 एचएमएससी को पुन: निलंबित करें, और पहले माइक्रोकैरियर निलंबन वाली खाली बोतल में स्थानांतरित करें।
    नोट: 15 एल बायोरिएक्टर विस्तार के लिए बीज कोशिकाओं को चरण 3.21 के अनुसार तैयार किया जाना चाहिए, जिसका उद्देश्य 500 एमएल में 1.0 x 109 कोशिकाओं को शामिल करना है।
  10. सेल सस्पेंशन युक्त बोतल से सी-फ्लेक्स ट्यूब को अब हेडप्लेट पर फीड पोर्ट पर वेल्ड करें, और बोतल से सभी सामग्री को पोत में पंप करें ताकि माइक्रोकैरियर्स को सेल टीकाकरण शुरू किया जा सके। खाली बोतल को सील और डिस्कनेक्ट करें। फीड पोर्ट को फीड बैग से हेडप्लेट पर फीड ट्यूब में फिर से वेल्ड करें।
  11. निम्नलिखित पैरामीटर सेट करके एचएमएससी की बढ़ी हुई टीकाकरण दक्षता के लिए आंतरायिक आंदोलन की अनुमति देने के लिए नियंत्रक पर आंदोलन सेटिंग्स को समायोजित करें: वी 1 = 35 (30) आरपीएम / V2 = 0 rpm/25 मिनट; चक्रों की संख्या = 12 (24); अंतिम आंदोलन गति = 35 (30) आरपीएम
    नोट: आंदोलन की गति को 40 (35) आरपीएम या 45 (40) आरपीएम तक समायोजित किया जा सकता है यदि कल्चर प्रक्रिया के दौरान माइक्रोकैरियर्स का गैर-समान वितरण या अवसादन देखा जाता है।
  12. मीडियम एक्सचेंज इंटरफ़ेस में बायोरिएक्टर नियंत्रक पर एक स्वचालित माध्यम पूरक और विनिमय व्यवस्था सेट करें। एचएमएससी खेती के लिए पैरामीटर सेट करें जैसा कि तालिका 2 में बताया गया है।
    नोट: इस स्तर पर तरल प्रवाह में शामिल लचीली ट्यूबों पर किसी भी रॉबर्ट क्लैंप को अनलैंप करें, खासकर फ़ीड और ब्लीड ट्यूब के लिए। पूरी संस्कृति प्रक्रिया के माध्यम से इन्हें बिना लैंप के रखें।
  13. वांछित समय बिंदुओं पर लुयर कनेक्टर के माध्यम से डिस्पोजेबल सैंपलिंग बैग को जोड़कर नमूना ट्यूब के माध्यम से नमूने लें, आमतौर पर हर दिन एक बार, और हर बार नमूना बैग में 10 एमएल का उपयोग करें। पहले नमूना बैग में 2-3 एमएल नमूने को शामिल करें, छोड़ दें, और फिर हर बार एक नए नमूना बैग में वास्तविक 10 एमएल नमूने को एलिकोट करें।
    नोट: प्रारंभिक 2-3 एमएल नमूना पिछले नमूना समय बिंदु से ट्यूब में तरल छोड़ा जा सकता है और पोत में स्थिति का सटीक प्रतिनिधित्व नहीं कर सकता है। हमेशा 75% इथेनॉल के साथ कनेक्शन बनाने या तोड़ने से पहले और बाद में ल्यूर कनेक्टर को साफ करके अतिरिक्त सड़न रोकनेवाला उपायों के साथ इन चरणों का पालन करें।
  14. लिए गए नमूनों को 15 एमएल शंक्वाकार सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। नमूने पर निम्न परीक्षण करें।
    1. सेल-लदी माइक्रोकैरियर सस्पेंशन का 200 μL लें, और निर्माता के निर्देशों के अनुसार कैल्सीन-एएम / पीआई सेल डबल स्टेनिंग के साथ दाग लगाएं। एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत निरीक्षण करें।
    2. गुरुत्वाकर्षण द्वारा माइक्रोकैरियर को तलछट करें, जिसमें आमतौर पर 5-10 मिनट लगते हैं। सतह पर तैरनेवाला को एस्पिरेट करें, और निर्माता के निर्देशों के अनुसार ग्लूकोज मीटर के साथ ग्लूकोज एकाग्रता का परीक्षण करें। एक ग्लूकोज स्तर ग्राफ ़ को प्लॉट करें।
    3. माइक्रोकैरियर्स को पूरी तरह से भंग करने के लिए 20-30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिलीग्राम / एमएल डाइजेस्ट घोल के ताजा तैयार 3-5 एमएल के साथ तलछट वाले सेल से लदे माइक्रोकैरियर्स को इनक्यूबेट करें। एक स्वचालित प्रतिदीप्ति सेल विश्लेषक के साथ एओ / पीआई के साथ धुंधला होने के बाद कोशिकाओं की गणना करें। एक कोशिका वृद्धि वक्र की योजना बनाएं। नियंत्रक पर उत्पन्न वास्तविक समय लाइव सेल विकास वक्र के साथ सहसंबंधित।
  15. कल्चर के दिन 4 या दिन 5 पर, 30 मिलीग्राम / एमएल पर 50 एमएल (200 एमएल) डाइजेस्ट घोल तैयार करें। डाइजेस्ट समाधान और घुलने योग्य माइक्रोकैरियर के बीच कार्य द्रव्यमान अनुपात 3: 20 से 5: 20 तक होता है। 0.22 μm कैप्सूल फ़िल्टर के साथ बाँझ-फ़िल्टर, और कैल्शियम और मैग्नीशियम के साथ हैंक के संतुलित नमक समाधान (HBSS) के 500 mL (2 L) में और पतला करें। 3 एल डिस्पोजेबल स्टोरेज बैग में स्थानांतरित करें।
    नोट: सेल कटाई से ठीक पहले केवल पाचन समाधान तैयार करें। पहले स्तर के विस्तार के लिए कम से कम 1.0 x 10 9-1.2 x 109 सेल और दूसरे स्तर के विस्तार के लिए 1.0 x 1010 सेल का लक्ष्य रखने की कोशिश करें। यदि कोशिकाएं तेजी से बढ़ती हैं, तो 4 दिन में फसल लें; यदि नहीं, तो 5 वें दिन फसल लें। पांचवें दिन से आगे जाने की सलाह नहीं दी जाती है।
  16. माइक्रोकैरियर ्स को व्यवस्थित करने के लिए नियंत्रक पर आंदोलन की गति को 0 पर सेट करें, जो आमतौर पर 20 मिनट के भीतर होता है। स्वचालित माध्यम विनिमय प्रोटोकॉल बंद करें, और बायोरिएक्टर नियंत्रक पर तापमान, पीएच और डीओ नियंत्रण रोकें। मैन्युअल रूप से नियंत्रक पर 300 आरपीएम पर पंप 2 शुरू करें, और पोत में लगभग 1 एल (2 एल) कल्चर निलंबन छोड़ने के लिए फ़ीड शासन में सुपरनैटेंट वितरित करें (चरण 2.17 में नोट की गई मात्रा वितरण गति का उपयोग करके या पोत के शरीर पर स्नातक के निशान से अनुमान लगाते हुए)। फ़ीड बैग को सील और पूरी तरह से डिस्कनेक्ट करें।
  17. ताजा तैयार डाइजेस्ट घोल के बैग को चरण 3.15 से फीड ट्यूब में वेल्ड करें, और सभी सामग्री को बर्तन में पंप करें। आंदोलन की गति 45 (40) आरपीएम पर शुरू करें। सुनिश्चित करें कि तापमान नियंत्रण अभी भी 37 डिग्री सेल्सियस पर तापमान बनाए रख रहा है। माइक्रोकैरियर 40-60 मिनट के भीतर घुल जाएंगे। माइक्रोकैरियर के विघटन की जांच करने के लिए एक उज्ज्वल-क्षेत्र माइक्रोस्कोप के तहत निरीक्षण करने के लिए 30 मिनट पर बाँझ लुएर लॉक सिरिंज के साथ नमूने का 1 एमएल लें और बाद में हर 5-10 मिनट लें।
  18. माइक्रोकैरियर्स के घुलने के बाद, एक 3 एल स्टोरेज बैग (15 एल बायोरिएक्टर के लिए दो 3 एल स्टोरेज बैग) को हार्वेस्ट ट्यूब में वेल्ड करें, और 300 आरपीएम पर पंप 2 का उपयोग करके सेल सस्पेंशन को पूरी तरह से पंप करें। वॉश बफर के रूप में 1% मानव सीरम एल्बुमिन (एचएसए) युक्त 1 एल (3.5 एल) नमकीन तैयार करें और अन्य तरल हस्तांतरण के लिए पिछले चरणों में उल्लिखित विधियों और सहायक उपकरणों का उपयोग करके अलग-अलग डिस्पोजेबल स्टोरेज बैग में 500 एमएल पूर्ण एसएफ माध्यम (500 एमएल सेल क्रायोप्रिजर्वेशन बफर, 10% डाइमिथाइल सल्फेट (डीएमएसओ) और 90% एसएफ माध्यम का एक सूत्रीकरण एक उदाहरण के रूप में लिया जाता है।
  19. सेल प्रोसेसिंग सिस्टम चालू करें, निर्माता के निर्देशों के अनुसार उपकरण में एक डिस्पोजेबल सेल प्रोसेसिंग किट स्थापित करें, सेल सस्पेंशन, वॉश बफर और एसएफ माध्यम (क्रायोप्रिजर्वेशन बफर) के बैग को डिस्पोजेबल सेल प्रोसेसिंग किट में वेल्ड करें, और किट की अखंडता और उचित स्थापना को शुरू करने और जांचने के लिए उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस पर प्रदर्शित सभी निर्देशों का सावधानीपूर्वक पालन करें।
  20. एक बार इंस्टॉलेशन पूरा हो जाने के बाद, वॉश और रीसस्पेंशन प्रक्रिया शुरू करने के लिए सॉफ्टवेयर में वॉश बफर और एसएफ मीडियम (क्रायोप्रिजर्वेशन बफर) में रीसस्पेंशन के साथ सेल वॉशिंग के लिए टेबल 3 में सूचीबद्ध पैरामीटर दर्ज करें। पूरी प्रक्रिया कई मैनुअल चेक पॉइंट के साथ स्वचालित रूप से की जाएगी।
  21. सेल प्रोसेसिंग सिस्टम द्वारा इंगित सेंट्रीफ्यूज चैंबर से कोशिकाओं का एक नमूना लें, और निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक स्वचालित सेल विश्लेषक के साथ सेल घनत्व की गणना करें। 2 x 106 कोशिकाओं / एमएल के घनत्व या 250 एमएल की अधिकतम कुल मात्रा के लिए रीसस्पेंशन वॉल्यूम समायोजित करें।
  22. सिस्टम द्वारा कोशिकाओं को कक्ष से बाहर निकालने के बाद डिस्पोजेबल सेल प्रोसेसिंग किट से सेल ट्रांसफर बैग को सील और डिस्कनेक्ट करें। यदि आवश्यक हो तो एक बड़े सेल ट्रांसफर बैग / मध्यम भंडारण बैग में पूर्ण एसएफ माध्यम के साथ सेल घनत्व को 2 x 106 सेल / एमएल तक रीडकरें। ये 15 एल बायोरिएक्टर में दूसरे स्तर के विस्तार के लिए बीज कोशिकाएं होंगी।

4. सेल निर्माण, भरण, और समाप्त

  1. 5 एल बायोरिएक्टर से सेल फसल से 1 दिन पहले 15 एल बायोरिएक्टर तैयार करना शुरू करें। कोष्ठक में इंगित 15 एल के मापदंडों को छोड़कर प्रोटोकॉल अनुभाग 2 और 3 में दिए गए चरणों का पूरी तरह से पालन करें।
  2. क्रायोप्रिजर्वेशन बफर के 250 एमएल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें, और सिस्टम द्वारा कोशिकाओं को कक्ष से बाहर निकालने के बाद डिस्पोजेबल सेल प्रोसेसिंग किट से सेल ट्रांसफर बैग को सील और डिस्कनेक्ट करें।
  3. चरण 4.2 से 3 एल सेल ट्रांसफर बैग में 250 एमएल रिसस्पेंडेड कोशिकाओं के साथ 2,000 एमएल क्रायोप्रिजर्वेशन बफर को स्थानांतरित करें। इस ट्रांसफर बैग को डिस्पोजेबल फिल एंड फिनिश कंज्यूमेबल किट में वेल्ड करें।
    नोट: यहां उपयोग किए जाने वाले क्रायोप्रिजर्वेशन बफर की अतिरिक्त मात्रा को चरण 3.21 में प्राप्त मतगणना परिणामों के अनुसार फॉर्मूलेशन के विनिर्देश और कुल सेल नंबर गणना द्वारा निर्धारित किया जाना चाहिए।
  4. सेल भरने वाले सिस्टम में डिस्पोजेबल फिल एंड फिनिश कंज्यूमेबल किट को इकट्ठा करें, और निर्माता के निर्देशों के अनुसार प्री-कूलिंग सिस्टम चालू करें। सिस्टम पर दिए गए निर्देशों का पालन करें, और प्रति बैच कुल 20 बैग के साथ 20 एमएल / बैग भरने के लिए सेट करें। किट से इन बैगों को सील और डिस्कनेक्ट करें, और मानक क्रायोप्रिजर्वेशन प्रक्रियाओं का पालन करें। क्रायोस्टोरेज बैग का उपयोग करें।
  5. डिस्पोजेबल फिल एंड फिनिश कंज्यूमेबल किट में 20 क्रायोप्रिजर्वेशन बैग का एक नया सेट वेल्ड करें, और सभी कोशिकाओं को एलिकोट किए जाने तक भरण और समाप्त करने की प्रक्रिया को दोहराएं। इन कोशिकाओं को क्रायोप्रिजर्व करने के लिए मानक प्रक्रियाओं का पालन करें।

5. सेल की गुणवत्ता का लक्षण वर्णन

  1. विघटित माइक्रोकैरियर से काटे गए एचएमएससी का नमूना लें, और साहित्य18 में वर्णित विधियों के बाद सेल पहचान के निर्धारण के लिए फ्लो साइटोमेट्री द्वारा लक्षण वर्णन के लिए सेल प्रोसेसिंग सिस्टम का उपयोग करें।
  2. क्रायोसंरक्षित कोशिकाओं को पिघलाएं, और सेल विशेषताओं के आगे के लक्षण वर्णन के लिए पारंपरिक 2 डी फ्लास्क या माइक्रोप्लेट्स पर पुन: परीक्षण करें, जिसमें सेल आकृति विज्ञान और त्रि-वंश भेदभाव क्षमता शामिल है, साहित्य18 में वर्णित विधियों का पालन करते हुए।

6. हलचल-टैंक बायोरिएक्टर में जी 02 माइक्रोकैरियर पर HEK293T विस्तार

  1. चरण 2 में उल्लिखित 5 एल बायोरिएक्टर तैयार करें। HEK293T कोशिकाओं के लिए, कोशिकाओं को W01 के बजाय बाँझ G02 माइक्रोकैरियर के साथ कल्चर करें। संस्कृति प्रक्रिया प्रोटोकॉल खंड 3 के समान है, हालांकि कुछ पैरामीटर अलग हैं, जैसा कि निम्नलिखित चरणों में विस्तृत किया जाएगा। ब्लीड ट्यूब के प्रतिस्थापन में बायोरिएक्टर में एक विशेष छिड़काव ट्यूब स्थापित करें, क्योंकि HEK293T कोशिकाओं की संस्कृति के लिए छिड़काव की आवश्यकता होती है।
  2. प्रोटोकॉल खंड 3 में विस्तृत प्रोटोकॉल से अलग, डीएमईएम में 5 एल बायोरिएक्टर के लिए 10% एफबीएस के साथ 20 ग्राम जी 02 माइक्रोकैरियर (यानी, दो बोतलें) तैयार करें, जिसमें दिन 0 कल्चर वॉल्यूम 3.5 एल (यानी, लगभग 5.71 ग्राम / एल की अंतिम एकाग्रता) पर सेट किया गया है। जी02 माइक्रोकैरियर्स की दो बोतलों से पहले बर्तन में 2 लीटर मध्यम का छिड़काव करें, और 1.75 x 109 HEK293T कोशिकाओं के 500 एमएल (यानी, 5 x 105 कोशिकाओं / एमएल के अंतिम घनत्व पर) को टीका लगाएं।
  3. एक आंदोलन शासन और मध्यम विनिमय व्यवस्था (प्रति दिन आदान-प्रदान किए जाने वाले माध्यम की मात्रा के आधार पर, प्रति दिन संस्कृति मात्रा, सीवीडी के रूप में व्यक्त किया जाता है), जो प्रोटोकॉल खंड 3 से अलग है और तालिका 4 में विस्तृत है।
    नोट: पंप 1 और पंप 2 को मैन्युअल रूप से सक्रिय करें ताकि दोनों छिड़काव के लिए लगातार पंप कर सकें। पंप की मात्रा वितरण गति के अंशांकन के आधार पर छिड़काव दर को पूरा करने के लिए हर दिन पंप की गति को समायोजित करें। आमतौर पर, यह एकल अंक सीमा में होगा। HEK293T कोशिकाओं के लिए, फ़ीड के रूप में ताजा माध्यम का उपयोग करें, और एचएमएससी के विपरीत, खर्च किए गए माध्यम को पूरी तरह से अपशिष्ट बोतल में फेंक दें, जिसके लिए माध्यम प्रसारित किया जाता है।
  4. 15 एल बायोरिएक्टर के दूसरे स्तर के विस्तार के लिए, एचएमएससी के साथ उपयोग किए जाने वाले माइक्रोकैरियर के पूर्ण विघटन के बजाय HEK293T कोशिकाओं के बीड-टू-बीड ट्रांसफर का उपयोग करें। विशेष रूप से, वांछित सेल घनत्व तक पहुंचने के बाद माइक्रोकैरियर्स को तलछट करने के लिए आंदोलन को रोकें, और फिर छिड़काव ट्यूब से जितना संभव हो उतना सुपरनैटेंट को बाहर निकालें, माइक्रोकैरियर्स को धोने के लिए शेष निलंबन की मात्रा के 3 गुना के साथ पीबीएस को खिलाएं, और तीन बार दोहराएं। अंतिम धोने में जितना संभव हो उतना पीबीएस को एस्पिरेट करें और फेंक दें।
  5. माइक्रोकैरियर्स से कोशिकाओं को अलग करने के लिए 1x पुनः संयोजक ट्रिप्सिन के 3.5 एल में फ़ीड करें, जबकि G02 माइक्रोकैरियर बरकरार रहते हैं। तापमान को 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें और आंदोलन की गति 60 आरपीएम पर करें। 45 मिनट के भीतर टुकड़ी को समाप्त करें, जब 80% से अधिक कोशिकाएं अलग हो जाती हैं, पूर्ण माध्यम की समान मात्रा के साथ।
  6. दूसरे स्तर के विस्तार के लिए फसल बंदरगाह से सीधे तैयार 15 एल पोत में स्थानांतरित करें।

7. हलचल-टैंक बायोरिएक्टर में वी 01 माइक्रोकैरियर पर वेरो सेल विस्तार।

  1. पीबीएस के साथ मिलकर बायोरिएक्टर पोत में लियोफिलाइज्ड माइक्रोकैरियर्स को 20 मिलीग्राम / एमएल की एकाग्रता में स्थानांतरित करके वी 01 माइक्रोकैरियर तैयार करें। प्रोटोकॉल अनुभाग 2 में उल्लिखित जहाज को इकट्ठा और निष्फल करें, लेकिन इसके बजाय 30 मिनट के लिए आटोक्लेव।
  2. नसबंदी के बाद, वी 01 माइक्रोकैरियर स्वाभाविक रूप से बस जाते हैं। ब्लीड और फीड ट्यूब का उपयोग करके दो बार बुनियादी डीएमईएम के साथ सतह पर तैरनेवाला का आदान-प्रदान करें, और सेल टीकाकरण और संस्कृति के लिए प्रोटोकॉल सेक्शन 3 पर आगे बढ़ने से पहले पोत की मात्रा के 50% -75% में 10% एनबीएस युक्त पूर्ण डीएमईएम जोड़ें।
  3. प्रोटोकॉल खंड 3 में विस्तृत प्रोटोकॉल से अलग, वेरो कोशिकाओं की 4 एल संस्कृति (यानी, 6 ग्राम / एल की अंतिम एकाग्रता) के लिए 24 ग्राम वी 01 माइक्रोकैरियर का उपयोग करें, और 4 x 109 वेरो कोशिकाओं के 500 एमएल (यानी, 1 x 106 कोशिकाओं / एमएल के अंतिम घनत्व पर) का टीकाकरण करें।
  4. कल्चर प्रक्रिया मापदंडों के लिए चरण 6.3-6.6 का पालन करें और 15 एल हलचल-टैंक बायोरिएक्टर में दूसरे स्तर के विस्तार के लिए पासिंग करें।

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Representative Results

एसीआईएससीपी प्लेटफॉर्म एक पूरी तरह से बंद प्रणाली है जो स्केल-अप विस्तार के लिए हलचल-टैंक बायोरिएक्टर की एक श्रृंखला, स्वचालित सेल कटाई और सूत्रीकरण के लिए एक सेल प्रोसेसिंग सिस्टम और एक सेल फिलिंग सिस्टम (चित्रा 1) को नियोजित करता है। अनुयायी कोशिकाएं छिद्रपूर्ण माइक्रोकैरियर्स से जुड़ती हैं, जिन्हें बायोरिएक्टर में फैलाया जा सकता है, इस प्रकार अनुयायी कोशिकाओं की निलंबित खेती को प्राप्त किया जा सकता है।

वर्णित प्रोटोकॉल का पालन करते हुए, 10 ग्राम डब्ल्यू01 माइक्रोकैरियर्स के साथ 2.5 x10 8 एचएमएससी को पहले प्रारंभिक विस्तार के लिए 5 एल हलचल-टैंक बायोरिएक्टर में टीका लगाया गया था। लगभग 2.9 x 10 9 कोशिकाओं को चौथे दिन सेल प्रोसेसिंग सिस्टम द्वारा केंद्रित और धोया गया था, जिनमें से 1.0 x 109 कटी हुई कोशिकाओं को खेती के दूसरे चरण के लिए 40 ग्राम डब्ल्यू 01 माइक्रोकैरियर के साथ 15 एल हलचल-टैंक बायोरिएक्टर में पारित किया गया था। आखिरकार, 1.1 x 1010 एमएससी को 9 वें दिन 70 से अधिक फॉर्मूलेशन बैग में काटा, तैयार और अलाइकोट किया गया (चित्रा 2 ए)। सेल नंबर, व्यवहार्यता और ग्लूकोज की खपत की दैनिक निगरानी की गई (चित्रा 2 बी, सी)। एक संचयी 128 गुना विस्तार हासिल किया गया था; इस बीच, सेल व्यवहार्यता 90% से अधिक रखी गई थी। ग्लूकोज के सेवन ने सेल विस्तार के साथ एक नकारात्मक सहसंबंध प्रदर्शित किया, जो स्वस्थ सेल विकास से जुड़े चयापचय को दर्शाता है।

विघटित छिद्रपूर्ण माइक्रोकैरियर को पूर्व-निष्फल किया जा सकता है और जीएमपी (चित्रा 3 ए) के लिए उपयुक्त एकल-उपयोग बंद सिस्टम पैकेजिंग में आ सकता है। कोशिकाएं माइक्रोकैरियर की सतह और मैक्रोपोर्स की आंतरिक दीवार से जुड़ सकती हैं (चित्रा 3 बी)। पीआई सेल डबल स्टेनिंग किट जैसे फ्लोरोसेंट डाई का उपयोग करके, छिद्रपूर्ण माइक्रोसेफर्स के अंदर की कोशिकाओं की कल्पना की जा सकती है (चित्रा 3 सी)। फ्लोरोसेंट छवियों के साथ उज्ज्वल-क्षेत्र छवियों को विलय करने से सेल वितरण की एकरूपता का विश्लेषण करने में मदद मिली। लाइव सेल स्टेनिंग ने मैन्युअल सैंपलिंग या ऑनलाइन लाइव सेल काउंटिंग जांच द्वारा मापी गई सेल गिनती के साथ एक मजबूत संबंध भी दिखाया।

उच्च सेल मात्रा की जबरदस्त मांग के अलावा, एमएससी के महत्वपूर्ण गुणवत्ता विशेषता (सीक्यूए) आकलन और रिलीज परीक्षण अपरिहार्य हैं, क्योंकि इनके बिना, कोशिकाओं को खेती के बाद निष्फल या बड़े पैमाने पर शुद्ध नहीं किया जा सकता है। सेल की गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए, एसीआईएससीपी प्लेटफॉर्म के प्रत्येक चरण में 3 डी-विस्तारित एमएससी का नमूना लिया जा सकता है। एसीआईएससीपी प्लेटफॉर्म से ताजा कटाई किए गए एमएससी ने शास्त्रीय फेनोटाइपिक मार्कर22 को बरकरार रखा, जिसमें सकारात्मक मार्करों (सीडी 73, सीडी 90, सीडी 105) और नकारात्मक मार्करों (एचएलए-डीआर, सीडी 34, सीडी 45, सीडी 19, सीडी 14) के लिए क्रमशः >95% और <2% की अभिव्यक्ति थी (चित्रा 4 ए)। क्रायोसंरक्षित कोशिकाओं को पिघलाया गया और 2 डी प्लानर फ्लास्क में टीका लगाया गया और अच्छी आसंजन क्षमता, सामान्य विस्तार व्यवहार (चित्रा 4 बी), और सर्पिल विकास के साथ एक विशिष्ट स्पिंडल आकार दिखाया गया (चित्रा 4 सी)। इसके अलावा, कोशिकाओं ने ओस्टोजेनिक, एडिपोजेनिक और चोंड्रोजेनिक वंशावली (चित्रा 4 डी) में अंतर करने की अपनी क्षमता को भी बनाए रखा।

इसके अलावा, HEK293T कोशिकाओं और वेरो कोशिकाओं का परीक्षण एसीआईएससीपी प्लेटफॉर्म में भी किया गया था। HEK293T सेल कल्चर के लिए, 5 एल बायोरिएक्टर में इनोकुलम सेल एकाग्रता 5 x 105 सेल / एमएल थी। बीड-टू-बीड ट्रांसफर प्रक्रिया के बाद, पीक सेल एकाग्रता 15 एल बायोरिएक्टर (चित्रा 5 ए) में 1.68 x 107 कोशिकाओं / एमएल तक पहुंच गई, और HEK293T कोशिकाओं ने उच्च व्यवहार्यता बनाए रखी (चित्रा 5 बी)। वेरो सेल कल्चर के लिए, 5 एल बायोरिएक्टर में इनोकुलम सेल एकाग्रता 2 x 105 सेल / एमएल थी। बीड-टू-बीड ट्रांसफर प्रक्रिया के बाद, 15 एल बायोरिएक्टर (चित्रा 6 ए) में प्राप्त पीक सेल एकाग्रता 1.08 x 107 सेल / एमएल थी, और वेरो कोशिकाओं ने उच्च व्यवहार्यता भी बनाए रखी (चित्रा 6 बी)।

Figure 1
चित्रा 1: एसीआईएससीपी प्लेटफॉर्म के माध्यम से एचएमएससी उत्पादन का योजनाबद्ध रोडमैप। यह आंकड़ा प्रकाशित साहित्य18 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: एसीआईएससीपी प्लेटफॉर्म के माध्यम से एचएमएससी का सेल विस्तार। (ए) एसीआईएससीपी प्लेटफॉर्म में हलचल-टैंक बायोरिएक्टर, एक सेल प्रोसेसिंग सिस्टम और एक सेल फिलिंग सिस्टम की एक श्रृंखला शामिल है। (बी) दो-स्तरीय विस्तार प्रक्रिया में एचएमएससी की वृद्धि वक्र, (सी) और प्रक्रिया के दौरान ग्लूकोज की खपत दर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: डब्ल्यू 01 माइक्रोकैरियर पर एचएमएससी विकास का लक्षण वर्णन। यह आंकड़ा प्रकाशित साहित्य18 से संशोधित किया गया है। (ए) डब्ल्यू 01 माइक्रोकैरियर एकल-उपयोग बंद-सिस्टम पैकेजिंग के साथ तैयार किए जाते हैं। (बी) खाली माइक्रोकैरियर और माइक्रोकैरियर की स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप छवियों को अनुगामी एचएमएससी के साथ संवर्धित किया गया। सफेद त्रिकोणीय सिर माइक्रोकैरियर की सतह पर कोशिकाओं को इंगित करते हैं; स्केल बार = 100 μm. (C) प्रतिनिधि ने दिन 1 से दिन 4 तक माइक्रोकैरियर पर संवर्धित एचएमएससी की उज्ज्वल क्षेत्र और प्रतिदीप्ति (लाइव सेल धुंधला) छवियों को विलय किया; स्केल बार = 100 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: एसीआईएससीपी प्लेटफॉर्म से काटे गए एचएमएससी का सेल पहचान मूल्यांकन । (ए) एचएमएससी के सतह मार्करों को फ्लो साइटोमेट्री द्वारा विशेषता दी गई थी। सभी सकारात्मक मार्कर (>95%) और नकारात्मक मार्कर (<2%) मानदंडों को पूरा करते हैं। (बी) क्रायोसंरक्षित 3 डी-विस्तारित एचएमएससी ने 2 डी फ्लास्क को पिघलाने और फिर से चढ़ाने के बाद सामान्य विस्तार व्यवहार का प्रदर्शन किया। (ग) 3डी-विस्तारित एचएमएससी की आकृति विज्ञान; स्केल बार = 50 μm. (D) 3D-विस्तारित hMSCs का त्रि-वंश भेदभाव। ओस्टोजेनिक, एडिपोजेनिक और चोंड्रोजेनिक क्षमताओं का मूल्यांकन क्रमशः अलीजारिन रेड, ऑयल रेड और एल्सियन ब्लू स्टेनिंग द्वारा किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: एसीआईएससीपी प्लेटफॉर्म के माध्यम से HEK293T कोशिकाओं का सेल विस्तार। (ए) 5 एल और 15 एल बायोरिएक्टर में HEK293T सेल घनत्व। (बी) ब्राइट-फील्ड (बीएफ) छवि, कैल्केन-एएम-सना हुआ (लाइव), और पीआई-सना हुआ (मृत) HEK293T कोशिकाएं जी 02 माइक्रोकैरियर्स पर संवर्धित हैं; स्केल बार = 1 मिमी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्र 6: एसीआईएससीपी प्लेटफॉर्म के माध्यम से वेरो कोशिकाओं का सेल विस्तार । (ए) 5 एल और 15 एल बायोरिएक्टर में वेरो सेल घनत्व। (बी) ब्राइट-फील्ड (बीएफ) छवि, कैल्केन-एएम-सना हुआ (लाइव), और पीआई-सना हुआ (मृत) वेरो कोशिकाएं वी 01 माइक्रोकैरियर्स पर संवर्धित; स्केल बार = 400 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 1: हलचल-टैंक बायोरिएक्टर की पैरामीटर सेटिंग्स। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

तालिका 2: एचएमएससी खेती के लिए स्वचालित माध्यम विनिमय की पैरामीटर सेटिंग्स। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

तालिका 3: एचएमएससी मार्ग और सूत्रीकरण के लिए सेल प्रोसेसिंग सिस्टम की पैरामीटर सेटिंग्स। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

तालिका 4: HEK293T और वेरो कोशिकाओं के लिए मध्यम विनिमय व्यवस्था और आंदोलन शासन। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

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Discussion

इम्यूनोथेरेपी और स्टेम सेल थेरेपी दोनों दवाओं के रूप में जीवित कोशिकाओं का उपयोग करते हैं; हालांकि, उनके अंतिम उत्पादों को छोटे अणुओं या वायरस के समान शुद्ध या निष्फल नहीं किया जाना चाहिए। इसलिए, डिजाइन द्वारा गुणवत्ता (क्यूबीडी) के सिद्धांत को हमेशा ध्यान में रखा जाना चाहिए और सेल उत्पादनके दौरान रासायनिक विनिर्माण और नियंत्रण (सीएमसी) प्रक्रिया पर व्यावहारिक रूप से लागू किया जाना चाहिए। एक पूरी तरह से बंद सेल कल्चर सिस्टम, साथ ही एक प्रसंस्करण प्रणाली और एक भरने वाली प्रणाली, अधिमानतः आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए माना जाता है। इस अध्ययन में, हमने एचएमएससी के दो-स्तरीय विस्तार करने के लिए जीएमपी-ग्रेड, विघटित और छिद्रपूर्ण 3 डी माइक्रोकैरियर ्स पर आधारित एसीआईएससीपी प्लेटफॉर्म का उपयोग करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है। कुछ शोधकर्ताओं ने इन विट्रो में एचएमएससी का विस्तार करने के लिए माइक्रोकैरियर्स के साथ बायोरिएक्टर का उपयोग करने की व्यवहार्यता का पता लगाया है, लेकिन रिपोर्ट किए गए अधिकांश अध्ययनों से पता चला है कि पैमाने में वृद्धि से एचएमएससी उपज में कमी आएगी, 6.1 x 10 5 सेल / एमएल या यहां तक कि 100 एमएल कामकाजी मात्रा में 12.5 x 10 5 सेल / एमएल से 2 एल वर्किंग वॉल्यूम24 में 2.7 x 10 5 सेल / एमएल तक। 25,26. भले ही हलचल-टैंक बायोरिएक्टर उच्चतम स्केलेबिलिटी प्रदर्शित करते हैं, पोत की संरचनात्मक विशेषताओं, इंपेलर प्रकार, टिप गति, वॉल्यूमेट्रिक मास ट्रांसफर गुणांक, ऑक्सीजन केकेएल ए, और बिजली संख्या जैसे प्रमुख मुद्दों पर पूरी तरहसे विचार किया जाना चाहिए। पिछले हलचल-टैंक बायोरिएक्टर से अलग, जो आमतौर पर रोगाणुओं या सीएचओ कोशिकाओं जैसे पालतू एंकरेज-स्वतंत्र कोशिकाओं की खेती के लिए डिज़ाइन किए गए थे, इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले बायोरिएक्टर को विशेष रूप से माइक्रोकैरियर-आधारित संस्कृति के लिए डिज़ाइन किया गया था और इस प्रकार, पोषक तत्व विनिमय रणनीतियों की विभिन्न प्रक्रिया आवश्यकताओं को पूरा करने में सक्षम है। सेल खेती की प्रक्रिया में अंतर के अलावा, एसीआईएससीपी प्लेटफॉर्म एक सेल फिलिंग सिस्टम के साथ एक निरंतर प्रवाह सेंट्रीफ्यूज-आधारित सेल प्रोसेसिंग सिस्टम को नियोजित करता है, जो बार-बार मैनुअल काम द्वारा किए गए बड़ी मात्रा में कोशिकाओं के उत्पादन के लिए पारंपरिक कटाई प्रक्रियाओं के विपरीत है, इस प्रकार एक उच्च हैंडलिंग प्रभावकारिता की गारंटी देता है। उन्नत स्वचालित उपकरणों में एक-बैच उत्पादन में उच्च उपज होती है।

अधिकांश स्टेम सेल एंकरेज-निर्भर हैं; इस प्रकार, वे सेल विनिर्माण के लिए माइक्रोकैरियर की मांग करते हैं। परंपरागत रूप से, पिछले वाणिज्यिक माइक्रोकैरियर ्स को विभिन्न सतह विशेषताओं का लाभ उठाने के लिए तैयार किया गया था, इस प्रकार विभिन्न सेल विस्तार गुना संख्या प्राप्त की गई थी। पिछले शोध में, पोर्सिन अस्थि मज्जा एमएससी के लिए साइटोडेक्स टाइप 1 माइक्रोकैरियर्स के उपयोग ने लगभग 4 x 10 5 कोशिकाओं / एमएल का सेल घनत्व उत्पन्न किया, जबकि जिलेटिन-लेपित साइटोडेक्स टाइप 3 के उपयोग ने मानव प्लेसेंटल एमएससी27 के लिए तुलनीय सेल संख्या (3.8 x 105 कोशिकाओं / एमएल) का उत्पादन किया। फिर भी, साइटोडेक्स टाइप 1 और टाइप 3 गैर-भंग योग्य हैं, और, इस प्रकार, सेल कटाई के दौरान ट्रिप्सिनाइजेशन प्रक्रिया न केवल सेल रिकवरी उपज बल्कि व्यवहार्यता और गुणवत्ता को भी प्रभावित करती है। इसलिए, सीजीटी उत्पादों के लिए पारंपरिक माइक्रोकैरियर ्स का उपयोग करने के कोई सफल मामले नहीं हैं, जहां अंतिम उत्पादों के रूप में कोशिकाएं गैर-घुलने योग्य माइक्रोकैरियर्स के संदूषण को खत्म करनेके लिए व्यापक डाउनस्ट्रीम शुद्धिकरण प्रक्रियाओं से नहीं गुजर सकती हैं। इसके विपरीत, डब्ल्यू 01 माइक्रोकैरियर पूरी तरह से भंग होने योग्य हैं, जिसका अर्थ है कि सेल उत्पादों को माइक्रोकैरियर के क्षरण से आसानी से काटा जा सकता है। यह माइक्रोकैरियर उत्पाद पूरी तरह से बंद सिस्टम पैकेजिंग में भी आता है, जिसका अर्थ है कि जीएमपी के अनुरूप एक ऑपरेशन प्रक्रिया आसानी से प्राप्त की जा सकती है। हमने दिखाया है कि दो-स्तरीय विस्तार प्रक्रिया के साथ पासिंग को डब्ल्यू 01 माइक्रोकैरियर्स के साथ आसानी से प्राप्त किया जा सकता है, और एक बैच में 1.1 x 1010 कुल कोशिकाओं को काटा जा सकता है; वास्तव में, यह केवल29,30 की पिछली रिपोर्ट ों में 50 एल बायोरिएक्टर में हासिल किया जा सकता है। इस काम में, हलचल-टैंक बायोरिएक्टर के अंदर पीक सेल घनत्व फसल से पहले लगभग 11.6 x 105 कोशिकाओं / एमएल तक पहुंच गया। इस प्रकार, यह उम्मीद की जा सकती है कि एसीआईएससीपी प्लेटफॉर्म में 100-200 एल बायोरिएक्टर के साथ प्रति बैच 1 x 1011 सेल आसानी से प्राप्त कर सकते हैं, जिसका अर्थ होगा कि प्रति वर्ष हजार बैच हर साल 300 ट्रिलियन एचएमएससी की मांग को आसानी से पूरा कर सकते हैं।

चूंकि कोशिकाओं में विभिन्न विशेषताएं होती हैं, इसलिए विभिन्न प्रकार के 3 डी माइक्रोकैरियर का उत्पादन किया जाता है और एक विशिष्ट सेल और एक माइक्रोकैरियर के बीच संगतता का परीक्षण करने के लिए उपलब्ध होते हैं। सीजीटी में गैर-सेल एंड उत्पादों के लिए, बायोरिएक्टर में HEK293T कोशिकाओं और वेरो कोशिकाओं के लिए माइक्रोकैरियर-आधारित स्केल-अप क्रमशः 1.5 x 10 6 सेल / एमएल और 3.3 x 106 सेल / एमएल तक पहुंचने की सूचना दी गईहै। हमने क्रमशः HEK293T कोशिकाओं और वेरो कोशिकाओं का विस्तार करने के लिए एसीआईएससीपी प्लेटफॉर्म में घुलने योग्य छिद्रपूर्ण माइक्रोकैरियर्स, जी 02 और वी 01 का उपयोग किया, और दोनों कोशिकाओं की चरम सेल घनत्व 1 x 107 कोशिकाओं / एमएल से ऊपर पहुंच गई। इसके अलावा, 3 डी माइक्रोकैरियर की डिग्रेडेबिलिटी इंट्रासेल्युलर वायरस के जैविक उत्पादों के उत्पादन के लिए फायदेमंद हो सकती है, क्योंकि कोशिकाओं को माइक्रोकैरियर से आसानी से अलग किया जा सकता है। गंभीर रूप से, एसीआईएससीपी मंच एक स्थापित नई जैव विनिर्माण प्रक्रिया का प्रतिनिधित्व करता है जो सेल और जीन थेरेपी उत्पादों के लिए मात्रा और गुणवत्ता आवश्यकताओं दोनों को पूरा करता है। हम उम्मीद करते हैं कि हमारे बड़े पैमाने पर सेल उत्पादन मंच सेल और जीन थेरेपी के विकास को सक्षम करने के लिए एक आवश्यक उपकरण के रूप में कार्य करेगा।

ऊपर चर्चा किए गए मंच के फायदों के बावजूद, भविष्य में कई बाधाओं को दरकिनार किया जाना बाकी है। सबसे पहले, वर्तमान रूप में एसीआईएससीपी प्लेटफॉर्म में नियोजित बायोरिएक्टर अभी भी ग्लास टैंक से लैस हैं, जिन्हें जीएमपी के मानदंडों को पूरा करने के लिए जटिल धोने की प्रक्रियाओं और सफाई सत्यापन की आवश्यकता होती है। एक एकल-उपयोग वाले हलचल-टैंक बायोरिएक्टर सिस्टम को भविष्य में संभावित रूप से नियोजित किया जा सकता है ताकि एकल-उपयोग उपभोग्य किट का एक बरकरार सेट तैयार किया जा सके। दूसरे, पालतू सेल लाइनों से अलग, एचएमएससी व्यक्तिगत दाताओं और विभिन्न ऊतकों से अलग प्राथमिक सेल उपभेद हैं, जिसका अर्थ है कि एचएमएससी विषमता प्रदर्शित करते हैं। इसलिए, इस पेपर में वर्णित प्रोटोकॉल एक संदर्भ के रूप में कार्य करता है, जबकि एसीआईएससीपी प्लेटफॉर्म के तकनीकी माइग्रेशन को प्राप्त करने के लिए व्यवस्थित प्रक्रिया विकास की आवश्यकता होती है। तीसरा, भले ही हमारे सहकर्मियों ने वेरो कोशिकाओं32 के साथ वैक्सीनिया वायरस के उत्पादन की व्यवहार्यता का प्रारंभिक परीक्षण किया है, लेकिन क्या HEK293T कोशिकाओं के 3 डी विस्तार में वायरल उत्पादन के लिए अच्छा प्रदर्शन हासिल किया जा सकता है, इसे आगे मान्य किया जाना बाकी है। अंत में, एसीआईएससीपी प्लेटफॉर्म की बड़े पैमाने पर सेल उत्पादन विधि, विघटित छिद्रपूर्ण माइक्रोकैरियर और स्वचालित बंद प्रणालियों की एक श्रृंखला पर आधारित है, सीजीटी उत्पादों के निर्माण के लिए औद्योगिक पैमाने पर उत्पादन दक्षता बढ़ाने और गुणवत्ता नियंत्रण को परिष्कृत करने का अवसर प्रदान करती है।

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Disclosures

वाई.डी. एक वैज्ञानिक सलाहकार हैं, और एच.एक्स., वाई.जेड., एल.जी., एम.एल., वाई.वाई., डब्ल्यू.एल., और एक्स.वाई. बीजिंग साइटोनिश बायोटेक्नोलॉजी कंपनी लिमिटेड के कर्मचारी हैं। अन्य लेखकों का इस लेख में वर्णित उत्पादों या कंपनियों में कोई वाणिज्यिक, मालिकाना या वित्तीय हित नहीं है। अन्य सभी लेखक घोषणा करते हैं कि उनके पास कोई प्रतिस्पर्धी हित नहीं हैं।

Acknowledgments

इस काम को प्रतिष्ठित युवा विद्वानों के लिए राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (82125018) द्वारा वित्तीय रूप से समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% trypsin EDTA BasalMedia S310JV Used for 2D cell harvest.
3D FloTrix Digest CytoNiche Biotech R001-500 This is a reagent that specifically dissolves 3D TableTrix microcarriers.
3D FloTrix MSC Serum Free Medium CytoNiche Biotech RMZ112 This is a serum-free,animal-free medium for mesenchymal stem cell expansion and maintenance in 2D planar culture as well as 3D culture on 3D TableTrix microcarriers.
3D FloTrix Single-Use Filtration Module CytoNiche Biotech R020-00-10 This module contains 0.22 μm capsule filters used for filtration of culture medium and digest solution.
3D FloTrix Single-Use Storage Bag (10 L) CytoNiche Biotech R020-00-03 Used as feed bag for 5 L bioreactor.
3D FloTrix Single-Use Storage Bag (3 L) CytoNiche Biotech R020-00-01 Used as cell seeding or transfer bags.
3D FloTrix Single-Use Storage Bag (50 L) CytoNiche Biotech R020-00-04 Used as feed bag for 15 L bioreactor.
3D FloTrix vivaPACK Disposable Fill&Finish Consumable Kit CytoNiche Biotech PACK-01-01 This is a standard kit adapted to 3D vivaPACK fill and finish system.
3D FloTrix vivaPACK fill and finish system for cells CytoNiche Biotech vivaPACK This system is a closed liquid handling device, with automated mixing and gas exhausting functions. Cells resuspended in cryopreservation buffer can be rapidly and evenly aliquoted into 20 bags per batch.
3D FloTrix vivaPREP PLUS cell processing system CytoNiche Biotech vivaPREP PLUS This system is a continuous flow centrifuge-based device.Cells can be concentrated, washed, and resuspended under completely closed procedures.
3D FloTrix vivaPREP PLUS Disposable Cell Processing Kit CytoNiche Biotech PREP-PLUS-00 This is a standard kit adapted to 3D vivaPREP PLUS cell processing.
3D FloTrix vivaSPIN  bioreactor 15 L CytoNiche Biotech FTVS15 This bioreactor product employs a controller, a 15 L glass stirred-tank vessel, and assessories. A special perfusion tube is available.
3D FloTrix vivaSPIN  bioreactor 5 L CytoNiche Biotech FTVS05 This bioreactor product employs a controller, a 5 L glass stirred-tank vessel, and assessories.A special perfusion tube is available.
3D FloTrix vivaSPIN Closed System Consumable Pack (10/15 L) CytoNiche Biotech R020-10-10 This is a standard tubing kit adapted to 3D vivaSPIN bioreactor 15 L, containing sampling bags.
3D FloTrix vivaSPIN Closed System Consumable Pack (2/5 L) CytoNiche Biotech R020-05-10 This is a standard tubing kit adapted to 3D vivaSPIN bioreactor 5 L, containing sampling bags.
3D TableTrix microcarriers G02 CytoNiche Biotech G02-10-10g These porous and degradable microcarriers are suitable for HEK293T cell culture. They come pre-sterilized in 10g/bottle with C-Flex tubings for welding to tubes on bioreactors.
3D TableTrix microcarriers V01 CytoNiche Biotech V01-100-10g These porous and degradable microcarriers are suitable for adherent cell culture, they come as non-sterilized microcarriers that need to be autoclaved in PBS before use. They are especially suitable for vaccine production.
3D TableTrix microcarriers W01 CytoNiche Biotech W01-10-10g (single-use packaging);
W01-200 (tablets)		 These porous and degradable microcarriers are suitable for adherent cell culture, especially for cells that need to be harvested as end products. They come pre-sterilized in 10g/bottle with C-Flex tubings for welding to tubes on bioreactors.The product has obtained 2 qualifications for pharmaceutical excipients from CDE, with the registration numbers of [F20200000496; F20210000003]. It has also received DMF qualification for pharmaceutical excipients from FDA, with the registration number of [DMF:35481]
APC anti-human CD45 Antibody BioLegend 368512 Used in flow cytometry for MSC identity assessment
Calcein-AM/PI Double Staining Kit Dojindo C542 Calcein-AM/PI Double Staining Kit is utilized for simultaneous fluorescence staining of viable and dead cells. This kit contains Calcein-AM and Propidium Iodide (PI) solutions, which stain viable and dead cells, respectively.
Cap for EZ Top Container Closures for NALGENE-containers (500mL) Saint-Gobain CAP-38 Brands and catalogue numbers are only for example, similar products are available from various suppliers and as long as they have the same functionality, items could be substituted with other brands.
C-Flex Tubing, Formulation 374 (0.25 in x 0.44 in) Saint-Gobain 374-250-3 Used for tube welding and disconnection.
CryoMACS Freezing Bag 50 Miltenyi Biotec  200-074-400 Used for expanding the 3D FloTrix vivaPACK Disposable Fill&Finish Consumable Kit.
Dimethyl Sulfate (DMSO)  Sigma D2650-100mL Used for preparation of cryopreservation solution.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) BasalMedia L120KJ Used for cultivation of HEK293T and Vero cells.
DURAN Original GL 45 Laboratory bottle (2 L) DWK life sciences 218016357 Used for waste collection from the 5 L bioreactor.
DURAN Original GL 45 Laboratory bottle (5 L) DWK life sciences 218017353 Used for waste collection from the 15 L bioreactor.
DURAN Original GL 45 Laboratory bottle (500 mL) DWK life sciences 218014459 Used for supplementary bottle of 0.1 M NaOH.
EZ Top Container Closures for NALGENE-containers (500mL) Saint-Gobain EZ500 ML-38-2 Brands and catalogue numbers are only for example, similar products are available from various suppliers and as long as they have the same functionality, items could be substituted with other brands.
Fetal bovine serum (FBS) superior quality Wisent 086-150 Used for cultivation of HEK293T cells.
FITC anti-human CD14 Antibody BioLegend 301804 Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
FITC anti-human CD34 Antibody BioLegend 343504 Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
FITC anti-human CD90 (Thy1) Antibody BioLegend 328108 Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
Flow cytometry Beckman Coulter CytoFLEX Used for cell identity assessment.
Fluorescence Cell Analyzer Alit life science Countstar Rigel S2 Used for cell counting. Cell viability can be calculated by staining with AO/PI dyes.
GL 45 Multiport Connector Screw Cap with 2 ports  DWK life sciences 292632806 Brands and catalogue numbers are only for example, similar products are available from various suppliers and as long as they have the same functionality, items could be substituted with other brands.
Glucose Meter Sinocare 6243578 Used for detecting glucose concentration in cell culture medium and supernatant.
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), with calcium and magnesium Gibco 14025092 Used for preparation of digest solution.
Human Albumin 20% Behring (HSA) CSL Behring N/A Used for preparation of wash buffer.
Inverted fluorescent microscope OLYMBUS CKX53SF Used for brifgt field and fluorescent observation and imaging.
Nalgene Measuring Cylinder (500 mL) Thermo Scientific 3662-0500PK Used for calibrating the liquid handling volume speed of peristaltic pumps.
Newborn calf serum (NBS) superfine MINHAI BIO SC101.02 Used for cultivation of Vero cells.
OriCell human mesenchymal stem cell adipogenic differentiation and characterization kit Cyagen HUXUC-90031 Used for tri-lineage differentiation of hUCMSCs.
OriCell human mesenchymal stem cell chondrogenic differentiation and characterization kit Cyagen HUXUC-90041 Used for tri-lineage differentiation of hUCMSCs.
OriCell human mesenchymal stem cell osteogenic differentiation and characterization kit Cyagen HUXUC-90021 Used for tri-lineage differentiation of hUCMSCs.
PE anti-human CD105 Antibody BioLegend 800504 Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
PE anti-human CD19 Antibody BioLegend 302208 Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
PE anti-human CD73 (Ecto-5'-nucleotidase) Antibody BioLegend 344004 Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
PE anti-human HLA-DR Antibody BioLegend 307605 Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
Phosphate Buffered Saline (PBS) Wisent 311-010-CL Used in autoclaving of glass vessel and V01 microcarriers, and replacement of culture medium.
Sani-Tech Platinum Cured Sanitary Silicone Tubing (0.13 in x 0.25 in) Saint-Gobain ULTRA-C-125-2F Used for solution transfering driven by peristaltic pumps.
Sterile Saline Hopebiol HBPP008-500 Used for preparation of wash buffer.
Trypzyme Recombinant Trypsin BasalMedia S342JV This reagent is used for bead-to-bead transfer of HEK293T and Vero cells.
Tube Sealer Yingqi Biotech Tube Sealer I This sealer is compatible with both C-Flex tubing and PVC tubing.
Tube Welder for PVC tubing Chu Biotech Tube Welder Micro I Used for welding of PVC tubing.
Tube Welder for TPE tubing Yingqi Biotech Tube Welder I-V2 Used for welding of TPE tubing.
ViaStain AO / PI Viability Stains Nexcelom CS2-0106-25mL Dual-Fluorescence Viability, using acridine orange (AO) and propidium iodide (PI), is the recommended method for accurate viability analysis of primary cells, such as PBMCs, and stem cells in samples containing debris.

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Chen, Y., Xu, H., Zhang, Y., Guo, L., Lan, M., Yang, Y., Liu, W., Yan, X., Du, Y. Large-Scale Cell Production Based on GMP-Grade Dissolvable Porous Microcarriers. J. Vis. Exp. (197), e65469, doi:10.3791/65469 (2023).

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