Summary
Здесь мы представляем протокол для достижения крупномасштабного производства адгезивных клеток с помощью полностью закрытой системы на основе растворимых микроносителей GMP-класса. Культивирование мезенхимальных стволовых клеток человека, клеток HEK293T и клеток Vero было валидировано и соответствовало как количественным требованиям, так и критериям качества для индустрии клеточной и генной терапии.
Abstract
Исследователи в области клеточной и генной терапии (ВКТ) уже давно сталкиваются с серьезной проблемой эффективного и крупномасштабного размножения клеток. Чтобы устранить основные недостатки двумерной (2D) планарной системы культивирования, мы разработали инновационную платформу автоматизированного закрытого промышленного производства клеток (ACISCP) на основе растворимого и пористого микроносителя GMP-класса для 3D-культивирования адгезивных клеток, включая мезенхимальные стволовые/стромальные клетки человека (hMSCs), HEK293T клетки и клетки Vero. Для достижения крупномасштабного расширения было проведено двухступенчатое расширение с помощью биореакторов с перемешиванием объемом 5 л и 15 л с получением 1,1 x10 10 гМСК с общим расширением в 128 раз в течение 9 дней. Клетки собирали путем полного растворения микроносителей, концентрировали, промывали и формулировали с помощью системы обработки клеток на основе центрифуги непрерывного действия, а затем аликвотировали с помощью системы заполнения клеток. По сравнению с 2D планарной культурой нет существенных различий в качестве МСК, собранных из 3D-культуры. Мы также применили эти растворимые пористые микроносители к другим популярным типам клеток в секторе CGT; В частности, HEK293T клетки и клетки Vero культивировались до пиковой плотности клеток 1,68 x 10 7 клеток/мл и 1,08 x 107 клеток/мл соответственно. В этом исследовании представлен протокол использования платформы биотехнологической инженерии, использующей характеристики растворимых микроносителей класса GMP и передового закрытого оборудования для производства адгезивных клеток в промышленных масштабах.
Introduction
За последние два десятилетия индустрия CGT стала свидетелем экспоненциального роста. Ожидается, что эволюция лекарственных средств нового поколения позволит лечить и излечивать многочисленные рефрактерные заболевания1. С момента первого одобрения Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) продукта CGT Kymriah в 2017 году исследования и разработки, связанные с CGT, в мире продолжали расти быстрыми темпами, при этом FDA отмечает, что количество активных заявок на новые экспериментальные препараты для CGT увеличилось до 500 в 2018году. Прогнозировалось, что к 2030 году количество одобренных продуктов CGT, вероятно, составит 54-74 в СоединенныхШтатах.
Несмотря на то, что быстрый рост исследований и инноваций в области CGT является захватывающим, все еще существует большой технологический разрыв между лабораторными исследованиями и производством в промышленных масштабах, который мог бы доставить эти перспективные лекарства для охвата такого количества пациентов, которое необходимо, по доступным ценам. Нынешние процессы, принятые для этих клинических испытаний, были разработаны в лабораториях для проведения небольших экспериментов, и необходимы значительные усилия для совершенствования и внедрения инновацийв производство CGT. Существует множество типов продуктов CGT, большинство из которых основаны на живых клетках, которые могут быть аллогенными, аутологичными, инженерными или натуральными. Эти живые лекарства намного сложнее, чем мелкомолекулярные соединения или биологические препараты, что делает крупномасштабное производство серьезной проблемой 4,5,6. В этой работе мы демонстрируем крупномасштабный протокол производства клеток для трех якорно-зависимых клеток, которые широко применяются в CGT. К ним относятся мезенхимальные стволовые/стромальные клетки человека (МСК), которые используются для клеточной терапии, а также клетки HEK293T и Vero, которые используются для производства вирусов для генной инженерии конечного терапевтического клеточного продукта. Клетки, зависящие от якорения, обычно культивируются на планарных системах, которые требуют ручной обработки. Однако ручные методы культивирования требуют значительного количества труда и подвержены загрязнению, что может поставить под угрозу качество конечного продукта. Кроме того, отсутствует поточный контроль процесса, что приводит к существенной вариабельности качества между партиями7. Если взять в качестве примера терапию стволовыми клетками, то с многообещающим портфелем из более чем 200 кандидатов на терапию стволовыми клетками, по оценкам, для удовлетворения потребностей клинического применения потребуется 300 триллионов МСКв год8. Таким образом, крупномасштабное производство терапевтических клеток стало необходимым условием для проведения этих терапевтических вмешательств с такойвысокой потребностью в клетках.
Чтобы избежать неудач планарных систем, были предприняты усилия по разработке крупномасштабных производственных процессов в биореакторах с перемешиванием с обычными нерастворимыми микроносителями 10,11,12,13, но они страдают от сложных процедур подготовки и низкой эффективности сбора клеток 14. Недавно мы разработали инновационный растворимый микроноситель для экспансии стволовых клеток, стремясь обойти проблемы, связанные с забором клеток из обычных нерастворимых коммерческих микроносителей15. Этот новый, коммерчески доступный 3D-растворимый пористый микроноситель 3D-класса GMP, 3D TableTrix, продемонстрировал большой потенциал для крупномасштабного производства клеток. Действительно, 3D-культура, основанная на этих пористых микроносителях, потенциально может воссоздать благоприятную биомиметическую микросреду для стимулирования клеточной адгезии, пролиферации, миграциии активации. Пористые структуры и взаимосвязанные пористые сети микроносителей могут создавать большую площадь клеточной адгезии и способствовать обмену кислорода, питательных веществ и метаболитов, тем самым создавая оптимальный субстрат для клеточной экспансии in vitro 17. Высокая пористость этих растворимых пористых микроносителей 3D-класса GMP позволяет крупномасштабно расширять хМСК, а способность клеток полностью растворяться позволяет эффективно собирать эти расширенные клетки18. Он также является продуктом класса GMP и был зарегистрирован в качестве фармацевтического вспомогательного вещества в Китайском центре оценки лекарственных средств (регистрационные номера: F20210000003 и F20200000496)19 и FDA Соединенных Штатов (FDA, США; Номер главного дела о наркотиках: 35481)20.
Здесь мы проиллюстрируем автоматизированную систему производства ячеек закрытого промышленного масштаба (ACISCP)18, использующую эти диспергируемые и растворимые пористые микроносители для hMSC, HEK293T cell и расширения клеток Vero. Мы добились успешного двухуровневого расширения МСК (128 кумулятивных расширений за 9 дней) из биореактора объемом 5 л в биореактор объемом 15 л и, наконец, получили до 1,1 x 1010 МСК из одной партии продукции. Клетки собирали путем полного растворения микроносителей, концентрировали, промывали и формулировали с помощью системы обработки клеток на основе центрифуги непрерывного действия, а затем аликвотировали с помощью системы заполнения клеток. Кроме того, мы оценили качество продуктов hMSC для подтверждения соответствия. Мы также продемонстрировали применение этих растворимых микроносителей для масштабного производства двух других типов ячеек крепления, ячеек HEK293T и клеток Vero, которые широко применяются в отрасли CGT. Пиковая плотность клеток HEK293T клеток достигала 1,68 x 10 7 клеток/мл, тогда как пиковая плотность клеток Vero достигала 1,08 x 107 клеток/мл. Система ACISCP может быть адаптирована для культивирования различных адгезивных клеток, и потенциально она может стать мощной платформой, способствующей ускорению индустриализации CGT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Человеческая пуповина была получена из пекинской больницы Цинхуа Чангэн. Все процедуры и протоколы, касающиеся получения, выделения и культивирования мезенхимальных стволовых клеток пуповины человека (ВЦМСК), проводились с информированного согласия и с одобрения Комитета по этике Пекинской больницы Цинхуа Чангэн (регистрационный номер 22035-4-02), а процедуры и протоколы соответствовали Хельсинкской декларации 1964 года и ее более поздним поправкам или сопоставимым этическим стандартам.
1. Монослойная культура мМСК, HEK293T-клеток и клеток Vero
- Выделяют первичные УКМСК человека из желе Уортона в соответствии с описанным методом21. Используйте безсывороточную (SF) питательную среду hMSC для выделения и отрастания первичных UCMSC, собирайте клетки на пассаже 2 и криоконсервируйте в качестве основного банка клеток (MCB).
- Инокуляцию 6 x10,5 человеческих UCMSC (предпочтительно клетки пассажа 2 или пассажа 3) в одну колбу T75 (т.е. плотность посева на 2D планарных сосудах составляет 8 000 клеток/см2) для монослойной культуры с 15 мл полной питательной среды SF hMSC. Обеспечьте равномерный высев, двигая колбу в виде восьмерки. Культивирование при 37 °C в 5%-ном инкубаторе клеточных культурCO2 до слияния 80%-90%.
- Для сбора урожая сцедите питательную среду и дважды промойте клетки 3-5 мл фосфатно-солевого буфера (PBS). Затем добавьте 2 мл 0,25% трипсина-ЭДТА и инкубируйте при 37 °C в течение 1-2 мин до тех пор, пока большинство клеток не станут круглыми и не отделятся от колбы, как это наблюдается под светлопольным инвертированным микроскопом с 4-кратным объективом. Добавьте 3 мл питательной среды SF hMSC для прекращения пищеварения.
- Переложите клеточную суспензию в коническую центрифужную пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте при 179 x g в течение 5 мин. Сцедите надосадочную жидкость, дважды промойте клеточную гранулу PBS и ресуспендируйте примерно в 3-5 мл питательной среды SF hMSC для посева на микроносители в биореакторах.
ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте жизнеспособность клеток и убедитесь, что они жизнеспособны на >90%. Подготавливайте ячейки только после того, как все подготовительные работы для биореакторов будут завершены (шаги 2.1-3.6). - Для монослойной культуры HEK293T клеток и клеток Vero посев по 2 x 10 6-3 x 106 клеток в каждую колбу T75 и культивирование с DMEM, содержащим 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 10% сыворотки новорожденных телят (NBS) соответственно.
- Выполните шаги 1.3-1.4 для сбора клеток. Ресуспендировать в 3-5 мл DMEM, содержащего 10% FBS.
2. Подготовка биореактора с перемешиванием перед посевом клеток
- На 1-й день тщательно промойте стеклянный сосуд проточной деионизированной (DI) водой один раз.
- Разберите все нержавеющие трубки и крыльчатки с головки, погрузите их в деионизированную воду и обработайте ультразвуковой очистительной машиной при 40 кГц и 60 °C в течение 1 часа для тщательной очистки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка и процедуры будут одинаковыми для расширения первого уровня в биореакторе объемом 5 л и расширения второго уровня в биореакторе объемом 15 л. Параметры биореактора объемом 15 л приведены в скобках. Если в скобках не указаны параметры, то эти параметры одинаковы для биореакторов объемом 5 л и 15 л. - Тщательно убедитесь, что все уплотнительные кольца целы и на месте, а затем установите разобранные детали обратно на головку в соответствии с инструкциями производителя.
ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости замените все изношенные или порванные уплотнительные кольца перед сборкой. Изношенные уплотнительные кольца нарушают герметичность и, следовательно, стерильность сосуда. - Добавьте 7 л (18 л для биореактора 15 л) 0,5 М раствора NaOH в сосуд объемом 5 л и поместите напорную пластину со собранными трубками на край сосуда, чтобы погрузить пробирки в раствор NaOH. Дайте настояться в течение 12 ч или в течение ночи, чтобы удалить эндотоксины из пробирок и стеклянного сосуда.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не превышайте 7 л (18 л), так как это максимальный объем стеклянного сосуда объемом 5 л (15 л). При работе с раствором NaOH надевайте надлежащие средства индивидуальной защиты, так как он вызывает коррозию. - Снимите накладку и перелейте раствор NaOH в подходящую бутылку для отходов. Утилизируйте в соответствии с лабораторными правилами безопасности. Тщательно промойте сосуд, головную пластину и ее части деионизированной водой, не содержащей эндотоксинов, или водой для инъекций, чтобы удалить остатки щелочи.
- Добавьте 2 л (5 л) PBS в сосуд, соберите все детали и прикрутите головную пластину к металлическому каркасу сосуда в соответствии с инструкциями производителя.
- Установите комплект расходных деталей закрытой системы на соответствующие детали/трубки/порты из нержавеющей стали (SS) на головке в соответствии с инструкциями производителя. Зажмите все зажимы Роберта на трубках, а также рекомендуется усилить зажимом гемостатами. Оставьте одну из трубок с вентиляционным фильтром 0,22 мкм на конце, который соединен с конденсатором, незажатой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Наденьте силиконовые трубки на наконечники гемостатов, чтобы не проткнуть силиконовые трубки. Зажимайте только силиконовые трубки и избегайте зажима трубок C-flex, входящих в этот комплект. Если оставить одну трубку на конденсаторе незажатой, это позволит снизить давление во время автоклавирования. - Приготовьте 250 мл 0,1 М раствора NaOH в автоклавируемой стеклянной бутылке GL 45 объемом 500 мл и установите многопортовую завинчивающуюся крышку GL 45 с двумя портами. Подсоедините силиконовую трубку длиной 180 мм, размером 0,13 x 0,25 дюйма (внутренний диаметр x внешний диаметр) к одному из портов на нижней стороне крышки; Длина должна быть достаточно большой, чтобы просто коснуться дна бутылки.
- Подсоедините еще один кусок силиконовой трубки, длиной на 500 мм длиннее предыдущего, к тому же порту на верхней стороне крышки, а другой конец подсоедините к отверстию для капельной подачи на верхней панели сосуда объемом 5 л. Подсоедините вентиляционный фильтр 0,22 мкм к другому порту на завинчивающейся крышке.
- Выполните двухточечную калибровку датчика pH в соответствии с инструкциями производителя. Затем вставьте датчики pH, растворенного кислорода (DO) и количества живых клеток в сосуд в соответствующие порты PG13,5 и плотно прикрутите к накладке.
- Выполните проверку герметичности полностью собранного сосуда в соответствии с инструкциями производителя. Поддерживайте давление 0,4 бар ± 0,01 бар не менее 30 мин. Медленно сбросьте давление после того, как система пройдет испытание. Если испытание на герметичность не удалось, внимательно найдите места утечки и укрепите резервуар в сборе.
- Автоклавируйте полностью собранный сосуд с помощью комплекта расходных материалов при давлении 15 фунтов на квадратный дюйм и температуре 121 °C в течение 60 минут. После автоклавирования проверьте все вентиляционные фильтры, чтобы убедиться, что они целы и сухие. Снимите все гемостаты.
ПРИМЕЧАНИЕ: Фильтр для отвода влажного воздуха не будет эффективно фильтровать газ и может нарушить стерильность сосуда во время культивирования клеток. Замените вентиляционные фильтры, если они влажные, и снова автоклавируйте весь сосуд. - Перенесите автоклавный сосуд в чистое помещение и дождитесь полного остывания до комнатной температуры. Вставьте датчик температуры в трубку защитной гильзы и подсоедините кабели для двигателя, датчика pH и датчика растворенного кислорода от контроллера к соответствующим частям сосуда. Плотно оберните термомат вокруг сосуда.
- Разжмите зажимы Robert на гибких трубках конденсатора выхлопных газов, кольцевого разбрызгивателя, отверстия для капельной подачи NaOH и отверстия для накладки воздуха. Включите контроллер, авторизуйтесь и введите в систему параметры, перечисленные в таблице 1 , согласно инструкции производителя. Эти пробирки не следует зажимать ни в коем случае в процессе культивирования.
- Нажмите « Пуск» и назовите эксперимент для запуска биореактора. Дайте биореактору поработать с этими настройками не менее 12 часов или в течение ночи, чтобы насытить PBS кислородом, чтобы позже выполнить одноточечную калибровку зонда растворенного кислорода.
- Откалибруйте объемную скорость перекачки жидкости насоса 1 и насоса 2 на контроллере биореактора. Установите силиконовую трубку размером 0,13 дюйма x 0,25 дюйма на каждый насос отдельно, при этом один конец трубки погрузите в бутылку с водой, а другой конец трубки вставьте в мерный цилиндр.
- Установите скорость вращения насоса на 300 об/мин и время 1 мин. Обратите внимание на количество воды, подаваемой в мерный цилиндр для обоих насосов. Эти номера понадобятся для последующих шагов.
- Приготовьте 500 мл питательной среды SF hMSC в соответствии с инструкциями производителя и замените крышку флакона со средой для клеточных культур одноразовой крышкой контейнера C-Flex EZ Top и совместимой крышкой. Выполняйте замену колпачка в шкафу биобезопасности (BSC).
- Приварите выпускную трубку на бутылке со средой к входной трубке C-flex на бутылке 10 г предварительно стерилизованных микроносителей W01 для МСК. Установите секцию трубки на насос 1 контроллера биореактора, установите вращение насоса на 300 об/мин и закачайте всю питательную среду из флакона во флакон с микроносителями. Храните эти микроносители при температуре 4 °C до использования на 0-й день.
ПРИМЕЧАНИЕ: Микроносители должны быть подготовлены в 1-й день. Для культуры в биореакторе объемом 15 л подготовьте в общей сложности четыре бутылки (т.е. 40 г с 4 x 500 мл среды SF).
3. Посев, культивирование и сбор урожая клеток в 5-литровом биореакторе с перемешиванием
- На день 0 выполните одноточечную калибровку, а именно 100%, для датчика растворенного кислорода на контроллере биореактора в соответствии с инструкциями производителя. Биореактор с перемешиванием теперь готов к культивированию клеток.
- Подготовьте стеклянную бутылку объемом 2 л (5 л) для сбора отходов, установите на нее завинчивающуюся крышку GL 45 Multiport Connector с двумя портами, с 30 мм, 0,25 дюйма x 0,44 дюйма C-Flex, подключенными к обоим портам, и автоклавом для стерилизации. Приварите трубку C-flex от одного из отверстий от бутылки для отходов к трубке для сбора урожая на верхней пластине сосуда биореактора с помощью трубчатого сварочного аппарата.
- Временно остановите контроль температуры, pH и растворенного кислорода на контроллере биореактора, установите силиконовую трубку, прикрепленную к трубке для сбора урожая, на перистальтический насос 2 в правильном направлении потока жидкости и полностью распределите весь PBS из емкости в бутылку для отходов. Выньте трубку из насоса, запечатайте и отсоедините бутылку для отходов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда снимайте зажимы Robert на гибких трубках, участвующих в потоке жидкости на каждом этапе. Зажмите обратно после завершения перекачки жидкости перед герметизацией и отсоединением. Зажим ближе к боковой стороне оголовья. Разжатие и зажим должны выполняться на всех последующих этапах, если не указано иное. - Приготовьте 7 л (30 л) полной среды SF hMSC и замените каждую оригинальную крышку флакона одноразовой крышкой контейнера C-Flex EZ Top и совместимой крышкой. Приварите одноразовый фильтрующий модуль к одному из портов одноразового мешка для хранения объемом 10 л (50 л). Выполните операцию по замене колпачков внутри BSC.
- Отфильтруйте и перенесите питательную среду в мешок для хранения, по одной бутылке за раз, приварив флаконы с питательной средой к другому концу капсульного фильтра и используя насос на контроллере биореактора. Обозначьте как мешок для корма.
- Приварите одно выпускное отверстие от загрузочного мешка к трубке C-flex на подающей трубке верхней пластины и установите трубку для насоса 1 на контроллере биореактора. Приварите другое выпускное отверстие от загрузочного мешка к спускной трубке и установите трубку для насоса 2 на контроллере биореактора в правильном направлении потока жидкости.
ПРИМЕЧАНИЕ: Установите секцию на линии потока жидкости, изготовленную из силиконовой трубки, на насосе для лучшей стойкости к износу по сравнению с трубками C-Flex. Убедитесь, что трубки установлены в правильном направлении. - Установите скорость насоса 1 на 300 об/мин и остановите насос после дозирования 1 л (5 л) среды из мешка для корма в емкость, исходя из скорости дозирования объема, указанной в шаге 2.17. Снова запустите контроль температуры, pH и растворенного кислорода с теми же настройками, что описаны в шаге 2.14.
- Запечатайте и отсоедините трубку, соединяющую мешок для корма с подающей трубкой на верхней пластине. Приварите трубку C-Flex от бутылки с дисперсными микроносителями, приготовленными на шаге 2.18, к подающей трубке и перекачайте все содержимое из бутылки в сосуд. Запечатайте и отсоедините пустую бутылку суспензии микроносителя. Продезинфицируйте всю поверхность бутылки 75% этанолом и поместите в BSC для использования в качестве бутылки для переноса клеточной суспензии.
ПРИМЕЧАНИЕ: При герметизации и отсоединении одноразовых принадлежностей оставляйте более длинный кусок трубки C-Flex со стороны накладки, так как на следующих этапах на одной и той же трубке будет выполнено несколько этапов сварки и разъединения. - Убедитесь, что температура, отображаемая на контроллере, достигает устойчивого состояния 37 °C, что обычно занимает около 30 минут, прежде чем приступать к подготовке семенных клеток, как показано на шагах 1.3-1.4. Ресуспендировать 2,5 x 108 чМСК в 500 мл среды SF и перенести в пустую бутылку, ранее содержащую суспензию микроносителя.
ПРИМЕЧАНИЕ: Семенные клетки для расширения биореактора объемом 15 л должны быть подготовлены в соответствии с этапом 3.21 с целью посева 1,0 x 109 ячеек в 500 мл. - Приварите трубку C-Flex от бутылки, содержащей клеточную суспензию, к загрузочному отверстию на верхней пластине и перекачайте все содержимое из бутылки в сосуд, чтобы инициировать инокуляцию клеток к микроносителям. Закройте и отсоедините пустую бутылку. Приварите подающее отверстие от загрузочного мешка к подающей трубке на передней пластине.
- Отрегулируйте настройки перемешивания на контроллере, чтобы разрешить прерывистое перемешивание для повышения эффективности посева hMSC, установив следующие параметры: V1 = 35 (30) об/мин/5 мин; V2 = 0 об/мин/25 мин; количество циклов = 12 (24); Конечная скорость перемешивания = 35 (30) об/мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость перемешивания может быть отрегулирована до 40 (35) об/мин или 45 (40) об/мин, если в процессе культивирования наблюдается неравномерное распределение или осаждение микроносителей. - Настройте автоматический режим пополнения и замены среды на контроллере биореактора в интерфейсе Medium Exchange. Задайте параметры культивирования hMSC, как указано в таблице 2.
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе снимите зажимы Роберта с гибких трубок, участвующих в потоке жидкости, особенно для подающей и выпускной трубок. Держите их незажатыми на протяжении всего процесса культивирования. - Возьмите пробы через пробоотборную трубку, подключив одноразовые пакеты для отбора проб через разъемы Люэра в желаемые моменты времени, обычно один раз в день, и аликвотируя 10 мл каждый раз в мешок для отбора проб. Аликвотируйте 2-3 мл образца в первый мешок для отбора проб, выбросьте, а затем каждый раз аликвотируйте фактические 10 мл образца в новый мешок для отбора проб.
ПРИМЕЧАНИЕ: Первоначальный образец объемом 2-3 мл может быть жидкостью, оставшейся в пробирке от предыдущего момента отбора проб, и может не точно отражать состояние в сосуде. Всегда выполняйте эти действия с дополнительными асептическими мерами, дезинфицируя разъемы Луэра до и после создания или разрыва соединений 75% этанолом. - Переложите отобранные образцы в коническую центрифужную пробирку объемом 15 мл. Выполните следующие испытания на образцах.
- Возьмите 200 мкл суспензии микроносителей, насыщенной клетками, и окрасьте с помощью Calcein-AM/PI Cell Double Staining в соответствии с инструкциями производителя. Наблюдение под флуоресцентным микроскопом.
- Осаждение микроносителей происходит под действием силы тяжести, что обычно занимает 5-10 минут. Аспирируйте надосадочную жидкость и проверьте концентрацию глюкозы глюкометром в соответствии с инструкциями производителя. Постройте график уровня глюкозы.
- Инкубируют осажденные микроносители, насыщенные клетками, со свежеприготовленным 3-5 мл раствора для переваривания 1 мг/мл при 37 °C в течение 20-30 мин до полного растворения микроносителей. Подсчитайте количество клеток после окрашивания с помощью AO/PI с помощью автоматизированного анализатора флуоресцентных клеток. Постройте кривую роста клеток. Коррелируйте с кривой роста живых клеток в реальном времени, генерируемой на контроллере.
- На 4-й или 5-й день культивирования приготовьте 50 мл (200 мл) раствора для переваривания в дозе 30 мг/мл. Соотношение рабочей массы между раствором дигеста и растворимыми микроносителями колеблется от 3:20 до 5:20. Стерильный фильтр с капсульным фильтром 0,22 мкм и далее разбавить в 500 мл (2 л) сбалансированного солевого раствора Хэнка (HBSS) с кальцием и магнием. Переложите в одноразовый пакет для хранения объемом 3 л.
ПРИМЕЧАНИЕ: Готовьте раствор для переваривания только непосредственно перед забором клеток. Старайтесь стремиться к тому, чтобы по крайней мере 1,0 x 10 9-1,2 x 109 клеток для расширения первого уровня и 1,0 x10 клеток для расширения второго уровня. Если клетки растут быстрее, собирайте урожай на 4 день; Если нет, собирайте урожай на 5-й день. Не рекомендуется выходить за пределы 5-го дня. - Установите скорость перемешивания на 0 на контроллере, чтобы микроносители осели, что обычно происходит в течение 20 минут. Отключите протокол автоматического обмена сред и остановите контроль температуры, pH и растворенного кислорода на контроллере биореактора. Вручную запустите насос 2 при 300 об/мин на контроллере и выдавите надосадочную жидкость в режим подачи, чтобы оставить около 1 л (2 л) суспензии культуры в сосуде (используя скорость дозирования объема, указанную в шаге 2.17, или измеряя по градуировочным меткам на корпусе сосуда). Запечатайте и полностью отсоедините мешок для корма.
- Приварите пакет со свежеприготовленным раствором для переваривания из шага 3.15 к подающей трубке и перекачайте все содержимое в сосуд. Запустите скорость перемешивания с 45 (40) об/мин. Убедитесь, что регулятор температуры по-прежнему поддерживает температуру на уровне 37 °C. Микроносители растворяются в течение 40-60 минут. Берут 1 мл образца стерильным шприцем с замком Люэра через 30 мин и в дальнейшем каждые 5-10 мин наблюдать под светлопольным микроскопом для проверки растворения микроносителей.
- После того, как микроносители растворятся, приварите один мешок для хранения объемом 3 л (два мешка для хранения объемом 3 л для биореактора объемом 15 л) к трубке для сбора урожая и полностью откачайте клеточную суспензию с помощью насоса 2 при 300 об/мин. Приготовьте 1 л (3,5 л) физиологического раствора, содержащего 1% сывороточного альбумина человека (HSA) в качестве буфера для промывки, и 500 мл полной среды SF (500 мл буфера для криоконсервации клеток, в качестве примера взята рецептура из 10% диметилсульфата (ДМСО) и 90% среды SF) в отдельных одноразовых пакетах для хранения, используя методы и аксессуары, упомянутые в предыдущих шагах для других жидкостей.
- Включите систему обработки клеток, установите одноразовый комплект для обработки клеток на прибор в соответствии с инструкциями производителя, приварите мешки с клеточной суспензией, промывочным буфером и средой SF (буфер для криоконсервации) к набору для обработки одноразовых ячеек и внимательно следуйте всем инструкциям, отображаемым в пользовательском интерфейсе, чтобы инициализировать и проверить целостность и правильную установку набора.
- После завершения установки введите в программное обеспечение параметры, перечисленные в таблице 3 для промывки клеток с промывочным буфером и ресуспензией в среде SF (буфер криоконсервации), чтобы начать процесс промывки и ресуспензии. Вся процедура будет выполняться автоматически с несколькими ручными контрольными точками.
- Возьмите пробу клеток из камеры центрифуги, как указано в системе обработки клеток, и рассчитайте плотность клеток с помощью автоматизированного анализатора клеток в соответствии с инструкциями производителя. Отрегулируйте объем ресуспензии для плотности 2 x 10,6 клеток/мл или максимального общего объема 250 мл.
- Запечатайте и отсоедините пакет для переноса клеток от одноразового набора для обработки клеток после того, как система отсосет клетки из камеры. При необходимости отрегулируйте плотность клеток до 2 x 10,6 клеток/мл с полной средой SF в большем пакете для переноса клеток/пакете для хранения. Это будут затравочные ячейки для расширения второго яруса в 15-литровом биореакторе.
4. Состав, заполнение и отделка ячеек
- Начинайте подготовку 15-литрового биореактора за 1 день до забора клеток из 5-литрового биореактора. Полностью выполните шаги, описанные в разделах 2 и 3 протокола, за исключением параметров для 15 л, указанных в скобках.
- Повторно суспендируйте клетки в 250 мл буфера для криоконсервации, а затем запечатайте и отсоедините пакет для переноса клеток от одноразового набора для обработки клеток после того, как система отсосет клетки из камеры.
- Перенесите 2 000 мл буфера для криоконсервации вместе с 250 мл ресуспендированных клеток с этапа 4.2 в мешок для переноса клеток объемом 3 л. Приварите этот пакет для переноски к одноразовому комплекту расходных материалов Fill&Finish.
ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительный объем используемого здесь буфера для криоконсервации должен определяться спецификацией рецептуры и расчетом общего количества клеток в соответствии с результатами подсчета, полученными на шаге 3.21 - Соберите одноразовый комплект расходных деталей Fill&Finish с системой наполнения ячейки и включите систему предварительного охлаждения в соответствии с инструкциями производителя. Следуйте инструкциям на системе и установите 20 мл / пакет, всего 20 пакетов на партию. Запечатайте и отсоедините эти пакеты от комплекта и следуйте стандартным процедурам криоконсервации. Используйте криогенные мешки.
- Приварите новый комплект из 20 пакетов для криоконсервации к одноразовому комплекту для заполнения и отделки и повторяйте процедуру заполнения и отделки до тех пор, пока все клетки не будут аликвотированы. Следуйте стандартным процедурам для криоконсервации этих клеток.
5. Характеристика качества клеток
- Берут пробы собранных МСК из растворимых микроносителей и используют систему обработки клеток для характеризации методом проточной цитометрии для определения идентичности клеток в соответствии с методами, описанными в литературе18.
- Разморозьте криоконсервированные клетки и переложите их на обычные 2D-колбы или микропланшеты для дальнейшей характеристики клеточных характеристик, включая морфологию клеток и способность к дифференцировке трех линий, следуя методам, описанным в литературе18.
6. HEK293T расширение на микроносителях G02 в биореакторе с перемешиванием
- Подготовьте биореактор объемом 5 л, как указано в шаге 2. Для HEK293T клеток культивируют клетки со стерильными микроносителями G02 вместо W01. Процесс культивирования аналогичен описанному в разделе 3 протокола, хотя некоторые параметры отличаются, как будет подробно описано в следующих шагах. Установите в биореактор специальную перфузионную трубку взамен дренажной трубки, так как перфузия необходима для культивирования HEK293T клеток.
- В отличие от протокола, подробно описанного в разделе 3 протокола, готовят 20 г микроносителей G02 (т.е. две бутылки) в DMEM с 10% FBS для 5-литрового биореактора, при этом объем культуры на 0-й день устанавливается равным 3,5 л (т.е. конечная концентрация около 5,71 г/л). Дозируют 2 л среды в сосуд перед двумя флаконами с микроносителями G02 и высевают 500 мл 1,75 x 109 HEK293T клеток (т. е. при конечной плотности 5 x 105 клеток/мл).
- Проводят режим перемешивания и режим обмена среды (в зависимости от количества среды, которое необходимо заменить в день, выраженного в объеме культуры в день, CVD), который отличается от раздела 3 протокола и подробно описан в таблице 4.
ПРИМЕЧАНИЕ: Активируйте насос 1 и насос 2 вручную, чтобы оба могли непрерывно перекачивать для перфузии. Регулируйте скорость насоса каждый день, чтобы она соответствовала скорости перфузии на основе калибровки скорости дозирования объема насосов. Обычно это будет однозначный диапазон. Для HEK293T клеток используйте свежую среду в качестве корма и полностью выбрасывайте отработанную среду в мусорную бутылку, в отличие от МСК, для которых среда циркулирует. - Для расширения второго яруса до биореактора объемом 15 л используйте перенос HEK293T ячеек из шарика в гранулу вместо полного растворения микроносителей, как это используется с МСК. В частности, прекратите перемешивание для осаждения микроносителей после достижения желаемой плотности клеток, а затем отсасывайте как можно больше надосадочной жидкости из перфузионной трубки, подайте PBS в 3 раза больше объема оставшейся суспензии для промывания микроносителей и повторите три раза. Аспирируйте и выбросьте как можно больше PBS при окончательной стирке.
- Введите 3,5 л 1x рекомбинантного трипсина, чтобы отделить клетки от микроносителей, в то время как микроносители G02 останутся нетронутыми. Установите температуру 37 °C и скорость перемешивания 60 об/мин. Прекратите отслоение в течение 45 мин, когда отслоится более 80% клеток, при равном количестве полной среды.
- Перекачка непосредственно из порта сбора урожая в подготовленный резервуар объемом 15 л для расширения второго яруса.
7. Расширение клеток Vero на микроносителях V01 в биореакторе с перемешиванием
- Микроносители V01 получают путем переноса лиофилизированных микроносителей в сосуд биореактора вместе с PBS до концентрации 20 мг/мл. Соберите и простерилизуйте сосуд, как указано в разделе 2 протокола, но вместо этого в автоклаве в течение 30 минут.
- После стерилизации микроносители V01 естественным образом оседают. Замените надосадочную жидкость на основной DMEM два раза, используя дренажную и питательную трубки, и добавьте полный DMEM, содержащий 10% NBS, в 50%-75% объема сосуда, прежде чем перейти к разделу протокола 3 для посева и культивирования клеток.
- В отличие от протокола, подробно описанного в разделе 3 протокола, используйте 24 г микроносителей V01 для культуры клеток Vero объемом 4 л (т. е. конечная концентрация 6 г/л) и инокуляция 500 мл клеток 4 x 109 клеток Vero (т. е. при конечной плотности 1 x 106 клеток/мл).
- Выполните шаги 6.3-6.6 для параметров процесса культивирования и перехода на расширение второго уровня в биореакторе с перемешиванием объемом 15 л.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Платформа ACISCP представляет собой полностью закрытую систему, в которой используется ряд биореакторов с перемешиванием для расширения масштабирования, система обработки клеток для автоматизированного сбора и составления клеточных формулировок, а также система наполнения клеток (рис. 1). Адгезивные клетки прикрепляются к пористым микроносителям, которые могут быть диспергированы в биореакторе, таким образом достигая суспензионного культивирования адгезивных клеток.
В соответствии с описанным протоколом, 2,5 x 108 hMSC с 10 г микроносителей W01 сначала инокулировали в 5-литровый биореактор с перемешиванием для первоначального расширения. Около 2,9 x 10 9 клеток были концентрированы и промыты системой обработки клеток на 4-й день, из которых 1,0 x 109 собранных клеток были помещены в 15-литровый биореактор с перемешиванием с 40 г микроносителей W01 для второй фазы культивирования. В конце концов, 1,1 x 10 10 МСК были собраны, составлены и аликвотированы в более чем70 мешков с рецептурами на 9-й день (Рисунок 2A). Количество клеток, жизнеспособность и потребление глюкозы контролировали ежедневно (рис. 2B, C). Достигнуто кумулятивное расширение в 128 раз; При этом жизнеспособность клеток поддерживалась на уровне выше 90%. Потребление глюкозы продемонстрировало отрицательную корреляцию с расширением клеток, показывая метаболизм, связанный со здоровым ростом клеток.
Растворимые пористые микроносители могут быть предварительно стерилизованы и поставляются в одноразовой закрытой системной упаковке, подходящей для GMP (Рисунок 3A). Клетки могут прикрепляться к поверхности микроносителей и внутренней стенке макропор (рис. 3Б). С помощью флуоресцентного красителя, такого как Calcein-AM/PI Cell Double Staining Kit, можно визуализировать клетки внутри пористых микросфер (рис. 3C). Слияние изображений светлого поля с флуоресцентными изображениями помогло проанализировать равномерность распределения клеток. Окрашивание живых клеток также показало сильную связь с подсчетом клеток, измеренным либо с помощью ручного отбора проб, либо с помощью онлайн-датчика для подсчета живых клеток.
В дополнение к огромному спросу на большое количество клеток, необходимы оценки критических характеристик качества (CQA) и тесты на высвобождение МСК, поскольку без них клетки не могли бы быть стерилизованы или тщательно очищены после культивирования. Чтобы гарантировать качество клеток, на каждом этапе платформы ACISCP можно отбирать образцы МСК, расширенные в 3D-диапазоне. МСК, только что собранные с платформы ACISCP, сохраняли классические фенотипические маркеры22 с экспрессией >95% и <2% для положительных маркеров (CD73, CD90, CD105) и отрицательных маркеров (HLA-DR, CD34, CD45, CD19, CD14) соответственно (рис. 4A). Криоконсервированные клетки размораживали и инокулировали в 2D-плоскую колбу и показали хорошую адгезию, нормальное расширение (рис. 4B) и типичную форму веретена со спиральным ростом (рис. 4C). Кроме того, клетки также сохранили свою способность дифференцироваться в остеогенную, адипогенную и хондрогенную линии (рис. 4D).
Кроме того, на платформе ACISCP были протестированы HEK293T клетки и клетки Vero. Для HEK293T клеточной культуры концентрация инокулятивных клеток составляла 5 х 10 5 кл/мл в 5-литровом биореакторе. После процесса переноса шарика в гранулу пиковая концентрация клеток достигала 1,68 x 107 клеток/мл в биореакторе объемом 15 л (рис. 5A), а HEK293T клетки сохраняли высокую жизнеспособность (рис. 5B). Для клеточной культуры Vero концентрация инокулятивных клеток составляла 2 x 10 5 клеток/мл в биореакторе объемом5 л. После процесса переноса шарика в гранулу достигнутая пиковая концентрация клеток составила 1,08 x 107 клеток/мл в биореакторе объемом 15 л (Рисунок 6A), а клетки Vero также сохраняли высокую жизнеспособность (Рисунок 6B).
Рисунок 1: Схематическая дорожная карта производства hMSC с помощью платформы ACISCP. Эта цифра была изменена из опубликованной литературы18. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Расширение клеток МСК с помощью платформы ACISCP. (A) Платформа ACISCP состоит из серии биореакторов с перемешиванием, системы обработки клеток и системы наполнения клеток. (В) Кривая роста МСК в двухуровневом процессе расширения, (В) и скорость потребления глюкозы в процессе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Характеристика роста hMSC на микроносителе W01. Эта цифра была изменена из опубликованной литературы18. (A) Микроносители W01 поставляются в одноразовой закрытой упаковке. (B) Изображения с помощью сканирующего электронного микроскопа пустых микроносителей и микроносителей, культивируемых адгезивными МСК. Белые треугольные головки указывают на клетки на поверхности микроносителей; масштабная линейка = 100 мкм. (C) Репрезентативные объединенные светлопольные и флуоресцентные (окрашивание живых клеток) изображения МСК, культивируемых на микроносителях, с 1-го по 4-й день; Масштабная линейка = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Оценка идентичности клеток МСК, полученных с помощью платформы ACISCP . (А) Поверхностные маркеры МСК характеризовали методом проточной цитометрии. Критериям соответствовали все положительные маркеры (>95%) и отрицательные (<2%). (B) Криоконсервированные 3D-расширенные МСК демонстрировали нормальное расширение после размораживания и повторного нанесения покрытия на 2D-колбы. (C) Морфология 3D-расширенных МСК МСК; Масштабная линейка = 50 мкм. (D) Трехлинейная дифференциация 3D-расширенных МСК. Остеогенные, адипогенные и хондрогенные способности оценивали с помощью окрашивания ализариновым красным, масляным красным и алциановым синим соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Расширение HEK293T ячеек с помощью платформы ACISCP. (A) HEK293T плотность клеток в биореакторах объемом 5 л и 15 л. (B) Изображение в светлом поле (BF), окрашенное кальцеином-AM (живое) и окрашенное PI (мертвое) HEK293T клеток, культивируемых на микроносителях G02; Масштабная линейка = 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Расширение клеток Vero с помощью платформы ACISCP . (A) Плотность клеток Vero в биореакторах объемом 5 л и 15 л. (B) Светлопольное (BF) изображение, окрашенные кальцеином-AM (живые) и PI-окрашенные (мертвые) клетки Vero, культивируемые на микроносителях V01; Масштабная линейка = 400 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Таблица 1: Настройки параметров биореактора с перемешиванием. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.
Таблица 2: Настройки параметров автоматизированного обмена сред для культивирования hMSC. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.
Таблица 3: Настройки параметров клеточной процессинговой системы для пассажа и формирования МСК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.
Таблица 4: Режим обмена среды и режим перемешивания для ячеек HEK293T и Vero. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Как иммунотерапия, так и терапия стволовыми клетками используют живые клетки в качестве лекарств; Однако их конечные продукты не должны очищаться или стерилизоваться так же, как малые молекулы или вирусы. Таким образом, принцип качества по проектированию (QbD) всегда должен иметь в виду и применяться на практике к процессу химического производства и контроля (CMC) при производстве клеток23. Полностью закрытая система культивирования клеток, а также система обработки и система наполнения предпочтительно рассматриваются для удовлетворения требований. В данном исследовании мы представили протокол использования платформы ACISCP на основе растворимых и пористых 3D-микроносителей GMP-класса для выполнения двухуровневого расширения hMSCs. Некоторые исследователи изучали возможность использования биореакторов вместе с микроносителями для увеличения МСК in vitro, но большинство опубликованных исследований показали, что увеличение масштаба приведет к снижению выхода МСК с 6,1 x 10 5 клеток/мл или даже 12,5 x 10 5 клеток/мл в 100 мл рабочего объема до 2,7 x 105 клеток/мл в 2 л рабочего объема24, 25,26. Несмотря на то, что биореакторы с перемешиванием обладают высочайшей масштабируемостью, следуеттщательно рассмотреть такие ключевые вопросы, как структурные характеристики сосуда, тип рабочего колеса, скорость наконечника, объемный коэффициент массообмена, kLa, кислорода и мощностное число. В отличие от предыдущих биореакторов с перемешиванием, которые обычно разрабатывались для культивирования микробов или одомашненных клеток, не зависящих от якорных якорей, таких как клетки CHO, биореактор, используемый в этом исследовании, был специально разработан для культуры на основе микроносителей и, таким образом, способен удовлетворить различные технологические потребности стратегий обмена питательными веществами. В дополнение к различиям в процессе культивирования клеток, платформа ACISCP использует систему обработки клеток на основе центрифуги с непрерывным потоком вместе с системой заполнения клеток, в отличие от обычных процедур сбора большого количества клеток, выполняемых путем многократной ручной работы, что гарантирует высокую эффективность обработки. Современные автоматизированные устройства имеют высокий выход при односерийном производстве.
Большинство стволовых клеток зависят от якорной привязки; Таким образом, им требуются микроносители для производства клеток. Как правило, предыдущие коммерческие микроносители были разработаны таким образом, чтобы использовать различные характеристики поверхности, что позволяет достичь различных чисел сгиба расширения ячеек. В предыдущих исследованиях использование микроносителей Cytodex типа 1 для МСК костного мозга свиней приводило к плотности клеток около 4 x 105 клеток/мл, в то время как использование покрытого желатином Cytodex типа 3 производило количество клеток, сопоставимое с МСК плаценты человека27. Тем не менее, Цитодекс типа 1 и типа 3 не растворяются, и, таким образом, процесс трипсинизации во время забора клеток влияет не только на выход клеток, но и на их жизнеспособность и качество. Таким образом, нет успешных примеров использования обычных микроносителей для продуктов CGT, когда клетки, как конечные продукты, не могут подвергаться обширным последующим процессам очистки для устранения загрязнения нерастворимыми микроносителями28. В отличие от них, микроносители W01 полностью растворимы, что означает, что клеточные продукты могут быть легко собраны путем деградации микроносителя. Этот микроноситель также поставляется в полностью закрытой системной упаковке, что означает, что рабочий процесс, соответствующий требованиям GMP, может быть легко достигнут. Мы показали, что пассаж с двухуровневым процессом расширения может быть легко достигнут с помощью микроносителей W01, и за одну партию можно получить до 1,1 x10 10 клеток; действительно, это могло быть достигнуто только в 50-литровых биореакторах в предыдущих сообщениях29,30. В этой работе пиковая плотность клеток внутри биореактора с перемешиванием достигала примерно 11,6 x 10,5 клеток/мл перед сбором урожая. Таким образом, можно было бы ожидать, что с биореактором объемом 100-200 л на платформе ACISCP можно было бы легко достичь 1 x 1011 ячеек на партию, что означало бы, что тысяча партий в год могла бы легко удовлетворить спрос на 300 триллионов hMSC каждый год.
Поскольку клетки имеют различные характеристики, производятся различные типы 3D-микроносителей, которые доступны для тестирования совместимости между конкретной клеткой и микроносителем. Для неклеточных конечных продуктов в ВКТ масштабирование на основе микроносителей для HEK293T клеток и клеток Vero в биореакторах достигло 1,5 x 10 6 клеток/мл и 3,3 x 106 клеток/мл соответственно31. Мы использовали растворимые пористые микроносители G02 и V01 в платформе ACISCP для расширения клеток HEK293T и Vero соответственно, и пиковая плотность клеток обеих клеток достигала более 1 x 107 клеток/мл. Кроме того, разлагаемость 3D-микроносителей может быть полезна для производства биопродуктов внутриклеточных вирусов, так как клетки могут быть легко отделены от микроносителей. Важно отметить, что платформа ACISCP представляет собой новый процесс биопроизводства, отвечающий требованиям как к количеству, так и к качеству продуктов клеточной и генной терапии. Мы ожидаем, что наша крупномасштабная платформа для производства клеток будет выступать в качестве важного инструмента для разработки клеточной и генной терапии.
Несмотря на преимущества платформы, о которых говорилось выше, в будущем еще предстоит обойти ряд ограничений. Во-первых, биореакторы, используемые на платформе ACISCP в нынешнем виде, по-прежнему оснащены стеклянными резервуарами, которые требуют сложных процедур промывки и проверки очистки на соответствие критериям GMP. Система одноразового биореактора с перемешиванием может быть использована в будущем для производства неповрежденного набора одноразовых комплектов расходных материалов. Во-вторых, в отличие от одомашненных клеточных линий, МСК являются первичными клеточными штаммами, выделенными из отдельных доноров и различных тканей, что означает, что МСК демонстрируют гетерогенность. Таким образом, протокол, описанный в этом документе, служит справочным материалом, в то время как для достижения технической миграции платформы ACISCP требуется систематическая разработка процессов. В-третьих, несмотря на то, что наши коллеги предварительно проверили возможность получения вируса осповакцины с помощью клеток Vero32, еще предстоит выяснить, могут ли быть достигнуты хорошие показатели вирусной продукции при 3D-расширении HEK293T клеток. В заключение следует отметить, что крупномасштабный метод производства ячеек платформы ACISCP, основанный на растворимых пористых микроносителях и серии автоматизированных замкнутых систем, дает возможность повысить эффективность производства и усовершенствовать контроль качества в промышленных масштабах для производства продуктов CGT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Y.D. является научным консультантом, а H.X., Y.Z., L.G., M.L., Y.Y., W.L. и X.Y. являются сотрудниками Beijing CytoNiche Biotechnology Co. Ltd. Другие авторы не имеют коммерческого, имущественного или финансового интереса к продуктам или компаниям, описанным в этой статье. Все остальные авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.
Acknowledgments
Работа выполнена при финансовой поддержке Национального научного фонда выдающихся молодых ученых (82125018).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin EDTA | BasalMedia | S310JV | Used for 2D cell harvest. |
| 3D FloTrix Digest | CytoNiche Biotech | R001-500 | This is a reagent that specifically dissolves 3D TableTrix microcarriers. |
| 3D FloTrix MSC Serum Free Medium | CytoNiche Biotech | RMZ112 | This is a serum-free,animal-free medium for mesenchymal stem cell expansion and maintenance in 2D planar culture as well as 3D culture on 3D TableTrix microcarriers. |
| 3D FloTrix Single-Use Filtration Module | CytoNiche Biotech | R020-00-10 | This module contains 0.22 μm capsule filters used for filtration of culture medium and digest solution. |
| 3D FloTrix Single-Use Storage Bag (10 L) | CytoNiche Biotech | R020-00-03 | Used as feed bag for 5 L bioreactor. |
| 3D FloTrix Single-Use Storage Bag (3 L) | CytoNiche Biotech | R020-00-01 | Used as cell seeding or transfer bags. |
| 3D FloTrix Single-Use Storage Bag (50 L) | CytoNiche Biotech | R020-00-04 | Used as feed bag for 15 L bioreactor. |
| 3D FloTrix vivaPACK Disposable Fill&Finish Consumable Kit | CytoNiche Biotech | PACK-01-01 | This is a standard kit adapted to 3D vivaPACK fill and finish system. |
| 3D FloTrix vivaPACK fill and finish system for cells | CytoNiche Biotech | vivaPACK | This system is a closed liquid handling device, with automated mixing and gas exhausting functions. Cells resuspended in cryopreservation buffer can be rapidly and evenly aliquoted into 20 bags per batch. |
| 3D FloTrix vivaPREP PLUS cell processing system | CytoNiche Biotech | vivaPREP PLUS | This system is a continuous flow centrifuge-based device.Cells can be concentrated, washed, and resuspended under completely closed procedures. |
| 3D FloTrix vivaPREP PLUS Disposable Cell Processing Kit | CytoNiche Biotech | PREP-PLUS-00 | This is a standard kit adapted to 3D vivaPREP PLUS cell processing. |
| 3D FloTrix vivaSPIN bioreactor 15 L | CytoNiche Biotech | FTVS15 | This bioreactor product employs a controller, a 15 L glass stirred-tank vessel, and assessories. A special perfusion tube is available. |
| 3D FloTrix vivaSPIN bioreactor 5 L | CytoNiche Biotech | FTVS05 | This bioreactor product employs a controller, a 5 L glass stirred-tank vessel, and assessories.A special perfusion tube is available. |
| 3D FloTrix vivaSPIN Closed System Consumable Pack (10/15 L) | CytoNiche Biotech | R020-10-10 | This is a standard tubing kit adapted to 3D vivaSPIN bioreactor 15 L, containing sampling bags. |
| 3D FloTrix vivaSPIN Closed System Consumable Pack (2/5 L) | CytoNiche Biotech | R020-05-10 | This is a standard tubing kit adapted to 3D vivaSPIN bioreactor 5 L, containing sampling bags. |
| 3D TableTrix microcarriers G02 | CytoNiche Biotech | G02-10-10g | These porous and degradable microcarriers are suitable for HEK293T cell culture. They come pre-sterilized in 10g/bottle with C-Flex tubings for welding to tubes on bioreactors. |
| 3D TableTrix microcarriers V01 | CytoNiche Biotech | V01-100-10g | These porous and degradable microcarriers are suitable for adherent cell culture, they come as non-sterilized microcarriers that need to be autoclaved in PBS before use. They are especially suitable for vaccine production. |
| 3D TableTrix microcarriers W01 | CytoNiche Biotech | W01-10-10g (single-use packaging); W01-200 (tablets) |
These porous and degradable microcarriers are suitable for adherent cell culture, especially for cells that need to be harvested as end products. They come pre-sterilized in 10g/bottle with C-Flex tubings for welding to tubes on bioreactors.The product has obtained 2 qualifications for pharmaceutical excipients from CDE, with the registration numbers of [F20200000496; F20210000003]. It has also received DMF qualification for pharmaceutical excipients from FDA, with the registration number of [DMF:35481] |
| APC anti-human CD45 Antibody | BioLegend | 368512 | Used in flow cytometry for MSC identity assessment |
| Calcein-AM/PI Double Staining Kit | Dojindo | C542 | Calcein-AM/PI Double Staining Kit is utilized for simultaneous fluorescence staining of viable and dead cells. This kit contains Calcein-AM and Propidium Iodide (PI) solutions, which stain viable and dead cells, respectively. |
| Cap for EZ Top Container Closures for NALGENE-containers (500mL) | Saint-Gobain | CAP-38 | Brands and catalogue numbers are only for example, similar products are available from various suppliers and as long as they have the same functionality, items could be substituted with other brands. |
| C-Flex Tubing, Formulation 374 (0.25 in x 0.44 in) | Saint-Gobain | 374-250-3 | Used for tube welding and disconnection. |
| CryoMACS Freezing Bag 50 | Miltenyi Biotec | 200-074-400 | Used for expanding the 3D FloTrix vivaPACK Disposable Fill&Finish Consumable Kit. |
| Dimethyl Sulfate (DMSO) | Sigma | D2650-100mL | Used for preparation of cryopreservation solution. |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | BasalMedia | L120KJ | Used for cultivation of HEK293T and Vero cells. |
| DURAN Original GL 45 Laboratory bottle (2 L) | DWK life sciences | 218016357 | Used for waste collection from the 5 L bioreactor. |
| DURAN Original GL 45 Laboratory bottle (5 L) | DWK life sciences | 218017353 | Used for waste collection from the 15 L bioreactor. |
| DURAN Original GL 45 Laboratory bottle (500 mL) | DWK life sciences | 218014459 | Used for supplementary bottle of 0.1 M NaOH. |
| EZ Top Container Closures for NALGENE-containers (500mL) | Saint-Gobain | EZ500 ML-38-2 | Brands and catalogue numbers are only for example, similar products are available from various suppliers and as long as they have the same functionality, items could be substituted with other brands. |
| Fetal bovine serum (FBS) superior quality | Wisent | 086-150 | Used for cultivation of HEK293T cells. |
| FITC anti-human CD14 Antibody | BioLegend | 301804 | Used in flow cytometry for MSC identity assessment. |
| FITC anti-human CD34 Antibody | BioLegend | 343504 | Used in flow cytometry for MSC identity assessment. |
| FITC anti-human CD90 (Thy1) Antibody | BioLegend | 328108 | Used in flow cytometry for MSC identity assessment. |
| Flow cytometry | Beckman Coulter | CytoFLEX | Used for cell identity assessment. |
| Fluorescence Cell Analyzer | Alit life science | Countstar Rigel S2 | Used for cell counting. Cell viability can be calculated by staining with AO/PI dyes. |
| GL 45 Multiport Connector Screw Cap with 2 ports | DWK life sciences | 292632806 | Brands and catalogue numbers are only for example, similar products are available from various suppliers and as long as they have the same functionality, items could be substituted with other brands. |
| Glucose Meter | Sinocare | 6243578 | Used for detecting glucose concentration in cell culture medium and supernatant. |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), with calcium and magnesium | Gibco | 14025092 | Used for preparation of digest solution. |
| Human Albumin 20% Behring (HSA) | CSL Behring | N/A | Used for preparation of wash buffer. |
| Inverted fluorescent microscope | OLYMBUS | CKX53SF | Used for brifgt field and fluorescent observation and imaging. |
| Nalgene Measuring Cylinder (500 mL) | Thermo Scientific | 3662-0500PK | Used for calibrating the liquid handling volume speed of peristaltic pumps. |
| Newborn calf serum (NBS) superfine | MINHAI BIO | SC101.02 | Used for cultivation of Vero cells. |
| OriCell human mesenchymal stem cell adipogenic differentiation and characterization kit | Cyagen | HUXUC-90031 | Used for tri-lineage differentiation of hUCMSCs. |
| OriCell human mesenchymal stem cell chondrogenic differentiation and characterization kit | Cyagen | HUXUC-90041 | Used for tri-lineage differentiation of hUCMSCs. |
| OriCell human mesenchymal stem cell osteogenic differentiation and characterization kit | Cyagen | HUXUC-90021 | Used for tri-lineage differentiation of hUCMSCs. |
| PE anti-human CD105 Antibody | BioLegend | 800504 | Used in flow cytometry for MSC identity assessment. |
| PE anti-human CD19 Antibody | BioLegend | 302208 | Used in flow cytometry for MSC identity assessment. |
| PE anti-human CD73 (Ecto-5'-nucleotidase) Antibody | BioLegend | 344004 | Used in flow cytometry for MSC identity assessment. |
| PE anti-human HLA-DR Antibody | BioLegend | 307605 | Used in flow cytometry for MSC identity assessment. |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Wisent | 311-010-CL | Used in autoclaving of glass vessel and V01 microcarriers, and replacement of culture medium. |
| Sani-Tech Platinum Cured Sanitary Silicone Tubing (0.13 in x 0.25 in) | Saint-Gobain | ULTRA-C-125-2F | Used for solution transfering driven by peristaltic pumps. |
| Sterile Saline | Hopebiol | HBPP008-500 | Used for preparation of wash buffer. |
| Trypzyme Recombinant Trypsin | BasalMedia | S342JV | This reagent is used for bead-to-bead transfer of HEK293T and Vero cells. |
| Tube Sealer | Yingqi Biotech | Tube Sealer I | This sealer is compatible with both C-Flex tubing and PVC tubing. |
| Tube Welder for PVC tubing | Chu Biotech | Tube Welder Micro I | Used for welding of PVC tubing. |
| Tube Welder for TPE tubing | Yingqi Biotech | Tube Welder I-V2 | Used for welding of TPE tubing. |
| ViaStain AO / PI Viability Stains | Nexcelom | CS2-0106-25mL | Dual-Fluorescence Viability, using acridine orange (AO) and propidium iodide (PI), is the recommended method for accurate viability analysis of primary cells, such as PBMCs, and stem cells in samples containing debris. |
References
- Golchin, A., Farahany, T. Z. Biological products: Cellular therapy and FDA approved products. Stem Cell Reviews and Reports. 15 (2), 166-175 (2019).
- Young, C. M., Quinn, C., Trusheim, M. R. Durable cell and gene therapy potential patient and financial impact: US projections of product approvals, patients treated, and product revenues. Drug Discovery Today. 27 (1), 17-30 (2022).
- Elverum, K., Whitman, M. Delivering cellular and gene therapies to patients: solutions for realizing the potential of the next generation of medicine. Gene Therapy. 27 (12), 537-544 (2020).
- Blache, U., Popp, G., Dünkel, A., Koehl, U., Fricke, S. Potential solutions for manufacture of CAR T cells in cancer immunotherapy. Nature Communications. 13 (1), 5225 (2022).
- Lee, B., et al. Cell culture process scale-up challenges for commercial-scale manufacturing of allogeneic pluripotent stem cell products. Bioengineering. 9 (3), 92 (2022).
- Emerson, J., Glassey, J. Bioprocess monitoring and control: Challenges in cell and gene therapy. Current Opinion in Chemical Engineering. 34, 100722 (2021).
- Robb, K. P., Fitzgerald, J. C., Barry, F., Viswanathan, S. Mesenchymal stromal cell therapy: progress in manufacturing and assessments of potency. Cytotherapy. 21 (3), 289-306 (2019).
- Olsen, T. R., Ng, K. S., Lock, L. T., Ahsan, T., Rowley, J. A. Peak MSC-Are we there yet. Frontiers in Medicine. 5, 178 (2018).
- Roots Analysis. Stem Cell Therapy Contract Manufacturing (CMO) Market, 2019 - 2030. , Available from: https://www.rootsanalysis.com/reports/view_document/stem-cell-therapy-contract-manufacturing-market-2019-2030/271.html (2019).
- Elseberg, C. L., et al. Microcarrier-based expansion process for hMSCs with high vitality and undifferentiated characteristics. The International Journal of Artificial Organs. 35 (2), 93-107 (2012).
- de Soure, A. M., Fernandes-Platzgummer, A., Silva, da, L, C., Cabral, J. M. Scalable microcarrier-based manufacturing of mesenchymal stem/stromal cells. Journal of Biotechnology. 236, 88-109 (2016).
- Rafiq, Q. A., Coopman, K., Nienow, A. W., Hewitt, C. J. Systematic microcarrier screening and agitated culture conditions improves human mesenchymal stem cell yield in bioreactors. Biotechnology Journal. 11 (4), 473-486 (2016).
- Tavassoli, H., et al. Large-scale production of stem cells utilizing microcarriers: A biomaterials engineering perspective from academic research to commercialized products. Biomaterials. 181, 333-346 (2018).
- Mizukami, A., et al. Technologies for large-scale umbilical cord-derived MSC expansion: Experimental performance and cost of goods analysis. Biochemical Engineering Journal. 135, 36-48 (2018).
- Yan, X., et al. Dispersible and dissolvable porous microcarrier tablets enable efficient large-scale human mesenchymal stem cell expansion. Tissue Engineering. Part C, Methods. 26 (5), 263-275 (2020).
- Carletti, E., Motta, A., Migliaresi, C. Scaffolds for tissue engineering and 3D cell culture. 3D Cell Culture: Methods and Protocols. Haycock, J. W. , Humana Press. Totowa, NJ. 17-39 (2011).
- Loh, Q. L., Choong, C. Three-dimensional scaffolds for tissue engineering applications: Role of porosity and pore size. Tissue Engineering. Part B Reviews. 19 (6), 485-502 (2013).
- Zhang, Y., et al. GMP-grade microcarrier and automated closed industrial scale cell production platform for culture of MSCs. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 16 (10), 934-944 (2022).
- NMPA. Pharmaceutical Excipient Registration Database: Microcarrier tablets for cells. Center for Drug Evaluation. , Available from: https://www.cde.org.cn/main/xxgk/listpage/ba7aed094c29ae314670a3563a716e (2023).
- List of Drug Master Files (DMFs). US Food and Drug Administration. , Available from: https://www.fda.gov/drug-mater-files-dmfs/list-drug-master-files-dmfs (2023).
- Beeravolu, N., et al. Isolation and characterization of mesenchymal stromal cells from human umbilical cord and fetal placenta. Journal of Visualized Experiments. (122), e55224 (2017).
- Xie, Y., et al. The quality evaluation system establishment of mesenchymal stromal cells for cell-based therapy products. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 176 (2020).
- Maillot, C., Sion, C., De Isla, N., Toye, D., Olmos, E. Quality by design to define critical process parameters for mesenchymal stem cell expansion. Biotechnology Advances. 50, 107765 (2021).
- Silva Couto, P., et al. Expansion of human mesenchymal stem/stromal cells (hMSCs) in bioreactors using microcarriers: Lessons learnt and what the future holds. Biotechnology Advances. 45, 107636 (2020).
- Chen, S., et al. Facile bead-to-bead cell-transfer method for serial subculture and large-scale expansion of human mesenchymal stem cells in bioreactors. Stem Cells Translational Medicine. 10 (9), 1329-1342 (2021).
- Tsai, A. C., Pacak, C. A. Bioprocessing of human mesenchymal stem cells: From planar culture to microcarrier-based bioreactors. Bioengineering. 8 (7), 96 (2021).
- Hewitt, C. J., et al. Expansion of human mesenchymal stem cells on microcarriers. Biotechnology Letters. 33 (11), 2325-2335 (2011).
- Mawji, I., Roberts, E. L., Dang, T., Abraham, B., Kallos, M. S. Challenges and opportunities in downstream separation processes for mesenchymal stromal cells cultured in microcarrier-based stirred suspension bioreactors. Biotechnology and Bioengineering. 119 (11), 3062-3078 (2022).
- Schirmaier, C., et al. Scale-up of adipose tissue-derived mesenchymal stem cell production in stirred single-use bioreactors under low-serum conditions. Engineering in Life Sciences. 14 (3), 292-303 (2014).
- Lawson, T., et al. Process development for expansion of human mesenchymal stromal cells in a 50L single-use stirred tank bioreactor. Biochemical Engineering Journal. 120, 49-62 (2017).
- Yang, J., et al. Large-scale microcarrier culture of HEK293T cells and Vero cells in single-use bioreactors. AMB Express. 9 (1), 70 (2019).
- Fang, Z., et al. Development of scalable vaccinia virus-based vector production process using dissolvable porous microcarriers. 25th Annual Meeting of the American Society of Gene & Cell Therapy. Molecular Therapy. 30, 195-196 (2022).
