Summary
Hier stellen wir die Extraktion und Präparation von polaren und semipolaren Metaboliten aus einem Korallenholobionten, sowie getrenntem Korallenwirtsgewebe und Symbiodiniaceae-Zellfraktionen für die gaschromatographische Massenspektrometrie-Analyse vor.
Abstract
Auf Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) basierende Ansätze haben sich als leistungsfähig erwiesen, um die metabolischen Grundlagen der Nesseltier-Dinoflagellaten-Symbiose aufzuklären und wie Korallen auf Stress reagieren (z. B. während der temperaturinduzierten Bleiche). Das Steady-State-Metaboliten-Profiling des Korallen-Holobionten, der den Nesseltierwirt und seine assoziierten Mikroben (Symbiodiniaceae und andere Protisten, Bakterien, Archaeen, Pilze und Viren) umfasst, wurde erfolgreich unter Umgebungs- und Stressbedingungen angewendet, um den ganzheitlichen Stoffwechselstatus der Koralle zu charakterisieren.
Um die Fragen rund um die symbiotischen Interaktionen zu beantworten, ist es jedoch notwendig, die Metabolitenprofile des Korallenwirts und seiner Algensymbionten unabhängig voneinander zu analysieren, was nur durch eine physikalische Trennung und Isolierung der Gewebe erreicht werden kann, gefolgt von einer unabhängigen Extraktion und Analyse. Während die Anwendung der Metabolomik im Korallenbereich relativ neu ist, haben die anhaltenden Bemühungen von Forschungsgruppen zur Entwicklung robuster Methoden zur Analyse von Metaboliten in Korallen geführt, einschließlich der Trennung des Korallenwirtsgewebes und der Algensymbionten.
In diesem Artikel wird eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Holobiontentrennung und die Extraktion von Metaboliten für die GC-MS-Analyse vorgestellt, einschließlich der wichtigsten Optimierungsschritte, die in Betracht gezogen werden sollten. Wir zeigen, dass das kombinierte Metabolitenprofil der beiden Fraktionen (Koralle und Symbiodiniaceae) nach unabhängiger Analyse dem Profil des Ganzen (Holobiont) ähnelt, aber durch die Trennung der Gewebe können wir auch wichtige Informationen über den Stoffwechsel und die Wechselwirkungen zwischen den beiden Partnern erhalten, die aus dem Ganzen allein nicht gewonnen werden können.
Introduction
Metaboliten stellen die Endprodukte zellulärer Prozesse dar, und die Metabolomik - die Untersuchung der von einem bestimmten Organismus oder Ökosystem produzierten Metaboliten - kann ein direktes Maß für die Funktionsweise von Organismen liefern1. Dies ist besonders wichtig für die Erforschung von Ökosystemen, symbiotischen Interaktionen und Wiederherstellungswerkzeugen, da das Ziel der meisten Managementstrategien darin besteht, bestimmte Ökosystemdienstleistungen zu erhalten (oder wiederherzustellen)2. Korallenriffe sind ein aquatisches Ökosystem, das den potenziellen Wert der Metabolomik für die Aufklärung symbiotischer Interaktionen und die Verknüpfung von korallenphysiologischen Reaktionen mit Auswirkungen auf Gemeinde- und Ökosystemebene demonstriert3. Die Anwendung der Hochdurchsatz-Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) wird besonders geschätzt, da sie in der Lage ist, ein breites Spektrum von Metabolitenklassen gleichzeitig mit hoher Selektivität und Empfindlichkeit schnell zu analysieren, eine schnelle Identifizierung von Verbindungen zu ermöglichen, wenn Spektralbibliotheken verfügbar sind, und ein hohes Maß an Reproduzierbarkeit und Genauigkeit bei relativ niedrigen Kosten pro Probe zu bieten.
Korallen sind Holobionten, die aus dem Korallentier, photosynthetischen Dinoflagellaten-Endosymbionten (Familie: Symbiodiniaceae4) und einem komplexen Mikrobiombestehen 5,6. Insgesamt wird die Fitness des Holobionten vor allem durch den Austausch von kleinen Molekülen und Elementen aufrechterhalten, um die Stoffwechselfunktion jedes Mitglieds zu unterstützen 7,8,9,10. Metabolomische Ansätze haben sich als besonders leistungsfähig erwiesen, um die metabolischen Grundlagen der Symbiosespezifität9,11, der Bleichreaktion auf thermischen Stress 7,8,12,13, der Krankheitsreaktionen 14, der Reaktionen auf Umweltverschmutzung 15, der Photoakklimatisierung 16 und der chemischen Signalgebung 17 in Korallen aufzuklären sowie die Entdeckung von Biomarkern zu unterstützen 18,19. Darüber hinaus kann die Metabolomik eine wertvolle Bestätigung für die Schlussfolgerungen liefern, die aus DNA- und RNA-basierten Techniken abgeleitet werden 9,20. Es besteht daher ein erhebliches Potenzial für den Einsatz der Metabolomik zur Bewertung der Gesundheit von Riffen und zur Entwicklung von Instrumenten für den Schutz von Riffen3, z. B. durch den Nachweis metabolischer Biomarker für Stress18,19 und für die Untersuchung des Potenzials aktiver Managementstrategien wie Ernährungssubventionen21.
Die Trennung der Wirts- und Symbiontenzellen und die Analyse ihrer Metabolitenprofile unabhängig voneinander und nicht zusammen wie der Holobiont kann mehr Informationen über die Partnerinteraktionen, den unabhängigen physiologischen und metabolischen Status und die potenziellen molekularen Mechanismen für die Anpassung liefern 11,12,22,23,24. Ohne die Koralle und die Symbiodiniaceae zu trennen, ist es fast unmöglich, den Beitrag und den Stoffwechsel von Korallen und/oder Symbiodiniaceae unabhängig voneinander aufzuklären, außer mit komplexer Genomrekonstruktion und metabolischer Modellierung25, aber dies muss noch auf die Korallen-Dinoflagellaten-Symbiose angewendet werden. Darüber hinaus kann der Versuch, Informationen über den individuellen Stoffwechsel des Wirts oder Algensymbionten aus dem Metabolitenprofil des Holobionten zu extrahieren, zu Fehlinterpretationen führen.
Zum Beispiel wurde bis vor kurzem angenommen, dass das Vorhandensein von mehrfach ungesättigten C18:3n-6-, C18:4n-3- und C16-Fettsäuren in Extrakten aus Korallen- und Holobiongewebe vom Algensymbionten stammt, da man davon ausging, dass Korallen nicht die für die Produktion von Omega-3 (ω3)-Fettsäuren essentiellen ωx-Desaturasen besitzen; Neuere genomische Beweise deuten jedoch darauf hin, dass mehrere Nesseltiere die Fähigkeit haben, ω3-PUFA de novo zu produzieren und ω3-langkettiges PUFA26 weiter zu biosynthetisieren. Die Kombination von GC-MS mit stabiler Isotopenmarkierung (z. B. 13 C-Bicarbonat, NaH13CO 3) kann verwendet werden, um das Schicksal von photosynthetisch fixiertem Kohlenstoff durch holobionte Stoffwechselnetzwerke von Korallen sowohl unter Kontrollbedingungen als auch als Reaktion auf externe Stressoren zu verfolgen27,28. Ein kritischer Schritt bei der Verfolgung des 13-C-Schicksals ist jedoch die Trennung des Korallengewebes von den Algenzellen - nur dann kann das Vorhandensein einer 13-C-markiertenVerbindung in der Korallenwirtsfraktion eindeutig als von Symbiodiniaceae abgeleiteter Metabolit, der in die Koralle transloziert wurde, oder als nachgeschaltetes Produkt einer translozierten markierten Verbindung zugeordnet werden. Diese Technik hat ihre Leistungsfähigkeit unter Beweis gestellt, indem sie die lang gehegte Annahme in Frage stellte, dass Glycerin die primäre Form ist, in der Photosynthese vom Symbionten zum Wirt transloziertwird 29, und indem sie aufklärte, wie sich der Nährstofffluss zwischen den Partnern während des Bleichens27,28 und als Reaktion auf inkompatible Symbiodiniaceae-Arten verändert11.
Während die Entscheidung, Gewebe zu trennen, in erster Linie von der Forschungsfrage bestimmt wird, sind die Praktikabilität, Zuverlässigkeit und potenziellen metabolischen Auswirkungen dieses Ansatzes wichtig zu berücksichtigen. Hier stellen wir detaillierte, demonstrierte Methoden zur Extraktion von Metaboliten aus dem Holobionten, sowie den getrennten Wirts- und Symbiontenfraktionen vor. Wir vergleichen die Metabolitenprofile des Wirts und des Symbionten unabhängig voneinander und wie diese Profile mit dem holobionten Metabolitenprofil verglichen werden.
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Protocol
ANMERKUNG: Der Versuchsaufbau, die Probenentnahme und die Lagerung wurden an anderer Stelle ausführlich beschrieben 2,30,31. Die Genehmigung für das Sammeln von Wildkorallen muss vor dem Sammeln und Experimentieren eingeholt werden. Die Proben hier stammen aus Kolonien von Montipora mollis (grüne Farbmorphe), die von Batavia Coral Farms (Geraldton, WA) importiert wurden und ursprünglich von einem Riff vor den Abrohlos-Inseln (Westaustralien; 28°52'43.3"S 114°00'17.0"E) in einer Tiefe von 1 m unter der Aquakulturlizenz AQ1643 gesammelt wurden. Vor der Probenahme wurden die Kolonien in einem 800-Liter-Aquarium bei 35 PSU, unter blauem und weißem Licht bei 150 μmol Photonen·m−2·s−1 und bei 25 °C ± 0,5 °C für 3 Monate gehalten. Die Korallenfragmente (~5 cm2, N = 6) wurden in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bis zur Verarbeitung bei −80 °C gelagert.
1. Vorbereitung der Extraktionslösungen und -geräte
- Bereiten Sie mindestens 1 Tag vor der Entnahme des Korallengewebes die Extraktionslösungen und -geräte vor.
- Reinstwasser in sauberen, reinigungsmittelfreien Gläsern bei 4 °C vorkühlen.
- Mischen Sie 100 % LC-Methanol mit einer Endkonzentration von 10 μg·ml−1 geeigneter interner Standards (z. B. 13C6-Sorbit).
- Stellen Sie eine 50%ige Methanol-Extraktionslösung her, die zur Hälfte zu 100 % aus Methanol in LC-Qualität und zur Hälfte aus Reinstwasser besteht. Beide Methanollösungen werden bei −20 °C gelagert.
HINWEIS: Um den Abbau der Metaboliten zu verhindern, wird empfohlen, die Probenverarbeitungsschritte in Chargen von jeweils fünf Korallenfragmenten durchzuführen, mit einem zusätzlichen biologischen (nur Wasser) Leerproben (Gesamtproben N = 6). Sobald jede Korallenprobe in die beiden Fraktionen (Korallenwirtsgewebe, im Folgenden "Wirt", und Mikroalgenzellen, im Folgenden "Symbiont") getrennt wurde, beträgt die Gesamtzahl der Proben in einer Verarbeitungscharge 12.
2. Abschreckung des Korallenstoffwechsels
ANMERKUNG: Der Versuchsaufbau, die Probenentnahme und die Lagerung wurden an anderer Stelle ausführlich beschrieben 2,30,31. Es sollte jedoch beachtet werden, dass die Zeit, die benötigt wird, um den Stoffwechsel zu unterdrücken (d. h. die Zeit zwischen der Entnahme von Korallenproben und der Konservierung), entscheidend ist, um die ursprüngliche Reaktion zu erfassen30. Die Probe ist so schnell wie möglich nach der Entnahme aufzubewahren, um Veränderungen in der Metabolitenzusammensetzung aufgrund von Probenabbau oder physiologischen Reaktionen zu vermeiden, die nicht dem Ziel entsprechen32.
- Legen Sie Korallenfragmente in einen sterilen Probenentnahmebeutel und lassen Sie überschüssiges Meerwasser so weit wie möglich abtropfen. Die Probe wird mindestens 30 s lang in flüssigen Stickstoff getaucht. Bringen Sie die Proben so schnell wie möglich zur Lagerung in einen Gefrierschrank bei −80 °C.
HINWEIS: Proben können bis zur Verarbeitung bei −80 °C in lichtblockierten Behältern eingefroren werden, wodurch Gefrier-Auftau-Zyklen vermieden werden.
3. Entfernung von Korallengewebe aus dem Skelett
HINWEIS: Die Proben sollten immer auf Eis (4 °C) aufbewahrt werden, um sicherzustellen, dass sie gleichzeitig in flüssiger Form vorliegen und gleichzeitig einen laufenden Stoffwechsel verhindern.
- Legen Sie einen sauberen, sterilen Probenentnahmebeutel auf Eis, so dass der Beutel stabil und offen auf dem Eis in einer flachen Vertiefung liegt, aber nicht in das Eis eingetaucht ist. Geben Sie 10 ml kaltes (4 °C) Reinstwasser in den Beutel.
HINWEIS: Dies hilft, ein wiederholtes Auftauen des Korallenfragments aufgrund der kalten Druckluft und des umgebenden Eises zu vermeiden. - Wählen Sie ein Korallenfragment mit einer sterilisierten Pinzette aus und spülen Sie es mit kaltem (4 °C) Reinstwasser mit einer sterilen Pasteurpipette ab, bis keine Meerwasserrückstände mehr vorhanden sind. Tauchen Sie das abgespülte Korallenfragment in den Beutel mit den 10 ml Reinstwasser.
HINWEIS: Diese Spülung ist wichtig, um alle Restsalze zu entfernen, die die nachgelagerte Analyse beeinträchtigen würden. Vermeiden Sie den Kontakt der Hand mit dem Wasser oder Korallenfragment durch den Beutel, um die Probe bei 4 °C zu halten. - Kleben Sie eine sterile 1-ml-Pipettenspitze mit Isolierband über das Ende einer Luftpistole, wobei ~5 mm das Ende der Spitze abschneiden (Abbildung 1A).
- Richten Sie die Luftpistole auf das Korallenfragment, während der Beutel halb verschlossen ist und der Luftstrom auf niedrigem Medium steht, um das Gewebe vorsichtig zu entfernen, indem Sie eine kreisförmige Bewegung des Wassers über das Korallenfragment fördern.
- Nach ~3 Minuten oder wenn das gesamte Gewebe aus dem Skelett entfernt worden zu sein scheint, schalten Sie die Luft aus und entfernen Sie die Airbrush. Verschließen Sie den Beutel vollständig.
- Drücken Sie das gesamte entfernte Korallengewebe in eine untere Ecke des Beutels. Schneiden Sie die gegenüberliegende Ecke ab und gießen Sie den Inhalt des Beutels vorsichtig in ein 15-ml-Röhrchen auf Eis.
4. Optionale Homogenisierung
HINWEIS: Einige Korallenarten sind zähflüssiger als andere, was bedeutet, dass das Airbrushing das Gewebe in Klumpen und nicht in einer Aufschlämmung entfernt. Sind Gewebeklumpen im Airbrush-Homogenat sichtbar, kann für alle Proben ein Homogenisierungsschritt bei 4 °C hinzugefügt werden.
- Reinigen Sie einen mechanischen Sägezahnhomogenisator zweimal mit 4 °C 70% Methanol und zum Schluss mit 4 °C Reinstwasser.
- Homogenisieren Sie die Korallenprobe in einem 15-ml-Röhrchen für ~1 Minute, bis die Probe vollständig homogenisiert ist und keine Klumpen mehr sichtbar sind.
- Reinigen Sie den Homogenisator wie in Schritt 4.1 zwischen den einzelnen Proben. Halten Sie die Homogenisierungszeit über die Proben hinweg konstant.
5. Probenentnahme zur Normalisierung
- Entnehmen Sie ein 1.000-μl-Aliquot aus dem homogenisierten Gewebe für die Symbiodiniaceae-Zellzahl, die Analyse des Proteingehalts des Korallenwirtsgewebes und die Chlorophyll-A-Schätzung . Bei −20 °C lagern, bis die Analyse erfolgt ist (Abschnitt 10).
6. Optionale Zelltrennung zwischen Korallenwirtsgewebe und Symbiodiniaceae
- Das Korallenhomogenat wird bei 2.500 × g 5 min bei 4 °C mit einer gekühlten Zentrifuge zentrifugiert.
HINWEIS: Diese Geschwindigkeit ist optimal, um die schwereren Symbiodiniaceae-Zellen vom Wirtsgewebe zu trennen, das im Überstand suspendiert ist, während ihre Zellwände intakt bleiben. - Entfernen Sie den Überstand, der das Wirtsmaterial enthält, und geben Sie ihn in ein neues 15-ml-Röhrchen.
HINWEIS: Die Lipide aus dem Wirtsgewebe bilden typischerweise eine schmale rosa/weiße Schicht auf den Symbiontenzellen. Diese Schicht kann zusammen mit dem löslichen Wirtsüberstand durch Pipettieren gesammelt werden (Abbildung 1B). - Den Wirt genau 1 Minute lang kräftig vortexen. Halten Sie die Algenpelletprobe und die Wirtsüberstandsprobe auf Eis.
- 2 ml Reinstwasser bei 4 °C in das Algenpellet geben. Genau 2 Minuten lang kräftig wirbeln, um das Pellet wieder zu suspendieren.
HINWEIS: Wenn für die Symbiodiniaceae-Genotypisierung keine einzelnen Fragmente von 1 cm aus der Korallenkolonie entnommen wurden, kann hier ein 200 μL Aliquot der Symbiodiniaceae-Zellsuspension gesammelt, in der bevorzugten DNA-Pufferlösung konserviert und wie in Thurber et al.30 für die Symbiodiniaceae-Genotypisierung beschrieben gelagert werden (z. B. gemäß González-Pech et al.12). - Wiederholen Sie die Schritte 6.1 bis 6.4 noch einmal.
HINWEIS: Die zuverlässige Trennung von Wirt und Symbiont hängt von der Korallenbiomasse und -art ab, da einige Arten zähflüssiger sein können als andere. Empfohlen werden mindestens drei Waschschritte, die jedoch je nach Abscheideerfolg erhöht werden können. Wiederholen Sie die Waschschritte 4.7-4.9, bis keine Symbiodiniaceae-Zellen mehr im unteren Teil der Wirtsfraktion zu sehen sind und bis die Symbiodiniaceae-Fraktion sichtbar frei von Wirtsmaterial ist (z. B. keine weiße Schicht auf der Oberseite) (Abbildung 1). - Entfernen Sie den Überstand, der das Wirtsmaterial enthält, und geben Sie ihn in ein neues 15-ml-Röhrchen.
- Bewahren Sie das Symbionten-Pellet im 15-ml-Röhrchen auf.
7. Trocknung der Probe
- Frieren Sie entweder das Holobiont-Homogenat oder sowohl die getrennte Wirts- als auch die Symbiodiniaceae-Fraktion bei −80 °C für ~120 Minuten ein. Die Proben werden über Nacht mit einem Vakuum von 0,01 mbar bei −85 °C lyophilisiert.
HINWEIS: Um Probenverluste während der Gefriertrocknung zu vermeiden, wird empfohlen, einen Deckel zu verwenden, der aus einem anderen sterilen Röhrchen oder sterilen Parafilm geschnitten wurde, mit einem ~2 mm großen Loch, das vorsichtig mit einer sterilen 25-G-Nadel durchgestanzt wurde. - Nach dem Trocknen mit einer Laborwaage eines der folgenden Gefäße wiegen: 1) 25 mg des Holobionten; 2) 15 mg der Symbiontenfraktion; oder 3) 30 mg des Wirtsgewebes aus jeder Probe in separate 2 ml weichmacherfreie Mikrozentrifugenröhrchen.
HINWEIS: Kritischer Schritt: Die Optimierung der Biomasse für die Extraktion ist unerlässlich, um sicherzustellen, dass der GC-MS nicht überlastet wird und gleichzeitig ein ausreichendes Signal gewährleistet ist. Das getrocknete Korallenmaterial ist sehr statisch. Um Probenverluste zu vermeiden, verwenden Sie antistatische Vorrichtungen, um elektrostatische Aufladungen aus den Proben und Wägegefäßen zu entfernen. Eine einfache und kostengünstige Alternative besteht darin, ein Wäschetrocknertuch unter das Probenröhrchen zu legen. Das getrocknete Symbionten-Pellet kann mit einer sterilen Klinge auf das gewünschte Gewicht geschnitten werden.
8. Intrazelluläre Metaboliten-Extraktionen
- Intrazelluläre Metabolitenextraktion aus lyophilisiertem Holobiont:
- 400 μl 100 % kaltes (−20 °C) Methanol mit internem Standard/en (IS; Nr. 13C6-Sorbit und/oder 13C5-15 N-Valin, bei 10μM) in jedes Röhrchen.
- Zu jeder Probe wird eine kleine Anzahl von 710-1.180 μm säuregewaschenen Glasperlen (~10 mg) gegeben. In eine Rührwerksmühle bei 50 Hz für 3 min in einen vorgekühlten (−20 °C) Rührwerkseinsatz geben.
- In jedes Röhrchen werden weitere 600 μl 100 % kaltes (−20 °C) Methanol mit ISs (13 C6 Sorbit und/oder 13C5-15 N Valin, bei 10μM) gegeben.
- Vortex 1 Min. lang mischen. Auf einem Drehspieß-Shaker bei 4 °C 30 Min. ruhen lassen.
- Intrazelluläre Metabolitenextraktion aus separierten lyophilisierten Symbiodiniaceae-Zellen:
- 200 μl 100 % kaltes (−20 °C) Methanol mit ISs (13 C6 Sorbit und/oder 13C 5-15 N Valin, bei 10μM) werden zu dem getrockneten Symbiodiniaceae-Material gegeben.
- Fügen Sie eine kleine Anzahl von 710-1.180 μm säuregewaschenen Glasperlen (~10 mg) hinzu. In eine Rührwerksmühle bei 50 Hz für 3 min in einen vorgekühlten (−20 °C) Rührwerkseinsatz geben.
- Weitere 800 μl 100 % kaltes (−20 °C) Methanol mit ISs zugeben und 30 s lang vortexen.
- Intrazelluläre Metabolitenextraktion aus separiertem lyophilisiertem Wirtsgewebe:
- 1 ml 100 % kaltes (−20 °C) LC-Methanol, das ISs (13C6 Sorbit und/oder 13C 5-15 N Valin, bei 10μM) enthält, zum getrockneten Wirtsmaterial geben.
- Vortex 20 s lang mischen. In einem schwimmenden Röhrchenhalter für 30 Minuten in ein Beschallungsbad bei 4 °C stellen.
9. Reinigung von Metabolitenextrakten
- Die Proben (Holobiont/Wirt/Symbiont) werden bei 3.000 × g für 30 min bei 4 °C zentrifugiert.
- Den gesamten Überstand in ein neues 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführen, wobei darauf zu achten ist, dass das Zelltrümmerpellet nicht gestört wird.
HINWEIS: Dies sind die semipolaren Extrakte. Diese können vorübergehend auf Eis gelagert werden, aber langfristig bei −80 °C im Dunkeln gelagert werden. - Zu den verbleibenden Zelltrümmern werden 1.000 μl 50 % kaltes (−20 °C) Methanol hinzugefügt. Kräftigen Wirbel für 1 Minute, um zu resuspendieren.
- Die Proben werden bei 3.000 × g für 30 min bei 4 °C zentrifugiert.
- Sammeln und poolen Sie den Überstand (polare Extrakte) mit den semipolaren Extrakten aus derselben Probe.
HINWEIS: Die Zelltrümmer können bei −80 °C gelagert und zur Normalisierung des Proteingehalts verwendet werden (Abschnitt 11). - Zentrifugieren Sie die gepoolten Extrakte 15 Minuten lang bei 16.100 g , um alle Ausfällungen zu entfernen, und bewegen Sie den Überstand in ein neues weichmacherfreies Mikrozentrifugenröhrchen (2 ml).
HINWEIS: Die Probenextrakte können bei −80 °C im Dunkeln gelagert werden. - Wenn Sie zur Analyse bereit sind, aliquoten Sie 50 μl von jedem Extrakt in einen Glaseinsatz. 30 min bei 30 °C mit einem Vakuumkonzentrator konzentrieren. Wiederholen Sie dies viermal (für 250 μl getrockneten Extrakt).
HINWEIS: Die getrockneten Proben können bis zur Analyse bei Raumtemperatur unter Trockenmittelbedingungen gelagert werden.
10. Metaboliten-Derivatisierung
HINWEIS : Ein zweistufiger Online-Derivatisierungsprozess wird für die Methoximierung und Trimethylsilylierung der polaren Metaboliten verwendet.
- Zu jeder Probe werden 25 μl Methoxyaminhydrochlorid (30 mg/ml in Pyridin) gegeben.
- Bei 37 °C auf einem Orbitalschüttler bei 750 U/min für 2 h rühren.
- Zu jeder Probe werden 25 μl N,O-Bis(trimethylsilyl)trifluoracetamid + Trimethylchlorsilan gegeben.
- Nochmals bei 37 °C und 750 U/min 1 h rühren.
- Lassen Sie die Proben bei Raumtemperatur 1 h lang ausbalancieren, bevor Sie 1 μl im Verhältnis 1:10 in den GC injizieren.
11. Gaschromatographie-Massenspektrometrie-Analyse
HINWEIS: Das Massenspektrometer sollte gemäß den Empfehlungen des Herstellers mit Tris-(Perfluorbutyl)-amin (CF43) eingestellt werden.
- Verwenden Sie ultrahochreines Helium als Trägergas mit einer konstanten Säulendurchflussrate von 1 ml/min.
- Verwenden Sie eine 30 m lange DB-5-Säule mit einer Schichtdicke von 1 μm und einem Innendurchmesser von 0,25 mm.
- GC Ofenprogramm
- Stellen Sie die Eingangstemperatur auf 280 °C ein.
- Beginnen Sie mit der Injektion bei einer Ofentemperatur von 100 °C und halten Sie sie 4 Minuten lang.
- Erhöhen Sie die Temperatur um 10 °C/min auf 320 °C und halten Sie sie dann 11 Minuten lang.
- Parameter des Massenspektrometers
- Stellen Sie die MS-Transferleitung auf 280 °C ein und stellen Sie die Ionenquelle auf 200 °C ein.
- Verwenden Sie Argon als Kollisionszellengas, um das MRM-Produkt (Multiple Reaction Monitoring) zu erzeugen.
- Erzielen Sie den Nachweis von Metaboliten relativ zu einer zeitsegmentierten MRM-Bibliothek mit MRM-Zielen.
12. Symbiodiniaceae-Zellzahl, Analyse des Proteingehalts im Korallenwirtsgewebe und Chlorophyll-a-Schätzung
- Anzahl der Symbiodiniaceae-Zellen:
- Nehmen Sie ein Aliquot des Korallengewebe-Homogenats.
- Zentrifugieren Sie die Proben bei 2.000 × g , um die Algen zu pelletieren.
- Entfernen Sie den ~200 μl Überstand aus dem Algenpellet und geben Sie ihn in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen.
HINWEIS: Dies ist die Proteinprobe, die zur Normalisierung der Daten verwendet wird. ggf. vor der Analyse bei −20 °C lagern. - Resuspendieren Sie das Algenpellet in 1 ml gefiltertem Meerwasser, indem Sie vorsichtig auf und ab pipettieren. Falls erforderlich, verdünnen Sie die Algensuspension, um die Zellzählung zu erleichtern.
- Führen Sie eine Zellzählung mit einem Hämozytometer unter einem Lichtmikroskop durch, indem Sie 10 μl in eine der Kammern geben. Führen Sie 8-10 Zählungen pro Probe durch.
HINWEIS: Wo verfügbar, können auch alternative Methoden zur Zählung der Algenzellen angewendet werden (z. B. Durchflusszytometrie, konfokale Hochdurchsatzmikroskopie). - Berechnen Sie die Konzentration der Symbiontenzellen (ml−1) unter Berücksichtigung der verwendeten Verdünnungsfaktoren.
- Assay für den Proteingehalt
- Quantifizierung des Proteingehalts der Probe (z. B. über den kolorimetrischen Assay von Bradford, wie er ursprünglich von Bradford et al.33 beschrieben wurde, oder den Lowry-Assay34,35, dessen Protokoll für Nesseltiere an anderer Stelle beschrieben wurde 36).
- Chlorophyll eine Extraktion
- Verwenden Sie ein Zellpellet von ~200.000 Zellen, gefroren oder frisch.
- Jedes Algenpellet wird in 2 ml Dimethylformamid (DMF) in einem Glasszintillationsfläschchen überführt und 48 Stunden lang im Dunkeln bei 4 °C inkubiert.
HINWEIS: DMF ist giftig und krebserregend, daher muss die Probenvorbereitung unter einem möglichst dunklen Abzug und auf Eis erfolgen. Wenn <200.000 Zellen vorhanden sind, verwenden Sie weniger DMF. - 3 min bei 16.000 × g zentrifugieren.
- Übertragen Sie 200 ml in eine UV-96-Well-Platte für photometrische Messungen. Führen Sie jede Probe dreifach mit DMF als Rohling aus.
- Messen Sie die Absorption bei den Wellenlängen (E) 663,8 nm, 646 nm und 750 nm. Subtrahieren Sie die Absorption bei 750 nm von der Absorption bei den beiden anderen Wellenlängen.
HINWEIS: Die Messung bei 750 nm korrigiert jegliche Streuung oder Trübung in der Probe. - Berechnen Sie die Chlorophyll-a-Konzentration (μg/ml) mit Gleichung (1):
Chl a-Konzentration (μg/ml) = (12,00 × E 663,8) - (3,11 × E646,8) (1)
13. Quantifizierung der Zellbiomasse nach Metabolitenextraktionen zur Normalisierung
ANMERKUNG: Es gibt zwei Optionen für die Quantifizierung der Zellbiomasse, die im Folgenden beschrieben werden: die Quantifizierung von Proteinen, die sich auf die Biomasse beziehen, mit einer modifizierten kolorimetrischen Bradford-Methode und die Messung des Trockengewichts der Zelltrümmer. Beide Methoden sind geeignet, da beide eine genaue Quantifizierung der Zellbiomasse ermöglichen.
- Proteingehalt der Zelltrümmer
- Die gefrorenen Zelltrümmer werden mit 1 ml 0,2 M NaOH resuspendiert und die Proben 20 Minuten lang bei 98 °C inkubiert.
- Kühlen Sie die Proben ~10 Minuten lang auf Eis ab und zentrifugieren Sie sie bei 3.000 × g für 5 Minuten bei Raumtemperatur.
- Quantifizierung des Proteingehalts der Probe (z. B. mit dem kolorimetrischen Assay von Bradford, wie ursprünglich von Bradford et al.33 beschrieben und von Smart et al.37 modifiziert).
- Messung des Trockengewichts von Zelltrümmern
- Resuspendieren Sie die Zelltrümmer aus der intrazellulären Metabolitenextraktion in doppelt destilliertem Wasser (~10 ml).
- Die Lösung wird unter Vakuum mit einem vorgewogenen Membranfilter (0,22 μm Pore, 47 mm) filtriert.
- Waschen Sie die Rohre, die Biomasse enthalten, zweimal mit Reinstwasser, um die vollständige Übertragung der Biomasse auf den Membranfilter zu gewährleisten.
- Entfernen Sie den Membranfilter, der die Biomasse enthält, und trocknen Sie ihn mit einem Mikrowellenherd (geringe Leistung; ~250 W für 20 min).
- Bewahren Sie das Filterpapier über Nacht in einem Exsikkator auf. Erfassen Sie das Trockengewicht des Filterpapiers und berechnen Sie das Trockengewicht der Biomasse, indem Sie das Gewicht des trockenen Membranfilters (unter Verwendung eines sauberen trockenen Membranfilters, der neben dem Probenfilter getrocknet wird) vom Gesamtgewicht abziehen.
14. Datenanalyse
- Analysieren Sie Metabolitenziele mithilfe von Metabolitendatenbanken, wobei jedes Ziel aus einem Quantifizierer und einem Qualifizierer-MRM besteht.
- Prüfen Sie die erkannten Metabolitenziele visuell und integrieren Sie sie bei Bedarf manuell.
- Verwenden Sie eine Metaboliten-Peakfläche, um die relative Häufigkeit jeder Probe für jede Gruppe zu berechnen. Die Werte werden leerkorrigiert und normalisiert, um die interne Standard-Peakfläche zu untersuchen und dann den Zelltrümmerproteingehalt gemäß Smart et al.37 zu beproben.
- Verwerfen Sie Metaboliten mit einer relativen Standardabweichung von mehr als 35 % in allen Behandlungsgruppen (N = 23 Metaboliten).
- Transformieren Sie die Daten (z. B. Kubikwurzel) und zentrieren Sie sie im Mittelwert. bestätigen eine Normalverteilung und Homogenität der Varianz.
- Führen Sie die Datenanalyse durch (ANOVA- und Heatmap-Erstellung; z. B. mit https://www.metaboanalyst.ca)38. Clustern Sie die Proben, um die Variabilität innerhalb der Behandlung mit den Paketen "cluster", "factoextra" und "klustR" zu untersuchen. Berechnen Sie die Gap-Statistik (eine Methode zur Bestimmung der optimalen Anzahl von Clustern39) mit der Funktion "clusGap" in R und stellen Sie sie mit dem R-Paket "tidyverse" dar. Führen Sie PERMANOVAs durch, um die Signifikanz in der Trennung zwischen den Metabolitenprofilen der Behandlung (z. B. in Primer) zu untersuchen.
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Representative Results
Alle Daten, die während dieser Arbeit erstellt wurden, sind in den Zusatzinformationen verfügbar.
Wirt-Symbionten-Trennung
Abbildung 1: Aufbau und Validierung der Trennung von Korallenwirtsgewebe und Symbiodiniaceae-Zellen. (A) Der Luftpistolenaufbau zur Entnahme von Korallengewebe aus dem Korallenskelett. Eine Pipettenspitze wird mit Isolierband an der Luftpistole befestigt, und ein kleiner (~5 mm) Abschnitt wird von der Spitze abgeschnitten, damit mehr Luft entweichen kann, ohne dass sich die Spitze löst. (B) Beispiele für das holobionte und separierte Wirtsgewebe (Überstand) und Symbiodiniaceae-Zellen (Pellet). Der Wert stellt die Anzahl der Zentrifugationsschritte dar. Der Pfeil zeigt auf die schmale Wirtslipidschicht auf dem Symbiontenpellet, die gesammelt und mit der Wirtsfraktion kombiniert werden kann. (C-E) Hellfeld- (oben) und Chlorophyll-Autofluoreszenzmikroskopie-Aufnahmen (unten) eines Aliquots des (C) Holobionten sowohl mit Wirtsgewebe als auch mit Symbiontenzellen, (D) der Wirtsfraktion ohne Symbiontenzellen, was durch die Abwesenheit jeglicher Chlorophyll-Autofluoreszenz verifiziert wird, und (E) intakten Symbiontenzellen, die die Entfernung des Wirtsgewebes demonstrieren. Maßstabsbalken = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Die mikroskopische Visualisierung zeigte keine Symbiodiniaceae-Zellen in den Wirtsgewebeproben nach den drei Waschschritten (Abbildung 1D). In ähnlicher Weise war in den Symbiontenfraktionen nur minimales Wirtsgewebe vorhanden (Abbildung 1E). Das Holobiont-Homogenat (Abbildung 1C) zeigte jedoch, dass die intrazellulären Symbiodiniaceae durch einfaches Airbrushing möglicherweise nicht ausreichend aus ihren Symbiosomen freigesetzt und somit während der mechanischen Homogenisierung (Protokollabschnitt 4) oder Lösungsmittelextraktion (Protokollabschnitt 8) im Vergleich zur zentrifugalen Trennung (Abbildung 1E) nicht ausreichend lysiert wurden). Diese Einschränkung könnte einen Teil der großen Variation innerhalb der Gruppe zwischen den Holobiont-Proben und spezifischen Beobachtungen in den Holobiont-Profilen erklären. Zum Beispiel waren zwei Metaboliten (Glykolsäure und 1-Hexadecanol) signifikant häufiger im Holobionten im Vergleich zum Symbionten, aber nicht im Wirt im Vergleich zum Symbionten; Dies könnte ein Ergebnis der großen Variation innerhalb der Gruppe in der relativen Häufigkeit dieser Metaboliten in den Holobiont-Profilen gewesen sein. Insbesondere wies die Holobiont-Probe 3 relativ höhere Konzentrationen von Dodecansäure, Glykolsäure und 1-Hexdecanol auf als jede der Symbionten- oder Wirtsproben einzeln. Wenn die Symbiontenzellen nicht ausreichend vom Wirtsgewebe gereinigt wurden, wurde der Gehalt des Holobiont-Proteins möglicherweise unterschätzt, was die Biomassenormalisierung beeinflusst und zur Berechnung einer höheren Metabolitenhäufigkeit im Verhältnis zur Biomasse in dieser Probe geführt hat. Dies unterstreicht das Potenzial für eine erhöhte Variation in der holobionten Metabolomik.
Analyse des Metabolitenprofils
Die Wahl des Massenspektrometer-Modus hängt von der durchgeführten Analyse ab. Für die Erstellung von Steady-State-Metaboliten ermöglicht eine umfassende zielgerichtete Methodik mit einer QqQ-MS im MRM-Modus eine verbesserte Detektion und Identifizierung von Metaboliten aufgrund der Eliminierung des Hintergrundrauschens, das durch hohe biologische Salzkonzentrationen erzeugt werden kann. Für Ansätze zur Markierung stabiler Isotope ermöglicht ein Massenspektrometer (d. h. Einzel-Quadrupol, Dreifach-Quadrupol [QqQ], Quadrupol-Flugzeit [QTOF]), das im Scan-Modus läuft, die Detektion von Massenisotopologen, die auf stabile Isotopenanreicherungsmuster hinweisen.
Die gezielte GC-MS-Analyse wurde mit der Shimadzu Smart Metabolite Database (v3; die etwa 350 endogene Metaboliten und mehrere stabile isotopenmarkierte interne Standards abdeckt) und der Shimadzu LabSolutions Insight-Software durchgeführt. Über alle Behandlungen hinweg wurden 107 annotierte Metaboliten identifiziert, darunter eine Reihe von Aminosäuren, organischen Säuren, Kohlenhydraten, Fettsäuren und Sterolen (Ergänzende Tabelle S1). Qualitative und quantitative Ionenpaare sind in der Zusatztabelle S2 aufgeführt. Das Kmeans-Clustering identifizierte drei unterschiedliche Cluster von Stichproben (verifiziert durch einen Gap-Statistik-Test), wobei sich alle Stichproben in separaten, unterschiedlichen Clustern befanden. die Symbionten befanden sich in Cluster 1, der Wirt in Cluster 2 und die Holobiontenproben in Cluster 3 (Abbildung 2).
Abbildung 2: Kmeans-Clusteranalyse der Metabolitenprofile . (A) Die Profile der Probenmetaboliten wurden nach euklidischer Distanz mit der optimalen Anzahl von Clustern (N = 3) geclustert, was durch eine lückenstatistische Berechnung verifiziert wurde. (B) Parallele Koordinatenvisualisierung der durchschnittlichen relativen Metabolitenhäufigkeit (Linie, farbig entsprechend dem Cluster) und des Konfidenzintervalls (Schattierung, farbig je nach Cluster) für jeden Cluster (rot = Cluster 1, grün = Cluster 2, blau = Cluster 3). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Vergleich des Metabolitenprofils von Wirt und Symbionten
Die Wirts- und Symbiontenprofile unterschieden sich signifikant voneinander (PERMANOVA, t = 16.909, p < .001; Ergänzende Tabelle S3) mit 100 einzelnen Metaboliten, die sich zwischen der Wirts- und der Symbiontenfraktion signifikant unterscheiden (ANOVA, FDR < .05; Abbildung 3 und ergänzende Tabelle S1). Davon waren 13 Metaboliten im Symbionten signifikant häufiger als in den Wirtsextrakten, darunter die Eicosanoide Docosahexaensäure (C22:6[ω-6]; DHA), Eicosapentaensäure (C20:5[ω-6]; EPA) und Arachidonsäure (C20:4[ω-6]; ARA) (ANOVA, FDR < 0,05; Abbildung 3 und ergänzende Tabelle S1). Insgesamt 87 Metaboliten waren im Symbionten weniger häufig als in den Wirtsextrakten (ANOVA, FDR < 0,05; Abbildung 3 und ergänzende Tabelle S1).
Abbildung 3: Heatmap-Visualisierung der relativen Metaboliten-Häufigkeiten mit Post-hoc-Analyseergebnissen der Gruppenvergleiche. Die Wirts-, Symbionten - und Holobiontenproben (N = 5 pro Gruppe) wurden über die Ward-Verknüpfung hierarchisch gruppiert, und die Metaboliten wurden nach dem euklidischen Distanzmaß geclustert. Die farbigen Quadrate weisen auf signifikante Unterschiede in den mittels ANOVA detektierten Gruppenvergleichen mit post-hoc Tukey's HSD hin (Supplementary Table S1). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Holobiont-Metabolitenprofile im Vergleich zu getrennten Wirts- und Symbiontenprofilen
Die Holobiont-Metabolitenprofile zeigten eine große Variabilität innerhalb der Gruppe, die durch die große Trennung der Proben im Holobiont-Cluster in der Kmeans-Analyse untermauert wurde. Insbesondere wurden Probe 3 und Probe 4 entlang der Dimension 2 von Probe 1, Probe 2 und Probe 5 getrennt (Abbildung 2A). Die holobionten Proben waren ein Zwischenprodukt zwischen den getrennten Wirts- und Symbiontenfraktionen (Abbildung 2A). Während die Kmeans-Clusterverteilungen (Abbildung 2A), die parallelen Koordinaten (Abbildung 2B) und die Heatmap-Visualisierung der relativen Metabolitenhäufigkeit (Abbildung 3) darauf hindeuteten, dass das Holobiontenprofil eher mit dem Wirtsfraktionsprofil übereinstimmte, unterschied sich das Holobiontenprofil signifikant vom Wirt (PERMANOVA, t = 3,47, p < 0,001; Ergänzende Tabelle S3) und Symbiontenprofile (PERMANOVA, t = 11,29, p < 0,001; Ergänzende Tabelle S3). Auf der Ebene der einzelnen Metaboliten unterschieden sich 66 bzw. 82 Metaboliten im Holobionten signifikant von den Wirts- bzw. Symbiontenprofilen (ANOVA, FDR < 0,05, Ergänzende Tabelle S1). Von diesen wiesen 54 (81,8 %) der 66 signifikanten Metaboliten eine signifikant höhere relative Häufigkeit im Wirt auf als die Holobiontenfraktion und 78 (95 %) wiesen eine signifikant höhere relative Häufigkeit im Holobionten auf als die Symbiontenfraktion; vier waren in den Symbiontenfraktionen häufiger, darunter DHA, Glycerin-3-Phosphat, Inositolphosphat und Phosphorsäure (Abbildung 3). Acht Metaboliten (darunter zwei Fettsäuren [Linolsäure (C18:1) und Myristinsäure (C14:0)], fünf Dicarbonsäuren und die Aminosäure Guanin) unterschieden sich signifikant in der Häufigkeit zwischen Wirt und Symbiont, jedoch nicht im Vergleich zur Holobiontenfraktion (Abbildung 3).
Ergänzende Tabelle S1: Die relative Häufigkeit jedes Metaboliten, der mittels GC-MS-Analyse im Holobionten und getrennten Wirt und Symbionten identifiziert wurde. Bei den Werten handelt es sich um Mittelwerte ± Standardfehler, und die bereitgestellten ANOVA-Ergebnisse, einschließlich der Post-hoc-Analyse, werden durch die farbigen Zellen (Spalten K, L und M) angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Tabelle S2: Qualitative und quantitative Ionenpaare für die identifizierten Metaboliten. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Tabelle S3: Ergebnisse von PERMANOVA. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Die Trennung von Wirt und Symbiont ist durch einfache Zentrifugation leicht und schnell zu erreichen, und die Ergebnisse hier zeigen, dass die Trennung der Fraktionen wertvolle Informationen liefern kann, die auf spezifische Beiträge von Holobiontenmitgliedern hinweisen, die zur funktionellen Analyse der Korallengesundheit beitragen können. In erwachsenen Korallen wird die Lipidsynthese hauptsächlich vom ansässigen Algensymbionten 40 durchgeführt, der Lipide (z. B. Triacylglycerin und Phospholipide)41 und Fettsäuren liefert, die die Stressregeneration fördern können 11,42. Von den 13 Metaboliten, die in dieser Arbeit in den Symbionten-Wirts-Profilen häufiger vorkamen, waren 9 Fettsäuren, darunter die biologisch relevanten Eicosanoide DHA (C22:6[ω-6]), EPA (C20:5[ω-6]) und ARA (C20:4[ω-6]), die an der Stresssignalisierung zwischen den Reichen in der Korallen-Symbiodiniaceae-Symbiose beteiligt sind 9,10. Inositolphosphat spielt eine entscheidende Rolle bei verschiedenen zellulären Funktionen, einschließlich Zellwachstum, Apoptose, Endozytose und Zelldifferenzierung. Es wurde häufig festgestellt, dass sich die relativen Häufigkeiten von Inositol-Isoformen und -Derivaten während einer Symbiose-Dysfunktion ändern 7,11,27,28, obwohl die Rolle dieser Isoformen und ihrer Derivate in der Korallen-Symbiodiniaceae-Symbiose unklar bleibt. Der deutliche Unterschied in der relativen Häufigkeit zwischen Wirts- und Symbiontenprofilen trägt also zu diesem Wissen bei.
Viele Studien haben holobionte Metabolitenprofile verwendet, um die metabolischen Interaktionen und die Leistung von Korallen unter Umgebungs- und Stressbedingungen zu untersuchen 13,43,44,45. Hier zeigen wir, dass die Analyse des Holobiont-Homogenats zu einer großen Variabilität innerhalb der Behandlung führen kann, und die resultierenden Profile können wirts- und/oder symbiontenspezifische Abundanzmuster und metabolische Beiträge zum gesamten Holobiont-Metabolom maskieren. Zum Beispiel waren von den 13 Metaboliten, die im Symbionten im Vergleich zur Wirtsfraktion signifikant häufiger vorkamen, nur 4 im Symbionten im Vergleich zum Holobionten signifikant häufiger. Dazu gehörten das potenziell biologisch relevante DHA und Inositolphosphat 7,9,10,11,27,28; Die deutlichen Unterschiede, die in den Stress-Signal-Eicosanoiden EPA und ARA zwischen Wirt und Symbiont beobachtet wurden, waren jedoch in den Holobionten- und Symbiontenproben nicht signifikant. Diese Metaboliten werden zunehmend als wichtige Metaboliten in der molekularen Sprache der Symbiose und als Indikatoren für Stressreaktionen anerkannt10, aber die Untersuchung von Holobiontenprofilen allein würde nicht die deutlichen Veränderungen in den relativen Abundanzverhältnissen dieser Metaboliten in bestimmten Holobiontenmitgliedern aufdecken. Daher kann die Analyse des Holobionten Unterschiede maskieren, die sonst offensichtlich sind, wenn Wirt und Symbiont getrennt analysiert werden, und diese Unterschiede werden in Studien, die abiotische oder biotische Behandlungen ausschließlich anhand von Holobiont-Profilen vergleichen, möglicherweise nicht als signifikant erkannt. Dies könnte es schwierig machen, spezifische Partnerbeiträge oder -funktionenabzuleiten 7,8,9,11,12,22,28, insbesondere wenn versucht wird, biologische Fragen zu beantworten, für welche symbiotischen Interaktionen dem beobachteten Holobion-Phänotyp zugrunde liegen 46,47.
Eine alternative Methode bestünde darin, die Wirtsgewebe und Symbiontenzellen zu trennen, ein Aliquot des Homogenats oder einen Extrakt jeder Fraktion zu nehmen, um vor der Extraktion zu rekombinieren, und dies zusammen mit den getrennten Fraktionen zu analysieren. Diese Methode würde die Freisetzung von Symbionten aus dem Wirtsgewebe sicherstellen, aber das Potenzial für menschliches Versagen und/oder Metabolitenverlust erhöhen48. Eine separate Analyse der Fraktionen und die Integration der Daten nach der Analyse wäre möglich, aber die Berechnungen müssten den Anteil von Symbionten- und Wirtszellen im ursprünglichen Korallenholobionten berücksichtigen.
Während durch die Trennung der Wirts- und Symbiontenfraktionen für die Metabolitenanalyse mehr Informationen gewonnen werden können, insbesondere in Bezug auf die Beiträge der einzelnen Mitglieder zum Stoffwechsel und zur Funktion des Holobionten, ist die Entscheidung, ob Wirt und Symbiont getrennt werden sollen, anstatt den Holobionten zu analysieren, letztendlich eine Entscheidung, die von der Forschungsfrage bestimmt wird. Zum Beispiel ist die Analyse des Metabolitenprofils des Holobionten relevant, wenn andere physiologische Messungen mit dem Holobionten durchgeführt werden (z. B. Analyse der Emissionen flüchtiger Metaboliten aus Korallenkolonien 49,50,51) und wenn Metabolomikprofile in Holobiont-Datensätze integriert werden müssen. Darüber hinaus ist die Trennung von Wirt und Symbiont nicht ohne Einschränkungen; Beispielsweise können zusätzliche Manipulationsschritte die Stabilität des Metaboliten beeinträchtigen und zu Datenverlusten oder Störeffekten führen48.
Darüber hinaus gibt es weitere Optimierungsschritte, die mit dem Verfahren der Wirt-Symbionten-Trennung verbunden sind: 1) Optimierung der Anzahl der Waschungen für die jeweilige Korallenart; und 2) Identifizierung der optimalen Biomasse, die aus beiden Fraktionen für die GC-MS-Analyse extrahiert werden soll. Beide Schritte müssen einbezogen werden, bevor die endgültige Probenverarbeitung beginnen kann, wodurch sowohl die Verbrauchsmaterialien als auch die analytischen Anforderungen an Material, Zeit und Kosten steigen. In dieser Arbeit könnten der Metabolitenverlust vom Wirt und die Symbiontenextraktionen aufgrund der zusätzlichen Schritte zu den höheren relativen Häufigkeiten einiger Metaboliten beigetragen haben, die im Holobionten im Vergleich zum Wirt oder zum Symbionten beobachtet wurden, wie z. B. Glykolsäure, 1-Hexadecanol und Dodecansäure. Die große Variation innerhalb der Gruppe in der Holobiontengruppe für diese Metaboliten ist jedoch, wie bereits erwähnt, ein alternativer Grund für diese beobachteten Muster.
Die Anwendung von Metabolomik-Ansätzen ist zwar relativ neu, hat aber einen tiefgreifenden Einfluss auf unsere Fähigkeit, die Funktion spezifischer Symbiosen aufzuklären. Dieser Ansatz hat zum Beispiel den Beitrag des Phytoplankton-Wachstumshormons Indol-3-Essigsäure aufgedeckt, das von Bakterien in der Pseudo-nitzschia-Multiseries-Sulfitobacter-Symbiose synthetisiert wird. Darüber hinaus hat dieser Ansatz die von Wirten und Symbionten abgeleitete Translokation in Korallen 11,27,28,29 aufgeklärt, die ein spannendes Potenzial für die Erhaltung und Wiederherstellung von Korallenriffen3 hat, z. B. durch die Detektion von Biomarkern19. Hier haben wir ein Verfahren für beide Ansätze bereitgestellt, in der Hoffnung, dass dies die Anwendung der Metabolomik für zukünftige Korallenriffuntersuchungen erleichtern und beschleunigen wird.
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Disclosures
Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt offenzulegen.
Acknowledgments
J.L.M. wurde durch ein Forschungsstipendium des UTS-Kanzlers unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100% LC-grade methanol | Merck | 439193 | LC grade essential |
| 2 mL microcentrifuge tubes, PP | Eppendorf | 30121880 | Polypropylene provides high resistance to chemicals, mechanical stress and temperature extremes |
| 2030 Shimadzu gas chromatograph | Shimadzu | GC-2030 | |
| 710-1180 µm acid-washed glass beads | Merck | G1152 |
This size is optimal for breaking the Symbiodiniaceae cells |
| AOC-6000 Plus Multifunctional autosampler | Shimadzu | AOC6000 | |
| Bradford reagent | Merck | B6916 | Any protein colourimetric reagent is acceptable |
| Compressed air gun | Ozito | 6270636 | Similar design acceptable. Having a fitting to fit a 1 mL tip over is critical. |
| DB-5 column with 0.25 mm internal diameter column and 1 µm film thickness | Agilent | 122-5013 | |
| DMF | Merck | RTC000098 | |
| D-Sorbitol-6-13C and/or 13C5–15N Valine | Merck | 605514/ 600148 | Either or both internal standards can be added to the methanol. |
| Flat bottom 96-well plate | Merck | CLS3614 | |
| Glass scintillation vials | Merck | V7130 | 20 mL, with non-plastic seal |
| Immunoglogin G | Merck | 56834 | if not availbe, Bovine Serum Albumin is acceptable |
| Primer | v4 | ||
| R | v4.1.2 | ||
| Shimadzu LabSolutions Insight software | v3.6 | ||
| Sodium Hydroxide | Merck | S5881 | Pellets to make 1 M solution |
| tidyverse | v1.3.1 | R package | |
| TissueLyser LT | Qiagen | 85600 | Or similar |
| TQ8050NX triple quadrupole mass spectrometer | Shimadzu | GCMS-TQ8050 NX | |
| UV-96 well plate | Greiner | M3812 | |
| Whirl-Pak sample bag | Merck | WPB01018WA | Sample collection bag; Size: big enough to house a ~5 cm coral fragment, but not too big that the water is too spread |
References
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