Storskalig cellproduktion baserad på upplösbara porösa mikrobärare av GMP-kvalitet

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att uppnå storskalig tillverkning av vidhäftande celler genom ett helt slutet system baserat på upplösbara mikrobärare av GMP-kvalitet. Odlingen av humana mesenkymala stamceller, HEK293T-celler och Vero-celler validerades och uppfyllde både kvantitetskrav och kvalitetskriterier för cell- och genterapiindustrin.

Abstract

Forskare inom cell- och genterapiindustrin (CGT) har länge stått inför en formidabel utmaning i den effektiva och storskaliga expansionen av celler. För att ta itu med de primära bristerna i det tvådimensionella (2D) plana odlingssystemet utvecklade vi innovativt en automatiserad plattform för produktion av celler i industriell skala (ACISCP) baserad på en GMP-klassad, upplösbar och porös mikrobärare för 3D-odling av vidhäftande celler, inklusive humana mesenkymala stam-/stromaceller (hMSC), HEK293T-celler och Vero-celler. För att uppnå storskalig expansion genomfördes en tvåstegsexpansion med 5 L och 15 L omrörda tankbioreaktorer för att ge 1,1 x 10¹⁰ hMSC med en total 128-faldig expansion inom 9 dagar. Cellerna skördades genom att helt lösa upp mikrobärarna, koncentrerades, tvättades och formulerades med ett centrifugbaserat cellbearbetningssystem med kontinuerligt flöde och aliciterades sedan med ett cellfyllningssystem. Jämfört med 2D-plan kultur finns det inga signifikanta skillnader i kvaliteten på hMSC som skördas från 3D-kultur. Vi har också applicerat dessa upplösbara porösa mikrobärare på andra populära celltyper inom CGT-sektorn; specifikt har HEK293T celler och Vero-celler odlats till toppcelldensiteter på 1,68 x 10 7 celler/ml respektive 1,08 x 10⁷ celler/ml. Denna studie ger ett protokoll för att använda en bioprocessteknisk plattform som utnyttjar egenskaperna hos GMP-upplösbara mikrobärare och avancerad sluten utrustning för att uppnå industriell tillverkning av vidhäftande celler.

Introduction

CGT-industrin har bevittnat en exponentiell expansion under de senaste två decennierna. Utvecklingen av nästa generations läkemedel förväntas behandla och bota många refraktära sjukdomar¹. Sedan det första godkännandet från Food and Drug Administration (FDA) av en CGT-produkt, Kymriah, 2017 har CGT-relaterad forskning och utveckling i världen fortsatt att växa i snabb takt, och FDA har sett att antalet aktiva nya läkemedelsansökningar för CGT har ökat till 500 under 2018². Det hade förutspåtts att antalet godkännanden av CGT-produkter sannolikt kommer att vara 54-74 i USA år 2030².

Även om den snabba tillväxten inom CGT-forskning och innovation är spännande, finns det fortfarande en stor teknisk klyfta mellan laboratorieforskning och tillverkning i industriell skala som kan leverera dessa lovande läkemedel för att nå så många patienter som behövs till överkomliga kostnader. De nuvarande processerna som används för dessa kliniska prövningar etablerades i laboratorier för småskaliga experiment, och betydande ansträngningar krävs för att förbättra och förnya CGT-tillverkningen³. Det finns många typer av CGT-produkter, de flesta av dem baserade på levande celler, som kan vara allogena, autologa, konstruerade eller naturliga. Dessa levande läkemedel är mycket mer komplexa än små molekylära enheter eller biologiska läkemedel, vilket gör storskalig tillverkning till en betydande utmaning ^4,5,6. I detta arbete demonstrerar vi ett storskaligt cellproduktionsprotokoll för tre förankringsberoende celler som används i stor utsträckning i CGT. Dessa inkluderar humana mesenkymala stamceller/stromaceller (hMSC), som har använts för cellbaserad terapi, och HEK293T-celler och Vero-celler, som båda används för att producera virus för genteknik av den slutliga terapeutiska cellprodukten. Förankringsberoende celler odlas vanligtvis på plana system, som kräver manuell bearbetning. Manuella odlingsmetoder kräver dock en betydande mängd arbete och är benägna att kontamineras, vilket kan äventyra kvaliteten på slutprodukten. Dessutom finns det ingen in-line processkontroll, vilket leder till betydande variationer i kvalitet mellan batcher⁷. Om man tar stamcellsterapi som ett exempel, med en lovande pipeline på över 200 stamcellsterapikandidater, uppskattas det att 300 biljoner hMSC skulle behövas per år för att möta kraven från kliniska tillämpningar⁸. Därför har storskalig tillverkning av terapeutiska celler blivit en förutsättning för att utföra dessa terapeutiska ingrepp med ett så högt cellbehov⁹.

För att undvika bakslag för plana system har ansträngningar gjorts för att utveckla storskaliga tillverkningsprocesser i bioreaktorer med omrörda tankar med konventionella icke-upplösbara mikrobärare 10,11,12,13^, men dessa lider av komplicerade beredningsprocedurer och låg cellskördseffektivitet ¹⁴. Nyligen har vi utvecklat en upplösbar mikrobärare för stamcellsexpansion, i syfte att kringgå utmaningarna med cellskörd från konventionella icke-upplösbara kommersiella mikrobärare¹⁵. Denna nya, kommersiellt tillgängliga 3D-upplösbara porösa mikrobärare av GMP-kvalitet, 3D TableTrix, har visat stor potential för storskalig cellproduktion. Faktum är att 3D-odling baserad på dessa porösa mikrobärare potentiellt kan återskapa gynnsamma biomimetiska mikromiljöer för att främja cellvidhäftning, proliferation, migration och aktivering¹⁶. De porösa strukturerna och sammankopplade pornätverken hos mikrobärare kan skapa ett större celladhesionsområde och främja utbytet av syre, näringsämnen och metaboliter, vilket skapar ett optimalt substrat för in vitro cellexpansion¹⁷. Den höga porositeten hos dessa 3D-lösliga porösa mikrobärare av GMP-kvalitet möjliggör storskalig expansion av hMSC, och förmågan för cellerna att vara helt upplösta möjliggör effektiv skörd av dessa expanderade celler¹⁸. Det är också en GMP-klassad produkt och har registrerats som ett farmaceutiskt hjälpämne hos Chinese Center for Drug Evaluation (registreringsnummer: F20210000003 och F20200000496)¹⁹ och FDA i USA (FDA, USA; Läkemedelsverkets registreringsnummer: 35481)²⁰.

Här illustrerar vi ett automatiserat system för produktion av celler i industriell skala (ACISCP)¹⁸ som använder dessa dispergerbara och upplösbara porösa mikrobärare för hMSC, HEK293T cell och Vero-cellexpansion. Vi uppnådde en framgångsrik tvåstegsexpansion av hMSCs (128 kumulativ expansion på 9 dagar) från en 5 L bioreaktor till en 15 L bioreaktor och erhöll slutligen upp till 1,1 x 10¹⁰ hMSCs från en enda produktionssats. Cellerna skördades genom att helt lösa upp mikrobärarna, koncentrerades, tvättades och formulerades med ett kontinuerligt flöde centrifugbaserat cellbearbetningssystem och aliciterades sedan med ett cellfyllningssystem. Dessutom bedömde vi kvaliteten på hMSC-produkterna för att bekräfta överensstämmelse. Vi demonstrerade också tillämpningen av dessa upplösbara mikrobärare för uppskalad produktion av två andra typer av förankringsceller, HEK293T-celler och Vero-celler, som används i stor utsträckning inom CGT-industrin. Den maximala celltätheten för HEK293T celler nådde 1,68 x 10 7 celler/ml, medan den maximala densiteten för Vero-celler nådde 1,08 x 10⁷ celler/ml. ACISCP-systemet skulle kunna anpassas för att odla en mängd olika vidhäftande celler, och det skulle potentiellt kunna bli en kraftfull plattform som bidrar till att påskynda industrialiseringen av CGT.

Protocol

Den mänskliga navelsträngen erhölls från Beijing Tsinghua Changgeng Hospital. Alla procedurer och protokoll avseende förvärv, isolering och odling av humana mesenkymala stamceller från navelsträngen (UCMSC) utfördes med informerat samtycke och med godkännande av den etiska kommittén vid Beijing Tsinghua Changgeng Hospital (registreringsnummer 22035-4-02), och procedurerna och protokollen överensstämde med Helsingforsdeklarationen från 1964 och dess senare ändringar eller jämförbara etiska standarder.

1. Monolagerodling av hMSCs, HEK293T-celler och Vero-celler

1. Isolera primära humana UCMSC:er från Whartons gelé enligt den rapporterade metoden²¹. Använd serumfritt (SF) hMSC-odlingsmedium för isolering och utväxt av primära UCMSC, skörda cellerna vid passage 2 och kryokonservera som en mastercellbank (MCB).
2. Inokulera 6 x 10⁵ humana UCMSC-celler (helst passage 2- eller passage 3-celler) i en T75-kolv (dvs. såddtätheten på 2D-plana kärl är 8 000 celler/^cm2) för enskiktsodling med 15 ml komplett SF hMSC-odlingsmedium. Säkerställ enhetlig sådd genom en åtta-rörelse av kolven. Odling vid 37 °C i en inkubator för 5 % CO₂ -cellodling till 80 %-90 % sammanflöde.
3. För att skörda, dekantera cellodlingsmediet och skölj cellerna med 3-5 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS) två gånger. Tillsätt sedan 2 ml 0,25 % trypsin-EDTA och inkubera vid 37 °C i 1-2 minuter tills de flesta cellerna har blivit runda och har lossnat från kolven, vilket observeras i ett ljusfältsinverterat mikroskop med ett 4x objektiv. Tillsätt 3 ml SF hMSC-odlingsmedium för att avsluta matsmältningen.
4. Överför cellsuspensionen till ett 15 ml koniskt centrifugrör och centrifugera vid 179 x g i 5 minuter. Dekantera supernatanten, skölj cellpelleten med PBS två gånger och återsuspendera i cirka 3-5 ml SF hMSC-odlingsmedium för sådd till mikrobärare i bioreaktorer.
   OBS: Kontrollera cellens livskraft och se till att cellerna är >90 % livskraftiga. Förbered cellerna först efter att allt förberedelsearbete för bioreaktorerna har slutförts (steg 2.1-3.6).
5. För enskiktsodling av HEK293T-celler och Vero-celler, inokulera vid 2 x 10 6-3 x 10^6-celler i varje T75-kolv och odla med DMEM innehållande 10 % fetalt bovint serum (FBS) respektive 10 % serum för nyfödda kalvar (NBS).
6. Följ steg 1.3-1.4 för att skörda cellerna. Omsuspendera i 3-5 ml DMEM innehållande 10 % FBS.

2. Förberedelse av bioreaktorn i omrörningstanken före cellsådd

1. På dag −1, skölj glaskärlet noggrant med rinnande avjoniserat (DI) vatten en gång.
2. Ta isär alla rostfria rör och pumphjul från huvudplattan, sänk ner dem i DI-vatten och sonikera med en ultraljudsrengörare vid 40 kHz och 60 °C i 1 timme för att rengöra noggrant.
   OBS: Förberedelserna och procedurerna kommer att vara desamma för första nivåns expansion i 5 L bioreaktorn och andra nivåns expansion i 15 L bioreaktorn. Parametrarna för 15 L bioreaktorn anges inom parentes genomgående. Om inga parametrar anges inom parentes är dessa parametrar desamma för 5 L och 15 L bioreaktorer.
3. Kontrollera noggrant att alla O-ringar är intakta och på plats, och sätt sedan tillbaka de demonterade delarna på huvudplattan enligt tillverkarens instruktioner.
   OBS: Byt ut alla slitna eller trasiga O-ringar före montering vid behov. Slitna O-ringar kommer att äventyra lufttätheten och därmed kärlets sterilitet.
4. Tillsätt 7 L (18 L för 15 L bioreaktorn) 0.5 M NaOH-lösning i 5 L kärlet och placera huvudplattan med rören monterade på kärlets kant för att sänka ner rören i NaOH-lösningen. Låt det stå i 12 timmar eller över natten för att ta bort endotoxiner från rören och glaskärlet.
   OBS: Överskrid inte 7 L (18 L) eftersom detta är den maximala volymen för glaskärlet på 5 L (15 L). Bär lämplig personlig skyddsutrustning när du hanterar NaOH-lösningen, eftersom den är frätande.
5. Ta bort huvudplattan och dekantera NaOH-lösningen i en lämplig avfallsflaska. Kassera enligt laboratoriets säkerhetsföreskrifter. Skölj kärlet, huvudplattan och dess delar noggrant med endotoxinfritt DI-vatten eller vatten för injektion för att avlägsna kvarvarande alkaliska ämnen.
6. Tillsätt 2 L (5 L) PBS till kärlet, sätt tillbaka alla delar och skruva fast huvudplattan på kärlets metallram enligt tillverkarens instruktioner.
7. Montera ett förbrukningspaket med slutet system på lämpliga delar/rör/portar i rostfritt stål (SS) på huvudplattan enligt tillverkarens instruktioner. Kläm fast alla Robert-klämmor på rören, och armering genom fastspänning med hemostater rekommenderas. Lämna ett av rören, med ett 0.22 μm luftventilationsfilter i änden som är anslutet till kondensorn, lossat.
   OBS: Skjut silikonrören på spetsarna på hemostaterna för att förhindra att silikonrören genomborras. Clamp endast på silikonrören och undvik clamping C-flex-rören som ingår i detta kit. Om du lämnar ett rör på kondensorn oclamped möjliggör tryckavlastning under autoklavering.
8. Förbered 250 ml 0,1 M NaOH-lösning i en autoklaverbar 500 ml GL 45-glasflaska och montera med en GL 45 Multiport Connector Screw Cap med två portar. Anslut ett 180 mm långt, 0.13 tum x 0.25 tum (innerdiameter x ytterdiameter) silikonrör till en av portarna på undersidan av locket; Längden ska vara tillräckligt lång för att precis nudda botten av flaskan.
9. Anslut en annan bit silikonrör, med en längd som är 500 mm längre än den föregående, till samma port på lockets ovansida och anslut den andra änden till en droppmatningsport på 5 L kärlets huvudplatta. Anslut ett 0.22 μm luftfilter till den andra porten på skruvlocket.
10. Utför en tvåpunktskalibrering på pH-sonden enligt tillverkarens instruktioner. Sätt sedan in sonderna för pH, upplöst syre (DO) och antal levande celler i kärlet i lämpliga PG13,5-portar och skruva fast på huvudplattan.
11. Utför en lufttäthetskontroll av det färdigmonterade kärlet enligt tillverkarens instruktioner. Håll ett tryck på 0,4 bar ± 0,01 bar i minst 30 min. Släpp långsamt trycket efter att systemet har klarat testet. Om lufttäthetstestet misslyckas, sök noggrant efter läckagepunkter och förstärk kärlenheten.
12. Autoklavera det färdigmonterade kärlet med förbrukningssatsen vid 15 psi och 121 °C i 60 minuter. Efter autoklavering, kontrollera alla luftfilter för att se till att de är intakta och torra. Ta bort alla hemostater.
    OBS: Ett våtluftsfilter filtrerar inte gasen effektivt och kan äventyra kärlets sterilitet under cellodling. Byt ut luftventilfiltren om de är våta och autoklavera hela kärlet igen.
13. Överför det autoklaverade kärlet till ett renrum och vänta tills det har svalnat helt till rumstemperatur. Sätt in temperatursonden i dykfickans rör och anslut kablarna för motorn, pH-sonden och DO-sonden från styrenheten till respektive delar på kärlet. Linda värmemattan tätt runt kärlet.
14. Lossa Robert clamps på de flexibla rören på avgaskondensorn, ringsparren, droppmatningsporten för NaOH och luftöverlagringsporten. Slå på styrenheten, logga in och ange parametrarna som anges i tabell 1 i systemet enligt tillverkarens instruktioner. Dessa rör ska inte klämmas fast när som helst under odlingsprocessen.
15. Klicka på Start och namnge experimentet för att starta bioreaktorn. Låt bioreaktorn köras på dessa inställningar i minst 12 timmar, eller över natten, för att mätta PBS med syre för att utföra en enpunktskalibrering för DO-sonden senare.
16. Kalibrera vätskehanteringsvolymhastigheten för pump 1 och pump 2 på bioreaktorstyrenheten. Installera ett 0.13 tum x 0.25 tum silikonrör på varje pump separat, med ena änden doppad i en flaska vatten och den andra änden av röret insatt i en mätcylinder.
17. Ställ in pumpens rotationshastighet på 300 rpm och tiden i 1 min. Notera mängden vatten som matas ut i mätcylindern för båda pumparna. Dessa nummer kommer att behövas för de efterföljande stegen.
18. Förbered 500 ml SF hMSC-odlingsmedium enligt tillverkarens instruktioner och sätt tillbaka locket på cellodlingsmediumflaskan med en engångsförslutning av C-Flex EZ Top-behållaren och ett kompatibelt lock. Utför lockbytet inuti ett biosäkerhetsskåp (BSC).
19. Svetsa utloppsröret på flaskan med medium till inloppet C-flex-röret på flaskan med 10 g försteriliserade W01-mikrobärare för MSC. Installera en del av slangen på pump 1 på bioreaktorregulatorn, ställ in pumprotationen på 300 rpm och pumpa in allt odlingsmedium från flaskan i flaskan med mikrobärare. Förvara dessa mikrobärare vid 4 °C fram till användning dag 0.
    OBS: Mikrobärarna bör förberedas på dag −1. För 15 l bioreaktorkultur, förbered fyra flaskor (dvs. 40 g, med totalt 4 x 500 ml SF-medium).

3. Cellsådd, odling och skörd i en 5 L bioreaktor med omrörd tank

1. På dag 0, utför en enpunktskalibrering, specifikt 100 %, för DO-sonden på bioreaktorstyrenheten enligt tillverkarens instruktioner. Bioreaktorn med omrörd tank är nu redo för cellodling.
2. Förbered en 2 L (5 L) glasflaska för avfallsuppsamling, utrusta den med en GL 45 Multiport Connector Screw Cap med två portar, med 30 mm, 0,25 tum x 0,44 tum C-Flex-rör anslutna till båda portarna och autoklav för att sterilisera. Svetsa C-flex-röret från en av portarna från avfallsflaskan till skörderöret på bioreaktorkärlets huvudplatta med en rörsvetsare.
3. Stoppa temperatur-, pH- och DO-kontrollen på bioreaktorstyrenheten tillfälligt, installera silikonröret som är fäst vid skörderöret på den peristaltiska pumpen 2 i rätt vätskeflödesriktning och mata ut all PBS helt från kärlet i avfallsflaskan. Lossa slangen från pumpen och försegla och koppla bort avfallsflaskan.
   OBS: Lossa alltid alla Robert clamps på de flexibla rören som är involverade i vätskeflödet i varje steg. Clamp tillbaka efter att vätskeöverföringen är klar innan tätning och frånkoppling. Clamp närmare mot huvudplattans sida. Lossning och fastspänning bör utföras för alla efterföljande steg om inget annat anges.
4. Förbered 7 L (30 L) komplett SF hMSC-medium och byt ut varje originalflasklock mot en engångsförslutning av C-Flex EZ Top-behållaren och ett kompatibelt lock. Svetsa en filtreringsmodul för engångsbruk till en av portarna på 10 L (50 L) förvaringspåse för engångsbruk. Utför operationen att sätta tillbaka locken inuti en BSC.
5. Filtrera och överför odlingsmediet till förvaringspåsen, en flaska i taget, genom att svetsa flaskorna med cellodlingsmedium till den andra änden av kapselfiltret och använda pumpen på bioreaktorstyrenheten. Ange som foderpåse.
6. Svetsa en utloppsport från matarpåsen till C-flex-röret på huvudplattans matarrör och installera röret till pump 1 på bioreaktorstyrenheten. Svetsa den andra utloppsporten från matarpåsen till avluftningsröret och installera röret till pump 2 på bioreaktorstyrenheten i rätt vätskeflödesriktning.
   OBS: Installera sektionen på vätskeflödesledningen, som är gjord av silikonslang, på pumpen för bättre motståndskraft mot slitage jämfört med C-Flex-rör. Se till att rören är installerade i rätt riktning.
7. Ställ in pumpens 1 hastighet på 300 rpm och stoppa pumpen efter att ha matat ut 1 L (5 L) medium från matarpåsen i kärlet, baserat på volymutmatningshastigheten som anges i steg 2.17. Starta temperatur-, pH- och DO-kontrollen igen, med samma inställningar som beskrivs i steg 2.14.
8. Försegla och koppla bort röret som ansluter matarpåsen till matarröret på huvudplattan. Svetsa C-Flex-röret från flaskan med de dispergerade mikrobärarna som förberetts i steg 2.18 till matarröret och pumpa allt innehåll från flaskan in i kärlet. Förslut och koppla bort den tomma flaskan med mikrobärarsuspension. Desinficera hela flaskans yta med 75 % etanol och placera den i en BSC för att använda den som en cellsuspensionsflaska.
   OBS: Lämna en längre bit C-Flex-rör på huvudplattans sida när du tätar och kopplar bort engångstillbehören, eftersom flera svets- och frånkopplingssteg kommer att utföras på samma rör i följande steg.
9. Se till att temperaturen som visas på regulatorn når ett stabilt tillstånd på 37 °C, vilket vanligtvis tar cirka 30 minuter, innan du fortsätter att förbereda fröcellerna som i steg 1.3-1.4. Återsuspendera 2,5 x 10⁸ hMSC i 500 ml SF-medium och överför till den tomma flaskan som tidigare innehöll mikrobärarsuspensionen.
   OBS: Fröcellerna för 15 L bioreaktorexpansion bör beredas enligt steg 3.21, i syfte att inokulera 1,0 x 10⁹ celler i 500 ml.
10. Svetsa C-Flex-röret från flaskan som nu innehåller cellsuspensionen till matningsporten på huvudplattan och pumpa allt innehåll från flaskan in i kärlet för att initiera cellinokulering till mikrobärarna. Förslut och koppla bort den tomma flaskan. Svetsa om matningsporten från matarpåsen till matarröret på huvudplattan.
11. Justera omrörningsinställningarna på styrenheten för att tillåta intermittent omrörning för förbättrad inokuleringseffektivitet för hMSC genom att ställa in följande parametrar: V1 = 35 (30) rpm/5 min; V2 = 0 varv/min/25 min; antal cykler = 12 (24); Slutlig omrörningshastighet = 35 (30) varv/min.
    OBS: Omrörningshastigheten kan justeras till 40 (35) rpm eller 45 (40) rpm om ojämn fördelning eller sedimentering av mikrobärarna observeras under odlingsprocessen.
12. Ställ in ett automatiserat mediumtillägg och utbytessystem på bioreaktorstyrenheten i Medium Exchange-gränssnittet. Ställ in parametrarna för hMSC-odlingen enligt tabell 2.
    OBS: Lossa alla Robert clamps på de flexibla rören som är involverade i vätskeflödet i detta skede, speciellt för matnings- och avluftningsröret. Håll dessa ospända genom hela kulturprocessen.
13. Ta proverna genom provtagningsröret genom att ansluta engångsprovtagningspåsarna via Luer-anslutningar vid önskade tidpunkter, vanligtvis en gång om dagen, och alikvotera 10 ml varje gång i provtagningspåsen. Lägg 2–3 ml prov i den första provtagningspåsen, kassera det och lägg sedan de faktiska 10 ml provet i en ny provtagningspåse varje gång.
    OBS: Det första 2-3 ml sample kan vara vätska kvar i röret från föregående provtagningstidpunkt och kanske inte exakt representerar tillståndet i kärlet. Utför alltid dessa steg med extra aseptiska åtgärder genom att desinficera Luer-anslutningarna före och efter att anslutningar med 75 % etanol har gjorts eller brutits.
14. Överför de tagna proverna till ett 15 ml koniskt centrifugrör. Utför följande tester på proverna.
    1. Ta 200 μL av den cellladdade mikrobärarsuspensionen och färga med Calcein-AM/PI Cell Double Staining enligt tillverkarens instruktioner. Observera under ett fluorescensmikroskop.
    2. Sedimentera mikrobärarna genom gravitationen, vilket vanligtvis tar 5-10 min. Aspirera supernatanten och testa glukoskoncentrationen med en glukosmätare enligt tillverkarens instruktioner. Rita en glukosnivågraf.
    3. Inkubera de sedimenterade cellfyllda mikrobärarna med en nyberedd 3–5 ml 1 mg/ml uppslutningslösning vid 37 °C i 20–30 minuter för att lösa upp mikrobärarna helt. Räkna cellerna efter färgning med AO/PI med en automatiserad fluorescenscellanalysator. Rita en celltillväxtkurva. Korrelera med tillväxtkurvan för levande celler i realtid som genereras på styrenheten.
15. På dag 4 eller dag 5 av odlingen, bered 50 ml (200 ml) uppslutningslösning vid 30 mg/ml. Förhållandet mellan arbetsmassan mellan uppslutningslösningen och upplösbara mikrobärare varierar från 3:20 till 5:20. Sterilt filter med ett 0,22 μm kapselfilter och späd ytterligare i 500 ml (2 L) av Hanks balanserade saltlösning (HBSS) med kalcium och magnesium. Överför till en 3 L engångspåse.
    OBS: Bered endast digestlösningen strax före cellskörd. Försök att sikta på minst 1,0 x 10 9-1,2 x 10⁹ celler för den första nivåns expansion och 1,0 x 10¹⁰ celler för den andra nivåns expansion. Om cellerna växer snabbare, skörda på dag 4; Om inte, skörda på dag 5. Det rekommenderas inte att gå längre än dag 5.
16. Ställ in omrörningshastigheten till 0 på styrenheten för att mikrobärarna ska sätta sig, vilket vanligtvis sker inom 20 minuter. Stäng av det automatiska medieutbytesprotokollet och stoppa temperatur-, pH- och DO-kontrollen på bioreaktorstyrenheten. Starta pump 2 manuellt vid 300 rpm på styrenheten och dispensera supernatanten i matningsregimen för att lämna cirka 1 L (2 L) odlingssuspension i kärlet (med hjälp av volymutmatningshastigheten som anges i steg 2.17 eller mät från graderingsmärkena på kärlets kropp). Försegla och koppla bort foderpåsen helt.
17. Svetsa påsen med nyberedd rötlösning från steg 3.15 till matarröret och pumpa in allt innehåll i kärlet. Starta omrörningshastigheten vid 45 (40) rpm. Se till att temperaturreglaget fortfarande håller temperaturen på 37 °C. Mikrobärare löses upp inom 40-60 minuter. Ta 1 ml av provet med en steril Luer lock-spruta vid 30 minuter och därefter var 5-10:e minut för att observera under ett ljusfältsmikroskop för att kontrollera upplösningen av mikrobärarna.
18. Efter att mikrobärarna har lösts upp, svetsa en 3 L förvaringspåse (två 3 L förvaringspåsar för 15 L bioreaktorn) till skörderöret och pumpa ut cellsuspensionen helt med pump 2 vid 300 rpm. Förbered 1 l (3,5 l) saltlösning innehållande 1 % humant serumalbumin (HSA) som tvättbuffert och 500 ml komplett SF-medium (500 ml cellkryokonserveringsbuffert, en formulering av 10 % dimetylsulfat (DMSO) och 90 % SF-medium tas som ett example) i separata engångsförvaringspåsar med de metoder och tillbehör som nämns i föregående steg för andra vätskeöverföringar.
19. Slå på cellbearbetningssystemet, installera ett engångscellbearbetningskit på instrumentet enligt tillverkarens instruktioner, svetsa påsarna med cellsuspension, tvättbuffert och SF-medium (kryokonserveringsbuffert) till engångscellbearbetningssatsen och följ noggrant alla instruktioner som visas på användargränssnittet för att initiera och kontrollera integriteten och korrekt installation av satsen.
20. När installationen är klar, ange parametrarna som anges i tabell 3 för celltvätt med tvättbuffert och resuspension i SF-medium (kryokonserveringsbuffert) till programvaran för att starta tvätt- och resuspensionsprocessen. Hela proceduren kommer att utföras automatiskt med flera manuella kontrollpunkter.
21. Ta ett prov av cellerna från centrifugkammaren, enligt cellbearbetningssystemet, och beräkna celldensiteten med en automatiserad cellanalysator enligt tillverkarens instruktioner. Ställ in resuspensionsvolymen för en densitet på 2 x 10⁶ celler/ml eller en maximal total volym på 250 ml.
22. Försegla och koppla bort cellöverföringspåsen från Disposable Cell Processing Kit efter att systemet har aspirerat ut cellerna från kammaren. Justera celldensiteten till 2 x 10⁶ celler/ml med komplett SF-medium i en större cellöverföringspåse/medium förvaringspåse om det behövs. Dessa kommer att vara fröcellerna för den andra nivåns expansion i 15 L-bioreaktorn.

4. Cellformulering, fyllning och finish

1. Börja förbereda 15 L bioreaktorn 1 dag före cellskörd från 5 L bioreaktor. Följ stegen i protokoll avsnitt 2 och 3 helt utom med parametrarna för 15 L angivna inom parentes.
2. Återsuspendera cellerna i 250 ml kryokonserveringsbuffert och försegla och koppla bort cellöverföringspåsen från engångscellbearbetningssatsen efter att systemet har aspirerat ut cellerna från kammaren.
3. Överför 2 000 ml kryokonserveringsbuffert tillsammans med 250 ml återsuspenderade celler från steg 4.2 till en 3 l cellöverföringspåse. Svetsa denna överföringspåse till ett förbrukningskit för engångsfyllning och finish.
   OBS: Den extra volymen kryokonserveringsbuffert som används här bör bestämmas av specifikationen av formulering och beräkning av totalt cellantal enligt räkneresultaten i steg 3.21
4. Montera engångsfyllnings- och finishförbrukningssatsen på cellfyllningssystemet och slå på förkylningssystemet enligt tillverkarens instruktioner. Följ instruktionerna på systemet och ställ in att fylla 20 ml/påse med totalt 20 påsar per sats. Försegla och koppla bort dessa påsar från satsen och följ standardprocedurer för kryokonservering. Använd kryoförvaringspåsar.
5. Svetsa en ny uppsättning med 20 kryokonserveringspåsar till engångsfyllnings- och finishförbrukningssatsen och upprepa fyllnings- och slutproceduren tills alla celler är alikvoterade. Följ standardprocedurer för att kryokonservera dessa celler.

5. Karakterisering av cellkvaliteten

1. Prov på de skördade hMSC från de upplösbara mikrobärarna och använd ett cellbearbetningssystem för karakterisering genom flödescytometri för bestämning av cellidentiteten enligt de metoder som beskrivs i litteratur¹⁸.
2. Tina de kryokonserverade cellerna och omplatta på konventionella 2D-kolvar eller mikroplattor för ytterligare karakterisering av cellegenskaperna, inklusive cellmorfologi och tri-lineage-differentieringsförmåga, enligt metoder som beskrivs i litteratur¹⁸.

6. HEK293T expansion av G02-mikrobärare i bioreaktorn med omrörd tank

1. Förbered en 5 L bioreaktor enligt beskrivningen i steg 2. För HEK293T celler, odla cellerna med sterila G02-mikrobärare istället för W01. Odlingsprocessen liknar den i protokollavsnitt 3, även om vissa parametrar är annorlunda, vilket kommer att beskrivas i följande steg. Installera ett speciellt perfusionsrör i bioreaktorn som ersättning för avluftningsröret, eftersom perfusion behövs för odling av HEK293T celler.
2. Till skillnad från protokollet som beskrivs i protokollavsnitt 3, förbered 20 g G02-mikrobärare (dvs. två flaskor) i DMEM med 10 % FBS för 5 L bioreaktorn, med dag 0-odlingsvolymen inställd på 3.5 L (dvs. en slutlig koncentration på cirka 5.71 g/L). Dosera 2 l medium i kärlet före de två flaskorna med G02-mikrobärare och inokulera 500 ml 1,75 x 10⁹ HEK293T celler (dvs. vid en slutlig densitet på 5 x 10⁵ celler/ml).
3. Utför en omrörningsregim och en mediumutbytesregim (baserad på den mängd medium som krävs för att bytas ut per dag, uttryckt som odlingsvolym per dag, CVD), som skiljer sig från protokollavsnitt 3 och beskrivs i tabell 4.
   OBS: Aktivera pump 1 och pump 2 manuellt så att båda kan pumpa kontinuerligt för att perfusion ska ske. Justera pumphastigheten varje dag för att möta perfusionshastigheten baserat på kalibreringen av pumparnas volymutmatningshastighet. Vanligtvis kommer detta att vara i det ensiffriga intervallet. För HEK293T celler, använd färskt medium som foder och släng förbrukat medium helt i en avfallsflaska, till skillnad från hMSC, för vilken mediet cirkuleras.
4. För den andra stegets expansion till 15 L-bioreaktorn, använd pärl-till-pärla-överföring av de HEK293T cellerna istället för fullständig upplösning av mikrobärarna som används med hMSC. Specifikt ska du stoppa omrörningen för att sedimentera mikrobärarna efter att önskad celltäthet har uppnåtts, och sedan aspirera så mycket supernatant som möjligt ur perfusionsröret, mata in PBS med 3 gånger volymen av återstående suspension för att tvätta mikrobärarna och upprepa tre gånger. Aspirera och kassera så mycket PBS som möjligt i den sista tvätten.
5. Mata in 3,5 L 1x rekombinant trypsin för att lossa cellerna från mikrobärarna medan G02-mikrobärarna förblir intakta. Ställ in temperaturen på 37 °C och omrörningshastigheten på 60 rpm. Avsluta avskiljningen inom 45 minuter, när mer än 80 % av cellerna har lossnat, med lika mycket komplett medium.
6. Överför direkt från skördehamnen till ett förberett 15 L-kärl för expansion på andra nivån.

7. Vero-cellexpansion på V01-mikrobärare i bioreaktorn med omrörd tank

1. Förbered V01-mikrobärare genom att överföra de frystorkade mikrobärarna till bioreaktorkärlet tillsammans med PBS till en koncentration av 20 mg/ml. Montera och sterilisera kärlet enligt protokoll avsnitt 2, men autoklav i 30 minuter istället.
2. Efter sterilisering sätter sig V01-mikrobärare naturligt. Byt ut supernatanten mot basisk DMEM två gånger med hjälp av avluftnings- och matarrören, och tillsätt hela DMEM innehållande 10 % NBS till 50-75 % av kärlets volym innan du fortsätter till protokollavsnitt 3 för cellinokulering och odling.
3. Till skillnad från det protokoll som beskrivs i avsnitt 3 i protokollet, använd 24 g V01-mikrobärare för en 4-litersodling av Vero-celler (dvs. en slutlig koncentration på 6 g/l) och inokulera 500 ml 4 x 10⁹ Vero-celler (dvs. vid en slutlig densitet på 1 x 10⁶ celler/ml).
4. Följ steg 6.3-6.6 för odlingsprocessparametrar och övergång till andra nivåns expansion i bioreaktorn med 15 L omrörd tank.

Representative Results

ACISCP-plattformen är ett helt slutet system som använder en serie bioreaktorer med omrörda tankar för uppskalningsexpansion, ett cellbearbetningssystem för automatiserad cellskörd och cellformulering samt ett cellfyllningssystem (figur 1). Vidhäftande celler fäster vid de porösa mikrobärarna, som kan dispergeras i bioreaktorn, vilket uppnår suspenderad odling av vidhäftande celler.

I enlighet med det beskrivna protokollet inokulerades först 2,5 x 10⁸ hMSC med 10 g W01-mikrobärare i en 5 L bioreaktor med omrörd tank för en första expansion. Cirka 2,9 x 10 9 celler koncentrerades och tvättades av cellbearbetningssystemet dag 4, varav 1,0 x 10⁹ skördade celler passerade till 15 L omrörd bioreaktor med 40 g W01-mikrobärare för den andra odlingsfasen. Så småningom skördades, formulerades och aliciterades 1,1 x¹⁰ MSC i över 70 formuleringspåsar på dag 9 (Figur 2A). Cellantal, viabilitet och glukosförbrukning övervakades dagligen (Figur 2B,C). En kumulativ 128-faldig expansion uppnåddes; Samtidigt hölls cellviabiliteten högre än 90 %. Intaget av glukos uppvisade en negativ korrelation med cellexpansion, vilket visar på metabolism associerad med hälsosam celltillväxt.

De upplösbara porösa mikrobärarna kan försteriliseras och levereras i en sluten engångsförpackning som är lämplig för GMP (Figur 3A). Cellerna kunde fästa på mikrobärarnas yta och makroporernas innervägg (Figur 3B). Genom att använda ett fluorescerande färgämne, såsom Calcein-AM/PI Cell Double Staining Kit, kunde cellerna inuti de porösa mikrosfärerna visualiseras (Figur 3C). Genom att slå samman ljusfältsbilder med fluorescerande bilder kunde man analysera likformigheten i cellfördelningen. Färgningen av levande celler visade också ett starkt samband med cellräkning mätt med antingen manuell provtagning eller online-sonden för levande cellräkning.

Förutom den enorma efterfrågan på stora cellkvantiteter är bedömningar av kritiska kvalitetsattribut (CQA) och frisättningstester av MSC oumbärliga, eftersom utan dessa kan celler inte steriliseras eller renas i stor utsträckning efter odling. För att säkerställa cellkvaliteten kan 3D-expanderade MSC:er provtas i varje steg av ACISCP-plattformen. MSC som nyligen skördats från ACISCP-plattformen behöll klassiska fenotypiska markörer²², med ett uttryck på >95 % och <2 % för de positiva markörerna (CD73, CD90, CD105) respektive negativa markörer (HLA-DR, CD34, CD45, CD19, CD14) (figur 4A). De kryokonserverade cellerna tinades och inokulerades till en 2D-kolv och uppvisade god vidhäftningsförmåga, normalt expansionsbeteende (Figur 4B) och en typisk spindelform med spiraltillväxt (Figur 4C). Dessutom bibehöll cellerna också sin förmåga att differentiera till osteogena, adipogena och kondrogena linjer (Figur 4D).

Dessutom testades HEK293T celler och Vero-celler även i ACISCP-plattformen. För HEK293T cellodling var inokulatcellkoncentrationen 5 x 10⁵ celler/ml i 5 L bioreaktorn. Efter överföringsprocessen från pärla till pärla nådde den maximala cellkoncentrationen 1,68 x 10⁷ celler/ml i 15 L-bioreaktorn (Figur 5A), och de HEK293T cellerna bibehöll hög livskraft (Figur 5B). För Vero-cellodlingen var inokulatcellkoncentrationen 2 x 10⁵ celler/ml i 5 L-bioreaktorn. Efter överföringsprocessen från pärla till pärla var den maximala cellkoncentrationen 1,08 x 10⁷ celler/ml i 15 L bioreaktorn (Figur 6A), och Vero-cellerna bibehöll också hög livskraft (Figur 6B).

Figur 1: Schematisk färdplan för hMSC-produktion via ACISCP-plattformen. Denna siffra har modifierats från publicerad litteratur¹⁸. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 2: Cellexpansion av hMSC via ACISCP-plattformen. A) ACISCP-plattformen består av en serie bioreaktorer med omrörda tankar, ett cellbearbetningssystem och ett cellfyllningssystem. (B) Tillväxtkurva för hMSC i den tvådelade expansionsprocessen, (C) och glukoskonsumtionshastigheten under processen. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 3: Karakterisering av hMSC-tillväxt på W01-mikrobäraren. Denna siffra har modifierats från publicerad litteratur¹⁸. (A) W01-mikrobärare bereds med engångsförpackningar med slutet system. (B) Svepelektronmikroskopbilder av tomma mikrobärare och mikrobärare odlade med vidhäftande hMSC. De vita triangulära huvudena indikerar celler på ytan av mikrobärare; skalstapel = 100 μm. C) Representativa sammanslagna ljusfälts- och fluorescensbilder (färgning av levande celler) av hMSC odlade på mikrobärare från dag 1 till dag 4. skalstapel = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 4: Cellidentitetsbedömning av hMSC skördad från ACISCP-plattformen . (A) Ytmarkörerna för hMSC karakteriserades med flödescytometri. Alla positiva markörer (>95 %) och negativa markörer (<2 %) uppfyllde kriterierna. (B) Kryokonserverade 3D-expanderade hMSC uppvisade normalt expansionsbeteende efter upptining och omplätering till 2D-kolvar. (C) Morfologi hos de 3D-expanderade hMSC:erna. skalstapel = 50 μm. (D) Tri-lineage-differentiering av de 3D-expanderade hMSC:erna. Osteogena, adipogena och kondrogena förmågor bedömdes med Alizarin Red, Oil Red respektive Alcian Blue färgning. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 5: Cellexpansion av HEK293T celler via ACISCP-plattformen. A) HEK293T celltätheten i bioreaktorerna på 5 och 15 liter. (B) Ljusfältsbild (BF), Calcein-AM-färgade (Live) och PI-färgade (döda) HEK293T-celler odlade på G02-mikrobärare. skalstapel = 1 mm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 6: Cellexpansion av Vero-celler via ACISCP-plattformen . (A) Vero-celldensitet i 5 L och 15 L bioreaktorer. (B) Ljusfältsbild (BF), Calcein-AM-färgade (Live) och PI-färgade (döda) Vero-celler odlade på V01-mikrobärare. skalstapel = 400 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Tabell 1: Parameterinställningar för bioreaktorn med omrörd tank. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Tabell 2: Parameterinställningar för automatiserat mediebyte för hMSC-odling. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Tabell 3: Parameterinställningar för cellbearbetningssystemet för hMSC-passage och formulering. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Tabell 4: Medium utbytesregim och omrörningsregim för HEK293T- och Vero-celler. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Discussion

Både immunterapi och stamcellsterapi använder levande celler som läkemedel; Deras slutprodukter bör dock inte renas eller steriliseras på samma sätt som små molekyler eller virus. Därför bör principen om inbyggd kvalitet (Quality by Design, QbD) alltid hållas i åtanke och tillämpas praktiskt på processen för kemisk tillverkning och kontroll (CMC) under cellproduktion²³. Ett helt slutet cellodlingssystem, samt ett processsystem och ett fyllningssystem, anses företrädesvis uppfylla kraven. I denna studie har vi presenterat ett protokoll för att använda en ACISCP-plattform baserad på GMP-klassade, upplösbara och porösa 3D-mikrobärare för att utföra en tvåstegsexpansion av hMSC. Vissa forskare har undersökt möjligheten att använda bioreaktorer tillsammans med mikrobärare för att expandera hMSC in vitro, men majoriteten av rapporterade studier har visat att en ökning av skalan skulle leda till en minskning av hMSC-utbytet, från 6,1 x 10 5 celler/ml eller till och med 12,5 x 10 5 celler/ml i 100 ml arbetsvolym till 2,7 x 10⁵ celler/ml i 2 liter arbetsvolym ^{24, 25,26}. Även om bioreaktorer med omrörda tankar uppvisar den högsta skalbarheten, bör viktiga frågor som kärlets strukturella egenskaper, pumphjulstypen, spetshastigheten, den volymetriska massöverföringskoefficienten, k_Laför syre och effekttalet övervägas noggrant²⁴. Till skillnad från tidigare bioreaktorer med omrörda tankar, som vanligtvis var utformade för odling av mikrober eller domesticerade förankringsoberoende celler som CHO-celler, var bioreaktorn som användes i denna studie speciellt utformad för mikrobärarbaserad odling och kan därmed tillfredsställa de olika processbehoven för näringsutbytesstrategier. Förutom skillnader i cellodlingsprocessen använder ACISCP-plattformen ett centrifugbaserat cellbearbetningssystem med kontinuerligt flöde tillsammans med ett cellfyllningssystem, till skillnad från konventionella skördeprocedurer för att producera stora mängder celler som utförs genom upprepat manuellt arbete, vilket garanterar en hög hanteringseffektivitet. Avancerade automatiserade enheter har ett högt utbyte i produktion av en batch.

De flesta stamceller är beroende av förankring; Därför efterfrågar de mikrobärare för celltillverkning. Konventionellt formulerades tidigare kommersiella mikrobärare för att utnyttja olika ytegenskaper och på så sätt uppnå olika antal cellexpansionsveck. I tidigare forskning har användningen av Cytodex typ 1-mikrobärare för MSC i svinbenmärg gett en celltäthet på cirka 4 x 10 5 celler/ml, medan användningen av gelatinbelagda Cytodex typ 3 har gett ett cellantal som är jämförbara (3,8 x 10⁵ celler/ml) med MSC i moderkakan^{hos människa 27}. Cytodex typ 1 och typ 3 är dock inte upplösliga, och därmed påverkar trypsiniseringsprocessen under cellskörden inte bara cellåterhämtningsutbytet utan också livskraften och kvaliteten. Därför finns det inga framgångsrika fall av användning av konventionella mikrobärare för CGT-produkter, där celler som slutprodukter inte kan genomgå omfattande nedströms reningsprocesser för att eliminera kontaminering av icke-upplösliga mikrobärare²⁸. Däremot är W01-mikrobärare helt upplösliga, vilket innebär att cellprodukterna lätt kan skördas genom nedbrytning av mikrobäraren. Denna mikrobärarprodukt levereras också i en helt sluten systemförpackning, vilket innebär att en driftprocess som överensstämmer med GMP enkelt kan uppnås. Vi har visat att passage med en tvåstegs expansionsprocess lätt kan uppnås med W01-mikrobärare, och så högt som 1,1 x 10¹⁰ totala celler kan skördas i en enda sats; I själva verket kunde detta endast uppnås i 50 L bioreaktorer i tidigare rapporter^29,30. I detta arbete nådde den maximala celldensiteten inuti bioreaktorn med omrörd tank cirka 11,6 x 10⁵ celler/ml före skörd. Således kan man förvänta sig att man lätt skulle kunna uppnå 1 x 10¹¹ celler per batch med en 100-200 L bioreaktor i ACISCP-plattformen, vilket skulle innebära att tusen batcher per år lätt skulle kunna möta efterfrågan på 300 biljoner hMSC varje år.

Eftersom celler har olika egenskaper produceras olika typer av 3D-mikrobärare som finns tillgängliga för att testa kompatibiliteten mellan en specifik cell och en mikrobärare. För icke-cellslutprodukter i CGT har mikrobärarbaserade uppskalningar för HEK293T-celler och Vero-celler i bioreaktorer rapporterats nå 1,5 x 10 6 celler/ml respektive 3,3 x 10⁶ celler/ml^{, 31}. Vi använde upplösbara porösa mikrobärare, G02 och V01, i ACISCP-plattformen för att expandera HEK293T celler respektive Vero-celler, och de maximala celltätheterna för båda cellerna nådde över 1 x 10⁷ celler/ml. Dessutom kan nedbrytbarheten hos 3D-mikrobärare vara fördelaktig för produktion av biologiska produkter av intracellulära virus, eftersom cellerna lätt kan separeras från mikrobärarna. ACISCP-plattformen representerar en etablerad ny biotillverkningsprocess som uppfyller både kvantitets- och kvalitetskraven för cell- och genterapiprodukter. Vi förväntar oss att vår storskaliga cellproduktionsplattform kommer att fungera som ett viktigt verktyg för att möjliggöra utveckling av cell- och genterapier.

Trots fördelarna med plattformen som diskuterats ovan återstår flera begränsningar att kringgå i framtiden. För det första är de bioreaktorer som används i ACISCP-plattformen i sin nuvarande form fortfarande utrustade med glastankar, som kräver komplicerade tvättprocedurer och rengöringsverifiering för att uppfylla kriterierna för god tillverkningssed. Ett bioreaktorsystem med omrörd tank för engångsbruk skulle kunna användas i framtiden för att producera en intakt uppsättning förbrukningsartiklar för engångsbruk. För det andra, till skillnad från domesticerade cellinjer, är hMSC primära cellstammar isolerade från enskilda donatorer och olika vävnader, vilket innebär att hMSC uppvisar heterogenitet. Därför fungerar protokollet som beskrivs i detta dokument som referens, medan systematisk processutveckling krävs för att uppnå den tekniska migreringen av ACISCP-plattformen. För det tredje, även om våra medarbetare preliminärt har testat möjligheten att producera vacciniaviruset med Vero-celler³², återstår det att validera ytterligare om god prestanda för virusproduktion i 3D-expansion av HEK293T celler skulle kunna uppnås. Sammanfattningsvis erbjuder den storskaliga cellproduktionsmetoden för ACISCP-plattformen, baserad på upplösbara porösa mikrobärare och en serie automatiserade slutna system, en möjlighet att förbättra produktionseffektiviteten och förfina kvalitetskontrollen i industriell skala för tillverkning av CGT-produkter.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% trypsin EDTA	BasalMedia	S310JV	Used for 2D cell harvest.
3D FloTrix Digest	CytoNiche Biotech	R001-500	This is a reagent that specifically dissolves 3D TableTrix microcarriers.
3D FloTrix MSC Serum Free Medium	CytoNiche Biotech	RMZ112	This is a serum-free,animal-free medium for mesenchymal stem cell expansion and maintenance in 2D planar culture as well as 3D culture on 3D TableTrix microcarriers.
3D FloTrix Single-Use Filtration Module	CytoNiche Biotech	R020-00-10	This module contains 0.22 μm capsule filters used for filtration of culture medium and digest solution.
3D FloTrix Single-Use Storage Bag (10 L)	CytoNiche Biotech	R020-00-03	Used as feed bag for 5 L bioreactor.
3D FloTrix Single-Use Storage Bag (3 L)	CytoNiche Biotech	R020-00-01	Used as cell seeding or transfer bags.
3D FloTrix Single-Use Storage Bag (50 L)	CytoNiche Biotech	R020-00-04	Used as feed bag for 15 L bioreactor.
3D FloTrix vivaPACK Disposable Fill&Finish Consumable Kit	CytoNiche Biotech	PACK-01-01	This is a standard kit adapted to 3D vivaPACK fill and finish system.
3D FloTrix vivaPACK fill and finish system for cells	CytoNiche Biotech	vivaPACK	This system is a closed liquid handling device, with automated mixing and gas exhausting functions. Cells resuspended in cryopreservation buffer can be rapidly and evenly aliquoted into 20 bags per batch.
3D FloTrix vivaPREP PLUS cell processing system	CytoNiche Biotech	vivaPREP PLUS	This system is a continuous flow centrifuge-based device.Cells can be concentrated, washed, and resuspended under completely closed procedures.
3D FloTrix vivaPREP PLUS Disposable Cell Processing Kit	CytoNiche Biotech	PREP-PLUS-00	This is a standard kit adapted to 3D vivaPREP PLUS cell processing.
3D FloTrix vivaSPIN  bioreactor 15 L	CytoNiche Biotech	FTVS15	This bioreactor product employs a controller, a 15 L glass stirred-tank vessel, and assessories. A special perfusion tube is available.
3D FloTrix vivaSPIN  bioreactor 5 L	CytoNiche Biotech	FTVS05	This bioreactor product employs a controller, a 5 L glass stirred-tank vessel, and assessories.A special perfusion tube is available.
3D FloTrix vivaSPIN Closed System Consumable Pack (10/15 L)	CytoNiche Biotech	R020-10-10	This is a standard tubing kit adapted to 3D vivaSPIN bioreactor 15 L, containing sampling bags.
3D FloTrix vivaSPIN Closed System Consumable Pack (2/5 L)	CytoNiche Biotech	R020-05-10	This is a standard tubing kit adapted to 3D vivaSPIN bioreactor 5 L, containing sampling bags.
3D TableTrix microcarriers G02	CytoNiche Biotech	G02-10-10g	These porous and degradable microcarriers are suitable for HEK293T cell culture. They come pre-sterilized in 10g/bottle with C-Flex tubings for welding to tubes on bioreactors.
3D TableTrix microcarriers V01	CytoNiche Biotech	V01-100-10g	These porous and degradable microcarriers are suitable for adherent cell culture, they come as non-sterilized microcarriers that need to be autoclaved in PBS before use. They are especially suitable for vaccine production.
3D TableTrix microcarriers W01	CytoNiche Biotech	W01-10-10g (single-use packaging); W01-200 (tablets)	These porous and degradable microcarriers are suitable for adherent cell culture, especially for cells that need to be harvested as end products. They come pre-sterilized in 10g/bottle with C-Flex tubings for welding to tubes on bioreactors.The product has obtained 2 qualifications for pharmaceutical excipients from CDE, with the registration numbers of [F20200000496; F20210000003]. It has also received DMF qualification for pharmaceutical excipients from FDA, with the registration number of [DMF:35481]
APC anti-human CD45 Antibody	BioLegend	368512	Used in flow cytometry for MSC identity assessment
Calcein-AM/PI Double Staining Kit	Dojindo	C542	Calcein-AM/PI Double Staining Kit is utilized for simultaneous fluorescence staining of viable and dead cells. This kit contains Calcein-AM and Propidium Iodide (PI) solutions, which stain viable and dead cells, respectively.
Cap for EZ Top Container Closures for NALGENE-containers (500mL)	Saint-Gobain	CAP-38	Brands and catalogue numbers are only for example, similar products are available from various suppliers and as long as they have the same functionality, items could be substituted with other brands.
C-Flex Tubing, Formulation 374 (0.25 in x 0.44 in)	Saint-Gobain	374-250-3	Used for tube welding and disconnection.
CryoMACS Freezing Bag 50	Miltenyi Biotec	200-074-400	Used for expanding the 3D FloTrix vivaPACK Disposable Fill&Finish Consumable Kit.
Dimethyl Sulfate (DMSO)	Sigma	D2650-100mL	Used for preparation of cryopreservation solution.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	BasalMedia	L120KJ	Used for cultivation of HEK293T and Vero cells.
DURAN Original GL 45 Laboratory bottle (2 L)	DWK life sciences	218016357	Used for waste collection from the 5 L bioreactor.
DURAN Original GL 45 Laboratory bottle (5 L)	DWK life sciences	218017353	Used for waste collection from the 15 L bioreactor.
DURAN Original GL 45 Laboratory bottle (500 mL)	DWK life sciences	218014459	Used for supplementary bottle of 0.1 M NaOH.
EZ Top Container Closures for NALGENE-containers (500mL)	Saint-Gobain	EZ500 ML-38-2	Brands and catalogue numbers are only for example, similar products are available from various suppliers and as long as they have the same functionality, items could be substituted with other brands.
Fetal bovine serum (FBS) superior quality	Wisent	086-150	Used for cultivation of HEK293T cells.
FITC anti-human CD14 Antibody	BioLegend	301804	Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
FITC anti-human CD34 Antibody	BioLegend	343504	Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
FITC anti-human CD90 (Thy1) Antibody	BioLegend	328108	Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
Flow cytometry	Beckman Coulter	CytoFLEX	Used for cell identity assessment.
Fluorescence Cell Analyzer	Alit life science	Countstar Rigel S2	Used for cell counting. Cell viability can be calculated by staining with AO/PI dyes.
GL 45 Multiport Connector Screw Cap with 2 ports	DWK life sciences	292632806	Brands and catalogue numbers are only for example, similar products are available from various suppliers and as long as they have the same functionality, items could be substituted with other brands.
Glucose Meter	Sinocare	6243578	Used for detecting glucose concentration in cell culture medium and supernatant.
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), with calcium and magnesium	Gibco	14025092	Used for preparation of digest solution.
Human Albumin 20% Behring (HSA)	CSL Behring	N/A	Used for preparation of wash buffer.
Inverted fluorescent microscope	OLYMBUS	CKX53SF	Used for brifgt field and fluorescent observation and imaging.
Nalgene Measuring Cylinder (500 mL)	Thermo Scientific	3662-0500PK	Used for calibrating the liquid handling volume speed of peristaltic pumps.
Newborn calf serum (NBS) superfine	MINHAI BIO	SC101.02	Used for cultivation of Vero cells.
OriCell human mesenchymal stem cell adipogenic differentiation and characterization kit	Cyagen	HUXUC-90031	Used for tri-lineage differentiation of hUCMSCs.
OriCell human mesenchymal stem cell chondrogenic differentiation and characterization kit	Cyagen	HUXUC-90041	Used for tri-lineage differentiation of hUCMSCs.
OriCell human mesenchymal stem cell osteogenic differentiation and characterization kit	Cyagen	HUXUC-90021	Used for tri-lineage differentiation of hUCMSCs.
PE anti-human CD105 Antibody	BioLegend	800504	Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
PE anti-human CD19 Antibody	BioLegend	302208	Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
PE anti-human CD73 (Ecto-5'-nucleotidase) Antibody	BioLegend	344004	Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
PE anti-human HLA-DR Antibody	BioLegend	307605	Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Wisent	311-010-CL	Used in autoclaving of glass vessel and V01 microcarriers, and replacement of culture medium.
Sani-Tech Platinum Cured Sanitary Silicone Tubing (0.13 in x 0.25 in)	Saint-Gobain	ULTRA-C-125-2F	Used for solution transfering driven by peristaltic pumps.
Sterile Saline	Hopebiol	HBPP008-500	Used for preparation of wash buffer.
Trypzyme Recombinant Trypsin	BasalMedia	S342JV	This reagent is used for bead-to-bead transfer of HEK293T and Vero cells.
Tube Sealer	Yingqi Biotech	Tube Sealer I	This sealer is compatible with both C-Flex tubing and PVC tubing.
Tube Welder for PVC tubing	Chu Biotech	Tube Welder Micro I	Used for welding of PVC tubing.
Tube Welder for TPE tubing	Yingqi Biotech	Tube Welder I-V2	Used for welding of TPE tubing.
ViaStain AO / PI Viability Stains	Nexcelom	CS2-0106-25mL	Dual-Fluorescence Viability, using acridine orange (AO) and propidium iodide (PI), is the recommended method for accurate viability analysis of primary cells, such as PBMCs, and stem cells in samples containing debris.