Summary
Här presenterar vi extraktion och framställning av polära och halvpolära metaboliter från en korallholobiont, samt separerad korallvärdvävnad och Symbiodiniaceae-cellfraktioner, för gaskromatografi-masspektrometrianalys.
Abstract
Gaskromatografi-masspektrometri (GC-MS)-baserade metoder har visat sig vara kraftfulla för att belysa den metaboliska grunden för nässel-dinoflagellatsymbiosen och hur koraller reagerar på stress (dvs. under temperaturinducerad blekning). Steady-state metabolitprofilering av korallholobionten, som omfattar nässelvärden och dess associerade mikrober (Symbiodiniaceae och andra protister, bakterier, arkéer, svampar och virus), har framgångsrikt tillämpats under omgivnings- och stressförhållanden för att karakterisera korallens holistiska metaboliska status.
Men för att svara på frågor kring de symbiotiska interaktionerna är det nödvändigt att analysera metabolitprofilerna för korallvärden och dess algsymbionter oberoende av varandra, vilket endast kan uppnås genom fysisk separation och isolering av vävnaderna, följt av oberoende extraktion och analys. Även om tillämpningen av metabolomik är relativt ny inom korallområdet, har forskargruppernas ihållande ansträngningar resulterat i utvecklingen av robusta metoder för att analysera metaboliter i koraller, inklusive separation av korallvärdvävnad och algsymbionter.
Detta dokument presenterar en steg-för-steg-guide för holobiontseparation och extraktion av metaboliter för GC-MS-analys, inklusive viktiga optimeringssteg för övervägande. Vi visar hur, när de analyserats oberoende av varandra, den kombinerade metabolitprofilen för de två fraktionerna (korall och Symbiodiniaceae) liknar profilen för helheten (holobiont), men genom att separera vävnaderna kan vi också få viktig information om metabolismen av och interaktionerna mellan de två partnerna som inte kan erhållas från helheten ensam.
Introduction
Metaboliter representerar slutprodukterna av cellulära processer, och metabolomik - studiet av den uppsättning metaboliter som produceras av en viss organism eller ett visst ekosystem - kan ge ett direkt mått på organismens funktion1. Detta är särskilt viktigt för att utforska ekosystem, symbiotiska interaktioner och restaureringsverktyg, eftersom målet med de flesta förvaltningsstrategier är att bevara (eller återställa) specifika ekosystemtjänstfunktioner2. Korallrev är ett akvatisk ekosystem som visar det potentiella värdet av metabolomik för att belysa symbiotiska interaktioner och koppla korallers fysiologiska svar till påverkan på samhällsnivå och ekosystemnivå3. Tillämpningen av gaskromatografi-masspektrometri (GC-MS) med hög genomströmning är särskilt uppskattad på grund av dess förmåga att snabbt analysera ett brett spektrum av metabolitklasser samtidigt med hög selektivitet och känslighet, ge snabb föreningsidentifiering när spektralbibliotek finns tillgängliga och ge en hög nivå av reproducerbarhet och noggrannhet, med en relativt låg kostnad per prov.
Koraller är holobionter som består av koralldjuret, fotosyntetiska dinoflagellatendosymbionter (familj: Symbiodiniaceae4) och ett komplext mikrobiom 5,6. Sammantaget upprätthålls holobiontens kondition främst genom utbyte av små molekyler och element för att stödja den metaboliska funktionen hos varje medlem 7,8,9,10. Metabolomiska metoder har visat sig vara särskilt kraftfulla för att belysa den metaboliska grunden för symbiosspecificitet9,11, blekningsresponsen på termisk stress 7,8,12,13, sjukdomsrespons 14, föroreningsexponeringsrespons 15, fotoacklimatisering 16 och kemisk signalering17 i koraller, samt hjälpa till med upptäckt av biomarkörer 18,19. Dessutom kan metabolomik ge värdefull bekräftelse på de slutsatser som dras från DNA- och RNA-baserade tekniker 9,20. Det finns därför en betydande potential för användning av metabolomik för att bedöma revens hälsa och utveckla verktyg för bevarande av rev3, till exempel genom detektion av metabola biomarkörer för stress18,19 och för att undersöka potentialen hos aktiva förvaltningsstrategier såsom näringssubventioner21.
Att separera värd- och symbiontcellerna och analysera deras metabolitprofiler oberoende av varandra, snarare än tillsammans som holobionten, kan ge mer information om partnerinteraktioner, oberoende fysiologiska och metaboliska statusar och potentiella molekylära mekanismer för anpassning 11,12,22,23,24. Utan att separera korallen och Symbiodiniaceae är det nästan omöjligt att klarlägga korallens och/eller Symbiodiniaceaes bidrag och metabolism oberoende av varandra, förutom med komplex genomrekonstruktion och metabolisk modellering25, men detta har ännu inte tillämpats på korall-dinoflagellatsymbiosen. Att försöka extrahera information om värd- eller algsymbiontens individuella metabolism från holobioontens metabolitprofil kan dessutom leda till feltolkningar.
Till exempel, tills nyligen, trodde man att förekomsten av C18:3n-6, C18:4n-3 och C16 fleromättade fettsyror i extrakt från korall- och holobioontvävnader härrörde från algsymbionten, eftersom koraller antogs inte ha de ωx-desaturas som är nödvändiga för produktionen av omega-3 (ω3) fettsyror; Nya genomiska bevis tyder dock på att flera nässeldjur har förmågan att producera ω3 PUFA de novo och ytterligare biosyntetisera ω3 långkedjig PUFA26. Att kombinera GC-MS med stabil isotopmärkning (t.ex. 13 C-bikarbonat, NaH 13CO 3) kan användas för att spåra ödet för fotosyntetiskt fixerat kol genom korallholobioontmetaboliska nätverk under både kontrollförhållanden och som svar på externa stressfaktorer27,28. Ett kritiskt steg i spårningen av 13 C-ödet är dock separationen av korallvävnaden från algcellerna - först då kan närvaron av en 13C-märkt förening i korallvärdfraktionen entydigt tilldelas som en Symbiodiniaceae-härledd metabolit translokerad till korallen eller en nedströmsprodukt av en translokerad märkt förening. Denna teknik har visat sin kraft genom att utmana det långvariga antagandet att glycerol är den primära formen i vilken fotosyntetat translokeras från symbiont till värd29, samt belysa hur näringsflödet mellan partners förändras under blekning27,28 och som svar på inkompatibla Symbiodiniaceae-arter11.
Även om beslutet att separera vävnader främst drivs av forskningsfrågan, är det viktigt att ta hänsyn till de praktiska, tillförlitliga och potentiella metaboliska effekterna av detta tillvägagångssätt. Här tillhandahåller vi detaljerade, demonstrerade metoder för extraktion av metaboliter från holobionten, såväl som de separata värd- och symbiontfraktionerna. Vi jämför metabolitprofilerna för värden och symbionten oberoende av varandra och hur dessa profiler förhåller sig till holobiont-metabolitprofilen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Den experimentella designen, provtagningen och förvaringen har beskrivits i detalj på andra ställen 2,30,31. Tillstånd för insamling av vilda koraller måste erhållas före insamling och experiment. Proverna här samlades in från kolonier av Montipora mollis (grön färgmorf) importerad från Batavia Coral Farms (Geraldton, WA), ursprungligen insamlade från ett rev utanför Abrohlosöarna (Western Australia; 28°52'43.3"S 114°00'17.0"E) på ett djup av 1 m enligt vattenbrukslicensen AQ1643. Före provtagningen hölls kolonierna i ett 800 L akvarium vid 35 PSU, under blått och vitt ljus vid 150 μmol fotoner·m−2·s−1 och vid 25 °C ± 0,5 °C i 3 månader. Korallfragmenten (~5 cm2, N = 6) knäcktes i flytande kväve och förvarades vid −80 °C fram till bearbetningen.
1. Beredning av extraktionslösningar och utrustning
- Minst 1 dag före avlägsnande av korallvävnad, förbered extraktionslösningarna och utrustningen.
- Kyl ultrarent vatten i rent, diskmedelsfritt glas vid 4 °C.
- Blanda 100 % metanol av LC-kvalitet med en slutlig koncentration på 10 μg·ml−1 av lämpliga interna standarder (t.ex. 13C6-sorbitol).
- Skapa en 50 % metanolextraktionslösning med hälften 100 % metanol av LC-kvalitet och hälften ultrarent vatten. Förvara båda metanollösningarna vid −20 °C.
OBS: För att förhindra nedbrytning av metaboliterna rekommenderas att provbearbetningsstegen utförs i omgångar om fem korallfragment åt gången, med ytterligare ett biologiskt (endast vatten) blankprov (totalt antal prover N = 6). När varje korallprov har separerats i de två fraktionerna (korallvärdvävnad, hädanefter "värd", och mikroalgceller, hädanefter "Symbiont"), kommer det totala antalet prover i en bearbetningssats att vara 12.
2. Släckning av korallmetabolism
OBS: Den experimentella designen, provtagningen och förvaringen har beskrivits i detalj på andra ställen 2,30,31. Det bör dock noteras att den tid det tar att släcka metabolismen (dvs. tiden mellan insamling av korallprover och konservering) är avgörande för att fånga det ursprungliga svaret30. Bevara provet så snabbt som möjligt efter insamlingen för att förhindra förändringar i metabolitsammansättningen på grund av nedbrytning av provet eller fysiologiskareaktioner som inte är målartade.
- Placera korallfragmentet i en steril provtagningspåse och töm eventuellt överflödigt havsvatten så mycket som möjligt. Sänk ner provet i flytande kväve i minst 30 s. Flytta proverna så snart som möjligt till en frys på −80 °C för förvaring.
OBS: Samples kan frysas vid −80°C i ljusblockerade behållare fram till bearbetning, för att undvika frys-upptiningscykler.
3. Avlägsnande av korallvävnad från skelettet
OBS: Proverna bör alltid förvaras på is (4 °C) för att säkerställa att de samtidigt är i flytande form samtidigt som de förhindrar pågående metabolism.
- Placera en ren, steril provtagningspåse på is så att påsen är stabil och öppen ovanpå isen i en grund brunn men inte är nedsänkt i isen. Tillsätt 10 ml kallt (4 °C) ultrarent vatten i påsen.
OBS: Detta kommer att hjälpa till att undvika upprepad frys-upptining av korallfragmentet på grund av den kalla trycksatta luften och den omgivande isen. - Välj ett korallfragment med steriliserad pincett och skölj med kallt (4 °C) ultrarent vatten med en steril Pasteur-pipett tills inga havsvattenrester finns kvar. Sänk ner det sköljda korallfragmentet i påsen som innehåller 10 ml ultrarent vatten.
OBS: Denna sköljning är avgörande för att ta bort eventuella restsalter som skulle störa nedströmsanalysen. Undvik handkontakt med vattnet eller korallfragmentet genom påsen för att hålla provet vid 4 °C. - Tejpa en steril 1 ml pipettspets över änden av en luftpistol med eltejp, med ~5 mm avskuren änden av spetsen (Figur 1A).
- Rikta luftpistolen mot korallfragmentet med påsen halvförseglad och luftflödet på lågt-medium för att försiktigt ta bort vävnaden genom att uppmuntra en cirkulär rörelse av vattnet över korallfragmentet.
- Efter ~3 min, eller när all vävnad verkar ha tagits bort från skelettet, stäng av luften och ta bort airbrushen. Förslut påsen helt.
- Pressa all borttagen korallvävnad till ett nedre hörn av påsen. Skär av det motsatta hörnet och häll försiktigt innehållet i påsen i ett 15 ml rör på is.
4. Valfri homogenisering
OBS: Vissa korallarter är mer trögflytande än andra, vilket innebär att airbrushingen tar bort vävnaden i klumpar istället för i en uppslamning. Om vävnadsklumpar är synliga i det retuscherade homogenatet kan ett homogeniseringssteg vid 4 °C läggas till för alla prover.
- Rengör en mekanisk sågtandad homogenisator två gånger med 4 °C 70 % metanol och slutligen med 4 °C ultrarent vatten.
- Homogenisera korallprovet i ett 15 ml rör i ~1 min tills provet är helt homogeniserat och inga klumpar är synliga.
- Rengör homogenisatorn som i steg 4.1 mellan varje prov. Håll homogeniseringstiden konsekvent över proverna.
5. Provtagning för normalisering
- Samla in en alikvot på 1 000 μl från den homogeniserade vävnaden för Symbiodiniaceae-cellräkning, analys av korallvärdvävnadens proteininnehåll och klorofyll a-uppskattning . Förvaras vid −20 °C tills analysklart (avsnitt 10).
6. Valfri separation av korallvärdvävnad och Symbiodiniaceae-celler
- Centrifugera korallhomogenatet vid 2 500 × g i 5 minuter vid 4 °C med en kyld centrifug.
OBS: Denna hastighet är optimal för att separera de tyngre Symbiodiniaceae-cellerna, samtidigt som deras cellväggar hålls intakta, från värdvävnaden, som är suspenderad i supernatanten. - Ta bort supernatanten som innehåller värdmaterialet och placera den i ett nytt 15 ml rör.
OBS: Lipiderna från värdvävnaden bildar vanligtvis ett smalt rosa/vitt lager ovanpå symbiontcellerna. Detta skikt kan samlas upp tillsammans med den lösliga värdsupernatanten via pipettering (figur 1B). - Virvla värden kraftigt i exakt 1 min. Förvara algpelletsprovet och värdsupernatantprovet på is.
- Tillsätt 2 ml ultrarent vatten vid 4 °C till algpelleten. Virvla kraftigt i exakt 2 minuter för att återsuspendera pelleten.
ANMÄRKNING: Om enskilda fragment på 1 cm inte samlades in från korallkolonin för Symbiodiniaceae-genotypning, kan en 200 μL alikvot av Symbiodiniaceae-cellsuspensionen samlas in här, bevarad i den föredragna DNA-buffertlösningen och lagras enligt beskrivningen i Thurber et al.30 för Symbiodiniaceae-genotypning (t.ex. enligt González-Pech et al.12). - Upprepa steg 6.1-6.4 en gång till.
OBS: Den tillförlitliga separationen av värd och symbiont beror på korallbiomassan och arten, eftersom vissa arter kan vara mer trögflytande än andra. Minst tre tvättsteg rekommenderas, men detta kan ökas beroende på separeringsframgången. Upprepa tvättsteg 4.7-4.9 tills inga Symbiodiniaceae-celler kan ses i botten av värdfraktionen och tills Symbiodiniaceae-fraktionen är synligt fri från värdmaterial (t.ex. inget vitt lager ovanpå) (Figur 1). - Ta bort supernatanten som innehåller värdmaterialet och placera den i ett nytt 15 ml rör.
- Behåll symbiontpelleten i 15 ml röret.
7. Torkning av prover
- Frys antingen holobionthomogenatet eller både den separerade värd- och Symbiodiniaceae-fraktionen vid −80 °C i ~120 minuter. Frys in proverna över natten med ett 0,01 mbar vakuum vid −85 °C.
OBS: För att undvika sample förlust under frystorkning, rekommenderas att använda ett lock skuret från ett annat sterilt rör, eller steril parafilm, med ett ~2 mm hål stansat försiktigt med en steril 25 G nål. - Väg upp något av följande med hjälp av en laboratorievåg när det är torrt: 1) 25 mg holobiont. 2) 15 mg symbiontfraktion; eller 3) 30 mg av värdvävnaden från varje prov i separata 2 ml mjukgörarfria mikrocentrifugrör.
OBS: Kritiskt steg: Optimeringen av biomassan för utvinning är avgörande för att säkerställa att GC-MS inte överbelastas samtidigt som tillräcklig signal säkerställs. Det torkade korallmaterialet är mycket statiskt. För att undvika provförlust, använd antistatiska enheter för att eliminera elektrostatiska laddningar från proverna och vägningskärlen. Ett enkelt och kostnadseffektivt alternativ är att placera ett torkark under provröret. Den torkade symbiontpelleten kan skäras till önskad vikt med hjälp av ett sterilt blad.
8. Extraktioner av intracellulära metaboliter
- Extraktion av intracellulär metabolit från frystorkat holobioont:
- Tillsätt 400 μl 100 % kall (−20 °C) metanol med intern standard/er (IS; 13C6 sorbitol och/eller 13C5-15 N valin, vid 10μM) till varje rör.
- Tillsätt ett litet antal 710–1 180 μm syratvättade glaspärlor (~10 mg) till varje prov. Placera i en pärlkvarn vid 50 Hz i 3 minuter i en förkyld (−20 °C) pärlkvarnsinsats.
- Tillsätt ytterligare 600 μl 100 % kall (−20 °C) metanol med ISs (13 C6 sorbitol och/eller 13C 5-15 N valin, vid 10μM) till varje rör.
- Virvla i 1 min. Ställ på en rotisserieskakare vid 4 °C i 30 minuter.
- Extraktion av intracellulära metaboliter från separerade frystorkade Symbiodiniaceae-celler:
- Tillsätt 200 μl 100 % kall (−20 °C) metanol med ämnesingivande substans (13 C6 sorbitol och/eller 13 C5–15N valin, vid 10μM) till det torkade Symbiodiniaceae-materialet.
- Tillsätt ett litet antal 710-1 180 μm syratvättade glaspärlor (~10 mg). Placera i en pärlkvarn vid 50 Hz i 3 minuter i en förkyld (−20 °C) pärlkvarnsinsats.
- Tillsätt ytterligare 800 μl 100 % kall (−20 °C) metanol med ISs och virvla i 30 s.
- Extraktion av intracellulär metabolit från separerad frystorkad värdvävnad:
- Tillsätt 1 ml 100 % kall (−20 °C) LC-metanol som innehåller ISs (13 C6 sorbitol och/eller 13C5–15 N valin, vid 10μM) till det torkade värdmaterialet.
- Virvel att blanda i 20 s. Placera i en flytande rörhållare i ett ultraljudsbehandlingsbad inställt på 4 °C i 30 minuter.
9. Rening av metabolitextrakt
- Centrifugera proverna (holobiont/värd/symbiont) vid 3 000 × g i 30 minuter vid 4 °C.
- Överför all supernatant till ett nytt 2 ml mikrocentrifugrör, var noga med att inte störa cellskräpet.
OBS: Dessa är de semipolära extrakten. Dessa kan förvaras tillfälligt på is, men förvaras under en längre tid vid −80 °C i mörker. - Tillsätt 1 000 μl 50 % kall (−20 °C) metanol till de återstående cellresterna. Virvla kraftigt i 1 minut för att återuppliva.
- Centrifugera proverna vid 3 000 × g i 30 minuter vid 4 °C.
- Samla in och slå samman supernatanten (polära extrakt) med de halvpolära extrakten från samma prov.
OBS: Cellresterna kan förvaras vid −80 °C och användas för normalisering av proteininnehållet (avsnitt 11). - Centrifugera de poolade extrakten vid 16 100 g i 15 minuter för att avlägsna alla utfällningar och flytta supernatanten till ett nytt mjukgörarfritt mikrocentrifugrör (2 ml).
OBS: Provextrakten kan förvaras vid −80 °C i mörker. - När analysen är klar fördelas 50 μl av varje extrakt i en glasinsats. Koncentratet i 30 minuter vid 30 °C med hjälp av en vakuumkoncentrator. Upprepa ytterligare fyra gånger (för 250 μl totalt torkat extrakt).
OBS: De torkade proverna kan förvaras i rumstemperatur under torkmedelsförhållanden fram till analys.
10. Metabolitderivatisering
OBS : En tvåstegs online-derivatiseringsprocess används för metoximering och trimetylsilylering av de polära metaboliterna.
- Tillsätt 25 μl metoxiaminhydroklorid (30 mg/ml i pyridin) till varje prov.
- Skaka vid 37 °C i en orbitalskakapparat inställd på 750 varv/min i 2 timmar.
- Tillsätt 25 μl N,O-bis(trimetylsilyl)trifluoracetamid + trimetylklorsilan till varje prov.
- Rör om igen vid 37 °C och 750 varv/min i 1 timme.
- Låt proverna utjämnas vid rumstemperatur i 1 timme innan 1 μl injiceras i ett split-förhållande på GC i förhållandet 1:10.
11. Gaskromatografi-masspektrometrianalys
OBS: Masspektrometern bör ställas in enligt tillverkarens rekommendationer med hjälp av tris-(perfluorbutyl)-amin (CF43).
- Använd helium med ultrahög renhet som bärgas vid ett konstant kolonnflöde på 1 ml/min.
- Använd en 30 m DB-5-kolonn med en filmtjocklek på 1 μm och en innerdiameter på 0,25 mm.
- GC ugnsprogram
- Ställ in inloppstemperaturen på 280 °C.
- Börja vid injektionen med en ugnstemperatur på 100 °C och håll kvar i 4 minuter.
- Öka temperaturen med 10 °C/min till 320 °C och håll sedan i 11 min.
- Parametrar för masspektrometer
- Ställ in MS-överföringsledningen på 280 °C och justera jonkällan till 200 °C.
- Använd argon som kollisionscellgas för att generera produktjonen för multipel reaktionsövervakning (MRM).
- Uppnå metabolitdetektion i förhållande till ett tidssegmenterat MRM-bibliotek som innehåller MRM-mål.
12. Symbiodiniaceae-cellräkning, analys av korallvärdvävnadens proteininnehåll och klorofyll en uppskattning
- Symbiodiniaceae cellantal:
- Ta en alikvot av korallvävnadshomogenatet.
- Centrifugera proverna vid 2 000 × g för att pelletera algerna.
- Ta bort ~200 μL supernatanten från algpelleten och placera den i ett nytt mikrocentrifugrör.
OBS: Detta kommer att vara proteinprovet som kommer att användas för att normalisera data; förvara den vid −20 °C före analys, om det behövs. - Återsuspendera algpelleten i 1 ml filtrerat havsvatten genom att försiktigt pipettera upp och ner. Späd vid behov algsuspensionen för att underlätta cellräkningen.
- Utför en cellräkning med hjälp av en hemocytometer under ett ljusmikroskop genom att tillsätta 10 μL till en av kamrarna. Slutför 8–10 räkningar per prov.
OBS: Alternativa metoder för att räkna algcellerna kan också användas där det finns tillgängligt (t.ex. flödescytometri, konfokalmikroskopi med hög genomströmning). - Beräkna symbiontcellernas koncentration (ml−1) med hänsyn tagen till eventuella utspädningsfaktorer.
- Bestämning av proteinhalten
- Kvantifiera provets proteininnehåll (t.ex. via Bradfords kolorimetriska analys, som ursprungligen beskrevs av Bradford et al.33, eller Lowry-analysen34,35, vars protokoll har beskrivits för nässeldjur på andra ställen 36).
- Klorofyll en extraktion
- Använd en cellpellets med ~200 000 celler, fryst eller färsk.
- Överför varje algpellet till 2 ml dimetylformamid (DMF) i en injektionsflaska med scintillation av glas och inkubera i mörker vid 4 °C i 48 timmar.
OBS: DMF är giftigt och cancerframkallande, så provberedningen måste slutföras under ett dragskåp som är så mörkt som möjligt och på is. Om det finns < 200 000 celler, använd mindre DMF. - Centrifugera i 3 minuter vid 16 000 × g.
- Överför 200 ml till en UV-96-brunnsplatta för fotometriska mätningar. Kör varje exempel i tre exemplar med DMF som tomt.
- Mät absorbansen vid våglängderna (E) 663,8 nm, 646 nm och 750 nm. Subtrahera absorbansen vid 750 nm från absorbansen vid båda de andra våglängderna.
OBS: Mätning vid 750 nm korrigerar för eventuell spridning eller grumlighet i provet. - Beräkna klorofyll a-koncentrationen (μg/ml) med hjälp av ekvation (1):
Koncentration av Chl a (μg/ml) = (12,00 × E 663,8) - (3,11 × E646,8) (1)
13. Kvantifiering av cellbiomassan efter metabolitextraktioner för normalisering
Anmärkning: Det finns två alternativ för kvantifiering av cellbiomassa som beskrivs nedan: kvantifiering av protein relaterat till biomassa med hjälp av en modifierad Bradford-kolorimetrisk metod och mätning av cellrestens torrvikt. Båda metoderna är lämpliga att använda, eftersom båda erbjuder noggrann kvantifiering av cellbiomassan.
- Proteininnehåll i cellresterna
- Återsuspendera det frysta cellskräpet med 1 ml 0,2 M NaOH och inkubera proverna vid 98 °C i 20 minuter.
- Kyl proverna på is i ~10 minuter och centrifugera vid 3 000 × g i 5 minuter vid omgivningstemperatur.
- Kvantifiera provets proteininnehåll (t.ex. via Bradfords kolorimetriska analys, som ursprungligen beskrevs av Bradford et al.33 och modifierades av Smart et al.37).
- Mätning av torrvikt för cellrester
- Återsuspendera cellresterna från den intracellulära metabolitextraktionen i dubbeldestillerat vatten (~10 ml).
- Filtrera lösningen under vakuum med hjälp av ett förviktat membranfilter (0,22 μm por, 47 mm).
- Tvätta rören som innehåller biomassa två gånger med ultrarent vatten för att säkerställa fullständig överföring av biomassa till membranfiltret.
- Ta bort membranfiltret som innehåller biomassan och torka det i en mikrovågsugn (låg effekt; ~250 W i 20 min).
- Förvara filterpapperet i en exsickator över natten. Anteckna filterpapperets torrvikt och beräkna biomassans torrvikt genom att subtrahera torrmembranfiltrets vikt (med hjälp av ett rent, torrt membranfilter som torkats tillsammans med provfiltret) från den totala vikten.
14. Analys av data
- Analysera metabolitmål med hjälp av metabolitdatabaser där varje mål består av en kvantifierare och en kvalificerande MRM.
- Inspektera de detekterade metabolitmålen visuellt och integrera dem manuellt efter behov.
- Använd en metabolittopparea för att beräkna den relativa förekomsten av varje prov för varje grupp. Värdena är blankkorrigerade och normaliserade för att ta prov på intern standardtopparea och sedan för att ta prov på proteininnehållet i cellskräp enligt Smart et al.37.
- Kassera metaboliter med en relativ standardavvikelse större än 35 % i alla behandlingsgrupper (N = 23 metaboliter).
- Transformera data (t.ex. kubrot) och medelcentrera dem. Bekräfta en normalfördelning och varianshomogenitet.
- Utför dataanalysen (ANOVA- och värmekartkonstruktion, t.ex. med hjälp av https://www.metaboanalyst.ca)38. Klustra proverna för att undersöka variabilitet inom behandlingen med hjälp av paketen "cluster", "factoextra" och "klustR". Beräkna gapstatistiken (en metod för att bestämma det optimala antalet kluster39) med hjälp av funktionen "clusGap" i R och plottar med hjälp av R-paketet "tidyverse". Utför PERMANOVAs för att undersöka signifikansen i separationen mellan behandlingens metabolitprofiler (t.ex. i Primer).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Alla data som tagits fram under detta arbete finns tillgängliga i tilläggsinformationen.
Separation mellan värd och symbiont
Figur 1: Uppställning och validering av separationen av korallvärdvävnader och Symbiodiniaceae-celler. (A) Luftpistolen för avlägsnande av korallvävnad från korallskelettet. En pipettspets är fäst vid blåspistolen med eltejp, och en liten (~5 mm) sektion skärs från spetsen för att tillåta mer luft att komma ut utan att lossna spetsen. (B) Exempel på holobiont och separerad värdvävnad (supernatant) och Symbiodiniaceae-celler (pellet). Värdet representerar antalet centrifugeringssteg. Pilen pekar på det smala värdlipidskiktet ovanpå symbiontpelleten som kan samlas upp och kombineras med värdfraktionen. (C-E) Ljusfältsmikroskopibilder (överst) och klorofyllautofluorescens (nederst) av en alikvot av (C)holobiont med både värdvävnad och symbiontceller, (D) värdfraktionen utan symbiontceller, verifierad genom frånvaro av klorofyllautofluorescens, och (E) intakta symbiontceller, som visar avlägsnandet av värdvävnaden. Skalstreck = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Mikroskopisk visualisering visade inga Symbiodiniaceae-celler i värdvävnadsproverna efter de tre tvättstegen (Figur 1D). På samma sätt fanns det minimal värdvävnad i symbiontfraktionerna (Figur 1E). Holobionthomogenatet (Figur 1C) visade dock att de intracellulära Symbiodiniaceae kanske inte frigjordes tillräckligt från sina symbiosomer genom enkel luftborstning och därför inte lyserades tillräckligt under den mekaniska homogeniseringen (protokollavsnitt 4) eller lösningsmedelsextraktionen (protokollavsnitt 8) jämfört med centrifugalseparering (Figur 1E). Denna begränsning skulle kunna förklara en del av den stora variationen inom gruppen mellan holobiontproverna och specifika observationer i holobiontprofilerna. Till exempel var två metaboliter (glykolsyra och 1-hexadekanol) signifikant vanligare i holobiont jämfört med symbiont men inte i värd jämfört med symbiont. Detta kan ha varit ett resultat av den stora variationen inom gruppen i den relativa förekomsten av dessa metaboliter i holobiontprofilerna. I synnerhet hade holobiont sample 3 relativt högre koncentrationer av dodekansyra, glykolsyra och 1-hexdecanol än något av symbiont- eller värdproverna individuellt. När data från metabolitens topparea normaliseras till provproteininnehållet, om symbiontcellerna inte rengjordes tillräckligt från värdvävnad, kan holobioontproteininnehållet ha underskattats, vilket påverkar normaliseringen av biomassan och leder till beräkningen av en högre metabolitförekomst i förhållande till biomassan i detta prov. Detta belyser ytterligare potentialen för ökad variation i holobioontmetabolomik.
Analys av metabolitprofil
Valet av masspektrometerläge beror på vilken analys som utförs. För steady-state metabolitprofilering möjliggör en omfattande riktad metod med QqQ-MS i MRM-läge förbättrad metabolitdetektion och identifiering på grund av eliminering av bakgrundsbrus som kan genereras av höga biologiska saltkoncentrationer. För metoder för bestämning av stabila isotoper kan en masspektrometer (dvs. enkelkvadrupol, trippelkvadrupol, kvadrupol flygtid [QTOF]) som körs i skanningsläge detektera massisotopologer som indikerar stabila isotopanrikningsmönster.
Riktad GC-MS-analys slutfördes med hjälp av Shimadzu Smart Metabolite Database (v3; som täcker cirka 350 endogena metaboliter och flera stabila isotopiskt märkta interna standarder) och Shimadzu LabSolutions Insight-programvaran. I alla behandlingar identifierades 107 annoterade metaboliter, inklusive en uppsättning aminosyror, organiska syror, kolhydrater, fettsyror och steroler (tilläggstabell S1). Kvalitativa och kvantitativa jonpar finns i tilläggstabell S2. Kmeans-klustring identifierade tre distinkta kluster av prover (verifierade med ett gapstatistiskt test), med alla prover i separata, distinkta kluster; Symbionterna fanns i kluster 1, värden i kluster 2 och holobiont-exemplen i kluster 3 (figur 2).
Figur 2: Kmeans-klusteranalys av metabolitprofilerna. (A) Provets metabolitprofiler klustrades efter euklidiskt avstånd med det optimala antalet kluster (N = 3), vilket verifierades via en beräkning av gapstatistik. (B) Parallell koordinatvisualisering av metabolitens genomsnittliga relativa abundans (linje, färgad enligt klustret) och konfidensintervall (skuggning, färgad enligt klustret) för varje kluster (röd = kluster 1, grön = kluster 2, blå = kluster 3). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Jämförelse av värd- och symbiontmetabolitprofil
Värd- och symbiontprofilerna skilde sig signifikant från varandra (PERMANOVA, t = 16.909, p < .001; Tilläggstabell S3), med 100 enskilda metaboliter som signifikant skiljer sig mellan värd- och symbiontfraktionerna (ANOVA, FDR < 0,05; Figur 3 och tilläggstabell S1). Av dessa var 13 metaboliter signifikant rikligare i symbionten än värdextrakten, inklusive eikosanoiderna dokosahexaensyra (C22:6[ω-6]; DHA), eikosapentaensyra (C20:5[ω-6]; EPA) och arakidonsyra (C20:4[ω-6]; ARA) (ANOVA, FDR < 0,05; Figur 3 och tilläggstabell S1). Totalt 87 metaboliter var mindre rikligt förekommande i symbionten än i värdextrakten (ANOVA, FDR < 0,05; Figur 3 och tilläggstabell S1).
Figur 3: Visualisering av värmekartor över metaboliternas relativa abundanser med post-hoc-analysresultat från gruppjämförelserna. Värd-, symbiont- och holobiontproverna (N = 5 per grupp) var hierarkiskt grupperade via Wards länkning, och metaboliterna grupperades enligt det euklidiska avståndsmåttet. De färgade rutorna indikerar signifikanta skillnader i de gruppjämförelser som detekterats via ANOVA med post hoc Tukeys HSD (tilläggstabell S1). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Holobiontmetabolitprofiler jämfört med separerade värd- och symbiontprofiler
Holobiont-metabolitprofilerna uppvisade stor variabilitet inom gruppen, vilket bekräftades av den stora separationen av prover i holobiontklustret i Kmeans-analysen. Specifikt separerades Urval 3 och Urval 4 längs dimension 2 från Urval 1, Urval 2 och Urval 5 (Figur 2A). Holobiontproverna låg mellan de separerade värd- och symbiontfraktionerna (Figur 2A). Medan Kmeans-klusterfördelningarna (Figur 2A), parallella koordinater (Figur 2B) och visualisering av värmekartan av metabolitens relativa abundans (Figur 3) indikerade att holobiontprofilen bättre överensstämde med värdfraktionsprofilen, skilde sig holobiontprofilen signifikant från både värden (PERMANOVA, t = 3,47, p < 0,001; Tilläggstabell S3) och symbiontprofiler (PERMANOVA, t = 11,29, p < 0,001; Tilläggstabell S3). På individnivå skilde sig 66 och 82 metaboliter i holobiont signifikant från värd- respektive symbiontprofilerna (ANOVA, FDR < 0,05, tilläggstabell S1). Av dessa hade 54 (81,8 %) av de 66 signifikanta metaboliterna signifikant högre relativ abundans i värden än holobiontfraktionen, och 78 (95 %) hade signifikant högre relativ abundans i holobiontfraktionen än symbiontfraktionen. fyra var rikligare i symbiontfraktionerna, inklusive DHA, glycerol-3-fosfat, inositolfosfat och fosforsyra (figur 3). Åtta metaboliter (inklusive två fettsyror [linolsyra (C18:1) och myristinsyra (C14:0)], fem dikarboxylsyror och aminosyran guanin) skilde sig signifikant i förekomst mellan värd och symbiont men inte jämfört med holobiontfraktionen (Figur 3).
Tilläggstabell S1: Den relativa förekomsten av varje metabolit som identifierats med hjälp av GC-MS-analys i holobiont och separerad värd och symbiont. Värdena är medelvärdet ± standardfelet, och de ANOVA-resultat som tillhandahålls, inklusive post hoc-analysen, indikeras av de färgade cellerna (kolumnerna K, L och M). Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggstabell S2: Kvalitativa och kvantitativa jonpar för de identifierade metaboliterna. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggstabell S3: PERMANOVA-resultat. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Separationen av värd och symbiont är lätt och snabbt att uppnå via enkel centrifugering, och resultaten här visar att separering av fraktionerna kan ge värdefull information som indikerar specifika holobiontmedlemsbidrag, vilket kan bidra till den funktionella analysen av korallhälsa. I vuxna koraller utförs lipidsyntesen främst av den inhemska algsymbionten40, som levererar lipider (t.ex. triacylglycerol och fosfolipider)41 och fettsyror som kan främja stressåterhämtning 11,42. Av de 13 metaboliter som var vanligare förekommande i symbiont- kontra värdprofilerna i detta arbete, var 9 fettsyror, inklusive de biologiskt relevanta eikosanoiderna DHA (C22:6[ω-6]), EPA (C20:5[ω-6]) och ARA (C20:4[ω-6]), som är inblandade i stresssignalering mellan kungadömena i korall-Symbiodiniaceae-symbiosen 9,10. Inositolfosfat spelar en avgörande roll i olika cellulära funktioner, inklusive celltillväxt, apoptos, endocytos och celldifferentiering. Den relativa förekomsten av inositolisoformer och derivat har ofta visat sig förändras under symbiosdysfunktion 7,11,27,28, även om rollen för dessa isoformer och deras derivat i korall-Symbiodiniaceae-symbiosen fortfarande är oklar. Den tydliga skillnaden i relativ abundans mellan värd- och symbiontprofiler bidrar till denna kunskap.
Många studier har använt holobiontmetabolitprofiler för att undersöka korallmetaboliska interaktioner och prestanda under omgivnings- och stressförhållanden 13,43,44,45. Här visar vi att analysen av holobionthomogenatet kan resultera i stor variabilitet inom behandlingen, och de resulterande profilerna kan maskera värd- och/eller symbiontspecifika abundansmönster och metabola bidrag till det totala holobiontmetabolomet. Till exempel, av de 13 metaboliter som var signifikant rikligare i symbionten i förhållande till värdfraktionen, var endast 4 signifikant rikligare i symbionten i förhållande till holobionten. Dessa inkluderade den potentiellt biologiskt relevanta DHA och inositolfosfat 7,9,10,11,27,28; De distinkta skillnader som observerades i de stresssignalerande eikosanoiderna EPA och ARA mellan värd och symbiont var dock inte signifikanta i holobiont- jämfört med symbiontproverna. Dessa metaboliter erkänns i allt högre grad som viktiga metaboliter i det molekylära språket för symbios och som indikatorer på stressresponser10, men att enbart undersöka holobiontprofiler skulle inte avslöja de distinkta förändringarna i de relativa överflödsförhållandena för dessa metaboliter i specifika holobioontmedlemmar. Således kan analys av holobiont maskera skillnader som annars är uppenbara när värden och symbionten analyseras separat, och dessa skillnader kanske inte upptäcks som signifikanta i studier som jämför abiotiska eller biotiska behandlingar enbart med hjälp av holobiontprofiler. Detta kan göra det svårt att härleda specifika partnerbidrag eller funktioner 7,8,9,11,12,22,28, särskilt när man försöker besvara biologiska frågor för vilka symbiotiska interaktioner ligger till grund för den observerade holobioontfenotypen 46,47.
En alternativ metod skulle vara att separera värdvävnaderna och symbiontcellerna, ta en alikvot av homogenatet eller ett extrakt av varje fraktion för att rekombinera före extraktionen och analysera detta tillsammans med de separerade fraktionerna. Denna metod skulle säkerställa frisättning av symbionter från värdvävnaderna, men skulle öka risken för mänskliga fel och/eller metabolitförlust48. Det kan vara möjligt att analysera fraktionerna separat och integrera data efter analysen, men beräkningarna skulle behöva ta hänsyn till andelen symbiont- och värdceller i den ursprungliga korallholobionten.
Även om mer information kan erhållas genom att separera värd- och symbiontfraktionerna för metabolitanalys, särskilt när det gäller enskilda medlemmars bidrag till holobioontmetabolism och funktion, är det i slutändan ett beslut som styrs av forskningsfrågan om man ska separera värden och symbionten snarare än att analysera holobionten. Till exempel är det relevant att analysera holobiontens metabolitprofil när andra fysiologiska mätningar görs med holobiont (t.ex. analys av flyktiga metabolitutsläpp från korallkolonier 49,50,51) och när metabolomikprofiler måste integreras med holobiont-dataset. Dessutom är separationen av värden och symbionten inte utan begränsningar; Till exempel kan ytterligare manipuleringssteg störa metabolitstabiliteten och resultera i dataförlust eller störfaktorer48.
Dessutom finns det ytterligare optimeringssteg involverade i värd-symbiontseparationsproceduren: 1) optimering av antalet tvättar för den specifika korallarten; och 2) identifiera den optimala biomassan att extrahera från båda fraktionerna för GC-MS-analys. Båda stegen måste inkluderas innan den slutliga provbearbetningen kan påbörjas, vilket ökar både förbruknings- och analyskraven för material, tid och kostnader. I detta arbete kan metabolitförlust från värd- och symbiontextraktioner på grund av de ytterligare stegen ha bidragit till de högre relativa halterna av vissa metaboliter som observerats i holobionten i förhållande till antingen värden eller symbionten, såsom glykolsyra, 1-hexadekanol och dodekansyra. Den stora variationen inom gruppen i holobioontgruppen för dessa metaboliter är dock, som nämnts, en alternativ orsak till dessa observerade mönster.
Tillämpningen av metabolomiska metoder är relativt ny, men har haft en djupgående inverkan på vår förmåga att belysa funktionen hos specifika symbioser. Till exempel har detta tillvägagångssätt avslöjat bidraget från det tillväxtfrämjande växtplanktonhormonet indol-3 ättiksyra, som syntetiseras av bakterier i symbiosen mellan Pseudo-nitzschia multiseries-Sulfitobacter. Dessutom har detta tillvägagångssätt belyst värd-härledd och symbiont-härledd translokation i koraller 11,27,28,29, vilket har spännande potential för bevarande och restaurering av korallrev3, till exempel genom biomarkördetektion 19. Här har vi tillhandahållit en procedur för båda tillvägagångssätten med förhoppningen att detta kommer att underlätta och påskynda tillämpningen av metabolomik för framtida korallrevsundersökningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingen intressekonflikt att redovisa.
Acknowledgments
J.L.M. stöddes av ett UTS Chancellor's Research Fellowship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100% LC-grade methanol | Merck | 439193 | LC grade essential |
| 2 mL microcentrifuge tubes, PP | Eppendorf | 30121880 | Polypropylene provides high resistance to chemicals, mechanical stress and temperature extremes |
| 2030 Shimadzu gas chromatograph | Shimadzu | GC-2030 | |
| 710-1180 µm acid-washed glass beads | Merck | G1152 |
This size is optimal for breaking the Symbiodiniaceae cells |
| AOC-6000 Plus Multifunctional autosampler | Shimadzu | AOC6000 | |
| Bradford reagent | Merck | B6916 | Any protein colourimetric reagent is acceptable |
| Compressed air gun | Ozito | 6270636 | Similar design acceptable. Having a fitting to fit a 1 mL tip over is critical. |
| DB-5 column with 0.25 mm internal diameter column and 1 µm film thickness | Agilent | 122-5013 | |
| DMF | Merck | RTC000098 | |
| D-Sorbitol-6-13C and/or 13C5–15N Valine | Merck | 605514/ 600148 | Either or both internal standards can be added to the methanol. |
| Flat bottom 96-well plate | Merck | CLS3614 | |
| Glass scintillation vials | Merck | V7130 | 20 mL, with non-plastic seal |
| Immunoglogin G | Merck | 56834 | if not availbe, Bovine Serum Albumin is acceptable |
| Primer | v4 | ||
| R | v4.1.2 | ||
| Shimadzu LabSolutions Insight software | v3.6 | ||
| Sodium Hydroxide | Merck | S5881 | Pellets to make 1 M solution |
| tidyverse | v1.3.1 | R package | |
| TissueLyser LT | Qiagen | 85600 | Or similar |
| TQ8050NX triple quadrupole mass spectrometer | Shimadzu | GCMS-TQ8050 NX | |
| UV-96 well plate | Greiner | M3812 | |
| Whirl-Pak sample bag | Merck | WPB01018WA | Sample collection bag; Size: big enough to house a ~5 cm coral fragment, but not too big that the water is too spread |
References
- Bundy, J. G., Davey, M. P., Viant, M. R. Environmental metabolomics: A critical review and future perspectives. Metabolomics. 5 (1), 3-21 (2008).
- Matthews, J. L., et al. The metabolic significance of symbiont community composition in the coral-algal symbiosis. Applied Environmental Metabolomics. Beale, D. J., Hillyer, K. E., Warden, A. C., Jones, O. A. H. , Academic Press. Cambridge, MA. 211-229 (2022).
- Lawson, C. A., et al. Informing coral reef conservation through metabolomic approaches. Coral Reef Conservation and Restoration in the Omics Age. Coral Reefs of the World. van Oppen, M. J. H., Aranda Lastra, M. , Springer. Cham, Switzerland. 179-202 (2022).
- LaJeunesse, T. C., et al. Systematic revision of Symbiodiniaceae highlights the antiquity and diversity of coral endosymbionts. Current Biology. 28 (16), 2570-2580 (2018).
- Rohwer, F., Seguritan, V., Azam, F., Knowlton, N. Diversity and distribution of coral-associated bacteria. Marine Ecology Progress Series. 243, 1-10 (2002).
- Maire, J., et al. Intracellular bacteria are common and taxonomically diverse in cultured and in hospite algal endosymbionts of coral reefs. The ISME Journal. 15 (7), 2028-2042 (2021).
- Hillyer, K. E., et al. Metabolite profiling of symbiont and host during thermal stress and bleaching in the coral Acropora aspera. Coral Reefs. 36, 105-118 (2016).
- Hillyer, K. E., Tumanov, S., Villas-Bôas, S., Davy, S. K. Metabolite profiling of symbiont and host during thermal stress and bleaching in a model cnidarian-dinoflagellate symbiosis. Journal of Experimental Biology. 219 (4), 516-527 (2016).
- Matthews, J. L., et al. Optimal nutrient exchange and immune responses operate in partner specificity in the cnidarian-dinoflagellate symbiosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (50), 13194-13199 (2017).
- Rosset, S. L., et al. The molecular language of the cnidarian-dinoflagellate symbiosis. Trends in Microbiology. 29 (4), 320-333 (2020).
- Matthews, J. L., et al. Partner switching and metabolic flux in a model cnidarian-dinoflagellate symbiosis. Royal Society. 285 (1892), 20182336 (2018).
- González-Pech, R. A., et al. Physiological factors facilitating the persistence of Pocillopora aliciae and Plesiastrea versipora in temperate reefs of south-eastern Australia under ocean warming. Coral Reefs. 41, 1239-1253 (2022).
- Williams, A., et al. Metabolomic shifts associated with heat stress in coral holobionts. Science Advances. 7 (1), (2021).
- Deutsch, J. M., et al. Metabolomics of healthy and stony coral tissue loss disease affected Montastraea cavernosa corals. Frontiers in Marine Science. 8, 1421 (2021).
- Stien, D., et al. A unique approach to monitor stress in coral exposed to emerging pollutants. Scientific Reports. 10 (1), 9601 (2020).
- Lohr, K. E., et al. Resolving coral photoacclimation dynamics through coupled photophysiological and metabolomic profiling. Journal of Experimental Biology. 222 (8), (2019).
- Jorissen, H., et al. Coral larval settlement preferences linked to crustose coralline algae with distinct chemical and microbial signatures. Scientific Reports. 11 (1), 14610 (2021).
- Roach, T. N., Dilworth, J., Jones, A. D., Quinn, R. A., Drury, C. Metabolomic signatures of coral bleaching history. Nature Ecology & Evolution. 5 (4), 495-503 (2021).
- Parkinson, J. E., et al. Molecular tools for coral reef restoration: Beyond biomarker discovery. Conservation Letters. 13 (1), 12687 (2020).
- Jiang, J., et al. How Symbiodiniaceae meets the challenges of life during coral bleaching. Coral Reefs. 40, 1339-1353 (2021).
- Guerra, F. D., Attia, M. F., Whitehead, D. C., Alexis, F. Nanotechnology for environmental remediation: materials and applications. Molecules. 23 (7), 1760 (2018).
- Matthews, J. L., et al. Metabolite pools of the reef building coral Montipora capitata are unaffected by Symbiodiniaceae community composition. Coral Reefs. 39, 1727-1737 (2020).
- Papina, M., Meziane, T., van Woesik, R. Symbiotic zooxanthellae provide the host-coral Montipora digitata with polyunsaturated fatty acids. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 135 (3), 533-537 (2003).
- Kellogg, R., Patton, J. Lipid droplets, medium of energy exchange in the symbiotic anemone Condylactis gigantea: A model coral polyp. Marine Biology. 75, 137-149 (1983).
- Ankrah, N. Y., Chouaia, B., Douglas, A. E. The cost of metabolic interactions in symbioses between insects and bacteria with reduced genomes. mBio. 9 (5), e01433 (2018).
- Kabeya, N., et al. Genes for de novo biosynthesis of omega-3 polyunsaturated fatty acids are widespread in animals. Science Advances. 4 (5), (2018).
- Hillyer, K. E., Dias, D., Lutz, A., Roessner, U., Davy, S. K. 13C metabolomics reveals widespread change in carbon fate during coral bleaching. Metabolomics. 14 (1), 12 (2018).
- Hillyer, K. E., Dias, D. A., Lutz, A., Roessner, U., Davy, S. K. Mapping carbon fate during bleaching in a model cnidarian symbiosis: the application of 13C metabolomics. New Phytologist. 214 (4), 1551-1562 (2017).
- Burriesci, M. S., Raab, T. K., Pringle, J. R. Evidence that glucose is the major transferred metabolite in dinoflagellate-cnidarian symbiosis. Journal of Experimental Biology. 215 (19), 3467-3477 (2012).
- Thurber, R. V., et al. Unified methods in collecting, preserving, and archiving coral bleaching and restoration specimens to increase sample utility and interdisciplinary collaboration. PeerJ. 10, 14176 (2022).
- Grottoli, A. G., et al. Increasing comparability among coral bleaching experiments. Ecological Applications. 31 (4), 02262 (2020).
- Mushtaq, M. Y., Choi, Y. H., Verpoorte, R., Wilson, E. G. Extraction for metabolomics: access to the metabolome. Phytochemical Analysis. 25 (4), 291-306 (2014).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1), 248-254 (1976).
- Peterson, G. L., et al. A simplification of the protein assay method of Lowry et al. which is more generally applicable. Analytical Biochemistry. 83 (2), 346-356 (1977).
- Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J.
- Zamer, W. E., Shick, J. M., Tapley, D. W. Protein measurement and energetic considerations: Comparisons of biochemical and stoichiometric methods using bovine serum albumin and protein isolated from sea anemones. Limnology and Oceanography. 34 (1), 256-263 (1989).
- Smart, K. F., Aggio, R. B., Van Houtte, J. R., Villas-Boas, S. G. Analytical platform for metabolome analysis of microbial cells using methyl chloroformate derivatization followed by gas chromatography-mass spectrometry. Nature Protocols. 5 (10), 1709-1729 (2010).
- Pang, Z., et al. Using MetaboAnalyst 5.0 for LC-HRMS spectra processing, multi-omics integration and covariate adjustment of global metabolomics data. Nature Protocols. 17 (8), 1735-1761 (2022).
- Tibshirani, R., Walther, G., Hastie, T. Estimating the number of clusters in a data set via the gap statistic. Journal of the Royal Statistical Society: Series B (Statistical Methodology). 63 (2), 411-423 (2001).
- Chen, W. -N., et al. Diel rhythmicity of lipid-body formation in a coral-Symbiodinium endosymbiosis). Coral Reefs. 31 (2), 521-534 (2012).
- Imbs, A. Fatty acids and other lipids of corals: composition, distribution, and biosynthesis. Russian Journal of Marine Biology. 39 (3), 153-168 (2013).
- Rosset, S., et al. Lipidome analysis of Symbiodiniaceae reveals possible mechanisms of heat stress tolerance in reef coral symbionts. Coral Reefs. 38 (6), 1241-1253 (2019).
- Carreón-Palau, L., Parrish, C. C., Del Angel-Rodriguez, J. A., Perez-Espana, H. Seasonal shifts in fatty acids and sterols in sponges, corals, and bivalves, in a southern Gulf of Mexico coral reef under river influence. Coral Reefs. 40 (2), 571-593 (2021).
- Imbs, A. B., Dang, L. T. Seasonal dynamics of fatty acid biomarkers in the soft coral Sinularia flexibilis, a common species of Indo-Pacific coral reefs. Biochemical Systematics and Ecology. 96, 104246 (2021).
- Oku, H., Yamashiro, H., Onaga, K., Sakai, K., Iwasaki, H. Seasonal changes in the content and composition of lipids in the coral Goniastrea aspera. Coral Reefs. 22 (1), 83-85 (2003).
- Weis, V. M. Cell biology of coral symbiosis: foundational study can inform solutions to the coral reef crisis. Integrative and Comparative Biology. 59 (4), 845-855 (2019).
- Oakley, C., Davy, S. Cell biology of coral bleaching. Coral Bleaching. van Oppen, M., Lough, J. , Springer. Cham, Switzerland. 189-211 (2018).
- Lu, W., et al. Metabolite measurement: Pitfalls to avoid and practices to follow. Annual Review of Biochemistry. 86, 277-304 (2017).
- Lawson, C. A., et al. Heat stress decreases the diversity, abundance and functional potential of coral gas emissions. Global Change Biology. 27 (4), 879-891 (2021).
- Olander, A., et al. Comparative volatilomics of coral endosymbionts from one-and comprehensive two-dimensional gas chromatography approaches. Marine Biology. 168 (5), 76 (2021).
- Wuerz, M., et al. Symbiosis induces unique volatile profiles in the model cnidarian Aiptasia. Journal of Experimental Biology. 225 (19), (2022).
