Summary
Her præsenterer vi ekstraktion og fremstilling af polære og semipolære metabolitter fra en koralholobiont samt adskilt koralværtsvæv og Symbiodiniaceae-cellefraktioner til gaskromatografi-massespektrometrianalyse.
Abstract
Gaskromatografi-massespektrometri (GC-MS) -baserede tilgange har vist sig at være kraftfulde til at belyse det metaboliske grundlag for den cnidar-dinoflagellatsymbiose, og hvordan koraller reagerer på stress (dvs. under temperaturinduceret blegning). Steady-state metabolitprofilering af koralholobionten, som omfatter cnidarian værten og dens tilknyttede mikrober (Symbiodiniaceae og andre protister, bakterier, arkæer, svampe og vira), er blevet anvendt med succes under omgivende og stressforhold for at karakterisere korallens holistiske metaboliske status.
For at besvare spørgsmål omkring de symbiotiske interaktioner er det imidlertid nødvendigt at analysere koralværtsens metabolitprofiler og dets algesymbionter uafhængigt, hvilket kun kan opnås ved fysisk adskillelse og isolering af vævene efterfulgt af uafhængig ekstraktion og analyse. Mens anvendelsen af metabolomics er relativt ny på koralområdet, har forskergruppernes vedvarende indsats resulteret i udviklingen af robuste metoder til analyse af metabolitter i koraller, herunder adskillelse af koralværtsvæv og algesymbionter.
Dette papir præsenterer en trinvis vejledning til holobiont separation og ekstraktion af metabolitter til GC-MS-analyse, herunder vigtige optimeringstrin til overvejelse. Vi demonstrerer, hvordan den kombinerede metabolitprofil for de to fraktioner (koral og Symbiodiniaceae), når den analyseres uafhængigt, ligner helhedens profil (holobiont), men ved at adskille vævene kan vi også få nøgleinformation om metabolismen af og interaktionerne mellem de to partnere, der ikke kan opnås fra helheden alene.
Introduction
Metabolitter repræsenterer slutprodukterne af cellulære processer, og metabolomics - undersøgelsen af pakken af metabolitter produceret af en given organisme eller økosystem - kan give et direkte mål for organismens funktion1. Dette er især kritisk for at udforske økosystemer, symbiotiske interaktioner og genopretningsværktøjer, da målet med de fleste forvaltningsstrategier er at bevare (eller gendanne) specifikke økosystemtjenestefunktioner2. Koralrev er et akvatisk økosystem, der demonstrerer den potentielle værdi af metabolomics til belysning af symbiotiske interaktioner og sammenkobling af koralfysiologiske reaktioner på samfundsniveau og økosystemniveaupåvirkninger 3. Anvendelsen af gaskromatografi-massespektrometri med høj kapacitet (GC-MS) er især værdsat på grund af dets evne til hurtigt at analysere en bred vifte af metabolitklasser samtidigt med høj selektivitet og følsomhed, give hurtig forbindelsesidentifikation, når spektralbiblioteker er tilgængelige, og give et højt niveau af reproducerbarhed og nøjagtighed med relativt lave omkostninger pr. prøve.
Koraller er holobionter bestående af koraldyret, fotosyntetiske dinoflagellatendosymbionter (familie: Symbiodiniaceae4) og et komplekst mikrobiom 5,6. Samlet set opretholdes holobiontens egnethed primært gennem udveksling af små molekyler og elementer for at understøtte hvert medlems metaboliske funktion 7,8,9,10. Metabolomiske tilgange har vist sig særligt effektive til at belyse det metaboliske grundlag for symbiosespecificitet9,11, blegningsresponset på termisk stress 7,8,12,13, sygdomsrespons 14, forureningseksponeringsrespons 15, fotoakklimatisering 16 og kemisk signalering 17 i koraller samt hjælp til opdagelse af biomarkører 18,19. Derudover kan metabolomics give værdifuld bekræftelse af konklusionerne udledt af DNA- og RNA-baserede teknikker 9,20. Der er derfor et betydeligt potentiale for anvendelse af metabolomics til vurdering af revets sundhed og udvikling af værktøjer til bevarelse af rev3, f.eks. gennem påvisning af metaboliske biomarkører for stress18,19 og til undersøgelse af potentialet i aktive forvaltningsstrategier såsom ernæringstilskud21.
Adskillelse af værts- og symbiontcellerne og analyse af deres metabolitprofiler uafhængigt snarere end sammen som holobionten kan give mere information om partnerinteraktionerne, uafhængige fysiologiske og metaboliske statuser og potentielle molekylære mekanismer til tilpasning 11,12,22,23,24. Uden at adskille koraller og Symbiodiniaceae er det næsten umuligt at belyse bidraget og metabolismen af koraller og / eller Symbiodiniaceae uafhængigt, undtagen med kompleks genomrekonstruktion og metabolisk modellering25, men dette er endnu ikke anvendt på koral-dinoflagellatsymbiosen. Desuden kan forsøg på at udtrække information om den individuelle metabolisme af værts- eller algesymbionten fra holobiontens metabolitprofil føre til fejlfortolkning.
For eksempel blev tilstedeværelsen af C18: 3n-6, C18: 4n-3 og C16 flerumættede fedtsyrer i ekstrakter fra koraller og holobiontvæv indtil for nylig antaget at være afledt af algesymbiont, da koraller blev antaget ikke at have ωx desaturaser, der er essentielle for produktionen af omega-3 (ω3) fedtsyrer; nylige genomiske beviser tyder imidlertid på, at flere cnidarians har evnen til at producere ω3 PUFA de novo og yderligere biosyntetisere ω3 langkædet PUFA26. Kombination af GC-MS med stabil isotopmærkning (f.eks. 13 C-bicarbonat, NaH 13CO 3)kan bruges til at spore skæbnen for fotosyntetisk fikseret kulstof gennem koralholobiont metaboliske netværk under både kontrolbetingelser og som reaktion på eksterne stressorer27,28. Et kritisk skridt i sporingen af 13 C skæbne er imidlertid adskillelsen af koralvævet fra algecellerne - først da kan tilstedeværelsen af en 13C-mærket forbindelse i koralværtsfraktionen utvetydigt tildeles som en Symbiodiniaceae-afledt metabolit translokeret til korallen eller et nedstrøms produkt af en translokeret mærket forbindelse. Denne teknik har demonstreret sin magt ved at udfordre den langvarige antagelse om, at glycerol er den primære form, hvor fotosynthate translokeres fra symbiont til vært29, samt belyse, hvordan ernæringsflux mellem partnere ændres under blegning27,28 og som reaktion på uforenelige Symbiodiniaceae-arter11.
Mens beslutningen om at adskille væv primært er drevet af forskningsspørgsmålet, er det praktisk, pålidelighed og potentielle metaboliske virkninger af denne tilgang vigtigt at overveje. Her leverer vi detaljerede, demonstrerede metoder til ekstraktion af metabolitter fra holobionten såvel som de separate værts- og symbiontfraktioner. Vi sammenligner metabolitprofilerne for værten og symbionten uafhængigt, og hvordan disse profiler sammenligner med holobiontmetabolitprofilen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Det eksperimentelle design, prøveindsamling og opbevaring er beskrevet detaljeret andetsteds 2,30,31. Tilladelse til indsamling af vilde koraller skal indhentes forud for indsamling og forsøg. Prøverne her blev indsamlet fra kolonier af Montipora mollis (grøn farvemorf) importeret fra Batavia Coral Farms (Geraldton, WA), oprindeligt indsamlet fra et rev ud for Abrohlosøerne (Western Australia; 28°52'43.3"S 114°00'17.0"E) i en dybde af 1 m under akvakulturlicensen AQ1643. Før prøveudtagningen blev kolonierne holdt i et 800 L akvarium ved 35 PSU, under blåt og hvidt lys ved 150 μmol fotoner · m - 2 · s - 1 og ved 25 ° C ± 0,5 ° C i 3 måneder. Koralfragmenterne (~5 cm2, N = 6) blev snapfrosset i flydende nitrogen og opbevaret ved -80 °C indtil forarbejdning.
1. Fremstilling af ekstraktionsopløsninger og udstyr
- Mindst 1 dag før fjernelse af koralvæv skal ekstraktionsopløsningerne og udstyret tilberedes.
- Forafkøl ultrarent vand i rent, vaskemiddelfrit glas ved 4 °C.
- Der blandes 100 % LC-kvalitet methanol med en slutkoncentration på 10 μg·ml-1 af passende interne standarder (f.eks. 13C6 sorbitol).
- Opret en 50% methanolekstraktionsopløsning ved hjælp af halv 100% LC-grade methanol og halvt ultrarent vand. Begge methanolopløsninger opbevares ved -20 °C.
BEMÆRK: For at forhindre nedbrydning af metabolitterne anbefales det at udføre prøvebehandlingstrinnene i batcher på fem koralfragmenter ad gangen med en yderligere biologisk (kun vand) blindprøve (samlede prøver N = 6). Når hver koralprøve er blevet adskilt i de to fraktioner (koralværtsvæv, fremover "Host" og mikroalgeceller, fremover "Symbiont"), vil det samlede antal prøver i en behandlingsbatch være 12.
2. Koralmetabolisme slukning
BEMÆRK: Det eksperimentelle design, prøveindsamling og opbevaring er beskrevet detaljeret andetsteds 2,30,31. Det skal dog bemærkes, at den tid, det tager at slukke stofskiftet (dvs. tiden mellem indsamling og bevaring af koralprøver) er afgørende for at fange det oprindelige respons30. Prøven opbevares så hurtigt som muligt efter indsamlingen for at forhindre ændringer i metabolitsammensætningen som følge af prøvenedbrydning eller fysiologiske reaktioner uden for målgruppen32.
- Placer koralfragment i en steril prøveopsamlingspose, og dræn overskydende havvand så meget som muligt. Prøven nedsænkes i flydende nitrogen i mindst 30 s. Flyt prøverne så hurtigt som muligt til en -80 °C fryser til opbevaring.
BEMÆRK: Prøver kan fryses ved -80 ° C i lysblokerede beholdere indtil forarbejdning, så man undgår fryse-optøningscyklusser.
3. Fjernelse af koralvæv fra skelettet
BEMÆRK: Prøverne skal altid opbevares på is (4 °C) for at sikre, at de samtidig er i flydende form, samtidig med at de forhindrer løbende metabolisme.
- Anbring en ren, steril prøveopsamlingspose på is, så posen er stabil og åben oven på isen i en lav brønd, men ikke er nedsænket i isen. Tilsæt 10 ml koldt (4 °C) ultrarent vand til posen.
BEMÆRK: Dette vil medvirke til at undgå gentagen fryseoptøning af koralfragmentet på grund af den kolde trykluft og omgivende is. - Vælg et koralfragment med steriliseret pincet, og skyl med koldt (4 °C) ultrarent vand med en steril Pasteur-pipette, indtil der ikke er nogen havvandsrester tilbage. Nedsænk det skyllede koralfragment i posen, der indeholder 10 ml ultrarent vand.
BEMÆRK: Denne skylning er afgørende for at fjerne eventuelle resterende salte, der ville forstyrre nedstrømsanalysen. Undgå håndkontakt med vand eller koralfragment gennem posen for at holde prøven ved 4 °C. - Tape en steril 1 ml pipettespids over enden af en luftpistol med elektrisk tape, med ~5 mm afskåret enden af spidsen (figur 1A).
- Ret luftpistolen mod koralfragmentet med posen halvt forseglet og luftstrømmen på lavt medium for forsigtigt at fjerne vævet ved at tilskynde til en cirkulær bevægelse af vandet over koralfragmentet.
- Efter ~ 3 minutter, eller når alt vævet ser ud til at være fjernet fra skelettet, skal du slukke for luften og fjerne airbrushen. Luk posen helt.
- Klem alt det fjernede koralvæv til et nederste hjørne af posen. Skær det modsatte hjørne af og hæld forsigtigt indholdet af posen i et 15 ml rør på is.
4. Valgfri homogenisering
BEMÆRK: Nogle koralarter er mere tyktflydende end andre, hvilket betyder, at luftbørstningen fjerner vævet i klumper i stedet for i en gylle. Hvis der er synlige vævsklumper i det luftbørstede homogenat, kan der tilsættes et homogeniseringstrin ved 4 °C for alle prøverne.
- Rengør en mekanisk savtandshomogenisator to gange med 4 °C 70% methanol og til sidst med 4 °C ultrarent vand.
- Homogeniser koralprøven i et 15 ml rør i ~ 1 min, indtil prøven er fuldt homogeniseret, og ingen klumper er synlige.
- Homogenisatoren rengøres som i trin 4.1 mellem hver prøve. Hold homogeniseringstiden konsistent på tværs af prøverne.
5. Prøveindsamling til normalisering
- Saml en 1.000 μL alikvote fra det homogeniserede væv til Symbiodiniaceae-celletal, analyse af koralværtsvævsproteinindhold og klorofyl et skøn. Opbevares ved -20 °C, indtil den er klar til analyse (punkt 10).
6. Valgfri koralværtsvæv-Symbiodiniaceae-celleseparation
- Koralhomogenatet centrifugeres ved 2.500 × g i 5 minutter ved 4 °C ved hjælp af en nedkølet centrifuge.
BEMÆRK: Denne hastighed er optimal til at adskille de tungere Symbiodiniaceae-celler, samtidig med at deres cellevægge holdes intakte, fra værtsvævet, som er suspenderet i supernatanten. - Supernatanten med værtsmaterialet fjernes, og anbringes i et nyt 15 ml glas.
BEMÆRK: Lipiderne fra værtsvævet danner typisk et smalt lyserødt / hvidt lag oven på symbiontcellerne. Dette lag kan opsamles sammen med den opløselige værtssupernatant via pipettering (figur 1B). - Kraftigt hvirvel værten i præcis 1 minut. Algepilleprøven og værtssupernatantprøven opbevares på is.
- Tilsæt 2 ml ultrarent vand ved 4 °C til algepellet. Kraftigt hvirvel i nøjagtigt 2 minutter for at resuspendere pelleten.
BEMÆRK: Hvis individuelle fragmenter på 1 cm ikke blev indsamlet fra koralkolonien til genotypning af Symbiodiniaceae, kan en 200 μL alikvote af Symbiodiniaceae-cellesuspensionen indsamles her, bevares i den foretrukne DNA-bufferopløsning og opbevares som beskrevet i Thurber et al.30 for Symbiodiniaceae-genotypning (f.eks. I henhold til González-Pech et al.12). - Gentag trin 6.1-6.4 igen.
BEMÆRK: Den pålidelige adskillelse af vært og symbiont afhænger af koralbiomassen og arten, da nogle arter kan være mere tyktflydende end andre. Mindst tre vasketrin anbefales, men dette kan øges afhængigt af separationssuccesen. Gentag vasketrin 4.7-4.9, indtil der ikke kan ses nogen Symbiodiniaceae-celler i bunden af værtsfraktionen, og indtil Symbiodiniaceae-fraktionen er synligt fri for værtsmateriale (f.eks. intet hvidt lag ovenpå) (figur 1). - Supernatanten med værtsmaterialet fjernes, og anbringes i et nyt 15 ml glas.
- Bevar den symbionte pellet i 15 ml røret.
7. Tørring af prøver
- Enten holobionthomogenatet eller både den adskilte vært og Symbiodiniaceae-fraktionerne fryses ved -80 °C i ~120 min. Frysetørrede prøverne natten over med et 0,01 mbar vakuum ved -85 °C.
BEMÆRK: For at undgå tab af prøver under frysetørring anbefales det at bruge et låg, der er skåret fra et andet sterilt rør eller steril parafilm, med et ~ 2 mm hul stanset forsigtigt igennem ved hjælp af en steril 25 G nål. - Når det er tørt, vejes et af følgende ved hjælp af en laboratorievægt: 1) 25 mg holobiont; 2) 15 mg af den symbionte fraktion; eller 3) 30 mg af værtsvævet fra hver prøve i separate 2 ml blødgørerfrie mikrocentrifugeglas.
BEMÆRK: Kritisk trin: Optimering af biomassen til udvinding er afgørende for at sikre, at GC-MS ikke overbelastes, samtidig med at der sikres tilstrækkeligt signal. Det tørrede koralmateriale er meget statisk. For at undgå tab af prøver skal du bruge antistatiske enheder til at eliminere elektrostatiske ladninger fra prøverne og vejebeholderne. Et enkelt og omkostningseffektivt alternativ er at placere et tørretumblerark under prøverøret. Den tørrede symbiontpille kan skæres til den ønskede vægt ved hjælp af et sterilt blad.
8. Ekstraktioner af intracellulære metabolitter
- Intracellulær metabolitekstraktion fra frysetørret holobiont:
- Tilsæt 400 μL 100% kold (-20 °C) methanol med intern standard(er) (IS; 13C6 sorbitol og/eller 13C5-15 N valin ved 10μM) til hvert rør.
- Der tilsættes et lille antal 710-1.180 μm syrevaskede glasperler (~10 mg) til hver prøve. Anbring i en perlemølle ved 50 Hz i 3 minutter i en forkølet (-20 °C) perlemølleindsats.
- Der tilsættes yderligere 600 μL 100 % kold (-20 °C) methanol med IS'er (13 C6 sorbitol og/eller 13C5-15 N valin ved 10μM) til hvert rør.
- Vortex blandes i 1 min. Anbring på en rotisserieryster ved 4 °C i 30 minutter.
- Intracellulær metabolitekstraktion fra separerede frysetørrede Symbiodiniaceae-celler:
- Der tilsættes 200 μL 100 % kold (-20 °C) methanol med IS'er (13 C6 sorbitol og/eller 13C 5-15 N valin ved 10μM) til det tørrede Symbiodiniaceae-materiale.
- Tilsæt et lille antal 710-1.180 μm syrevaskede glasperler (~10 mg). Anbring i en perlemølle ved 50 Hz i 3 minutter i en forkølet (-20 °C) perlemølleindsats.
- Tilsæt yderligere 800 μL 100% kold (-20 °C) methanol med IS'er og hvirvel i 30 s.
- Intracellulær metabolitekstraktion fra separeret frysetørret værtsvæv:
- Der tilsættes 1 ml 100 % kold (-20 °C) LC-methanol indeholdende IS'er (13 C6 sorbitol og/eller 13C 5-15 N valin ved 10μM) til det tørrede værtsmateriale.
- Vortex at blande i 20 s. Anbring i en flydende rørholder i et sonikeringsbad indstillet til 4 ° C i 30 minutter.
9. Oprensning af metabolitekstrakt
- Prøverne (holobiont/vært/symbiont) centrifugeres ved 3.000 × g i 30 minutter ved 4 °C.
- Overfør al supernatanten til et nyt 2 ml mikrocentrifugeglas, og pas på ikke at forstyrre celleaffaldspelletsen.
BEMÆRK: Dette er de semipolære ekstrakter. Disse kan opbevares midlertidigt på is, men opbevares på lang sigt ved -80 °C i mørke. - Til det resterende celleaffald tilsættes 1.000 μL 50% kold (-20 °C) methanol. Kraftigt hvirvel i 1 min for at resuspendere.
- Prøverne centrifugeres ved 3 000 × g i 30 minutter ved 4 °C.
- Supernatanten (polære ekstrakter) opsamles og pooles med de halvpolære ekstrakter fra samme prøve.
BEMÆRK: Celleaffaldet kan opbevares ved -80 °C og anvendes til normalisering af proteinindholdet (afsnit 11). - De samlede ekstrakter centrifugeres ved 16,100 g i 15 minutter for at fjerne alle bundfaldene, og supernatanten flyttes til et nyt mikrocentrifugeglas uden blødgører (2 ml).
BEMÆRK: Prøveekstrakterne kan opbevares ved -80 °C i mørke. - Når det er klar til analyse, alikvote 50 μL af hvert ekstrakt i en glasindsats. Koncentrer i 30 minutter ved 30 °C ved hjælp af en vakuumkoncentrator. Gentag fire gange mere (for 250 μL total tørret ekstrakt).
BEMÆRK: De tørrede prøver kan opbevares ved stuetemperatur under tørremiddelbetingelser indtil analyse.
10. Metabolit derivatisering
BEMÆRK: En to-trins online derivatiseringsproces anvendes til methoximering og trimethylsilylering af de polære metabolitter.
- Der tilsættes 25 μL methoxyaminhydrochlorid (30 mg/ml i pyridin) til hver prøve.
- Der omrystes ved 37 °C på en orbitalryster, der er indstillet til 750 o/min i 2 timer.
- Der tilsættes 25 μL N,O-bis(trimethylsilyl)trifluoracetamid + trimethylchlorosilan til hver prøve.
- Omrystes igen ved 37 °C og 750 o/min i 1 time.
- Lad prøverne ekvilibrere ved stuetemperatur i 1 time, før 1 μL injiceres i et 1:10 splitforhold på GC.
11. Gaskromatografi-massespektrometri analyse
BEMÆRK: Massespektrometeret skal indstilles i henhold til producentens anbefalinger ved hjælp af tris-(perfluorbutyl)-amin (CF43).
- Brug helium med ultrahøj renhed som bæregas ved en konstant søjlestrømningshastighed på 1 ml / min.
- Brug en 30 m DB-5 søjle med en 1 μm filmtykkelse og en 0,25 mm indvendig diameter.
- GC ovn program
- Indstil indgangstemperaturen til 280 °C.
- Start ved injektionen med en ovntemperatur på 100 °C, og hold den i 4 minutter.
- Forøg temperaturen med 10 °C/min til 320 °C, og hold den derefter nede i 11 minutter.
- Massespektrometer parametre
- Indstil MS-overførselsledningen til 280 °C, og juster ionkilden til 200 °C.
- Brug argon som kollisionscellegas til at generere multipel reaktionsovervågning (MRM) produktion.
- Opnå metabolitdetektion i forhold til et tidssegmenteret MRM-bibliotek, der indeholder MRM-mål.
12. Symbiodiniaceae-celletal, analyse af koralværtsvævsproteinindhold og klorofyl et skøn
- Symbiodiniaceae celletal:
- Tag en prøve af koralvævshomogenatet.
- Centrifuger prøverne ved 2.000 × g for at pelletere algerne.
- ~200 μL supernatanten fjernes fra algepellet, og den anbringes i et nyt mikrocentrifugeglas.
BEMÆRK: Dette vil være proteinprøven, som vil blive brugt til at normalisere dataene; opbevares om nødvendigt ved -20 °C inden analyse. - Algepillen resuspenderes i 1 ml filtreret havvand ved forsigtigt at pippe op og ned. Fortynd om nødvendigt algesuspensionen for at lette celletællingen.
- Udfør en celletælling ved hjælp af et hæmocytometer under et lysmikroskop ved at tilsætte 10 μL til et af kamrene. Komplet 8-10 tællinger pr. prøve.
BEMÆRK: Alternative metoder til tælling af algecellerne kan også anvendes, hvor de er tilgængelige (f.eks. flowcytometri, konfokal mikroskopi med høj kapacitet). - Beregn koncentrationen af symbiontcellerne (ml-1) under hensyntagen til eventuelle anvendte fortyndingsfaktorer.
- Indhold for proteinindholdet
- Kvantificer prøveproteinindholdet (f.eks. via Bradfords kolorimetriske assay, som oprindeligt beskrevet af Bradford et al.33, eller Lowry-assay34,35, hvis protokol er beskrevet for cnidarians andetsteds 36).
- Klorofyl , en ekstraktion
- Brug en cellepille på ~ 200.000 celler, frosne eller friske.
- Hver algepellet overføres til 2 ml dimethylformamid (DMF) i et hætteglas med scintillationsglas, og der inkuberes i mørke ved 4 °C i 48 timer.
BEMÆRK: DMF er giftigt og kræftfremkaldende, så prøveforberedelsen skal udføres under en stinkhætte, der er så mørk som muligt og på is. Hvis der er < 200.000 celler, skal du bruge mindre DMF. - Centrifuger i 3 minutter ved 16.000 × g.
- Overfør 200 ml til en UV-96 brøndplade til fotometriske målinger. Kør hver prøve i tre eksemplarer med DMF som blind.
- Absorbansen måles ved bølgelængderne (E) 663,8 nm, 646 nm og 750 nm. Absorbansen ved 750 nm trækkes fra absorbansen ved begge de øvrige bølgelængder.
BEMÆRK: Måling ved 750 nm korrigerer for eventuel spredning eller turbiditet i prøven. - Klorofylkoncentrationen A (μg/ml) beregnes ved hjælp af ligning (1):
Chl a-koncentration(μg/ml) = (12,00 × E 663,8) - (3,11 × E646,8) (1)
13. Kvantificering af cellebiomassen efter metabolitekstraktioner med henblik på normalisering
BEMÆRK: Der er to muligheder for kvantificering af cellebiomasse beskrevet nedenfor: kvantificering af protein relateret til biomasse ved hjælp af en modificeret Bradford-kolorimetrisk metode og måling af celleaffaldets tørvægt. Begge metoder er hensigtsmæssige at bruge, da begge giver nøjagtig kvantificering af cellebiomassen.
- Proteinindhold i celleaffald
- Resuspender det frosne celleaffald med 1 ml 0,2 M NaOH og inkuber prøverne ved 98 °C i 20 minutter.
- Prøverne afkøles på is i ~10 min, og centrifugeres ved 3.000 × g i 5 minutter ved omgivelsestemperatur.
- Kvantificer prøveproteinindholdet (f.eks. via Bradfords kolorimetriske assay, som oprindeligt beskrevet af Bradford et al.33 og modificeret af Smart et al.37).
- Måling af celleaffald tørvægt
- Resuspender celleaffaldet fra den intracellulære metabolitekstraktion i dobbeltdestilleret vand (~ 10 ml).
- Opløsningen filtreres under vakuum ved hjælp af et forvejet membranfilter (0,22 μm pore, 47 mm).
- Vask rørene indeholdende biomasse to gange med ultrarent vand for at sikre fuldstændig overførsel af biomasse til membranfilteret.
- Fjern membranfilteret, der indeholder biomassen, og tør det ved hjælp af en mikrobølgeovn (lav effekt; ~250 W i 20 min).
- Opbevar filterpapiret i en ekssikkator natten over. Filterpapirets tørvægt registreres, og biomassens tørvægt beregnes ved at trække vægten af tørmembranfilteret (ved hjælp af et rent tørmembranfilter, der er tørret sammen med prøvefilteret) fra den samlede vægt.
14. Analyse af data
- Analysér metabolitmål ved hjælp af metabolitdatabaser, hvor hvert mål består af en kvantifikator og kvalifikator MRM.
- Undersøg visuelt de detekterede metabolitmål, og integrer dem manuelt efter behov.
- Brug et metabolittopareal til at beregne relativ forekomst af hver prøve for hver gruppe. Værdier er tomme, korrigeret og normaliseret for at prøve internt standard topareal og derefter for at prøve proteinindhold i celleaffald i henhold til Smart et al.37.
- Kassér metabolitter med en relativ standardafvigelse større end 35% i alle behandlingsgrupperne (N = 23 metabolitter).
- Transformér dataene (f.eks. terningrod), og centrer dem i mean; Bekræft en normalfordeling og homogenitet af varians.
- Udfør dataanalysen (ANOVA og heatmap-konstruktion; f.eks. ved hjælp af https://www.metaboanalyst.ca)38. Klynge prøverne for at undersøge variabilitet inden for behandling ved hjælp af pakkerne "cluster", "factoextra" og "klustR". Beregn gapstatistikken (en metode til bestemmelse af det optimale antal klynger39) ved hjælp af funktionen "clusGap" i R og plots ved hjælp af R-pakken "tidyverse". Udfør PERMANOVAs for at undersøge signifikansen i adskillelsen mellem behandlingsmetabolitprofilerne (f.eks. i Primer).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Alle de data, der er produceret under dette arbejde, er tilgængelige i de supplerende oplysninger.
Adskillelse mellem vært og symbiont
Figur 1: Opsætning og validering af adskillelsen af koralværtsvæv og Symbiodiniaceae-celler. (A) Luftpistolopsætningen til fjernelse af koralvæv fra koralskelettet. En pipettespids er fastgjort til luftpistolen med elektrisk tape, og en lille (~ 5 mm) sektion skæres fra spidsen for at give mere luft mulighed for at slippe ud uden at løsne spidsen. B) Eksempler på holobiont og separeret værtsvæv (supernatant) og Symbiodiniaceae-celler (pellet). Værdien repræsenterer antallet af centrifugeringstrin. Pilen peger på det smalle værtslipidlag oven på den symbionte pellet, der kan opsamles og kombineres med værtsfraktionen. (C-E) Brightfield (øverst) og klorofyl autofluorescens (nederst) mikroskopi billeder af en alikvot af (C) holobionten med både værtsvæv og symbiontceller, (D) værtsfraktionen uden symbiontceller som verificeret ved fravær af chlorophyll autofluorescens og (E) intakte symbiontceller, der demonstrerer fjernelse af værtsvævet. Skalabjælker = 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Mikroskopisk visualisering viste ingen Symbiodiniaceae-celler i værtsvævsprøverne efter de tre vasketrin (figur 1D). Tilsvarende var der minimalt værtsvæv til stede i symbiontfraktionerne (figur 1E). Det holobionte homogenat (figur 1C) viste imidlertid, at det intracellulære Symbiodiniaceae muligvis ikke er blevet tilstrækkeligt frigivet fra deres symbiosomer ved simpel luftbørstning og derfor ikke så tilstrækkeligt lyseret under den mekaniske homogenisering (protokolafsnit 4) eller opløsningsmiddelekstraktion (protokolafsnit 8) sammenlignet med centrifugalseparation (figur 1E). Denne begrænsning kan forklare noget af den store variation inden for gruppen mellem holobiontprøverne og specifikke observationer i holobiontprofilerne. For eksempel var to metabolitter (glycolsyre og 1-hexadecanol) signifikant mere rigelige i holobionten versus symbionten, men ikke i værten versus symbiont; Dette kan have været et resultat af den store variation inden for gruppen i den relative forekomst af disse metabolitter i holobiontprofilerne. Især havde holobiont prøve 3 relativt højere koncentrationer af dodecansyre, glycolsyre og 1-hexdecanol end nogen af symbiont- eller værtsprøverne individuelt. Da metabolittens toparealdata normaliseres til prøveproteinindhold, hvis symbiontcellerne ikke blev renset tilstrækkeligt for værtsvæv, kan det holobionte proteinindhold være blevet undervurderet, hvilket påvirker biomassenormaliseringen og fører til beregning af en højere metabolitoverflod i forhold til biomassen i denne prøve. Dette fremhæver yderligere potentialet for øget variation i holobiont metabolomics.
Analyse af metabolitprofil
Valget af massespektrometertilstand afhænger af den analyse, der udføres. Til steady-state metabolitprofilering muliggør en omfattende målrettet metode, der anvender en QqQ-MS i MRM-tilstand, forbedret metabolitdetektion og identifikation på grund af eliminering af baggrundsstøj, der kan genereres af høje biologiske saltkoncentrationer. For stabile isotopmærkningsmetoder muliggør et massespektrometer (dvs. enkelt quadrupol, triple quadrupol [QqQ], quadrupol-flight time [QTOF]), der kører i scanningstilstand, påvisning af masseisotopologer, der indikerer stabile isotopberigelsesmønstre.
Målrettet GC-MS-analyse blev gennemført ved hjælp af Shimadzu Smart Metabolite Database (v3; som dækker ca. 350 endogene metabolitter og flere stabile isotopisk mærkede interne standarder) og Shimadzu LabSolutions Insight-softwaren. På tværs af alle behandlingerne blev der identificeret 107 annoterede metabolitter, herunder en række aminosyrer, organiske syrer, kulhydrater, fedtsyrer og steroler (supplerende tabel S1). Kvalitative og kvantitative ionpar er angivet i supplerende tabel S2. Kmeans-klyngedannelse identificerede tre forskellige klynger af prøver (verificeret ved en gap-statistisk test) med alle prøverne i separate, forskellige klynger; symbionterne var i klynge 1, værten i klynge 2 og holobiontprøverne i klynge 3 (figur 2).
Figur 2: Kmeans cluster analyse af metabolitprofilerne . (A) Prøvemetabolitprofilerne blev grupperet efter euklidisk afstand med det optimale antal klynger (N = 3), som blev verificeret via en gap-statistisk beregning. (B) Parallel koordinatvisualisering af den gennemsnitlige metabolitrelative forekomst (linje, farvet i henhold til klyngen) og konfidensinterval (skygge, farvet i henhold til klyngen) for hver klynge (rød = klynge 1, grøn = klynge 2, blå = klynge 3). Klik her for at se en større version af denne figur.
Sammenligning af værts- og symbiontmetabolitprofil
Værts- og symbiontprofilerne var signifikant forskellige fra hinanden (PERMANOVA, t = 16.909, p < .001; Supplerende tabel S3) med 100 individuelle metabolitter, der er signifikant forskellige mellem værtsfraktionerne og symbiontfraktionerne (ANOVA, FDR < .05; Figur 3 og supplerende tabel S1). Af disse var 13 metabolitter signifikant mere rigelige i symbionten end værtsekstrakterne, herunder eicosanoiderne docosahexaensyre (C22: 6 [ω-6]; DHA), eicosapentaensyre (C20:5[ω-6]; EPA) og arachidonsyre (C20: 4 [ω-6]; ARA) (ANOVA, FDR < 0,05; Figur 3 og supplerende tabel S1). I alt 87 metabolitter var mindre rigelige i symbionten end værtsekstrakterne (ANOVA, FDR < 0,05; Figur 3 og supplerende tabel S1).
Figur 3: Heatmap visualisering af metabolittens relative forekomster med post-hoc analyseresultater af gruppesammenligningerne. Værts-, symbiont- og holobiontprøverne (N = 5 pr. Gruppe) blev hierarkisk grupperet via Wards kobling, og metabolitterne blev grupperet i henhold til euklidisk afstandsmål. De farvede firkanter angiver signifikante forskelle i gruppesammenligningerne detekteret via ANOVA med post hoc Tukeys HSD (supplerende tabel S1). Klik her for at se en større version af denne figur.
Holobiont metabolitprofiler sammenlignet med adskilte værts- og symbiontprofiler
De holobionte metabolitprofiler viste stor variabilitet inden for gruppen, underbygget af den store adskillelse af prøver i holobiontklyngen i Kmeans-analysen; specifikt blev prøve 3 og prøve 4 adskilt langs dimension 2 fra prøve 1, prøve 2 og prøve 5 (figur 2A). De holobionte prøver var mellemliggende mellem de adskilte værts- og symbiontefraktioner (figur 2A). Mens Kmeans-klyngefordelingerne (figur 2A), parallelle koordinater (figur 2B) og varmekortvisualisering af metabolittens relative overflod (figur 3) indikerede, at holobiontprofilen bedre matchede værtsfraktionsprofilen, adskilte holobiontprofilen sig signifikant fra begge værter (PERMANOVA, t = 3,47, p < 0,001; Supplerende tabel S3) og symbiontprofiler (PERMANOVA, t = 11, 29, p < 0, 001; Supplerende tabel S3). På det individuelle metabolitniveau var 66 og 82 metabolitter i holobionten signifikant forskellige fra henholdsvis værts- og symbiontprofilerne (ANOVA, FDR < 0,05, supplerende tabel S1). Af disse havde 54 (81,8%) ud af de 66 signifikante metabolitter signifikant højere relativ overflod i værten end den holobionte fraktion, og 78 (95%) havde signifikant højere relativ overflod i holobionten end den symbionte fraktion; fire var mere rigelige i symbiontfraktionerne, herunder DHA, glycerol-3-phosphat, inositolphosphat og fosforsyre (figur 3). Otte metabolitter (herunder to fedtsyrer [linolsyre (C18: 1) og myristiske (C14: 0) syrer], fem dicarboxylsyrer og aminosyren guanin) var signifikant forskellige i overflod mellem værten og symbionten, men ikke sammenlignet med den holobionte fraktion (figur 3).
Supplerende tabel S1: Den relative forekomst af hver metabolit identificeret ved hjælp af GC-MS-analyse i holobiont og adskilt vært og symbiont. Værdierne er gennemsnitlige ± standardfejl, og de angivne ANOVA-resultater, herunder post-hoc-analysen, er angivet med de farvede celler (kolonne K, L og M). Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende tabel S2: Kvalitative og kvantitative ionpar for de identificerede metabolitter. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende tabel S3: PERMANOVA resultater. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Adskillelsen af vært og symbiont kan let og hurtigt opnås via simpel centrifugering, og resultaterne her viser, at adskillelse af fraktionerne kan give værdifuld information, der indikerer specifikke holobionte medlemsbidrag, som kan bidrage til den funktionelle analyse af koralsundhed. I voksne koraller udføres lipidsyntese primært af den hjemmehørende algesymbiont40, som leverer lipider (f.eks. Triacylglycerol og phospholipider)41 og fedtsyrer, der kan fremme stressgenopretning 11,42. Af de 13 metabolitter, der var mere rigelige i symbionten versus værtsprofilerne i dette arbejde, var 9 fedtsyrer, herunder de biologisk relevante eicosanoider DHA (C22: 6 [ω -6]), EPA (C20: 5 [ω -6]) og ARA (C20: 4 [ω-6]), som er impliceret i stresssignalering mellem kongeriget i koral-Symbiodiniaceae symbiose 9,10. Inositolphosphat spiller en afgørende rolle i forskellige cellulære funktioner, herunder cellevækst, apoptose, endocytose, og celledifferentiering. Den relative overflod af inositolisoformer og derivater har ofte vist sig at ændre sig under symbiose dysfunktion 7,11,27,28, selv om rollen af disse isoformer og deres derivater i koral-Symbiodiniaceae symbiose forbliver uklar. Således hjælper den klare forskel i relativ overflod mellem værts- og symbiontprofiler med at bidrage til denne viden.
Mange undersøgelser har brugt holobionte metabolitprofiler til at undersøge koralmetaboliske interaktioner og ydeevne under omgivende og stressforhold 13,43,44,45. Her viser vi, at analysen af holobionthomogenatet kan resultere i stor variation inden for behandlingen, og de resulterende profiler kan maskere værts- og/eller symbiontspecifikke overflodsmønstre og metaboliske bidrag til det samlede holobionte metabolom. For eksempel var kun 4 af de 13 metabolitter, der var signifikant mere rigelige i symbionten i forhold til værtsfraktionen, signifikant mere rigelige i symbionten i forhold til holobionten. Disse omfattede det potentielt biologisk relevante DHA og inositolphosphat 7,9,10,11,27,28; de tydelige forskelle, der blev observeret i de stresssignalerende eicosanoider EPA og ARA mellem værten og symbionten, var imidlertid ikke signifikante i holobiont versus symbiontprøverne. Disse metabolitter anerkendes i stigende grad som vigtige metabolitter i symbiosens molekylære sprog og som indikatorer for stressresponser10, men undersøgelse af holobionteprofiler alene ville ikke afsløre de tydelige ændringer i de relative tæthedsforhold mellem disse metabolitter i specifikke holobionte medlemmer. Således kan analyse af holobionten maskere forskelle, der ellers er tydelige, når værten og symbionten analyseres separat, og disse forskelle kan muligvis ikke påvises som signifikante i undersøgelser, der sammenligner abiotiske eller biotiske behandlinger udelukkende ved hjælp af holobionte profiler. Dette kan gøre det udfordrende at udlede specifikke partnerbidrag eller funktioner 7,8,9,11,12,22,28, især når man forsøger at besvare biologiske spørgsmål, for hvilke symbiotiske interaktioner ligger til grund for den observerede holobionte fænotype 46,47.
En alternativ metode ville være at adskille værtsvæv og symbiontceller, tage en alikvot af homogenatet eller et ekstrakt af hver fraktion for at rekombinere før ekstraktion og analysere dette sammen med de adskilte fraktioner; Denne metode vil sikre frigivelse af symbionter fra værtsvævet, men vil øge risikoen for menneskelige fejl og/eller metabolittab48. Det kan være muligt at analysere fraktionerne separat og integrere dataene efter analysen, men beregningerne skal tage højde for andelen af symbiont- og værtsceller i det oprindelige koralholobiont.
Mens mere information kan opnås ved at adskille værts- og symbiontfraktionerne til metabolitanalyse, især med hensyn til individuelle medlemsbidrag til holobiont metabolisme og funktion, er det i sidste ende en beslutning styret af forskningsspørgsmålet, om man skal adskille værten og symbionten snarere end at analysere holobionten. For eksempel er analyse af holobiontens metabolitprofil relevant, når andre fysiologiske målinger foretages med holobionten (f.eks. Analyse af flygtige metabolitemissioner fra koralkolonier 49,50,51), og når metabolomicsprofiler skal integreres med holobionte datasæt. Derudover er adskillelsen af værten og symbionten ikke uden begrænsninger; For eksempel kan yderligere manipulationstrin forstyrre metabolitstabiliteten og resultere i datatab eller forstyrrende virkninger48.
Desuden er der yderligere optimeringstrin involveret i værtssymbiontseparationsproceduren: 1) optimering af antallet af vaske for den specifikke koralart; og 2) identifikation af den optimale biomasse, der skal ekstraheres fra begge fraktioner til GC-MS-analyse. Begge trin skal inkluderes, før den endelige prøvebehandling kan påbegyndes, hvilket øger både forbrugsstof- og analysekravene til materiale, tid og omkostninger. I dette arbejde kan metabolittab fra værten og symbiontekstraktioner på grund af de yderligere trin have bidraget til de højere relative mængder af nogle metabolitter, der observeres i holobionten i forhold til enten værten eller symbionten, såsom glycolsyre, 1-hexadecanol og dodecansyre. Imidlertid er den store variation inden for gruppen i holobiontgruppen for disse metabolitter som nævnt en alternativ årsag til disse observerede mønstre.
Anvendelsen af metabolomics-tilgange, selvom den er relativt ny, har haft en dybtgående indvirkning på vores evne til at belyse funktionen af specifikke symbioser. For eksempel har denne tilgang afsløret bidraget fra fytoplankton vækstfremmende hormon indol-3 eddikesyre, som syntetiseres af bakterier i Pseudo-nitzschia multiseries-Sulfitobacter symbiosen. Desuden har denne tilgang belyst værtsafledt og symbiontafledt translokation i koraller 11,27,28,29, hvilket har spændende potentiale for bevarelse og restaurering af koralrev3, såsom gennem biomarkørdetektion 19. Her har vi tilvejebragt en procedure for begge tilgange med håb om, at dette vil lette og fremskynde anvendelsen af metabolomics til fremtidige koralrevundersøgelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikt at afsløre.
Acknowledgments
J.L.M. blev støttet af et UTS Chancellor's Research Fellowship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100% LC-grade methanol | Merck | 439193 | LC grade essential |
| 2 mL microcentrifuge tubes, PP | Eppendorf | 30121880 | Polypropylene provides high resistance to chemicals, mechanical stress and temperature extremes |
| 2030 Shimadzu gas chromatograph | Shimadzu | GC-2030 | |
| 710-1180 µm acid-washed glass beads | Merck | G1152 |
This size is optimal for breaking the Symbiodiniaceae cells |
| AOC-6000 Plus Multifunctional autosampler | Shimadzu | AOC6000 | |
| Bradford reagent | Merck | B6916 | Any protein colourimetric reagent is acceptable |
| Compressed air gun | Ozito | 6270636 | Similar design acceptable. Having a fitting to fit a 1 mL tip over is critical. |
| DB-5 column with 0.25 mm internal diameter column and 1 µm film thickness | Agilent | 122-5013 | |
| DMF | Merck | RTC000098 | |
| D-Sorbitol-6-13C and/or 13C5–15N Valine | Merck | 605514/ 600148 | Either or both internal standards can be added to the methanol. |
| Flat bottom 96-well plate | Merck | CLS3614 | |
| Glass scintillation vials | Merck | V7130 | 20 mL, with non-plastic seal |
| Immunoglogin G | Merck | 56834 | if not availbe, Bovine Serum Albumin is acceptable |
| Primer | v4 | ||
| R | v4.1.2 | ||
| Shimadzu LabSolutions Insight software | v3.6 | ||
| Sodium Hydroxide | Merck | S5881 | Pellets to make 1 M solution |
| tidyverse | v1.3.1 | R package | |
| TissueLyser LT | Qiagen | 85600 | Or similar |
| TQ8050NX triple quadrupole mass spectrometer | Shimadzu | GCMS-TQ8050 NX | |
| UV-96 well plate | Greiner | M3812 | |
| Whirl-Pak sample bag | Merck | WPB01018WA | Sample collection bag; Size: big enough to house a ~5 cm coral fragment, but not too big that the water is too spread |
References
- Bundy, J. G., Davey, M. P., Viant, M. R. Environmental metabolomics: A critical review and future perspectives. Metabolomics. 5 (1), 3-21 (2008).
- Matthews, J. L., et al. The metabolic significance of symbiont community composition in the coral-algal symbiosis. Applied Environmental Metabolomics. Beale, D. J., Hillyer, K. E., Warden, A. C., Jones, O. A. H. , Academic Press. Cambridge, MA. 211-229 (2022).
- Lawson, C. A., et al. Informing coral reef conservation through metabolomic approaches. Coral Reef Conservation and Restoration in the Omics Age. Coral Reefs of the World. van Oppen, M. J. H., Aranda Lastra, M. , Springer. Cham, Switzerland. 179-202 (2022).
- LaJeunesse, T. C., et al. Systematic revision of Symbiodiniaceae highlights the antiquity and diversity of coral endosymbionts. Current Biology. 28 (16), 2570-2580 (2018).
- Rohwer, F., Seguritan, V., Azam, F., Knowlton, N. Diversity and distribution of coral-associated bacteria. Marine Ecology Progress Series. 243, 1-10 (2002).
- Maire, J., et al. Intracellular bacteria are common and taxonomically diverse in cultured and in hospite algal endosymbionts of coral reefs. The ISME Journal. 15 (7), 2028-2042 (2021).
- Hillyer, K. E., et al. Metabolite profiling of symbiont and host during thermal stress and bleaching in the coral Acropora aspera. Coral Reefs. 36, 105-118 (2016).
- Hillyer, K. E., Tumanov, S., Villas-Bôas, S., Davy, S. K. Metabolite profiling of symbiont and host during thermal stress and bleaching in a model cnidarian-dinoflagellate symbiosis. Journal of Experimental Biology. 219 (4), 516-527 (2016).
- Matthews, J. L., et al. Optimal nutrient exchange and immune responses operate in partner specificity in the cnidarian-dinoflagellate symbiosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (50), 13194-13199 (2017).
- Rosset, S. L., et al. The molecular language of the cnidarian-dinoflagellate symbiosis. Trends in Microbiology. 29 (4), 320-333 (2020).
- Matthews, J. L., et al. Partner switching and metabolic flux in a model cnidarian-dinoflagellate symbiosis. Royal Society. 285 (1892), 20182336 (2018).
- González-Pech, R. A., et al. Physiological factors facilitating the persistence of Pocillopora aliciae and Plesiastrea versipora in temperate reefs of south-eastern Australia under ocean warming. Coral Reefs. 41, 1239-1253 (2022).
- Williams, A., et al. Metabolomic shifts associated with heat stress in coral holobionts. Science Advances. 7 (1), (2021).
- Deutsch, J. M., et al. Metabolomics of healthy and stony coral tissue loss disease affected Montastraea cavernosa corals. Frontiers in Marine Science. 8, 1421 (2021).
- Stien, D., et al. A unique approach to monitor stress in coral exposed to emerging pollutants. Scientific Reports. 10 (1), 9601 (2020).
- Lohr, K. E., et al. Resolving coral photoacclimation dynamics through coupled photophysiological and metabolomic profiling. Journal of Experimental Biology. 222 (8), (2019).
- Jorissen, H., et al. Coral larval settlement preferences linked to crustose coralline algae with distinct chemical and microbial signatures. Scientific Reports. 11 (1), 14610 (2021).
- Roach, T. N., Dilworth, J., Jones, A. D., Quinn, R. A., Drury, C. Metabolomic signatures of coral bleaching history. Nature Ecology & Evolution. 5 (4), 495-503 (2021).
- Parkinson, J. E., et al. Molecular tools for coral reef restoration: Beyond biomarker discovery. Conservation Letters. 13 (1), 12687 (2020).
- Jiang, J., et al. How Symbiodiniaceae meets the challenges of life during coral bleaching. Coral Reefs. 40, 1339-1353 (2021).
- Guerra, F. D., Attia, M. F., Whitehead, D. C., Alexis, F. Nanotechnology for environmental remediation: materials and applications. Molecules. 23 (7), 1760 (2018).
- Matthews, J. L., et al. Metabolite pools of the reef building coral Montipora capitata are unaffected by Symbiodiniaceae community composition. Coral Reefs. 39, 1727-1737 (2020).
- Papina, M., Meziane, T., van Woesik, R. Symbiotic zooxanthellae provide the host-coral Montipora digitata with polyunsaturated fatty acids. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 135 (3), 533-537 (2003).
- Kellogg, R., Patton, J. Lipid droplets, medium of energy exchange in the symbiotic anemone Condylactis gigantea: A model coral polyp. Marine Biology. 75, 137-149 (1983).
- Ankrah, N. Y., Chouaia, B., Douglas, A. E. The cost of metabolic interactions in symbioses between insects and bacteria with reduced genomes. mBio. 9 (5), e01433 (2018).
- Kabeya, N., et al. Genes for de novo biosynthesis of omega-3 polyunsaturated fatty acids are widespread in animals. Science Advances. 4 (5), (2018).
- Hillyer, K. E., Dias, D., Lutz, A., Roessner, U., Davy, S. K. 13C metabolomics reveals widespread change in carbon fate during coral bleaching. Metabolomics. 14 (1), 12 (2018).
- Hillyer, K. E., Dias, D. A., Lutz, A., Roessner, U., Davy, S. K. Mapping carbon fate during bleaching in a model cnidarian symbiosis: the application of 13C metabolomics. New Phytologist. 214 (4), 1551-1562 (2017).
- Burriesci, M. S., Raab, T. K., Pringle, J. R. Evidence that glucose is the major transferred metabolite in dinoflagellate-cnidarian symbiosis. Journal of Experimental Biology. 215 (19), 3467-3477 (2012).
- Thurber, R. V., et al. Unified methods in collecting, preserving, and archiving coral bleaching and restoration specimens to increase sample utility and interdisciplinary collaboration. PeerJ. 10, 14176 (2022).
- Grottoli, A. G., et al. Increasing comparability among coral bleaching experiments. Ecological Applications. 31 (4), 02262 (2020).
- Mushtaq, M. Y., Choi, Y. H., Verpoorte, R., Wilson, E. G. Extraction for metabolomics: access to the metabolome. Phytochemical Analysis. 25 (4), 291-306 (2014).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1), 248-254 (1976).
- Peterson, G. L., et al. A simplification of the protein assay method of Lowry et al. which is more generally applicable. Analytical Biochemistry. 83 (2), 346-356 (1977).
- Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J.
- Zamer, W. E., Shick, J. M., Tapley, D. W. Protein measurement and energetic considerations: Comparisons of biochemical and stoichiometric methods using bovine serum albumin and protein isolated from sea anemones. Limnology and Oceanography. 34 (1), 256-263 (1989).
- Smart, K. F., Aggio, R. B., Van Houtte, J. R., Villas-Boas, S. G. Analytical platform for metabolome analysis of microbial cells using methyl chloroformate derivatization followed by gas chromatography-mass spectrometry. Nature Protocols. 5 (10), 1709-1729 (2010).
- Pang, Z., et al. Using MetaboAnalyst 5.0 for LC-HRMS spectra processing, multi-omics integration and covariate adjustment of global metabolomics data. Nature Protocols. 17 (8), 1735-1761 (2022).
- Tibshirani, R., Walther, G., Hastie, T. Estimating the number of clusters in a data set via the gap statistic. Journal of the Royal Statistical Society: Series B (Statistical Methodology). 63 (2), 411-423 (2001).
- Chen, W. -N., et al. Diel rhythmicity of lipid-body formation in a coral-Symbiodinium endosymbiosis). Coral Reefs. 31 (2), 521-534 (2012).
- Imbs, A. Fatty acids and other lipids of corals: composition, distribution, and biosynthesis. Russian Journal of Marine Biology. 39 (3), 153-168 (2013).
- Rosset, S., et al. Lipidome analysis of Symbiodiniaceae reveals possible mechanisms of heat stress tolerance in reef coral symbionts. Coral Reefs. 38 (6), 1241-1253 (2019).
- Carreón-Palau, L., Parrish, C. C., Del Angel-Rodriguez, J. A., Perez-Espana, H. Seasonal shifts in fatty acids and sterols in sponges, corals, and bivalves, in a southern Gulf of Mexico coral reef under river influence. Coral Reefs. 40 (2), 571-593 (2021).
- Imbs, A. B., Dang, L. T. Seasonal dynamics of fatty acid biomarkers in the soft coral Sinularia flexibilis, a common species of Indo-Pacific coral reefs. Biochemical Systematics and Ecology. 96, 104246 (2021).
- Oku, H., Yamashiro, H., Onaga, K., Sakai, K., Iwasaki, H. Seasonal changes in the content and composition of lipids in the coral Goniastrea aspera. Coral Reefs. 22 (1), 83-85 (2003).
- Weis, V. M. Cell biology of coral symbiosis: foundational study can inform solutions to the coral reef crisis. Integrative and Comparative Biology. 59 (4), 845-855 (2019).
- Oakley, C., Davy, S. Cell biology of coral bleaching. Coral Bleaching. van Oppen, M., Lough, J. , Springer. Cham, Switzerland. 189-211 (2018).
- Lu, W., et al. Metabolite measurement: Pitfalls to avoid and practices to follow. Annual Review of Biochemistry. 86, 277-304 (2017).
- Lawson, C. A., et al. Heat stress decreases the diversity, abundance and functional potential of coral gas emissions. Global Change Biology. 27 (4), 879-891 (2021).
- Olander, A., et al. Comparative volatilomics of coral endosymbionts from one-and comprehensive two-dimensional gas chromatography approaches. Marine Biology. 168 (5), 76 (2021).
- Wuerz, M., et al. Symbiosis induces unique volatile profiles in the model cnidarian Aiptasia. Journal of Experimental Biology. 225 (19), (2022).
