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Biology

गैस क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री-आधारित हार्ड कोरल नमूनों के लक्षित मेटाबोलॉमिक्स

Published: October 13, 2023 doi: 10.3791/65628
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 2
1Climate Change Cluster (C3), University of Technology Sydney, 2Metabolomics Australia, Bio21 Molecular Science and Biotechnology Institute, The University of Melbourne, 3School of Biological Sciences, Victoria University of Wellington

Summary

यहां, हम गैस क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए कोरल होलोबियोनेट से ध्रुवीय और अर्ध-ध्रुवीय मेटाबोलाइट्स के निष्कर्षण और तैयारी के साथ-साथ अलग कोरल होस्ट ऊतक और सिम्बियोडिनेसी सेल अंशों को प्रस्तुत करते हैं।

Abstract

गैस क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (जीसी-एमएस) -आधारित दृष्टिकोण सीनिडेरियन-डिनोफ्लैगलेट सिम्बायोसिस के चयापचय आधार को स्पष्ट करने के लिए शक्तिशाली साबित हुए हैं और कोरल तनाव का जवाब कैसे देता है (यानी, तापमान-प्रेरित विरंजन के दौरान)। कोरल होलोबियोनेट की स्थिर-राज्य मेटाबोलाइट प्रोफाइलिंग, जिसमें निडारियन होस्ट और इसके संबंधित रोगाणु (सिम्बियोडिनेसी और अन्य प्रोटिस्ट, बैक्टीरिया, आर्किया, कवक और वायरस) शामिल हैं, कोरल की समग्र चयापचय स्थिति को चिह्नित करने के लिए परिवेश और तनाव की स्थिति के तहत सफलतापूर्वक लागू किया गया है।

हालांकि, सहजीवी इंटरैक्शन के आसपास के सवालों के जवाब देने के लिए, कोरल होस्ट और उसके अल्गल सिम्बियोट्स के मेटाबोलाइट प्रोफाइल का स्वतंत्र रूप से विश्लेषण करना आवश्यक है, जिसे केवल ऊतकों के भौतिक पृथक्करण और अलगाव द्वारा प्राप्त किया जा सकता है, इसके बाद स्वतंत्र निष्कर्षण और विश्लेषण। जबकि मेटाबोलॉमिक्स का अनुप्रयोग कोरल क्षेत्र के लिए अपेक्षाकृत नया है, अनुसंधान समूहों के निरंतर प्रयासों के परिणामस्वरूप कोरल में मेटाबोलाइट्स का विश्लेषण करने के लिए मजबूत तरीकों का विकास हुआ है, जिसमें कोरल होस्ट ऊतक और अल्गल सिम्बियोट्स का पृथक्करण शामिल है।

यह पेपर होलोबियोन्ट पृथक्करण और जीसी-एमएस विश्लेषण के लिए मेटाबोलाइट्स के निष्कर्षण के लिए एक चरण-दर-चरण मार्गदर्शिका प्रस्तुत करता है, जिसमें विचार के लिए प्रमुख अनुकूलन चरण शामिल हैं। हम प्रदर्शित करते हैं कि कैसे, एक बार स्वतंत्र रूप से विश्लेषण करने के बाद, दो अंशों (कोरल और सिम्बियोडिनियासी) का संयुक्त मेटाबोलाइट प्रोफाइल पूरे (होलोबियोन्ट) के प्रोफाइल के समान है, लेकिन ऊतकों को अलग करके, हम दो भागीदारों के बीच चयापचय और बातचीत के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी भी प्राप्त कर सकते हैं जो अकेले पूरे से प्राप्त नहीं की जा सकती है।

Introduction

मेटाबोलाइट्स सेलुलर प्रक्रियाओं के अंतिम उत्पादों का प्रतिनिधित्व करते हैं, और मेटाबोलॉमिक्स - किसी दिए गए जीव या पारिस्थितिकी तंत्र द्वारा उत्पादित मेटाबोलाइट्स के सूट का अध्ययन -जीव के कामकाज का प्रत्यक्ष माप प्रदान कर सकता है। यह पारिस्थितिक तंत्र, सहजीवी इंटरैक्शन और बहाली उपकरणों की खोज के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, क्योंकि अधिकांश प्रबंधन रणनीतियों का लक्ष्य विशिष्ट पारिस्थितिकी तंत्रसेवा कार्यों को संरक्षित (या पुनर्स्थापित) करना है। कोरल रीफ्स एक जलीय पारिस्थितिकी तंत्र है जो सहजीवी बातचीत को स्पष्ट करने और समुदाय-स्तर और पारिस्थितिकी तंत्र-स्तरके प्रभावों के लिए कोरल शारीरिक प्रतिक्रियाओं को जोड़ने के लिए मेटाबोलॉमिक्स के संभावित मूल्य को प्रदर्शित करता है। उच्च-थ्रूपुट गैस क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (जीसी-एमएस) का आवेदन विशेष रूप से उच्च चयनात्मकता और संवेदनशीलता के साथ मेटाबोलाइट वर्गों की एक विस्तृत श्रृंखला का तेजी से विश्लेषण करने की क्षमता के कारण मूल्यवान है, वर्णक्रमीय पुस्तकालय उपलब्ध होने पर तेजी से यौगिक पहचान प्रदान करता है, और प्रति नमूना अपेक्षाकृत कम लागत के साथ उच्च स्तर की प्रजनन क्षमता और सटीकता प्रदान करता है।

कोरल होलोबियोन्ट्स हैं जिनमें कोरल जानवर, प्रकाश संश्लेषक डाइनोफ्लैगलेट एंडोसिम्बियोन्ट्स (परिवार: सिम्बियोडिनियासी4), और एक जटिल माइक्रोबायोम 5,6 शामिल हैं। कुल मिलाकर, होलोबियोन्ट की फिटनेस को मुख्य रूप से छोटे अणुओं और तत्वों के आदान-प्रदान के माध्यम से बनाए रखा जाता है ताकि प्रत्येक सदस्यके चयापचय कामकाज का समर्थन किया जा सके। मेटाबोलिक दृष्टिकोण सहजीवन विशिष्टता 9,11 के चयापचय आधार को स्पष्ट करने के लिए विशेष रूप से शक्तिशाली साबित हुए हैं, थर्मल तनाव के लिए विरंजन प्रतिक्रिया 7,8,12,13, रोग प्रतिक्रियाएं 14, प्रदूषण जोखिम प्रतिक्रियाएं15, फोटोक्लीमेशन 16, और कोरल में रासायनिक सिग्नलिंग 17, साथ ही बायोमार्कर खोज 18 में सहायता करती हैं।, 19. इसके अतिरिक्त, मेटाबोलॉमिक्स डीएनए- और आरएनए-आधारित तकनीकों 9,20 से अनुमानित निष्कर्षों की मूल्यवान पुष्टि प्रदान कर सकता है। इसलिए, रीफ स्वास्थ्य का आकलन करने और रीफसंरक्षण के लिए उपकरण विकसित करने के लिए मेटाबोलॉमिक्स के उपयोग के लिए काफी संभावना है, जैसे कि तनाव18,19 के चयापचय बायोमार्कर का पता लगाने के माध्यम से और पोषण सब्सिडी21 जैसी सक्रिय प्रबंधन रणनीतियों की क्षमता की जांच करने के लिए।

मेजबान और सिम्बियोनेट कोशिकाओं को अलग करना और होलोबियोनेट के रूप में एक साथ होने के बजाय स्वतंत्र रूप से उनके मेटाबोलाइट प्रोफाइल का विश्लेषण करना, साथी इंटरैक्शन, स्वतंत्र शारीरिक और चयापचय स्थिति और अनुकूलन के लिए संभावित आणविक तंत्र 11,12,22,23,24 के बारे में अधिक जानकारी प्राप्त कर सकता है।. कोरल और सिम्बियोडिनियासी को अलग किए बिना, जटिल जीनोम पुनर्निर्माण और चयापचय मॉडलिंग25 को छोड़कर, कोरल और / या सिम्बियोडिनेशिया के योगदान और चयापचय को स्वतंत्र रूप से स्पष्ट करना लगभग असंभव है, लेकिन इसे कोरल-डिनोफ्लैगलेट सिम्बायोसिस पर लागू किया जाना बाकी है। इसके अलावा, होलोबियोनेट के मेटाबोलाइट प्रोफाइल से मेजबान या अल्गल सिम्बियोनेट के व्यक्तिगत चयापचय के बारे में जानकारी निकालने का प्रयास गलत व्याख्या का कारण बन सकता है।

उदाहरण के लिए, हाल तक, कोरल और होलोबियोनेट ऊतकों के अर्क में सी 18: 3 एन -6, सी 18: 4 एन -3, और सी 16 पॉलीअनसेचुरेटेड फैटी एसिड की उपस्थिति को अल्गल सिम्बियोनेट से प्राप्त माना जाता था, क्योंकि कोरल को ओमेगा -3 फैटी एसिड के उत्पादन के लिए आवश्यक एक्स डिसैट्यूरेज़ नहीं माना जाता था; हालांकि, हाल के जीनोमिक साक्ष्य से पता चलता है कि कई सीनिडारियन में 3 पीयूएफए डी नोवो का उत्पादन करने और आगे बायोसिंथेसाइज़ करने की क्षमता होतीहै। स्थिर आइसोटोपिक लेबलिंग (जैसे, 13 सी-बाइकार्बोनेट, एनएएच 13सीओ3) केसाथ जीसी-एमएस के संयोजन का उपयोग दोनों नियंत्रण स्थितियों के तहत और बाहरी तनावों के जवाब में कोरल होलोबियोन्ट चयापचय नेटवर्क के माध्यम से प्रकाश संश्लेषक रूप से निश्चित कार्बन के भाग्य को ट्रैक करने के लिए किया जा सकता है। हालांकि, 13 सी भाग्य की ट्रैकिंग में एक महत्वपूर्ण कदम कोरल कोशिकाओं से कोरल ऊतक का पृथक्करण है- केवल तभी कोरल होस्ट अंश में 13सी-लेबल यौगिक की उपस्थिति को स्पष्ट रूप से कोरल में स्थानांतरित सिम्बायोडिनियासी-व्युत्पन्न मेटाबोलाइट या एक ट्रांसलोकेटेड लेबल यौगिक के डाउनस्ट्रीम उत्पाद के रूप में सौंपा जा सकता है। इस तकनीक ने लंबे समय से चली आ रही धारणा को चुनौती देकर अपनी शक्ति का प्रदर्शन किया है कि ग्लिसरॉल प्राथमिक रूप है जिसमें फोटोसिंथेट को सिम्बियोनेट से होस्ट29 में स्थानांतरित किया जाता है, साथ ही यह स्पष्ट किया जाता है कि ब्लीचिंग27,28 के दौरान और असंगत सिम्बियोडिनेसीप्रजातियों के जवाब में अंतर-साथी पोषण प्रवाह कैसे बदलता है।

जबकि ऊतकों को अलग करने का निर्णय मुख्य रूप से अनुसंधान प्रश्न से प्रेरित होता है, इस दृष्टिकोण की व्यावहारिकता, विश्वसनीयता और संभावित चयापचय प्रभावों पर विचार करना महत्वपूर्ण है। यहां, हम होलोबियोन्ट से मेटाबोलाइट्स के निष्कर्षण के लिए विस्तृत, प्रदर्शित तरीके प्रदान करते हैं, साथ ही साथ अलग-अलग मेजबान और सिम्बियोनेट अंश भी प्रदान करते हैं। हम स्वतंत्र रूप से मेजबान और सिम्बियोनेट के मेटाबोलाइट प्रोफाइल की तुलना करते हैं और ये प्रोफाइल होलोबियोनेट मेटाबोलाइट प्रोफाइल की तुलना कैसे करते हैं।

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Protocol

नोट: प्रयोगात्मक डिजाइन, नमूना संग्रह और भंडारण को कहीं और विस्तार से वर्णित किया गयाहै 2,30,31. संग्रह और प्रयोग से पहले जंगली कोरल के संग्रह के लिए परमिट अनुमोदन प्राप्त किया जाना चाहिए। यहां के नमूने बटाविया कोरल फार्म्स (गेराल्डटन, डब्ल्यूए) से आयातित मोंटीपोरा मोलिस (हरे रंग-मॉर्फ) की कॉलोनियों से एकत्र किए गए थे, जो मूल रूप से एक्वाकल्चर लाइसेंस एक्यू 1643 के तहत 1 मीटर की गहराई पर अबरोहलोस द्वीप समूह (पश्चिमी ऑस्ट्रेलिया; 28 °52'43.3"एस 114 °00'17.0"ई) से एकत्र किए गए थे। नमूने से पहले, कॉलोनियों को 35 पीएसयू पर 800 एल मछलीघर में, नीले और सफेद प्रकाश के तहत 150 μmol फोटॉन -2 -s-1 पर और 3 महीने के लिए 25 डिग्री सेल्सियस ± 0.5 डिग्री सेल्सियस पर आयोजित किया गया था। कोरल टुकड़े (~ 5 सेमी2, एन = 6) तरल नाइट्रोजन में स्नैप-जमे हुए थे और प्रसंस्करण तक -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किए गए थे।

1. निष्कर्षण समाधान और उपकरण की तैयारी

  1. कोरल ऊतक हटाने से कम से कम 1 दिन पहले, निष्कर्षण समाधान और उपकरण तैयार करें।
  2. 4 डिग्री सेल्सियस पर साफ, डिटर्जेंट मुक्त ग्लासवेयर में अल्ट्राप्योर पानी छिड़कें।
  3. 100% एलसी-ग्रेड मेथनॉल को उपयुक्त आंतरिक मानक (ओं) (जैसे, 13सी6 सोर्बिटोल) की 10 μg-mL-1 अंतिम एकाग्रता के साथ मिलाएं।
  4. आधे 100% एलसी-ग्रेड मेथनॉल और आधे अल्ट्राप्योर पानी का उपयोग करके 50% मेथनॉल निष्कर्षण समाधान बनाएं। -20 डिग्री सेल्सियस पर दोनों मेथनॉल समाधान स्टोर करें।
    नोट: मेटाबोलाइट्स के क्षरण को रोकने में मदद करने के लिए, एक समय में पांच प्रवाल टुकड़ों के बैचों में नमूना प्रसंस्करण चरणों को करने की सिफारिश की जाती है, जिसमें एक अतिरिक्त जैविक (केवल पानी) रिक्त (कुल नमूने एन = 6) होता है। एक बार जब प्रत्येक कोरल नमूने को दो अंशों (कोरल होस्ट ऊतक, अब से "होस्ट", और माइक्रोएल्गल कोशिकाओं, अब से "सिम्बियोन्ट") में विभाजित किया जाता है, तो एक प्रसंस्करण बैच में नमूनों की कुल संख्या 12 होगी।

2. कोरल चयापचय शमन

नोट: प्रयोगात्मक डिजाइन, नमूना संग्रह और भंडारण को कहीं और विस्तार से वर्णित किया गयाहै 2,30,31. हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि चयापचय को बुझाने में लगने वाला समय (यानी, कोरल नमूना संग्रह और संरक्षण के बीच का समय) मूल प्रतिक्रिया30 को पकड़ने के लिए महत्वपूर्ण है। नमूना क्षरण या गैर-लक्ष्यशारीरिक प्रतिक्रियाओं के कारण मेटाबोलाइट संरचना में परिवर्तन को रोकने के लिए संग्रह के बाद जितनी जल्दी हो सके नमूना संरक्षित करें।

  1. कोरल टुकड़े को बाँझ नमूना संग्रह बैग में रखें, और जितना संभव हो सके किसी भी अतिरिक्त समुद्री जल को सूखा दें। नमूने को कम से कम 30 सेकंड के लिए तरल नाइट्रोजन में डुबोएं। जितनी जल्दी हो सके नमूने को भंडारण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में ले जाएं।
    नोट: नमूने को प्रसंस्करण तक प्रकाश-अवरुद्ध कंटेनरों में -80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज किया जा सकता है, फ्रीज-पिघलाव चक्र से बचा जा सकता है।

3. कंकाल से कोरल ऊतक हटाना

नोट: नमूनों को हर समय बर्फ (4 डिग्री सेल्सियस) पर रखा जाना चाहिए ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि वे चल रहे चयापचय को रोकते हुए तरल रूप में एक साथ हैं।

  1. बर्फ पर एक साफ, बाँझ नमूना संग्रह बैग रखें ताकि बैग स्थिर हो और उथले कुएं में बर्फ के ऊपर खुला हो लेकिन बर्फ में डूबा न हो। बैग में 10 मिलीलीटर ठंडा (4 डिग्री सेल्सियस) अल्ट्राप्योर पानी जोड़ें।
    नोट: यह ठंडे दबाव वाली हवा और आसपास की बर्फ के कारण कोरल टुकड़े के बार-बार फ्रीज-पिघलने से बचने में मदद करेगा।
  2. निष्फल चिमटी के साथ एक कोरल टुकड़े का चयन करें, और बाँझ पाश्चर पिपेट का उपयोग करके ठंडे (4 डिग्री सेल्सियस) अल्ट्राप्योर पानी से कुल्ला करें जब तक कि कोई समुद्री जल अवशेष न रहे। कुल्ला किए गए कोरल टुकड़े को 10 मिलीलीटर अल्ट्राप्योर पानी वाले बैग में डुबोएं।
    नोट: यह कुल्ला किसी भी अवशिष्ट लवण को हटाने के लिए महत्वपूर्ण है जो डाउनस्ट्रीम विश्लेषण में हस्तक्षेप करेगा। नमूने को 4 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखने के लिए बैग के माध्यम से पानी या कोरल टुकड़े के साथ हाथ के संपर्क से बचें।
  3. विद्युत टेप के साथ एक एयर गन के अंत में एक बाँझ 1 एमएल पिपेट टिप टेप करें, जिसमें ~ 5 मिमी टिप के अंत को काट दिया जाए (चित्रा 1 ए)।
  4. एयर गन को कोरल टुकड़े पर रखें, जिसमें बैग आधा सील हो और कोरल टुकड़े पर पानी के गोलाकार आंदोलन को प्रोत्साहित करके ऊतक को धीरे से हटाने के लिए कम-मध्यम पर हवा का प्रवाह हो।
  5. ~ 3 मिनट के बाद, या जब कंकाल से सभी ऊतक हटा दिए गए प्रतीत होते हैं, तो हवा बंद कर दें, और एयरब्रश को हटा दें। बैग को पूरी तरह से सील करें।
  6. बैग के निचले कोने में सभी हटाए गए कोरल ऊतक को निचोड़ें। विपरीत कोने को काट दें और धीरे से बैग की सामग्री को बर्फ पर 15 एमएल ट्यूब में डालें।

4. वैकल्पिक समरूपीकरण

नोट: कुछ प्रवाल प्रजातियां दूसरों की तुलना में अधिक चिपचिपी होती हैं, जिसका अर्थ है कि एयर-ब्रशिंग एक घोल के बजाय झुरमुट में ऊतक को हटा देगा। यदि हवा से ब्रश किए गए होमोजेनेट में ऊतक के झुरमुट दिखाई देते हैं, तो सभी नमूनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक होमोजेनाइजेशन चरण जोड़ा जा सकता है।

  1. एक यांत्रिक सॉ-टूथ होमोजिनाइज़र को 4 डिग्री सेल्सियस 70% मेथनॉल के साथ दो बार और अंत में 4 डिग्री सेल्सियस अल्ट्राप्योर पानी से साफ करें।
  2. कोरल नमूने को ~ 1 मिनट के लिए 15 एमएल ट्यूब में होमोजिनाइज़ करें जब तक कि नमूना पूरी तरह से समरूप न हो जाए और कोई झुरमुट दिखाई न दे।
  3. प्रत्येक नमूने के बीच चरण 4.1 के रूप में होमोजिनाइज़र को साफ करें। नमूनों में समरूपीकरण समय को सुसंगत रखें।

5. सामान्यीकरण के लिए नमूना संग्रह

  1. सिम्बियोडिनेसी सेल गणना, कोरल होस्ट ऊतक प्रोटीन सामग्री विश्लेषण और क्लोरोफिल एक अनुमान के लिए होमोजिनाइज्ड ऊतक से 1,000 μL एलिकोट एकत्र करें। विश्लेषण के लिए तैयार होने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें (अनुभाग 10)।

6. वैकल्पिक कोरल होस्ट ऊतक-सिम्बायोडिनियासी सेल पृथक्करण।

  1. प्रशीतित सेंट्रीफ्यूज का उपयोग करके 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 2,500 × ग्राम पर कोरल होमोजेनेट को सेंट्रीफ्यूज करें।
    नोट: यह गति मेजबान ऊतक से उनकी सेल की दीवारों को बरकरार रखते हुए, भारी सिम्बियोडिनियासी कोशिकाओं को अलग करने के लिए इष्टतम है, जो सतह पर तैरनेवाला में निलंबित है।
  2. मेजबान सामग्री युक्त सतह पर तैरनेवाला को हटा दें, और एक नई 15 एमएल ट्यूब में रखें।
    नोट: मेजबान ऊतक से लिपिड आमतौर पर सिम्बियोनेट कोशिकाओं के शीर्ष पर एक संकीर्ण गुलाबी / सफेद परत बनाते हैं। इस परत को पाइपिंग के माध्यम से घुलनशील मेजबान सुपरनैटेंट के साथ एकत्र किया जा सकता है (चित्रा 1 बी)।
  3. मेजबान को ठीक 1 मिनट के लिए जोरदार भंवर दें। अल्गल गोली का नमूना रखें और बर्फ पर सतह पर तैरनेवाला नमूना रखें।
  4. अल्गल गोली में 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिलीलीटर अल्ट्राप्योर पानी जोड़ें। गोली को फिर से निलंबित करने के लिए ठीक 2 मिनट के लिए जोरदार भंवर।
    नोट: यदि सिम्बियोडिनेसी जीनोटाइपिंग के लिए कोरल कॉलोनी से 1 सेमी के अलग-अलग टुकड़े एकत्र नहीं किए गए थे, तो सिम्बियोडिनेसी सेल सस्पेंशन का 200 μL एलिकोट यहां एकत्र किया जा सकता है, पसंदीदा डीएनए बफर समाधान में संरक्षित किया जा सकता है, और सिम्बियोडिनेसी जीनोटाइपिंग के लिए थर्बर एट अल.30 में वर्णित के रूप में संग्रहीत किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, गोंजालेज-पेच एट अल.12 के अनुसार)।
  5. चरण 6.1-6.4 को एक बार फिर दोहराएँ।
    नोट: मेजबान और सिम्बियोनेट का विश्वसनीय पृथक्करण कोरल बायोमास और प्रजातियों पर निर्भर करता है, क्योंकि कुछ प्रजातियां दूसरों की तुलना में अधिक चिपचिपी हो सकती हैं। कम से कम तीन धोने के चरणों की सिफारिश की जाती है, लेकिन इसे पृथक्करण की सफलता के आधार पर बढ़ाया जा सकता है। धोने के चरण 4.7-4.9 को तब तक दोहराएं जब तक कि मेजबान अंश के तल में कोई सिम्बायोडिनियासी कोशिकाएं नहीं देखी जा सकती हैं और जब तक कि सिम्बियोडिनियासी अंश मेजबान सामग्री से स्पष्ट रूप से मुक्त नहीं होता है (उदाहरण के लिए, शीर्ष पर कोई सफेद परत नहीं) (चित्रा 1)।
  6. मेजबान सामग्री युक्त सतह पर तैरनेवाला को हटा दें, और एक नई 15 एमएल ट्यूब में रखें।
  7. 15 एमएल ट्यूब में सिम्बियोनेट गोली को बनाए रखें।

7. नमूना सुखाने

  1. या तो होलोबियोनेट होमोजेनेट या अलग किए गए मेजबान और सिम्बियोडिनियासी अंशों दोनों को ~ 120 मिनट के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज करें। -85 डिग्री सेल्सियस पर 0.01 एमबार वैक्यूम के साथ रात भर नमूनों को लियोफिलाइज़ करें।
    नोट: लियोफिलाइजेशन के दौरान नमूना हानि से बचने के लिए, एक अन्य बाँझ ट्यूब, या बाँझ पैराफिल्म से काटे गए ढक्कन का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है, जिसमें बाँझ 25 ग्राम सुई का उपयोग करके सावधानीपूर्वक ~ 2 मिमी छेद छिद्रित होता है।
  2. सूखने पर, प्रयोगशाला संतुलन का उपयोग करके, निम्नलिखित में से एक का वजन करें: 1) 25 मिलीग्राम होलोबियोनेट; 2) सिम्बियोनेट अंश के 15 मिलीग्राम; या 3) प्रत्येक नमूने से 30 मिलीग्राम मेजबान ऊतक को अलग-अलग 2 एमएल प्लास्टिसाइज़र-मुक्त माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में विभाजित करें।
    नोट: महत्वपूर्ण कदम: निष्कर्षण के लिए बायोमास का अनुकूलन यह सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है कि पर्याप्त सिग्नल सुनिश्चित करते समय जीसी-एमएस ओवरलोड नहीं है। सूखे कोरल सामग्री बहुत स्थिर है। नमूना हानि से बचने के लिए, नमूने और वजन वाहिकाओं से इलेक्ट्रोस्टैटिक चार्ज को खत्म करने के लिए एंटी-स्टैटिक उपकरणों का उपयोग करें। एक सरल और लागत प्रभावी विकल्प नमूना ट्यूब के नीचे कपड़े धोने की ड्रायर शीट रखना है। सूखे सिम्बियोनेट गोली को बाँझ ब्लेड का उपयोग करके वांछित वजन तक काटा जा सकता है।

8. इंट्रासेल्युलर मेटाबोलाइट निष्कर्षण

  1. लियोफिलाइज्ड होलोबियोनेट से इंट्रासेल्युलर मेटाबोलाइट निष्कर्षण:
    1. आंतरिक मानक (आईएस) के साथ 100% ठंडा (−20 डिग्री सेल्सियस) मेथनॉल के 400 μL जोड़ें; 13सी6 सोर्बिटोल और / या 13सी5-15 एन वेलिन, 10μM पर) प्रत्येक ट्यूब पर।
    2. प्रत्येक नमूने में 710-1,180 μm एसिड-धुले हुए ग्लास मोती (~ 10 मिलीग्राम) की एक छोटी संख्या जोड़ें। 50 हर्ट्ज पर एक मोती मिल में 3 मिनट के लिए प्रीचिल्ड (-20 डिग्री सेल्सियस) मोती मिल में रखें।
    3. प्रत्येक ट्यूब में आईएसएस (13 सी6 सोर्बिटोल और / या 13सी5-15 एन वेलिन, 10 μM पर) के साथ 100% ठंडा (−20 डिग्री सेल्सियस) मेथनॉल का एक अतिरिक्त 600 μL जोड़ें।
    4. 1 मिनट के लिए मिश्रण करने के लिए भंवर। 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रोटिसरी शेकर पर रखें।
  2. अलग-अलग लियोफिलाइज्ड सिम्बियोडिनियासी कोशिकाओं से इंट्रासेल्युलर मेटाबोलाइट निष्कर्षण:
    1. सूखे सिम्बियोडिनियासी सामग्री में आईएसएस (13 सी6 सोर्बिटोल और / या 13सी5-15 एन वेलिन, 10μM पर) के साथ 100% ठंडा (−20 डिग्री सेल्सियस) मेथनॉल का 200 μL जोड़ें।
    2. 710-1,180 μm एसिड-धुले हुए ग्लास मोती (~ 10 मिलीग्राम) की एक छोटी संख्या जोड़ें। 50 हर्ट्ज पर एक मोती मिल में 3 मिनट के लिए प्रीचिल्ड (-20 डिग्री सेल्सियस) मोती मिल में रखें।
    3. आईएसएस के साथ 100% ठंडा (−20 डिग्री सेल्सियस) मेथनॉल का एक और 800 μL जोड़ें, और 30 s के लिए भंवर।
  3. अलग किए गए लियोफिलाइज्ड मेजबान ऊतक से इंट्रासेल्युलर मेटाबोलाइट निष्कर्षण:
    1. सूखे मेजबान सामग्री में 100% ठंडा (−20 डिग्री सेल्सियस) एलसी-ग्रेड मेथनॉल युक्त आईएसएस (13 सी6 सोर्बिटोल और / या 13सी5-15 एन वेलिन, 10μM पर) का 1 एमएल जोड़ें।
    2. भंवर को 20 सेकंड के लिए मिलाया जाए। 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेट किए गए सोनिकेशन स्नान में एक फ्लोटिंग ट्यूब होल्डर में रखें।

9. मेटाबोलाइट निकालने की शुद्धि

  1. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 3,000 × ग्राम पर नमूने (होलोबियोनेट / होस्ट / सिम्बियोनेट) को सेंट्रीफ्यूज करें।
  2. सभी सुपरनैटेंट को एक नए 2 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें, सावधान रहें कि सेल मलबे गोली को परेशान न करें।
    नोट: ये अर्ध-ध्रुवीय अर्क हैं। इन्हें अस्थायी रूप से बर्फ पर रखा जा सकता है लेकिन अंधेरे में -80 डिग्री सेल्सियस पर लंबे समय तक संग्रहीत किया जा सकता है।
  3. शेष सेल मलबे में, 50% ठंडा (−20 डिग्री सेल्सियस) मेथनॉल के 1,000 μL जोड़ें। 1 मिनट के लिए जोरदार भंवर को फिर से निलंबित करें।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 3,000 × ग्राम पर नमूने सेंट्रीफ्यूज करें।
  5. एक ही नमूने से अर्ध-ध्रुवीय अर्क के साथ सतह पर तैरनेवाला (ध्रुवीय अर्क) एकत्र करें और पूल करें।
    नोट: सेल मलबे को -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है और प्रोटीन सामग्री सामान्यीकरण (धारा 11) के लिए उपयोग किया जा सकता है।
  6. सभी अवक्षेपों को हटाने के लिए 15 मिनट के लिए 16,100 ग्राम पर पूल किए गए अर्क को सेंट्रीफ्यूज करें, और सुपरनैटेंट को एक नए प्लास्टिसाइज़र-मुक्त माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब (2 एमएल) में ले जाएं।
    नोट: नमूना अर्क अंधेरे में -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  7. विश्लेषण करने के लिए तैयार होने पर, प्रत्येक अर्क के 50 μL को एक ग्लास सम्मिलित में डालें। वैक्यूम कंसंट्रेटर का उपयोग करके 30 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए ध्यान केंद्रित करें। चार और बार दोहराएं (कुल सूखे अर्क के 250 μL के लिए)।
    नोट: सूखे नमूने विश्लेषण तक डेसिकेंट स्थितियों के तहत कमरे के तापमान पर संग्रहीत किया जा सकता है।

10. मेटाबोलाइट डेरिवेटाइजेशन।

नोट: ध्रुवीय मेटाबोलाइट्स के मेथॉक्सिमेशन और ट्राइमिथाइलसिलेशन के लिए एक दो-चरण ऑनलाइन व्युत्पन्न प्रक्रिया का उपयोग किया जाता है।

  1. प्रत्येक नमूने में मेथॉक्सीमाइन हाइड्रोक्लोराइड (पाइरिडाइन में 30 मिलीग्राम / एमएल) के 25 μL जोड़ें।
  2. 2 घंटे के लिए 750 आरपीएम पर सेट ऑर्बिटल शेकर पर 37 डिग्री सेल्सियस पर आंदोलन करें।
  3. प्रत्येक नमूने में एन, ओ-बिस (ट्राइमिथाइलसिलिल) ट्राइफ्लोरोसिटामाइड + ट्राइमिथाइलक्लोरोसिलेन के 25 μL जोड़ें।
  4. 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 750 आरपीएम पर फिर से आंदोलन करें।
  5. जीसी पर 1: 10 विभाजित अनुपात में 1 μL इंजेक्ट करने से पहले नमूने को 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर बराबर करने की अनुमति दें।

11. गैस क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण

नोट: मास स्पेक्ट्रोमीटर को ट्रिस-(पेरफ्लोरोब्यूटाइल)-अमाइन (सीएफ 43) का उपयोग करके निर्माता की सिफारिशों के अनुसार ट्यून किया जाना चाहिए।

  1. 1 एमएल / मिनट की निरंतर कॉलम प्रवाह दर पर वाहक गैस के रूप में अल्ट्रा-उच्च शुद्धता हीलियम का उपयोग करें।
  2. 1 μm फिल्म मोटाई और 0.25 मिमी आंतरिक व्यास के साथ 30 मीटर डीबी -5 कॉलम का उपयोग करें।
  3. जीसी ओवन प्रोग्राम
    1. इनलेट तापमान को 280 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें।
    2. 100 डिग्री सेल्सियस के ओवन तापमान के साथ इंजेक्शन पर शुरू करें, और 4 मिनट के लिए पकड़ें।
    3. तापमान को 10 डिग्री सेल्सियस / मिनट से 320 डिग्री सेल्सियस तक बढ़ाएं, और फिर 11 मिनट तक पकड़ें।
  4. मास स्पेक्ट्रोमीटर पैरामीटर
    1. एमएस ट्रांसफर लाइन को 280 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें, और आयन स्रोत को 200 डिग्री सेल्सियस पर समायोजित करें।
    2. एकाधिक प्रतिक्रिया निगरानी (एमआरएम) उत्पाद आयन उत्पन्न करने के लिए टकराव सेल गैस के रूप में आर्गन का उपयोग करें।
    3. एमआरएम लक्ष्यों वाले समय-खंडित एमआरएम लाइब्रेरी के सापेक्ष मेटाबोलाइट का पता लगाने का लक्ष्य प्राप्त करें।

12. सिम्बियोडिनेसी सेल गिनती, कोरल होस्ट ऊतक प्रोटीन सामग्री विश्लेषण, और क्लोरोफिल एक अनुमान।

  1. सिम्बियोडिनेसी सेल की गिनती:
    1. कोरल ऊतक होमोजेनेट का एक एलिकोट लें।
    2. शैवाल को पेलेट करने के लिए नमूने को 2,000 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें।
    3. अल्गल गोली से ~ 200 μL सुपरनैटेंट निकालें, और एक नई माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में रखें।
      नोट: यह प्रोटीन नमूना होगा जिसका उपयोग डेटा को सामान्य करने के लिए किया जाएगा; यदि आवश्यक हो, तो विश्लेषण करने से पहले इसे -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    4. 1 मिलीलीटर फ़िल्टर किए गए समुद्री पानी में अल्गल गोली को धीरे-धीरे ऊपर और नीचे पाइप करके पुन: निलंबित करें। यदि आवश्यक हो, तो सेल गिनती को सुविधाजनक बनाने के लिए अल्गल निलंबन को पतला करें।
    5. कक्षों में से एक में 10 μL जोड़कर प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके सेल गिनती का संचालन करें। प्रति नमूना 8-10 गिनती पूरी करें।
      नोट: अल्गल कोशिकाओं की गिनती के लिए वैकल्पिक तरीकों को भी लागू किया जा सकता है जहां उपलब्ध है (जैसे, फ्लो साइटोमेट्री, उच्च-थ्रूपुट कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी)।
    6. उपयोग किए गए किसी भी कमजोर पड़ने वाले कारकों को ध्यान में रखते हुए, सिम्बियोनेट कोशिकाओं (एमएल -1) की एकाग्रता की गणना करें।
  2. प्रोटीन सामग्री के लिए परख
    1. नमूना प्रोटीन सामग्री की मात्रा निर्धारित करें (उदाहरण के लिए, ब्रैडफोर्ड के कलरिमेट्रिक परख के माध्यम से, जैसा कि शुरू में ब्रैडफोर्ड एट अल .33 द्वारा वर्णित किया गया था, या लोरी परख 34,35, जिसके लिए प्रोटोकॉल को कहीं और सीनिडारियन के लिए वर्णित किया गया है 36)।
  3. क्लोरोफिल एक निष्कर्षण
    1. ~ 200, 000 कोशिकाओं की एक सेल गोली का उपयोग करें, जमे हुए या ताजा।
    2. प्रत्येक अल्गल गोली को एक ग्लास सिंटिलेशन शीशी में 2 मिलीलीटर डाइमिथाइलफॉर्मामाइड (डीएमएफ) में स्थानांतरित करें, और 48 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में इनक्यूबेट करें।
      नोट: डीएमएफ विषाक्त और कार्सिनोजेनिक है, इसलिए नमूना तैयारी को फ्यूम हुड के तहत पूरा किया जाना चाहिए जो जितना संभव हो उतना अंधेरा और बर्फ पर हो। यदि < 200,000 कोशिकाएं हैं, तो कम डीएमएफ का उपयोग करें।
    3. 16,000 × ग्राम पर 3 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज।
    4. फोटोमेट्रिक माप के लिए यूवी -96 वेल प्लेट में 200 एमएल स्थानांतरित करें। प्रत्येक नमूने को रिक्त स्थान के रूप में डीएमएफ के साथ तीन प्रतियों में चलाएं।
    5. तरंग दैर्ध्य (ई) 663.8 एनएम, 646 एनएम और 750 एनएम पर अवशोषण को मापें। अन्य दोनों तरंग दैर्ध्य पर अवशोषण से 750 एनएम पर अवशोषण घटाएं।
      नोट: 750 एनएम पर मापना नमूने में किसी भी बिखराव या टर्बिडिटी के लिए सही है।
    6. समीकरण (1) का उपयोग करके क्लोरोफिल ए एकाग्रता (μg/mL) की गणना करें:
      Chl a सांद्रता (μg/mL) = (12.00 × E 663.8) - (3.11 × E646.8) (1)

13. सामान्यीकरण के लिए मेटाबोलाइट निष्कर्षण के बाद सेल बायोमास का परिमाणीकरण।

नोट: नीचे वर्णित सेल बायोमास की मात्रा का ठहराव के लिए दो विकल्प हैं: एक संशोधित ब्रैडफोर्ड कलरमेट्रिक विधि का उपयोग करके बायोमास से संबंधित प्रोटीन का परिमाणीकरण और सेल मलबे सूखे वजन का माप। या तो विधि का उपयोग करना उपयुक्त है, क्योंकि दोनों सेल बायोमास की सटीक मात्रा प्रदान करते हैं।

  1. सेल मलबे की प्रोटीन सामग्री
    1. जमे हुए सेल मलबे को 0.2 एम एनएओएच के 1 एमएल के साथ फिर से निलंबित करें, और 20 मिनट के लिए 98 डिग्री सेल्सियस पर नमूने को इनक्यूबेट करें।
    2. नमूने को ~ 10 मिनट के लिए बर्फ पर ठंडा करें, और परिवेश के तापमान पर 5 मिनट के लिए 3,000 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें।
    3. नमूना प्रोटीन सामग्री की मात्रा निर्धारित करें (उदाहरण के लिए, ब्रैडफोर्ड के कलरिमेट्रिक परख के माध्यम से , जैसा कि शुरू में ब्रैडफोर्ड एट अल .33 द्वारा वर्णित किया गया था और स्मार्ट एट अल .37 द्वारा संशोधित किया गया था)।
  2. सेल मलबे सूखे वजन का माप।
    1. डबल-आसुत जल (~ 10 एमएल) में इंट्रासेल्युलर मेटाबोलाइट निष्कर्षण से सेल मलबे को फिर से निलंबित करें।
    2. पहले से तौले हुए झिल्ली फिल्टर (0.22 μm पोर, 47 मिमी) का उपयोग करके वैक्यूम के तहत समाधान को फ़िल्टर करें।
    3. झिल्ली फिल्टर में बायोमास के पूर्ण हस्तांतरण को सुनिश्चित करने के लिए बायोमास युक्त ट्यूबों को दो बार अल्ट्राप्योर पानी से धोएं।
    4. बायोमास युक्त झिल्ली फिल्टर को हटा दें और इसे माइक्रोवेव ओवन (कम शक्ति; 20 मिनट के लिए ~ 250 डब्ल्यू) का उपयोग करके सुखाएं।
    5. फ़िल्टर पेपर को रात भर एक डेसिकेटर में स्टोर करें। फिल्टर पेपर के सूखे वजन को रिकॉर्ड करें और कुल वजन से सूखी झिल्ली फिल्टर (नमूना फिल्टर के साथ सूखे एक साफ सूखी झिल्ली फिल्टर का उपयोग करके) के वजन को घटाकर बायोमास के सूखे वजन की गणना करें।

14. डेटा विश्लेषण

  1. मेटाबोलाइट डेटाबेस का उपयोग करके मेटाबोलाइट लक्ष्यों का विश्लेषण करें जहां प्रत्येक लक्ष्य में क्वांटिफायर और क्वालीफायर एमआरएम शामिल है।
  2. नेत्रहीन रूप से पता लगाए गए मेटाबोलाइट लक्ष्यों का निरीक्षण करें और आवश्यकतानुसार उन्हें मैन्युअल रूप से एकीकृत करें।
  3. प्रत्येक समूह के लिए प्रत्येक नमूने की सापेक्ष बहुतायत की गणना करने के लिए एक मेटाबोलाइट पीक क्षेत्र का उपयोग करें। आंतरिक मानक शिखर क्षेत्र का नमूना लेने के लिए मानों को रिक्त रूप से सही और सामान्यीकृत किया जाता है, और फिर स्मार्ट एट अल .37 के अनुसार सेल मलबे प्रोटीन सामग्री का नमूना लेने के लिए।
  4. सभी उपचार समूहों (एन = 23 मेटाबोलाइट्स) में 35% से अधिक सापेक्ष मानक विचलन वाले मेटाबोलाइट्स को छोड़ दें।
  5. डेटा (जैसे, क्यूब रूट) को बदलें, और उन्हें माध्य-केंद्र करें; विचरण के सामान्य वितरण और समरूपता की पुष्टि करें।
  6. डेटा विश्लेषण करें (एनोवा और हीटमैप निर्माण; उदाहरण के लिए, https://www.metaboanalyst.ca) 38 का उपयोग करना। "क्लस्टर", "फैक्टोएक्स्ट्रा", और "क्लस्टर" पैकेज का उपयोग करके उपचार परिवर्तनशीलता की जांच करने के लिए नमूनों को क्लस्टर करें। आर पैकेज "सुव्यवस्थित" का उपयोग करके आर और प्लॉट में "क्लुसगैप" फ़ंक्शन का उपयोग करके अंतराल सांख्यिकी (क्लस्टर39 की इष्टतम संख्या निर्धारित करने के लिए एक विधि) की गणना करें। उपचार मेटाबोलाइट प्रोफाइल (जैसे, प्राइमर में) के बीच अलगाव में महत्व की जांच करने के लिए पर्मानोवा का प्रदर्शन करें।

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Representative Results

इस कार्य के दौरान उत्पादित सभी आंकड़े पूरक जानकारी में उपलब्ध हैं।

मेजबान-सहजीवी पृथक्करण

Figure 1
चित्रा 1: कोरल मेजबान ऊतकों और सिम्बियोडिनियासी कोशिकाओं के पृथक्करण का सेटअप और सत्यापन। (ए) कोरल कंकाल से कोरल ऊतक को हटाने के लिए एयर गन सेटअप। एक पिपेट टिप को विद्युत टेप के साथ एयर गन से जोड़ा जाता है, और एक छोटा (~ 5 मिमी) खंड नोक से काटा जाता है ताकि टिप को हटाए बिना अधिक हवा बच सके। (बी) होलोबियोनेट और अलग मेजबान ऊतक (सुपरनैटेंट) और सिम्बियोडिनेसी कोशिकाओं (पेलेट) के उदाहरण। मान सेंट्रीफ्यूजेशन चरणों की संख्या का प्रतिनिधित्व करता है। तीर सिम्बियोनेट गोली के शीर्ष पर संकीर्ण मेजबान लिपिड परत को इंगित करता है जिसे मेजबान अंश के साथ एकत्र और जोड़ा जा सकता है। (C-E) ब्राइटफील्ड (ऊपर) और क्लोरोफिल ऑटोफ्लोरेसेंस (नीचे) माइक्रोस्कोपी छवियां मेजबान ऊतक और सिम्बियोनेट कोशिकाओं दोनों के साथ (सी) होलोबियोनेट के एलिकोट की छवियां, (डी) किसी भी क्लोरोफिल ऑटोफ्लोरेसेंस की अनुपस्थिति से सत्यापित सिम्बियोनेट कोशिकाओं के बिना मेजबान अंश, और (ई) बरकरार सिम्बियोनेट कोशिकाएं, मेजबान ऊतक को हटाने का प्रदर्शन करती हैं। स्केल सलाखों = 100 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

माइक्रोस्कोपिक विज़ुअलाइज़ेशन ने तीन धोने के चरणों (चित्रा 1 डी) के बाद मेजबान ऊतक के नमूनों में कोई सिम्बियोडिनेसी कोशिकाओं को नहीं दिखाया। इसी तरह, सिम्बियोनेट अंशों में न्यूनतम मेजबान ऊतक मौजूद थे (चित्रा 1 ई)। हालांकि, होलोबियोनेट होमोजेनेट (चित्रा 1 सी) से पता चला है कि इंट्रासेल्युलर सिम्बियोडिनियासी को सरल एयर-ब्रशिंग द्वारा उनके सहजीवन से पर्याप्त रूप से जारी नहीं किया जा सकता है और इस प्रकार, केन्द्रापसारक पृथक्करण (चित्रा 1 ई) की तुलना में यांत्रिक समरूपीकरण (प्रोटोकॉल खंड 4) या विलायक निष्कर्षण (प्रोटोकॉल खंड 8) के दौरान पर्याप्त रूप से नहीं छोड़ा जा सकता है।). यह सीमा होलोबियोन्ट नमूनों और होलोबियोन्ट प्रोफाइल में विशिष्ट टिप्पणियों के बीच कुछ बड़े अंतर-समूह भिन्नता की व्याख्या कर सकती है। उदाहरण के लिए, दो मेटाबोलाइट्स (ग्लाइकोलिक एसिड और 1-हेक्साडेकानॉल) होलोबियोनेट बनाम सिम्बियोनेट में काफी अधिक प्रचुर मात्रा में थे, लेकिन मेजबान बनाम सिम्बियोनेट में नहीं; यह होलोबियोनेट प्रोफाइल में इन मेटाबोलाइट्स की सापेक्ष बहुतायत में बड़े अंतर-समूह भिन्नता का परिणाम हो सकता है। विशेष रूप से, होलोबियोनेट नमूना 3 में व्यक्तिगत रूप से किसी भी सिम्बियोनेट या मेजबान नमूने की तुलना में डोडेकेनोइक एसिड, ग्लाइकोलिक एसिड और 1-हेक्स्डेकानोल की अपेक्षाकृत अधिक सांद्रता थी। चूंकि मेटाबोलाइट पीक क्षेत्र डेटा को प्रोटीन सामग्री का नमूना लेने के लिए सामान्यीकृत किया जाता है, यदि सिम्बियोनेट कोशिकाओं को मेजबान ऊतक से पर्याप्त रूप से साफ नहीं किया गया था, तो होलोबियोनेट प्रोटीन सामग्री को कम करके आंका जा सकता है, इस प्रकार बायोमास सामान्यीकरण को प्रभावित किया जा सकता है और इस नमूने में बायोमास के सापेक्ष उच्च मेटाबोलाइट बहुतायत की गणना की जा सकती है। यह आगे होलोबियोन्ट मेटाबोलॉमिक्स में बढ़ी हुई भिन्नता की क्षमता पर प्रकाश डालता है।

मेटाबोलाइट प्रोफाइल विश्लेषण
मास स्पेक्ट्रोमीटर मोड की पसंद किए जा रहे विश्लेषण पर निर्भर है। स्थिर-राज्य मेटाबोलाइट प्रोफाइलिंग के लिए, एमआरएम मोड में क्यूक्यूक्यू-एमएस का उपयोग करके एक व्यापक लक्षित पद्धति उच्च जैविक नमक सांद्रता द्वारा उत्पन्न होने वाले पृष्ठभूमि शोर के उन्मूलन के कारण बेहतर मेटाबोलाइट का पता लगाने और पहचान करने में सक्षम बनाती है। स्थिर आइसोटोप-लेबलिंग दृष्टिकोण ों के लिए, स्कैन मोड में चलने वाला एक मास स्पेक्ट्रोमीटर (यानी, एकल क्वाड्रोपोल, ट्रिपल क्वाड्रोपोल [क्यूक्यूक्यू], क्वाड्रोपोल-टाइम ऑफ फ्लाइट [क्यूटीओएफ]) मास आइसोटोपोलॉग ्स का पता लगाने की अनुमति देता है जो स्थिर आइसोटोपिक संवर्धन पैटर्न का संकेत देते हैं।

लक्षित जीसी-एमएस विश्लेषण शिमाडज़ू स्मार्ट मेटाबोलाइट डेटाबेस (वी 3; जिसमें लगभग 350 अंतर्जात मेटाबोलाइट्स और कई स्थिर समस्थानिक रूप से लेबल किए गए आंतरिक मानकों को शामिल किया गया है) और शिमाडज़ू लैबसॉल्यूशंस इनसाइट सॉफ्टवेयर का उपयोग करके पूरा किया गया था। सभी उपचारों में, 107 एनोटेटेड मेटाबोलाइट्स की पहचान की गई, जिसमें अमीनो एसिड, कार्बनिक एसिड, कार्बोहाइड्रेट, फैटी एसिड और स्टेरोल्स (पूरक तालिका एस 1) का एक सूट शामिल था। पूरक तालिका एस 2 में गुणात्मक और मात्रात्मक आयन जोड़े प्रदान किए जाते हैं। केमीन क्लस्टरिंग ने नमूनों के तीन अलग-अलग समूहों की पहचान की (एक अंतराल सांख्यिकीय परीक्षण द्वारा सत्यापित), जिसमें सभी नमूने अलग-अलग, अलग-अलग समूहों में थे; सिम्बियोन्ट्स क्लस्टर 1 में थे, क्लस्टर 2 में मेजबान, और क्लस्टर 3 में होलोबियोन्ट नमूने (चित्रा 2)।

Figure 2
चित्रा 2: मेटाबोलाइट प्रोफाइल का मतलब क्लस्टर विश्लेषण है । (ए) नमूना मेटाबोलाइट प्रोफाइल को यूक्लिडियन दूरी द्वारा क्लस्टर (एन = 3) की इष्टतम संख्या द्वारा क्लस्टर किया गया था, जिसे एक अंतराल सांख्यिकीय गणना के माध्यम से सत्यापित किया गया था। (बी) प्रत्येक क्लस्टर (लाल = क्लस्टर 1, हरा = क्लस्टर 2, नीला = क्लस्टर 3) के लिए औसत मेटाबोलाइट सापेक्ष बहुतायत (लाइन, क्लस्टर के अनुसार रंगीन) और आत्मविश्वास अंतराल (छायांकन, क्लस्टर के अनुसार रंगीन) का समानांतर समन्वय विज़ुअलाइज़ेशन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

मेजबान और सिम्बियोनेट मेटाबोलाइट प्रोफाइल तुलना।
मेजबान और सिम्बियोनेट प्रोफाइल एक दूसरे से काफी अलग थे (पेरमानोवा, टी = 16.909, पी < .001; पूरक तालिका एस 3, जिसमें 100 अलग-अलग मेटाबोलाइट्स मेजबान और सिम्बियोनेट अंशों (एनोवा, एफडीआर < .05) के बीच काफी भिन्न हैं; चित्रा 3 और पूरक तालिका एस 1)। इनमें से, 13 मेटाबोलाइट्स मेजबान अर्क की तुलना में सिम्बियोनेट में काफी अधिक प्रचुर मात्रा में थे, जिसमें इकोसैनोइड्स डोकोसाहेक्साएनोइक एसिड (सी 22: 6 [ डीएचए), इकोसापेंटेनोइक एसिड (सी 20: 5 [ ईपीए), और एराकिडोनिक एसिड (सी 20: 4 [ आरा) (एनोवा, एफडीआर < 0.05; चित्रा 3 और पूरक तालिका एस 1)। मेजबान अर्क (एनोवा, एफडीआर < 0.05) की तुलना में सिम्बियोनेट में कुल 87 मेटाबोलाइट्स कम प्रचुर मात्रा में थे; चित्रा 3 और पूरक तालिका एस 1)।

Figure 3
चित्रा 3: समूह तुलना के पोस्ट-हॉक विश्लेषण परिणामों के साथ मेटाबोलाइट सापेक्ष बहुतायत का हीटमैप विज़ुअलाइज़ेशन। मेजबान, सिम्बियोनेट और होलोबियोन्ट नमूने (एन = 5 प्रति समूह) वार्ड के लिंकेज के माध्यम से पदानुक्रमित क्लस्टर थे, और मेटाबोलाइट्स को यूक्लिडियन दूरी माप के अनुसार क्लस्टर किया गया था। रंगीन वर्ग पोस्ट हॉक ट्यूकी के एचएसडी (पूरक तालिका एस 1) के साथ एनोवा के माध्यम से पता लगाए गए समूह तुलना में महत्वपूर्ण अंतर दर्शाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अलग-अलग होस्ट और सिम्बियोनेट प्रोफाइल की तुलना में होलोबियोनेट मेटाबोलाइट प्रोफाइल।
होलोबियोनेट मेटाबोलाइट प्रोफाइल ने समूह के भीतर बड़ी परिवर्तनशीलता का प्रदर्शन किया, जो कि मीन्स विश्लेषण में होलोबियोन्ट क्लस्टर में नमूनों के बड़े पृथक्करण से प्रमाणित हुआ; विशेष रूप से, नमूना 3 और नमूना 4 को नमूना 1, नमूना 2 और नमूना 5 (चित्रा 2 ए) से आयाम 2 के साथ अलग किया गया था। होलोबियोन्ट नमूने अलग मेजबान और सिम्बियोनेट अंशों (चित्रा 2 ए) के बीच मध्यवर्ती थे। जबकि केमीन क्लस्टर वितरण (चित्रा 2 ए), समानांतर निर्देशांक (चित्रा 2 बी), और मेटाबोलाइट सापेक्ष बहुतायत (चित्रा 3) के हीटमैप विज़ुअलाइज़ेशन ने संकेत दिया कि होलोबियोनेट प्रोफाइल मेजबान अंश प्रोफ़ाइल से अधिक निकटता से मेल खाती है, होलोबियोनेट प्रोफ़ाइल दोनों मेजबान (पेरमानोवा, टी = 3.47, पी < 0.001) से काफी भिन्न है; पूरक तालिका एस 3)। और सिम्बियोनेट प्रोफाइल (पेरमानोवा, टी = 11.29, पी < 0.001; पूरक तालिका एस 3)। व्यक्तिगत मेटाबोलाइट स्तर पर, होलोबियोनेट में 66 और 82 मेटाबोलाइट्स क्रमशः मेजबान और सिम्बियोनेट प्रोफाइल से काफी भिन्न थे (एनोवा, एफडीआर < 0.05, पूरक तालिका एस 1)। इनमें से, 66 महत्वपूर्ण मेटाबोलाइट्स में से 54 (81.8%) में होलोबियोन्ट अंश की तुलना में मेजबान में काफी अधिक सापेक्ष बहुतायत थी, और 78 (95%) में सिम्बियोनेट अंश की तुलना में होलोबियोन्ट में काफी अधिक सापेक्ष बहुतायत थी; डीएचए, ग्लिसरॉल -3-फॉस्फेट, इनोसिटोल फॉस्फेट और फॉस्फोरिक एसिड (चित्रा 3) सहित सिम्बियोनेट अंशों में चार अधिक प्रचुर मात्रा में थे। आठ मेटाबोलाइट्स (दो फैटी एसिड [लिनोलिक (सी 18: 1) और मिरिस्टिक (सी 14: 0) एसिड सहित), पांच डाइकारबॉक्सिलिक एसिड और अमीनो एसिड गुआनिन) मेजबान और सिम्बियोनेट के बीच बहुतायत में काफी भिन्न थे, लेकिन होलोबियोन्ट अंश की तुलना में नहीं (चित्रा 3)।

पूरक तालिका एस 1: होलोबियोनेट में जीसी-एमएस विश्लेषण का उपयोग करके पहचाने गए प्रत्येक मेटाबोलाइट की सापेक्ष बहुतायत और अलग मेजबान और सिम्बियोनेट। मान मानक त्रुटि ± माध्य हैं, और पोस्ट हॉक विश्लेषण सहित प्रदान किए गए एनोवा परिणाम, रंगीन कोशिकाओं (कॉलम के, एल और एम) द्वारा इंगित किए जाते हैं। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका एस 2: पहचाने गए मेटाबोलाइट्स के लिए गुणात्मक और मात्रात्मक आयन जोड़े। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका एस 3: पेरमानोवा परिणाम। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

मेजबान और सिम्बियोनेट का पृथक्करण सरल सेंट्रीफ्यूजेशन के माध्यम से आसानी से और तेजी से प्राप्त किया जा सकता है, और यहां परिणाम बताते हैं कि अंशों को अलग करना विशिष्ट होलोबियोन्ट सदस्य योगदान के संकेत के रूप में मूल्यवान जानकारी प्रदान कर सकता है, जो कोरल स्वास्थ्य के कार्यात्मक विश्लेषण की ओर योगदान कर सकता है। वयस्क कोरल में, लिपिड संश्लेषण मुख्य रूप से निवासी अल्गल सिम्बियोनेट 40 द्वारा किया जाता है, जो लिपिड (जैसे, ट्राईसिलेग्लिसरॉल और फॉस्फोलिपिड्स) 41 और फैटी एसिड की आपूर्ति करता है जो तनाव वसूली को बढ़ावा दे सकता है 11,42. इस काम में सिम्बियोनेट बनाम होस्ट प्रोफाइल में अधिक प्रचुर मात्रा में पाए जाने वाले 13 मेटाबोलाइट्स में से 9 फैटी एसिड थे, जिनमें जैविक रूप से प्रासंगिक इकोसैनोइड्स डीएचए (सी 22: 6 [. इनोसिटोल फॉस्फेट सेल विकास, एपोप्टोसिस, एंडोसाइटोसिस और सेल भेदभाव सहित विभिन्न सेलुलर कार्यों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। इनोसिटोल आइसोफॉर्म और डेरिवेटिव की सापेक्ष बहुतायत अक्सर सहजीवन शिथिलता 7,11,27,28 के दौरान बदलती हुई पाई गई है, हालांकि कोरल-सिम्बियोडिनेसी सिम्बायोसिस सिम्बायोसिस में इन आइसोफॉर्म और उनके डेरिवेटिव की भूमिका स्पष्ट नहीं है। इस प्रकार, मेजबान और सिम्बियोनेट प्रोफाइल के बीच सापेक्ष बहुतायत में स्पष्ट अंतर इस ज्ञान में योगदान करने में मदद करता है।

कई अध्ययनों ने परिवेश और तनाव की स्थिति 13,43,44,45 के तहत कोरल चयापचय इंटरैक्शन और प्रदर्शन की जांच करने के लिए होलोबियोनेट मेटाबोलाइट प्रोफाइल का उपयोग किया है। यहां, हम दिखाते हैं कि होलोबियोन्ट होमोजेनेट के विश्लेषण के परिणामस्वरूप बड़े भीतर-उपचार परिवर्तनशीलता हो सकती है, और परिणामस्वरूप प्रोफाइल मेजबान- और / या सिम्बियोन्ट-विशिष्ट बहुतायत पैटर्न और समग्र होलोबियोनेट मेटाबोलोम में चयापचय योगदान को मुखौटा कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, 13 मेटाबोलाइट्स में से जो मेजबान अंश के सापेक्ष सिम्बियोनेट में काफी अधिक प्रचुर मात्रा में थे, केवल 4 होलोबियोनेट के सापेक्ष सिम्बियोनेट में काफी अधिक प्रचुर मात्रा में थे। इनमें संभावित जैविक रूप से प्रासंगिक डीएचए और इनोसिटोल फॉस्फेट 7,9,10,11,27,28 शामिल थे; हालांकि, मेजबान और सिम्बियोनेट के बीच तनाव-सिग्नलिंग इकोसैनोइड्स ईपीए और एआरए में देखे गए अलग-अलग अंतर होलोबियोनेट बनाम सिम्बियोनेट नमूनों में महत्वपूर्ण नहीं थे। इन मेटाबोलाइट्स को तेजी से सहजीवन की आणविक भाषा में महत्वपूर्ण मेटाबोलाइट्स के रूप में और तनाव प्रतिक्रियाओं के संकेतक के रूप में पहचाना जा रहाहै10, लेकिन अकेले होलोबियोनेट प्रोफाइल की जांच करने से विशिष्ट होलोबियोन्ट सदस्यों में इन मेटाबोलाइट्स के सापेक्ष बहुतायत अनुपात में अलग-अलग परिवर्तन ों का पता नहीं चलेगा। इस प्रकार, होलोबियोनेट का विश्लेषण उन मतभेदों को मुखौटा कर सकता है जो अन्यथा स्पष्ट होते हैं जब मेजबान और सिम्बियोनेट का अलग-अलग विश्लेषण किया जाता है, और इन अंतरों को उन अध्ययनों में महत्वपूर्ण नहीं पाया जा सकता है जो केवल होलोबियोनेट प्रोफाइल का उपयोग करके अजैविक या जैविक उपचार की तुलना करते हैं। यह विशिष्ट साथी योगदान या कार्यों 7,8,9,11,12,22,28 का अनुमान लगाना चुनौतीपूर्ण बना सकता है, खासकर जब जैविक प्रश्नों का उत्तर देने का प्रयास किया जाता है जिसके लिए सहजीवी इंटरैक्शन देखे गए होलोबियोन्ट फेनोटाइप 46,47 को रेखांकित करते हैं।

एक वैकल्पिक पद्धति मेजबान ऊतकों और सिम्बियोनेट कोशिकाओं को अलग करना होगा, निष्कर्षण से पहले पुनर्संयोजन के लिए होमोजेनेट का एक एलिकोट या प्रत्येक अंश का एक अर्क लेना होगा, और अलग किए गए अंशों के साथ इसका विश्लेषण करना होगा; यह विधि मेजबान ऊतकों से सिम्बियोन्ट्स की रिहाई सुनिश्चित करेगी, लेकिन मानव त्रुटि और / या मेटाबोलाइटहानि की संभावना को बढ़ाएगी। अंशों का अलग-अलग विश्लेषण करना और डेटा पोस्ट विश्लेषण को एकीकृत करना संभव हो सकता है, लेकिन गणना को मूल कोरल होलोबियोनेट में सिम्बियोनेट और मेजबान कोशिकाओं के अनुपात को ध्यान में रखना होगा।

जबकि मेटाबोलाइट विश्लेषण के लिए मेजबान और सिम्बियोनेट अंशों को अलग करके अधिक जानकारी प्राप्त की जा सकती है, विशेष रूप से होलोबियोनेट चयापचय और कार्य में व्यक्तिगत सदस्य योगदान के संदर्भ में, क्या होलोबियोनेट का विश्लेषण करने के बजाय मेजबान और सिम्बियोनेट को अलग करना है, अंततः शोध प्रश्न द्वारा शासित निर्णय है। उदाहरण के लिए, होलोबियोनेट के मेटाबोलाइट प्रोफाइल का विश्लेषण करना प्रासंगिक है जब अन्य शारीरिक माप होलोबियोनेट के साथ लिए जाते हैं (उदाहरण के लिए, कोरल कॉलोनियों से वाष्पशील मेटाबोलाइट उत्सर्जन का विश्लेषण 49,50,51) और जब मेटाबोलॉमिक्स प्रोफाइल को होलोबियोनेट डेटासेट के साथ एकीकृत करने की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, मेजबान और सिम्बियोनेट का पृथक्करण सीमाओं के बिना नहीं है; उदाहरण के लिए, अतिरिक्त हेरफेर कदम मेटाबोलाइट स्थिरता में हस्तक्षेप कर सकते हैं और इसके परिणामस्वरूप डेटा हानि या भ्रामक प्रभावहो सकते हैं।

इसके अलावा, मेजबान-सिम्बियोनेट पृथक्करण प्रक्रिया में अतिरिक्त अनुकूलन चरण शामिल हैं: 1) विशिष्ट प्रवाल प्रजातियों के लिए धोने की संख्या को अनुकूलित करना; और 2) जीसी-एमएस विश्लेषण के लिए दोनों अंशों से निकालने के लिए इष्टतम बायोमास की पहचान करना। अंतिम नमूना प्रसंस्करण शुरू होने से पहले दोनों चरणों को शामिल करने की आवश्यकता है, इस प्रकार सामग्री, समय और लागत के लिए उपभोग्य और विश्लेषणात्मक आवश्यकताओं दोनों में वृद्धि हुई है। इस काम में, मेजबान से मेटाबोलाइट हानि और अतिरिक्त चरणों के कारण सिम्बियोनेट निष्कर्षण ने मेजबान या सिम्बियोनेट के सापेक्ष होलोबियोनेट में देखे गए कुछ मेटाबोलाइट्स की उच्च सापेक्ष बहुतायत में योगदान दिया हो सकता है, जैसे ग्लाइकोलिक एसिड, 1-हेक्साडेकानोल, और डोडेकेनोइक एसिड। हालांकि, इन मेटाबोलाइट्स के लिए होलोबियोन्ट समूह में बड़ी अंतर-समूह भिन्नता, जैसा कि उल्लेख किया गया है, इन देखे गए पैटर्न का एक वैकल्पिक कारण है।

मेटाबोलॉमिक्स दृष्टिकोण का अनुप्रयोग, जबकि अपेक्षाकृत नया है, विशिष्ट सहजीवन के कार्य को स्पष्ट करने की हमारी क्षमता पर गहरा प्रभाव पड़ा है। उदाहरण के लिए, इस दृष्टिकोण ने फाइटोप्लांकटन के विकास को बढ़ावा देने वाले हार्मोन इंडोल -3 एसिटिक एसिड के योगदान का खुलासा किया है, जिसे स्यूडो-निट्जशिया मल्टीसीरीज़-सल्फाइटोबैक्टर सिम्बायोसिस में बैक्टीरिया द्वारा संश्लेषित किया जाता है। इसके अलावा, इस दृष्टिकोण ने कोरल 11,27,28,29 में मेजबान-व्युत्पन्न और सिम्बियोनेट-व्युत्पन्न स्थानांतरण को स्पष्ट किया है, जिसमें कोरल रीफ संरक्षण और बहाली3 के लिए रोमांचक क्षमता है, जैसे कि बायोमार्कर डिटेक्शन 19 के माध्यम से। यहां, हमने दोनों दृष्टिकोणों के लिए एक प्रक्रिया प्रदान की है, इस उम्मीद के साथ कि यह भविष्य के कोरल रीफ जांच के लिए मेटाबोलॉमिक्स के आवेदन को सुविधाजनक और तेज करेगा।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

जेएलएम को यूटीएस चांसलर रिसर्च फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100% LC-grade methanol Merck 439193 LC grade essential
2 mL microcentrifuge tubes, PP Eppendorf 30121880 Polypropylene provides high resistance to chemicals, mechanical stress and temperature extremes
2030 Shimadzu gas chromatograph Shimadzu GC-2030
710-1180 µm acid-washed glass beads Merck
G1152		 This size is optimal for breaking the Symbiodiniaceae cells
AOC-6000 Plus Multifunctional autosampler Shimadzu AOC6000
Bradford reagent Merck B6916 Any protein colourimetric reagent is acceptable
Compressed air gun Ozito 6270636 Similar design acceptable. Having a fitting to fit a 1 mL tip over is critical.
 DB-5 column with 0.25 mm internal diameter column and 1 µm film thickness Agilent 122-5013
DMF Merck RTC000098
D-Sorbitol-6-13C and/or 13C5–15N Valine Merck 605514/ 600148 Either or both internal standards can be added to the methanol.
Flat bottom 96-well plate Merck CLS3614
Glass scintillation vials Merck V7130 20 mL, with non-plastic seal
Immunoglogin G Merck 56834 if not availbe, Bovine Serum Albumin is acceptable
Primer v4
R v4.1.2
Shimadzu LabSolutions Insight software v3.6
Sodium Hydroxide Merck S5881 Pellets to make 1 M solution
tidyverse v1.3.1 R package
TissueLyser LT Qiagen 85600 Or similar
TQ8050NX triple quadrupole mass spectrometer Shimadzu GCMS-TQ8050 NX
UV-96 well plate Greiner M3812
Whirl-Pak sample bag Merck WPB01018WA Sample collection bag; Size: big enough to house a ~5 cm coral fragment, but not too big that the water is too spread

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गैस क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री लक्षित मेटाबोलॉमिक्स हार्ड कोरल नमूने चयापचय आधार निडारियन-डिनोफ्लैगलेट सिम्बायोसिस तापमान-प्रेरित ब्लीचिंग स्थिर-राज्य मेटाबोलाइट प्रोफाइलिंग कोरल होलोबियोनेट सिम्बायोटिक इंटरैक्शन मेटाबोलाइट प्रोफाइल भौतिक पृथक्करण ऊतक अलगाव मेटाबोलाइट निष्कर्षण जीसी-एमएस विश्लेषण अनुकूलन कदम
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Matthews, J. L., Bartels, N., Elahee Doomun, S. N., Davy, S. K., De Souza, D. P. Gas Chromatography-Mass Spectrometry-Based Targeted Metabolomics of Hard Coral Samples. J. Vis. Exp. (200), e65628, doi:10.3791/65628 (2023).

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