Summary
여기에서는 가스 크로마토그래피-질량 분석 분석을 위해 산호 홀로비온트에서 극성 및 반극성 대사 산물의 추출 및 준비와 분리된 산호 숙주 조직 및 Symbiodiniaceae 세포 분획을 제시합니다.
Abstract
가스 크로마토그래피-질량분석법(GC-MS) 기반 접근법은 자포동물-와편모충 공생의 대사 기초와 산호가 스트레스에 어떻게 반응하는지(즉, 온도로 인한 표백 중)를 설명하는 데 강력한 것으로 입증되었습니다. 자포동물 숙주와 관련 미생물(Symbiodiniaceae 및 기타 원생생물, 박테리아, 고세균, 곰팡이 및 바이러스)로 구성된 산호 홀로비온트의 정상 상태 대사 산물 프로파일링은 산호의 전체적인 대사 상태를 특성화하기 위해 주변 및 스트레스 조건에서 성공적으로 적용되었습니다.
그러나 공생 상호 작용을 둘러싼 질문에 답하려면 산호 숙주와 조류 공생체의 대사 산물 프로필을 독립적으로 분석해야 하며, 이는 조직의 물리적 분리 및 분리에 의해서만 달성될 수 있으며 독립적인 추출 및 분석이 뒤따릅니다. 대사체학의 적용은 산호 분야에서 비교적 새로운 것이지만, 연구 그룹의 지속적인 노력으로 산호 숙주 조직과 조류 공생체의 분리를 포함하여 산호의 대사 산물을 분석하는 강력한 방법이 개발되었습니다.
이 백서는 고려해야 할 주요 최적화 단계를 포함하여 GC-MS 분석을 위한 홀로비온트 분리 및 대사 산물 추출에 대한 단계별 가이드를 제공합니다. 우리는 일단 독립적으로 분석되면 두 분획(산호 및 공생충과)의 결합된 대사 산물 프로필이 전체(홀로비온트)의 프로필과 유사하지만 조직을 분리함으로써 전체만으로는 얻을 수 없는 두 파트너의 대사 및 상호 작용에 대한 주요 정보를 얻을 수 있음을 보여줍니다.
Introduction
대사 산물은 세포 과정의 최종 산물을 나타내며, 대사체학(metabolomics)은 특정 유기체 또는 생태계에서 생산되는 대사 산물 모음에 대한 연구로 유기체 기능의 직접적인 측정을 제공할 수 있습니다1. 이는 생태계, 공생적 상호작용 및 복원 도구를 탐색하는 데 특히 중요한데, 대부분의 관리 전략의 목표는 특정 생태계 서비스 기능을 보존(또는 복원)하는 것이기 때문이다2. 산호초는 공생적 상호작용을 규명하고 산호의 생리적 반응을 군집 수준 및 생태계 수준의 영향과 연결하기 위한 대사체학의 잠재적 가치를 보여주는 하나의 수생 생태계이다3. 고처리량 가스 크로마토그래피-질량분석법(GC-MS)의 응용 분야는 높은 선택성과 감도로 광범위한 대사산물 클래스를 동시에 신속하게 분석하고, 스펙트럼 라이브러리를 사용할 수 있을 때 신속한 화합물 식별을 제공하며, 상대적으로 낮은 시료당 비용으로 높은 수준의 재현성과 정확도를 제공할 수 있기 때문에 특히 가치가 있습니다.
산호는 산호 동물, 광합성 와편모충 내공생체(과: Symbiodiniaceae4) 및 복잡한 마이크로바이옴 5,6으로 구성된 홀로비온트입니다. 전반적으로, 홀로비온트의 적합성은 주로 각 구성원의 대사 기능을 지원하기 위해 작은 분자와 요소의 교환을 통해 유지된다 7,8,9,10. 대사체학 접근법은 산호의 공생 특이성(symbiosis specificity)9,11, 열 스트레스에 대한 표백 반응(bleaching response)7,8,12,13, 질병 반응(disease response)14, 오염 노출 반응(pollution exposure response)15, 광순응(photo-aclimation)16 및 화학적 신호전달(chemical signalling)17의 대사 기초를 밝히고 바이오마커 발견(biomarker discovery)18을 돕는 데 특히 강력한 것으로 입증되었다,19. 또한, 대사체학은 DNA 및 RNA 기반 기술에서 추론된 결론에 대한 귀중한 확인을 제공할 수 있습니다 9,20. 따라서 스트레스의 대사 바이오마커 검출18,19 및 영양 보조금 21과 같은 적극적인 관리 전략의 잠재력을 조사하는 것과 같이 산호초의 건강을 평가하고 산호초 보존을 위한 도구를 개발하기 위해 대사체학을 사용할 수 있는 상당한 잠재력이 있다21.
숙주 세포와 공생 세포를 분리하고 홀로비온트로 함께 하지 않고 독립적으로 대사 산물 프로파일을 분석하면 파트너 상호 작용, 독립적인 생리학적 및 대사 상태, 적응을 위한 잠재적 분자 메커니즘에 대한 더 많은 정보를 얻을 수 있습니다 11,12,22,23,24. 산호와 공생충과(Symbiodiniaceae)를 분리하지 않고, 복잡한 게놈 재구성 및대사 모델링을 제외하고는 산호 및/또는 공생충과(Symbiodiniaceae)의 기여와 신진대사를 독립적으로 설명하는 것은 거의 불가능하지만, 이는 산호-와편모충 공생에 아직 적용되지 않았다. 또한, 홀로비온트의 대사 산물 프로필에서 숙주 또는 조류 공생체의 개별 대사에 대한 정보를 추출하려고 시도하면 오해가 발생할 수 있습니다.
예를 들어, 최근까지, 산호 및 홀로비온트 조직으로부터의 추출물에서 C18:3n-6, C18:4n-3 및 C16 고도불포화 지방산의 존재는 조류 공생체로부터 유래된 것으로 생각되었는데, 이는 산호가 오메가-3(ω3) 지방산의 생산에 필수적인 ωx 탈포화효소를 가지고 있지 않다고 가정했기 때문이다. 그러나, 최근의 게놈 증거에 의하면, 다수의 자포동물은 ω3 PUFA de novo를 생산하고 ω3 장쇄 PUFA26을 추가로 생합성할 수 있는 능력을 가지고 있다. GC-MS를 안정 동위원소 표지(예: 13C-중탄산염, NaH 13CO3)와결합하면 제어 조건과 외부 스트레스 요인에 대한 반응으로 산호 홀로비온트 대사 네트워크를 통해 광합성으로 고정된 탄소의 운명을 추적하는 데 사용할 수 있습니다27,28. 그러나, 13 C 운명의 추적에 있는 긴요한 단계는 조류 세포에서 산호 조직의 분리이다 그 때 산호 숙주 분획에 있는 13C 표지된 화합물의 존재는 산호에 전이된 Symbiodiniaceae 파생한 대사 산물 또는 전위된 레테르를 붙인 화합물의 하류 제품으로 명백하게 할당될 수 있다. 이 기술은 글리세롤이 광합성이 공생체에서 숙주로 전위되는 주요 형태라는 오랜 가정에 도전하고(29), 표백27,28 및 양립할 수 없는 Symbiodiniaceae 종11에 대한 반응으로 파트너 간 영양 플럭스가 어떻게 변하는지 설명함으로써 그 힘을 입증했습니다.
조직을 분리하는 결정은 주로 연구 질문에 의해 결정되지만, 이 접근법의 실용성, 신뢰성 및 잠재적인 대사 영향을 고려하는 것이 중요합니다. 여기에서는 홀로비온트에서 대사 산물을 추출하기 위한 상세하고 입증된 방법과 별도의 숙주 및 공생체 분획을 제공합니다. 우리는 숙주와 공생체의 대사 산물 프로필을 독립적으로 비교하고 이러한 프로필이 홀로비온트 대사 산물 프로필과 어떻게 비교되는지 비교합니다.
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Protocol
참고: 실험 설계, 샘플 수집 및 보관은 2,30,31의 다른 곳에서 자세히 설명되었습니다. 야생 산호 채취에 대한 허가 승인은 채취 및 실험 전에 받아야 합니다. 이곳의 샘플은 바타비아 산호 농장(워싱턴 주 제럴턴)에서 수입된 몬티포라 몰리스(Montipora mollis, 녹색 형태) 군락에서 채취한 것으로, 원래는 양식 허가 AQ1643에 따라 수심 1m의 아브로로스 제도(Abrohlos Islands; 28°52'43.3"S 114°00'17.0"E)의 암초에서 채취한 것입니다. 샘플링 전에 콜로니는 35 PSU의 800 L 수족관에서, 150 μmol 광자·m−2·s−1의 청색광 및 백색광 아래에서, 그리고 25 °C ± 0.5 °C에서 3개월 동안 보관되었습니다. 산호 조각(~5cm2, N=6)을 액체 질소에서 급속 냉동하고 처리할 때까지 -80°C에서 보관하였다.
1. 추출 용액 및 장비의 준비
- 산호 조직 제거 최소 1일 전에 추출 용액과 장비를 준비하십시오.
- 깨끗하고 세제가 없는 유리 제품에 초순수를 4°C로 사전 식힙니다.
- 100% LC 등급 메탄올을 10μg·mL−1 최종 농도의 적절한 내부 표준물질(예: 13C6소르비톨)과 혼합합니다.
- 절반은 100% LC 등급 메탄올, 절반은 초순수를 사용하여 50% 메탄올 추출 용액을 만듭니다. 두 메탄올 용액을 모두 -20°C에서 보관합니다.
참고: 대사 산물의 분해를 방지하기 위해 한 번에 5개의 산호 조각 배치로 샘플 처리 단계를 수행하고 하나의 추가 생물학적(물만) 공백(총 샘플 N = 6)을 사용하는 것이 좋습니다. 각 산호 샘플이 두 개의 분획(산호 숙주 조직, 이하 "숙주", 미세조류 세포, 이하 "공생체")으로 분리되면 한 처리 배치의 총 샘플 수는 12개가 됩니다.
2. 산호 대사 담금질
참고: 실험 설계, 샘플 수집 및 보관은 2,30,31의 다른 곳에서 자세히 설명되었습니다. 그러나, 대사를 소멸시키는 데 걸리는 시간(즉, 산호 샘플 수집과 보존 사이의 시간)은 본래의 반응을 포착하는 데 중요하다는 것을 유의해야 한다(30). 채취 후 가능한 한 빨리 시료를 보존하여 시료 분해 또는 비표적 생리학적 반응으로 인한 대사산물 조성의 변화를 방지한다32.
- 산호 조각을 멸균 샘플 수집 백에 넣고 여분의 바닷물을 최대한 배출합니다. 샘플을 액체 질소에 최소 30초 동안 담그십시오. 샘플을 가능한 한 빨리 -80°C 냉동고로 옮겨 보관합니다.
참고: 샘플은 처리할 때까지 빛이 차단된 용기에서 -80°C로 동결할 수 있으므로 동결-해동 주기를 피할 수 있습니다.
3. 골격에서 산호 조직 제거
알림: 샘플은 지속적인 신진대사를 방지하면서 동시에 액체 형태가 되도록 항상 얼음(4°C) 위에 보관해야 합니다.
- 깨끗하고 멸균된 검체 채취 백을 얼음 위에 놓아 백이 안정적이고 얕은 우물의 얼음 위에서 열리지만 얼음에 잠기지 않도록 합니다. 10mL의 찬물(4°C) 초순수를 백에 넣습니다.
알림: 이렇게 하면 차갑고 가압된 공기와 주변 얼음으로 인한 산호 조각의 반복적인 동결-해동을 방지하는 데 도움이 됩니다. - 멸균된 핀셋으로 산호 조각을 선택하고 멸균 파스퇴르 피펫을 사용하여 해수 잔여물이 남지 않을 때까지 찬물(4°C) 초순수로 헹굽니다. 헹군 산호 조각을 초순수 10mL가 들어 있는 가방에 담그십시오.
참고: 이 헹굼은 다운스트림 분석을 방해할 수 있는 잔류 염을 제거하는 데 중요합니다. 샘플을 4°C로 유지하기 위해 백을 통해 물이나 산호 조각에 손이 닿지 않도록 하십시오. - 멸균 1mL 피펫 팁을 전기 테이프로 에어건 끝에 테이프로 붙이고 팁 끝을 ~5mm 잘라냅니다(그림 1A).
- 가방을 반쯤 밀봉하고 공기 흐름을 중저온으로 하여 산호 조각 위로 물이 원을 그리며 움직이도록 하여 조직을 부드럽게 제거하기 위해 산호 조각에 에어건을 조준합니다.
- ~3분 후 또는 골격에서 모든 조직이 제거된 것처럼 보이면 공기를 끄고 에어브러시를 제거합니다. 가방을 완전히 밀봉하십시오.
- 제거한 산호 조직을 모두 가방의 하단 모서리에 짜냅니다. 반대쪽 모서리를 잘라내고 봉지의 내용물을 얼음 위에 있는 15mL 튜브에 부드럽게 붓습니다.
4. 선택적인 균질화
알림: 일부 산호 종은 다른 종보다 점성이 더 높기 때문에 에어 브러싱으로 슬러리 대신 덩어리로 조직을 제거합니다. 에어 브러시 균질액에 조직 덩어리가 보이면 모든 샘플에 대해 4°C에서 균질화 단계를 추가할 수 있습니다.
- 기계식 톱니 균질화기를 4°C 70% 메탄올로 두 번 청소하고 마지막으로 4°C 초순수로 청소합니다.
- 샘플이 완전히 균질화되고 덩어리가 보이지 않을 때까지 15mL 튜브에서 산호 샘플을 ~1분 동안 균질화합니다.
- 각 샘플 사이의 4.1단계에서와 같이 균질기를 청소합니다. 시료 전체에서 균질화 시간을 일정하게 유지합니다.
5. 정규화를 위한 샘플 수집
- Symbiodiniaceae 세포 수, 산호 숙주 조직 단백질 함량 분석 및 엽록 소 추정을 위해 균질화된 조직에서 1,000μL 부분 표본을 수집합니다. 분석할 준비가 될 때까지 -20°C에서 보관합니다(섹션 10).
6. 선택적 산호 숙주 조직 - Symbiodiniaceae 세포 분리
- 냉장 원심분리기를 사용하여 2,500× g 에서 4°C에서 5분 동안 산호 균질액을 원심분리합니다.
참고: 이 속도는 상층액에 부유하는 숙주 조직에서 세포벽을 그대로 유지하면서 더 무거운 Symbiodiniaceae 세포를 분리하는 데 최적입니다. - 숙주 물질이 포함된 상층액을 제거하고 새 15mL 튜브에 넣습니다.
참고: 숙주 조직의 지질은 일반적으로 공생체 세포 위에 좁은 분홍색/흰색 층을 형성합니다. 이 층은 피펫팅을 통해 용해성 숙주 상층액과 함께 수집할 수 있습니다(그림 1B). - 정확히 1분 동안 호스트를 세게 소용돌이칩니다. 조류 펠릿 샘플과 호스트 상청액 샘플을 얼음 위에 보관하십시오.
- 조류 펠릿에 4°C에서 초순수 2mL를 추가합니다. 펠릿을 다시 부유시키기 위해 정확히 2분 동안 격렬하게 소용돌이칩니다.
참고: Symbiodiniaceae 유전형 분석을 위해 산호 콜로니에서 1cm의 개별 단편을 수집하지 않은 경우, Symbiodiniaceae 세포 현탁액의 200μL 분취액을 여기에서 수집하고, 선호하는 DNA 완충액에 보존하고, Symbiodiniaceae 유전형 분석에 대한 Thurber et al.30 에 설명된 대로 저장할 수 있습니다(예: González-Pech et al.12에 따름). - 6.1-6.4단계를 한 번 더 반복합니다.
알림: 숙주와 공생체의 신뢰할 수 있는 분리는 일부 종은 다른 종보다 점성이 더 높을 수 있기 때문에 산호 바이오매스와 종에 따라 다릅니다. 최소 3단계의 세척이 권장되지만 분리 성공 여부에 따라 늘릴 수 있습니다. 숙주 분획의 바닥에서 Symbiodiniaceae 세포가 보이지 않을 때까지, 그리고 Symbiodiniaceae 분획에 숙주 물질이 눈에 띄게 없어질 때까지(예: 상단에 흰색 층이 없음) 세척 단계 4.7-4.9를 반복합니다(그림 1). - 숙주 물질이 포함된 상층액을 제거하고 새 15mL 튜브에 넣습니다.
- 공생체 펠릿을 15mL 튜브에 보관합니다.
7. 샘플 건조
- holobiont 균질화 또는 분리된 숙주와 Symbiodiniaceae 분획을 모두 -80°C에서 ~120분 동안 동결합니다. -85°C에서 0.01mbar 진공으로 밤새 샘플을 동결건조합니다.
참고: 동결건조 중 샘플 손실을 방지하려면 멸균 2G 바늘을 사용하여 ~2mm 구멍이 조심스럽게 뚫린 다른 멸균 튜브 또는 멸균 파라필름에서 절단된 뚜껑을 사용하는 것이 좋습니다. - 건조 시 실험실 저울을 사용하여 다음 중 하나를 계량합니다: 1) 홀로비온트 25mg; 2) 공생체 분획 15mg; 또는 3) 각 샘플에서 30mg의 숙주 조직을 별도의 2mL 가소제가 없는 미세 원심분리기 튜브에 넣습니다.
참고: 중요 단계: 추출을 위한 바이오매스의 최적화는 충분한 신호를 보장하면서 GC-MS에 과부하가 걸리지 않도록 하는 데 필수적입니다. 말린 산호 물질은 매우 정적입니다. 샘플 손실을 방지하려면 정전기 방지 장치를 사용하여 샘플 및 칭량 용기에서 정전기 전하를 제거하십시오. 간단하고 비용 효율적인 대안은 샘플 튜브 아래에 세탁 건조기 시트를 놓는 것입니다. 건조된 공생체 펠릿은 멸균 블레이드를 사용하여 원하는 무게로 절단할 수 있습니다.
8. 세포내 대사산물 추출
- 동결건조된 홀로비온트에서 세포내 대사산물 추출:
- 내부 표준물질(IS; 13의C6 소르비톨 및/또는 13C5-15 N 발린, 10μM에서) 각 튜브에.
- 소량의 710-1,180μm 산 세척 유리 비드(~10mg)를 각 샘플에 추가합니다. 50Hz의 비드 밀에 3분 동안 사전 냉각된(-20°C) 비드 밀 인서트에 넣습니다.
- IS(13C6 소르비톨 및/또는 13C 5-15 N 발린, 10 μM에서)가 포함된 100% 저온(-20°C) 메탄올 600μL를 각 튜브에 추가합니다.
- 1분 동안 섞는 소용돌이. 4°C의 로티세리 셰이커에 30분간 올려 놓습니다.
- 분리된 동결건조된 Symbiodiniaceae 세포에서 세포내 대사산물 추출:
- 건조된 Symbiodiniaceae 재료에 IS(13C6 소르비톨 및/또는 13C5-15N 발린, 10μM에서)가 포함된 100% 저온(-20°C) 메탄올 200μL를 추가합니다.
- 소량의 710-1,180μm 산 세척 유리 비드(~10mg)를 추가합니다. 50Hz의 비드 밀에 3분 동안 사전 냉각된(-20°C) 비드 밀 인서트에 넣습니다.
- IS가 있는 800% 저온(-20°C) 메탄올 800μL를 추가하고 30초 동안 소용돌이를 추가합니다.
- 분리된 동결건조된 숙주 조직에서 세포내 대사산물 추출:
- IS(13C6 소르비톨 및/또는 13C5-15N 발린, 10μM에서)를 함유한 100% 저온(-20°C) LC 등급 메탄올 1mL를 건조된 호스트 물질에 추가합니다.
- 20초 동안 혼합하는 소용돌이. 플로팅 튜브 홀더에 넣고 4 ° C로 설정된 초음파 처리 수조에서 30 분 동안 놓습니다.
9. 대사 산물 추출물 정화
- 샘플(holobiont/host/symbiont)을 3,000× g 에서 4°C에서 30분 동안 원심분리합니다.
- 모든 상층액을 새로운 2mL 미세 원심분리기 튜브로 옮기고 세포 파편 펠릿을 방해하지 않도록 주의합니다.
참고 : 이들은 반 극성 추출물입니다. 이들은 일시적으로 얼음 위에 보관할 수 있지만 어둠 속에서 -80 °C에서 장기간 보관할 수 있습니다. - 나머지 세포 파편에 1,000μL의 50% 저온(-20°C) 메탄올을 추가합니다. 1분 동안 세게 소용돌이치면 다시 매립됩니다.
- 샘플을 3,000× g 에서 4°C에서 30분 동안 원심분리합니다.
- 동일한 샘플에서 상층액(극성 추출물)을 반극성 추출물과 함께 수집하고 합산합니다.
참고: 세포 파편은 -80°C에서 보관할 수 있으며 단백질 함량 정규화에 사용할 수 있습니다(섹션 11). - 고인 추출물을 16,100g에서 15분 동안 원심 분리하여 모든 침전물을 제거하고 상층액을 가소제가 없는 새로운 마이크로 원심분리기 튜브(2mL)로 옮깁니다.
참고: 샘플 추출물은 어두운 곳에서 -80°C에서 보관할 수 있습니다. - 분석할 준비가 되면 각 추출물 50μL를 유리 삽입물에 분주합니다. 진공 농축기를 사용하여 30°C에서 30분 동안 농축합니다. 4회 더 반복합니다(총 건조 추출물 250μL).
참고: 건조된 샘플은 분석할 때까지 건조제 조건에서 실온에 보관할 수 있습니다.
10. 대사 산물 유도체화
참고 : 극성 대사 산물의 메톡시메이션(methoximation) 및 트리메틸실릴화(trimethylsilylation)를 위해 2단계 온라인 유도체화 공정이 사용됩니다.
- 각 샘플에 25μL의 메톡시아민 염산염(피리딘 30mg/mL)을 추가합니다.
- 37°C에서 750rpm으로 설정된 오비탈 셰이커에서 2시간 동안 교반합니다.
- 각 샘플에 25μL의 N,O-bis(트리메틸실릴)트리플루오로아세트아미드 + 트리메틸클로로실란을 추가합니다.
- 37°C 및 750rpm에서 1시간 동안 다시 교반합니다.
- 시료를 실온에서 1시간 동안 평형화한 후 GC에 1:10 분할 비율로 1μL를 주입합니다.
11. 가스 크로마토그래피-질량 분석
알림: 질량 분석기는 트리스-(퍼플루오로부틸)-아민(CF43)을 사용하여 제조업체의 권장 사항에 따라 조정해야 합니다.
- 초고순도 헬륨을 1mL/분의 일정한 컬럼 유속으로 운반 가스로 사용합니다.
- 필름 두께가 1μm이고 내부 직경이 0.25mm인 30m DB-5 컬럼을 사용합니다.
- GC 오븐 프로그램
- 입구 온도를 280°C로 설정합니다.
- 오븐 온도 100°C로 주입을 시작하고 4분 동안 유지합니다.
- 온도를 10°C/분 320°C로 높인 다음 11분 동안 유지합니다.
- 질량분석기 파라미터
- MS 이송 라인을 280°C로 설정하고 이온 소스를 200°C로 조정합니다.
- 아르곤을 충돌 셀 가스로 사용하여 다중 반응 모니터링(MRM) 생성물 이온을 생성합니다.
- MRM 표적을 포함하는 시간 분할 MRM 라이브러리를 기준으로 대사체 검출을 달성합니다.
12. Symbiodiniaceae 세포 수, 산호 숙주 조직 단백질 함량 분석 및 엽록소 추정
- Symbiodiniaceae 세포 수:
- 산호 조직 균질액의 분취액을 취하십시오.
- 샘플을 2,000× g 으로 원심분리하여 조류를 펠릿화합니다.
- 조류 펠릿에서 ~200μL 상층액을 제거하고 새 미세 원심분리기 튜브에 넣습니다.
참고: 이것은 데이터를 정규화하는 데 사용되는 단백질 샘플입니다. 필요한 경우 분석하기 전에 -20 °C에서 보관하십시오. - 여과된 해수 1mL에 조류 펠릿을 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 재현탁시킵니다. 필요한 경우 세포 계수를 용이하게 하기 위해 조류 현탁액을 희석합니다.
- 챔버 중 하나에 10μL를 추가하여 광학 현미경 아래에서 혈구계를 사용하여 세포 계수를 수행합니다. 샘플당 8-10개의 카운트를 완료합니다.
참고: 조류 세포를 계수하기 위한 대체 방법도 가능한 경우 적용할 수 있습니다(예: 유세포 분석, 고처리량 공초점 현미경 검사). - 사용된 희석 계수를 고려하여 공생체 세포의 농도(mL−1)를 계산합니다.
- 단백질 함량 분석
- 샘플 단백질 함량을 정량화합니다(예: Bradford et al.33에 의해 처음 기술된 Bradford의 비색 분석 또는 다른 곳에서 cnidarians에 대해 설명된 프로토콜인 Lowry 분석(34,35)을 통해).
- 엽록소 추출
- ~ 200, 000 세포, 냉동 또는 신선의 세포 펠릿을 사용하십시오.
- 각 조류 펠릿을 유리 섬광 바이알에 담긴 2mL의 디메틸포름아미드(DMF)에 옮기고 어두운 곳에서 48시간 동안 4°C에서 배양합니다.
참고: DMF는 독성이 있고 발암성이 있으므로 샘플 준비는 가능한 한 어두운 흄 후드 아래에서 얼음 위에서 완료해야 합니다. 셀이 <200,000개인 경우 DMF를 더 적게 사용합니다. - 16,000 × g에서 3분 동안 원심분리합니다.
- 측광 측정을 위해 200mL를 UV-96 웰 플레이트로 옮깁니다. DMF를 공백으로 사용하여 각 샘플을 삼중으로 실행합니다.
- 파장 (E) 663.8nm, 646nm 및 750nm에서 흡광도를 측정합니다. 다른 두 파장의 흡광도에서 750nm의 흡광도를 뺍니다.
참고: 750nm에서 측정하면 샘플의 산란 또는 탁도가 보정됩니다. - 방정식 (1)을 사용하여 엽록소 농도(μg/mL)를 계산합니다.
Chl 농도 (μg/mL) = (12.00 × E663.8) - (3.11 × E 646.8) (1)
13. 정상화를 위한 대사산물 추출 후 세포 바이오매스의 정량화
참고: 아래에 설명된 세포 바이오매스의 정량화에는 수정된 Bradford 비색법을 사용한 바이오매스와 관련된 단백질의 정량화와 세포 파편 건조 중량 측정의 두 가지 옵션이 있습니다. 두 방법 모두 세포 바이오매스의 정확한 정량화를 제공하므로 두 방법 모두 사용하기에 적합합니다.
- 세포 파편의 단백질 함량
- 동결된 세포 파편을 1mL의 0.2M NaOH로 재현탁시키고 샘플을 98°C에서 20분 동안 배양합니다.
- 샘플을 얼음 위에서 ~10분 동안 식히고 주변 온도에서 3,000× g 에서 5분 동안 원심분리합니다.
- 샘플 단백질 함량을 정량화합니다(예: Bradford et al.33에 의해 처음 설명되고 Smart et al.37에 의해 수정된 Bradford의 비색 분석을 통해).
- 세포 파편 건조 중량 측정
- 세포 내 대사 산물 추출에서 세포 파편을 이중 증류수(~10mL)에 재현탁시킵니다.
- 사전 계량된 멤브레인 필터(0.22μm 기공, 47mm)를 사용하여 진공 상태에서 용액을 여과합니다.
- 바이오매스가 포함된 튜브를 초순수로 두 번 세척하여 바이오매스가 멤브레인 필터로 완전히 전달되도록 합니다.
- 바이오매스가 포함된 멤브레인 필터를 제거하고 전자레인지(저전력, ~250W에서 20분)를 사용하여 건조시킵니다.
- 여과지를 데시케이터에 밤새 보관하십시오. 여과지의 건조 중량을 기록하고 총 중량에서 건식 멤브레인 필터(샘플 필터와 함께 건조된 깨끗한 건식 멤브레인 필터 사용)의 무게를 빼서 바이오매스의 건조 중량을 계산합니다.
14. 데이터 분석
- 각 표적이 정량자 및 한정자 MRM으로 구성된 대사체 데이터베이스를 사용하여 대사체 표적을 분석합니다.
- 검출된 대사산물 표적을 육안으로 검사하고 필요에 따라 수동으로 통합합니다.
- 대사산물 피크 면적을 사용하여 각 그룹에 대한 각 샘플의 상대적 존재도를 계산합니다. 값은 공백으로 수정되고 정규화되어 내부 표준 피크 영역을 샘플링한 다음 Smart et al.37에 따라 세포 파편 단백질 함량을 샘플링합니다.
- 모든 처리군에서 상대 표준 편차가 35%를 초과하는 대사 산물(N = 23 대사 산물)을 폐기합니다.
- 데이터(예: 세제곱근)를 변환하고 평균 중심화합니다. 분산의 정규 분포와 균질성을 확인합니다.
- 데이터 분석(분산 분석 및 히트맵 구성, 예: https://www.metaboanalyst.ca 사용)38을 수행합니다. 샘플을 군집화하여 "cluster", "factoextra" 및 "klustR" 패키지를 사용하여 처리 내 변동성을 조사합니다. 갭 통계량(최적의 군집 수를 결정하는 방법)을 R의 "clusGap" 함수를 사용하여계산하고, R 패키지 "tidyverse"를 사용하여 플롯한다. PERMANOVA를 수행하여 처리 대사 산물 프로파일 간의 분리에서 유의성을 조사합니다(예: Primer에서).
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Representative Results
이 작업 중에 생성된 모든 데이터는 보충 정보에서 사용할 수 있습니다.
숙주-공생체 분리
그림 1: 산호 숙주 조직과 Symbiodiniaceae 세포의 분리 설정 및 검증. (A) 산호 골격에서 산호 조직을 제거하기 위한 에어건 설정. 피펫 팁은 전기 테이프로 에어건에 부착되고 팁에서 작은(~5mm) 섹션이 절단되어 팁을 빼지 않고 더 많은 공기가 빠져나갈 수 있습니다. (B) 홀로비온트와 분리된 숙주 조직(상등액) 및 공생충과(Symbiodiniaceae) 세포(펠렛)의 예. 이 값은 원심분리 단계의 수를 나타냅니다. 화살표는 수집하여 숙주 분획과 결합할 수 있는 공생체 펠릿 위에 있는 좁은 숙주 지질층을 가리킵니다. (씨-E) 명시야(위) 및 엽록소 자가형광(아래) 숙주 조직과 공생 세포가 모두 있는 (C) 홀로비온트의 부분 표본, (D) 엽록소 자가형광이 없는 것으로 확인된 공생 세포가 없는 숙주 분획, (E) 숙주 조직의 제거를 보여주는 온전한 공생 세포의 현미경 이미지. 스케일 바 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
현미경 시각화는 세 가지 세척 단계 후 숙주 조직 샘플에서 Symbiodiniaceae 세포를 보여주지 않았습니다(그림 1D). 유사하게, 공생체 분획에는 최소한의 숙주 조직이 존재하였다(그림 1E). 그러나 holobiont homogenate(그림 1C)는 세포 내 Symbiodiniaceae가 단순한 에어 브러싱에 의해 공생체에서 적절하게 방출되지 않았을 수 있으며, 따라서 원심 분리(그림 1E)에 비해 기계적 균질화(프로토콜 섹션 4) 또는 용매 추출(프로토콜 섹션 8) 중에 충분히 용해되지 않았을 수 있음을 보여주었습니다). 이러한 한계는 홀로비온트 샘플과 홀로비온트 프로파일의 특정 관찰 사이의 큰 그룹 내 변동 중 일부를 설명할 수 있습니다. 예를 들어, 두 대사 산물(글리콜산 및 1-헥사데칸올)은 홀로비온트 대 공생체에서 훨씬 더 풍부했지만 숙주 대 공생체에서는 그렇지 않았습니다. 이것은 홀로비온트 프로필에서 이러한 대사 산물의 상대적 풍부도에 그룹 내 큰 변동의 결과일 수 있습니다. 특히, holobiont 샘플 3은 공생체 또는 숙주 샘플 개별보다 도데카노산, 글리콜산 및 1-헥스데칸올의 농도가 상대적으로 높았습니다. 대사 산물 피크 면적 데이터가 샘플 단백질 함량으로 정규화됨에 따라, 공생체 세포가 숙주 조직을 충분히 세척하지 않은 경우, 홀로비온트 단백질 함량이 과소 평가되어 바이오매스 정규화에 영향을 미치고 이 샘플의 바이오매스에 비해 더 높은 대사 산물 함량을 계산할 수 있습니다. 이는 홀로비온트 대사체학(holobiont metabolomics)의 변동 증가 가능성을 더욱 강조합니다.
대사 산물 프로파일 분석
질량분석기 모드의 선택은 수행 중인 분석에 따라 다릅니다. 정상 상태 대사체 프로파일링의 경우, MRM 모드에서 QqQ-MS를 사용하는 포괄적인 표적 방법론을 사용하면 높은 생물학적 염 농도로 인해 발생할 수 있는 배경 노이즈를 제거하여 대사 산물 검출 및 식별을 개선할 수 있습니다. 안정 동위원소 표지 접근법의 경우, 스캔 모드에서 실행되는 질량 분석기(즉, 단일 사중극자, 삼중 사중극자[QqQ], 사중극자 비행 시간[QTOF])를 사용하면 안정 동위원소 농축 패턴을 나타내는 질량 동위원소를 검출할 수 있습니다.
표적 GC-MS 분석은 Shimadzu Smart Metabolite Database(v3, 약 350개의 내인성 대사산물 및 여러 안정 동위원소 표지 내부 표준물질 포함)와 Shimadzu LabSolutions Insight 소프트웨어를 사용하여 완료되었습니다. 모든 처리에서 아미노산, 유기산, 탄수화물, 지방산 및 스테롤을 포함하여 107개의 주석이 달린 대사 산물이 확인되었습니다(보충 표 S1). 정성적 및 정량적 이온쌍은 보충표 S2에 제공된다. Kmeans 군집화는 세 개의 서로 다른 표본 군집(갭 통계 검정으로 확인됨)을 식별했으며, 모든 표본은 별도의 별개의 군집에 있습니다. 공생체는 클러스터 1에, 숙주는 클러스터 2에, 홀로비온트 샘플은 클러스터 3에 있었습니다(그림 2).
그림 2: 대사 산물 프로파일의 Kmeans 클러스터 분석 . (A) 샘플 대사 산물 프로파일은 최적의 클러스터 수(N = 3)에 의해 유클리드 거리로 군집화되었으며, 이는 갭 통계량 계산을 통해 확인되었습니다. (B) 각 군집(빨간색 = 군집 1, 녹색 = 군집 2, 파랑 = 군집 3)에 대한 평균 대사산물 상대 풍부도(선, 군집에 따라 색상이 지정됨) 및 신뢰 구간(음영, 군집에 따라 착색)의 병렬 좌표 시각화. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
숙주와 공생체 대사 산물 프로파일 비교
숙주와 공생체 프로파일은 서로 유의하게 구별되었다(PERMANOVA, t=16.909, p <.001; 보충표 S3), 숙주와 공생체 분획 간에 유의하게 다른 100개의 개별 대사산물(ANOVA, FDR < .05; 그림 3 및 보충 표 S1). 이 중 13개의 대사산물은 숙주 추출물보다 공생체에 훨씬 더 풍부했으며, 여기에는 에이코사노이드 도코사헥사엔산(C22:6[ω-6]; DHA), 에이코사펜타엔산(C20:5[ω-6]; EPA) 및 아라키돈산(C20:4[ω-6]; ARA) (ANOVA, FDR < 0.05; 그림 3 및 보충 표 S1). 총 87개의 대사산물은 숙주 추출물보다 공생체에서 덜 풍부했다(ANOVA, FDR < 0.05; 그림 3 및 보충 표 S1).
그림 3: 그룹 비교의 사후 분석 결과를 사용한 대사 산물의 상대적 풍부도에 대한 히트맵 시각화. 숙주, 공생체 및 홀로비온트 샘플(그룹당 N = 5)은 Ward의 연결을 통해 계층적으로 클러스터링되었고, 대사 산물은 유클리드 거리 측정에 따라 클러스터링되었습니다. 색상이 지정된 사각형은 사후 Tukey의 HSD(보충 표 S1)와 ANOVA를 통해 감지된 그룹 비교에서 상당한 차이를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
분리된 숙주 및 공생체 프로파일과 비교한 Holobiont 대사 산물 프로파일
홀로비온트 대사체 프로파일은 Kmeans 분석에서 홀로비온트 클러스터에서 샘플이 크게 분리되어 입증된 그룹 내 변동성이 크다는 것을 보여주었습니다. 구체적으로, 샘플 3 및 샘플 4는 샘플 1, 샘플 2 및 샘플 5로부터 차원 2를 따라 분리되었습니다(그림 2A). 홀로비온트 샘플은 분리된 숙주와 공생체 분획 사이의 중간이었습니다(그림 2A). Kmeans 군집 분포(그림 2A), 평행 좌표(그림 2B) 및 대사 산물 상대 풍부도의 히트맵 시각화(그림 3)는 홀로비온트 프로파일이 숙주 분획 프로파일과 더 밀접하게 일치함을 나타냈지만, 홀로비온트 프로파일은 숙주 모두와 유의하게 달랐습니다(PERMANOVA, t = 3.47, p < 0.001; 보충표 S3) 및 공생체 프로파일(PERMANOVA, t = 11.29, p < 0.001; 보충표 S3). 개별 대사체 수준에서, 홀로비온트의 66개 및 82개 대사산물은 각각 숙주 및 공생체 프로파일과 유의하게 달랐다(ANOVA, FDR < 0.05, 보충표 S1). 이 중 66개의 중요한 대사 산물 중 54개(81.8%)는 홀로비온트 분획보다 숙주에서 상대적 존재도가 현저히 높았고, 78개(95%)는 공생체 분획보다 홀로비온트에서 상대적 존재도가 훨씬 높았다. DHA, 글리세롤-3-포스페이트, 이노시톨 포스페이트, 인산을 포함한 4가지 공생체 분획이 더 풍부했습니다(그림 3). 8개의 대사 산물(2개의 지방산[리놀레산(C18:1) 및 미리스틱(C14:0)산], 5개의 디카르복실산 및 아미노산 구아닌을 포함)은 숙주와 공생체 간에 풍부도가 크게 달랐지만 홀로비온트 분획과 비교했을 때는 그렇지 않았습니다(그림 3).
보충표 S1: 홀로비온트에서 GC-MS 분석을 사용하여 확인된 각 대사체의 상대적 풍부도 및 분리된 숙주와 공생체. 값은 평균 ± 표준 오차이며, 사후 분석을 포함하여 제공된 분산 분석 결과는 색상이 지정된 셀(K, L 및 M 열)로 표시됩니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 표 S2: 확인된 대사 산물에 대한 정성적 및 정량적 이온 쌍. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충표 S3: PERMANOVA 결과. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
숙주와 공생체의 분리는 간단한 원심분리를 통해 쉽고 빠르게 달성할 수 있으며, 여기의 결과는 분획을 분리하는 것이 특정 홀로비온트 구성원 기여를 나타내는 귀중한 정보를 제공할 수 있음을 보여주며, 이는 산호 건강의 기능적 분석에 기여할 수 있습니다. 성체 산호에서, 지질 합성은 주로 상주 조류 공생체(40)에 의해 수행되는데, 이 공생체는 지질(예를 들어, 트리아실글리세롤 및 인지질)41 및 스트레스 회복을 촉진할 수 있는 지방산을 공급한다11,42. 이 연구에서 공생체 대 숙주 프로필에서 더 풍부한 13 개의 대사 산물 중 9 개는 생물학적으로 관련된 eicosanoids DHA (C22 : 6 [ω-6]), EPA (C20 : 5 [ω-6]) 및 ARA (C20 : 4 [ω-6])를 포함하여 지방산이었으며, 이는 산호-Symbiodiniaceae 공생 9,10에서 왕국 간 스트레스 신호와 관련이 있습니다. 인산 이노시톨은 세포 성장, 세포 사멸, 세포내이입 및 세포 분화를 포함한 다양한 세포 기능에 중요한 역할을 합니다. 이노시톨 동형과 유도체의 상대적 풍부도는 공생 기능 장애 7,11,27,28 동안 자주 변하는 것으로 밝혀졌지만, 산호-공생 공생에서 이러한 동형과 그 유도체의 역할은 불분명합니다. 따라서 숙주와 공생체 프로파일 사이의 상대적 풍부도의 분명한 차이는 이러한 지식에 기여하는 데 도움이 됩니다.
많은 연구에서 홀로비온트 대사산물 프로파일을 사용하여 주변 및 스트레스 조건 하에서 산호 대사 상호작용 및 성능을 조사하였다 13,43,44,45. 여기에서, 우리는 홀로비온트 균질액의 분석이 큰 치료 내 변동성을 초래할 수 있으며, 결과 프로파일이 전체 홀로비온트 대사체에 대한 숙주 및/또는 공생체 특이적 풍부도 패턴과 대사 기여를 가릴 수 있음을 보여줍니다. 예를 들어, 숙주 분획에 비해 공생체에서 현저하게 더 풍부한 13개의 대사산물 중 4개만이 홀로비온트에 비해 공생체에서 현저하게 더 풍부했습니다. 여기에는 잠재적으로 생물학적으로 관련된 DHA 및 이노시톨 포스페이트 7,9,10,11,27,28이 포함되었습니다. 그러나 숙주와 공생체 사이의 스트레스 신호 eicosanoids EPA 및 ARA에서 관찰 된 뚜렷한 차이는 holobiont 대 symbiont 샘플에서 유의하지 않았습니다. 이러한 대사 산물은 공생의 분자 언어에서 중요한 대사 산물 및 스트레스 반응의 지표로 점점 더 인식되고 있지만(10), 홀로비온트 프로파일을 검사하는 것만으로는 특정 홀로비온트 구성원에서 이러한 대사 산물의 상대적 풍부 비율의 뚜렷한 변화를 밝힐 수 없습니다. 따라서 홀로비온트를 분석하면 숙주와 공생체를 별도로 분석할 때 명백한 차이를 가릴 수 있으며, 이러한 차이는 홀로비온트 프로파일만을 사용하여 비생물적 또는 생물학적 처리를 비교하는 연구에서 유의한 것으로 감지되지 않을 수 있습니다. 이것은 특정 파트너의 기여 또는 기능을 추론하는 것을 어렵게 만들 수 있다 7,8,9,11,12,22,28, 특히 공생적 상호작용이 관찰된 홀로비온트 표현형(46,47)의 기초가 되는 생물학적 질문에 답하려고 할 때 더욱 그렇다.
또 다른 방법은 숙주 조직과 공생 세포를 분리하고, 균질액의 부분 표본 또는 각 분획의 추출물을 채취하여 추출 전에 재결합하고, 분리된 분획과 함께 이를 분석하는 것입니다. 이 방법은 숙주 조직으로부터 공생체의 방출을 보장하지만, 인적 오류 및/또는 대사 산물 손실의 가능성을 증가시킬 것이다48. 분획을 별도로 분석하고 분석 후 데이터를 통합하는 것이 가능할 수 있지만, 계산은 원래 산호 홀로비온트에서 공생 세포와 숙주 세포의 비율을 고려해야 합니다.
대사체 분석을 위해 숙주와 공생체 분획을 분리하여 더 많은 정보를 얻을 수 있지만, 특히 홀로비온트 대사 및 기능에 대한 개별 구성원의 기여도 측면에서 홀로비온트를 분석하지 않고 숙주와 공생체를 분리할지 여부는 궁극적으로 연구 질문에 의해 결정됩니다. 예를 들어, 홀로비온트의 대사체 프로파일 분석은 홀로비온트로 다른 생리학적 측정을 수행할 때(예: 산호 군집 49,50,51로부터의 휘발성 대사체 방출 분석) 및 대사체학 프로파일이 홀로비온트 데이터 세트와 통합되어야 할 때 관련이 있습니다. 또한 숙주와 공생체의 분리에는 제한이 없습니다. 예를 들어, 추가적인 조작 단계들은 대사산물 안정성을 방해할 수 있고, 데이터 손실 또는 교란 효과(48)를 초래할 수 있다.
더욱이, 숙주-공생체 분리 절차와 관련된 추가적인 최적화 단계들이 있다: 1) 특정 산호 종에 대한 세척 횟수 최적화; 2) GC-MS 분석을 위해 두 분획에서 추출할 최적의 바이오매스를 식별합니다. 최종 시료 처리를 시작하기 전에 두 단계를 모두 포함해야 하므로 재료, 시간 및 비용에 대한 소모품 및 분석 요구 사항이 모두 증가합니다. 이 연구에서, 숙주로부터의 대사 산물 손실과 추가 단계로 인한 공생체 추출은 글리콜산, 1-헥사데칸올 및 도데칸산과 같은 숙주 또는 공생체에 비해 홀로비온트에서 관찰되는 일부 대사 산물의 상대적 풍부도가 더 높은 데 기여했을 수 있습니다. 그러나 이러한 대사 산물에 대한 holobiont 그룹의 큰 그룹 내 변화는 언급했듯이 이러한 관찰 된 패턴에 대한 대체 이유입니다.
대사체학 접근법의 적용은 비교적 새로운 것이지만 특정 공생의 기능을 설명하는 우리의 능력에 지대한 영향을 미쳤습니다. 예를 들어, 이 접근법은 식물성 플랑크톤 성장 촉진 호르몬인 인돌-3 아세트산의 기여를 밝혀냈으며, 인돌-3 아세트산은 Pseudo-nitzschia multiseries-Sulfitobacter 공생의 박테리아에 의해 합성됩니다. 더욱이, 이 접근법은 산호 11,27,28,29에서 숙주-유래 및 공생체-유래 전좌를 해명했으며, 이는 바이오 마커 검출(biomarker detection)19 등을 통해 산호초 보존 및 복원3에 대한 흥미로운 잠재력을 가지고 있다. 여기에서 우리는 미래의 산호초 조사를 위한 대사체학의 적용을 촉진하고 가속화할 수 있기를 희망하며 두 가지 접근 방식에 대한 절차를 제공했습니다.
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Disclosures
저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
J.L.M.은 UTS Chancellor's Research Fellowship의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100% LC-grade methanol | Merck | 439193 | LC grade essential |
| 2 mL microcentrifuge tubes, PP | Eppendorf | 30121880 | Polypropylene provides high resistance to chemicals, mechanical stress and temperature extremes |
| 2030 Shimadzu gas chromatograph | Shimadzu | GC-2030 | |
| 710-1180 µm acid-washed glass beads | Merck | G1152 |
This size is optimal for breaking the Symbiodiniaceae cells |
| AOC-6000 Plus Multifunctional autosampler | Shimadzu | AOC6000 | |
| Bradford reagent | Merck | B6916 | Any protein colourimetric reagent is acceptable |
| Compressed air gun | Ozito | 6270636 | Similar design acceptable. Having a fitting to fit a 1 mL tip over is critical. |
| DB-5 column with 0.25 mm internal diameter column and 1 µm film thickness | Agilent | 122-5013 | |
| DMF | Merck | RTC000098 | |
| D-Sorbitol-6-13C and/or 13C5–15N Valine | Merck | 605514/ 600148 | Either or both internal standards can be added to the methanol. |
| Flat bottom 96-well plate | Merck | CLS3614 | |
| Glass scintillation vials | Merck | V7130 | 20 mL, with non-plastic seal |
| Immunoglogin G | Merck | 56834 | if not availbe, Bovine Serum Albumin is acceptable |
| Primer | v4 | ||
| R | v4.1.2 | ||
| Shimadzu LabSolutions Insight software | v3.6 | ||
| Sodium Hydroxide | Merck | S5881 | Pellets to make 1 M solution |
| tidyverse | v1.3.1 | R package | |
| TissueLyser LT | Qiagen | 85600 | Or similar |
| TQ8050NX triple quadrupole mass spectrometer | Shimadzu | GCMS-TQ8050 NX | |
| UV-96 well plate | Greiner | M3812 | |
| Whirl-Pak sample bag | Merck | WPB01018WA | Sample collection bag; Size: big enough to house a ~5 cm coral fragment, but not too big that the water is too spread |
References
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