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Biology

Cromatografía de gases-Espectrometría de masas basada en metabolómica dirigida de muestras de coral duro

Published: October 13, 2023 doi: 10.3791/65628
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 2
1Climate Change Cluster (C3), University of Technology Sydney, 2Metabolomics Australia, Bio21 Molecular Science and Biotechnology Institute, The University of Melbourne, 3School of Biological Sciences, Victoria University of Wellington

Summary

Aquí, presentamos la extracción y preparación de metabolitos polares y semipolares de un holobionte de coral, así como tejido huésped de coral separado y fracciones celulares de Symbiodiniaceae, para el análisis de cromatografía de gases-espectrometría de masas.

Abstract

Los enfoques basados en cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS) han demostrado ser poderosos para dilucidar la base metabólica de la simbiosis cnidario-dinoflagelada y cómo responde el coral al estrés (es decir, durante el blanqueamiento inducido por la temperatura). El perfil de metabolitos en estado estacionario del holobionte de coral, que comprende el huésped cnidario y sus microbios asociados (Symbiodiniaceae y otros protistas, bacterias, arqueas, hongos y virus), se ha aplicado con éxito en condiciones ambientales y de estrés para caracterizar el estado metabólico holístico del coral.

Sin embargo, para responder a las preguntas que rodean las interacciones simbióticas, es necesario analizar los perfiles de metabolitos del coral huésped y sus simbiontes de algas de forma independiente, lo que solo puede lograrse mediante la separación física y el aislamiento de los tejidos, seguidos de una extracción y análisis independientes. Si bien la aplicación de la metabolómica es relativamente nueva en el campo de los corales, los esfuerzos sostenidos de los grupos de investigación han dado como resultado el desarrollo de métodos robustos para analizar los metabolitos en los corales, incluida la separación del tejido huésped de coral y los simbiontes de algas.

Este artículo presenta una guía paso a paso para la separación de holobiontes y la extracción de metabolitos para el análisis de GC-MS, incluidos los pasos clave de optimización para su consideración. Demostramos cómo, una vez analizado de forma independiente, el perfil de metabolitos combinados de las dos fracciones (coral y Symbiodiniaceae) es similar al perfil del conjunto (holobionte), pero al separar los tejidos, también podemos obtener información clave sobre el metabolismo y las interacciones entre los dos socios que no se puede obtener del todo por sí solo.

Introduction

Los metabolitos representan los productos finales de los procesos celulares, y la metabolómica -el estudio del conjunto de metabolitos producidos por un organismo o ecosistema determinado- puede proporcionar una medida directa del funcionamiento del organismo. Esto es particularmente crítico para explorar los ecosistemas, las interacciones simbióticas y las herramientas de restauración, ya que el objetivo de la mayoría de las estrategias de manejo es preservar (o restaurar) funciones específicas de los servicios ecosistémicos2. Los arrecifes de coral son un ecosistema acuático que demuestra el valor potencial de la metabolómica para dilucidar las interacciones simbióticas y vincular las respuestas fisiológicas de los corales con los impactos a nivel de la comunidad y del ecosistema3. La aplicación de la cromatografía de gases-espectrometría de masas de alto rendimiento (GC-MS) es especialmente valorada debido a su capacidad para analizar rápidamente una amplia gama de clases de metabolitos simultáneamente con alta selectividad y sensibilidad, proporcionar una rápida identificación de compuestos cuando se dispone de bibliotecas espectrales y proporcionar un alto nivel de reproducibilidad y precisión, con un coste por muestra relativamente bajo.

Los corales son holobiontes formados por el animal coralino, endosimbiontes dinoflagelados fotosintéticos (familia: Symbiodiniaceae4) y un microbioma complejo 5,6. En general, la aptitud del holobionte se mantiene principalmente a través del intercambio de pequeñas moléculas y elementos para apoyar el funcionamiento metabólico de cada miembro 7,8,9,10. Los enfoques metabolómicos han demostrado ser especialmente poderosos para dilucidar la base metabólica de la especificidad de la simbiosis 9,11, la respuesta de blanqueamiento al estrés térmico 7,8,12,13, las respuestas a enfermedades 14, las respuestas a la exposición a la contaminación 15, la fotoaclimatación 16 y la señalización química 17 en corales, así como para ayudar en el descubrimiento de biomarcadores 18,19. Además, la metabolómica puede proporcionar una valiosa confirmación de las conclusiones inferidas a partir de técnicas basadas en ADN y ARN 9,20. Por lo tanto, existe un potencial considerable para el uso de la metabolómica para evaluar la salud de los arrecifes y desarrollar herramientas para la conservación de los arrecifes3, por ejemplo, mediante la detección de biomarcadores metabólicos de estrés18,19 y para examinar el potencial de las estrategias de gestión activa, como los subsidios nutricionales21.

Separar las células huésped y simbionte y analizar sus perfiles de metabolitos de forma independiente, en lugar de juntas como el holobionte, puede proporcionar más información sobre las interacciones de la pareja, los estados fisiológicos y metabólicos independientes y los posibles mecanismos moleculares de adaptación 11,12,22,23,24. Sin separar el coral y las Symbiodiniaceae, es casi imposible dilucidar la contribución y el metabolismo de los corales y/o Symbiodiniaceae de forma independiente, excepto con la reconstrucción compleja del genoma y el modelado metabólico25, pero esto aún no se ha aplicado a la simbiosis coral-dinoflagelado. Además, intentar extraer información sobre el metabolismo individual del huésped o del simbionte de algas a partir del perfil de metabolitos del holobionte puede dar lugar a interpretaciones erróneas.

Por ejemplo, hasta hace poco, se pensaba que la presencia de ácidos grasos poliinsaturados C18:3n-6, C18:4n-3 y C16 en extractos de tejidos de corales y holobiontes se derivaba del simbionte de las algas, ya que se suponía que los corales no poseían las ωx desaturasas esenciales para la producción de ácidos grasos omega-3 (ω3); sin embargo, la evidencia genómica reciente sugiere que múltiples cnidarios tienen la capacidad de producir AGPI ω3 de novo y biosintetizar aún más AGPI26 de cadena larga ω3. La combinación de GC-MS con marcaje isotópico estable (p. ej., 13 C-bicarbonato, NaH 13CO 3) se puede utilizar para rastrear el destino del carbono fijado fotosintéticamente a través de las redes metabólicas de holobiontes de coral tanto en condiciones de control como en respuesta a factores estresantes externos27,28. Sin embargo, un paso crítico en el seguimiento del destino de 13 C es la separación del tejido de coral de las células de algas, solo entonces se puede asignar inequívocamente la presencia de un compuesto marcado con 13C en la fracción huésped del coral como un metabolito derivado de Symbiodiniaceae translocado al coral o un producto aguas abajo de un compuesto marcado translocado. Esta técnica ha demostrado su poder al desafiar la suposición sostenida durante mucho tiempo de que el glicerol es la forma primaria en la que el fotosintato se transloca del simbionte al huésped29, así como al dilucidar cómo cambia el flujo nutricional entre socios durante el blanqueamiento27,28 y en respuesta a especies de Symbiodiniaceae incompatibles11.

Si bien la decisión de separar los tejidos depende principalmente de la pregunta de investigación, es importante tener en cuenta la practicidad, la confiabilidad y los posibles impactos metabólicos de este enfoque. Aquí, proporcionamos métodos detallados y demostrados para la extracción de metabolitos del holobionte, así como de las fracciones separadas del huésped y del simbionte. Comparamos los perfiles de metabolitos del huésped y del simbionte de forma independiente y cómo se comparan estos perfiles con el perfil de metabolitos del holobionte.

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Protocol

NOTA: El diseño experimental, la recolección de muestras y el almacenamiento se han descrito en detalle en otro lugar 2,30,31. La aprobación del permiso para la recolección de corales silvestres debe obtenerse antes de la recolección y experimentación. Las muestras aquí fueron colectadas de colonias de Montipora mollis (color verde-morfo) importadas de Batavia Coral Farms (Geraldton, WA), originalmente recolectadas de un arrecife frente a las Islas Abrohlos (Australia Occidental; 28°52'43.3"S 114°00'17.0"E) a una profundidad de 1 m bajo la Licencia de Acuicultura AQ1643. Antes del muestreo, las colonias se mantuvieron en un acuario de 800 L a 35 PSU, bajo luz azul y blanca a 150 μmol de fotones·m−2·s−1, y a 25 °C ± 0,5 °C durante 3 meses. Los fragmentos de coral (~5cm2, N = 6) se congelaron en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C hasta su procesamiento.

1. Preparación de las soluciones y equipos de extracción

  1. Al menos 1 día antes de la extracción del tejido de coral, prepare las soluciones y el equipo de extracción.
  2. Enfríe previamente agua ultrapura en cristalería limpia y sin detergente a 4 °C.
  3. Mezcle metanol 100% de grado LC con una concentración final de 10 μg·mL−1 de patrón interno apropiado (p. ej., 13C6 sorbitol).
  4. Cree una solución de extracción de metanol al 50 % utilizando la mitad de metanol de grado LC al 100 % y la mitad de agua ultrapura. Almacenar ambas soluciones de metanol a -20 °C.
    NOTA: Para ayudar a prevenir la degradación de los metabolitos, se recomienda realizar los pasos de procesamiento de muestras en lotes de cinco fragmentos de coral a la vez, con un espacio en blanco biológico adicional (solo agua) (muestras totales N = 6). Una vez que cada muestra de coral se ha separado en las dos fracciones (tejido huésped de coral, en adelante "Huésped", y células de microalgas, en adelante "Simbionte"), el número total de muestras en un lote de procesamiento será de 12.

2. Extinción del metabolismo de los corales

NOTA: El diseño experimental, la recolección de muestras y el almacenamiento se han descrito en detalle en otro lugar 2,30,31. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que el tiempo que se tarda en apagar el metabolismo (es decir, el tiempo que transcurre entre la recolección y la preservación de la muestra de coral) es fundamental para capturar la respuesta original30. Conservar la muestra lo antes posible después de la recolección para evitar cambios en la composición del metabolito debido a la degradación de la muestra o a respuestas fisiológicas no objetivo32.

  1. Coloque el fragmento de coral en una bolsa estéril de recolección de muestras y drene el exceso de agua de mar tanto como sea posible. Sumerja la muestra en nitrógeno líquido durante un mínimo de 30 s. Traslade las muestras lo antes posible a un congelador a -80 °C para su almacenamiento.
    NOTA: Las muestras se pueden congelar a -80 °C en recipientes con bloqueo de luz hasta su procesamiento, evitando los ciclos de congelación y descongelación.

3. Eliminación de tejido coralino del esqueleto

NOTA: Las muestras deben mantenerse en hielo (4 °C) en todo momento para garantizar que estén simultáneamente en forma líquida y evitar el metabolismo continuo.

  1. Coloque una bolsa de recolección de muestras limpia y estéril sobre hielo para que la bolsa esté estable y abierta sobre el hielo en un pozo poco profundo, pero no esté sumergida en el hielo. Añadir 10 ml de agua ultrapura fría (4 °C) a la bolsa.
    NOTA: Esto ayudará a evitar la congelación y descongelación repetida del fragmento de coral debido al aire frío presurizado y al hielo circundante.
  2. Seleccione un fragmento de coral con pinzas esterilizadas y enjuague con agua ultrapura fría (4 °C) utilizando una pipeta Pasteur estéril hasta que no queden residuos de agua de mar. Sumerja el fragmento de coral enjuagado en la bolsa que contiene los 10 ml de agua ultrapura.
    NOTA: Este enjuague es fundamental para eliminar cualquier sal residual que interfiera con el análisis posterior. Evite el contacto de las manos con el agua o el fragmento de coral a través de la bolsa para mantener la muestra a 4 °C.
  3. Pegue una punta de pipeta estéril de 1 ml sobre el extremo de una pistola de aire comprimido con cinta aislante, con ~5 mm cortado en el extremo de la punta (Figura 1A).
  4. Apunte la pistola de aire comprimido sobre el fragmento de coral con la bolsa medio sellada y el flujo de aire en bajo-medio para eliminar suavemente el tejido fomentando un movimiento circular del agua sobre el fragmento de coral.
  5. Después de ~ 3 minutos, o cuando parezca que se ha eliminado todo el tejido del esqueleto, apague el aire y retire el aerógrafo. Selle completamente la bolsa.
  6. Apriete todo el tejido de coral extraído en una esquina inferior de la bolsa. Corta la esquina opuesta y vierte suavemente el contenido de la bolsa en un tubo de 15 ml con hielo.

4. Homogeneización opcional

NOTA: Algunas especies de coral son más viscosas que otras, lo que significa que el aerógrafo eliminará el tejido en grupos en lugar de en una suspensión. Si se observan grumos de tejido en el homogeneizado con aerógrafo, se puede añadir un paso de homogeneización a 4 °C para todas las muestras.

  1. Limpie un homogeneizador mecánico de dientes de sierra dos veces con metanol al 70% a 4 °C y finalmente con agua ultrapura a 4 °C.
  2. Homogeneizar la muestra de coral en un tubo de 15 ml durante ~1 min hasta que la muestra esté completamente homogeneizada y no se vean grumos.
  3. Limpie el homogeneizador como en el paso 4.1 entre cada muestra. Mantenga el tiempo de homogeneización constante en todas las muestras.

5. Recogida de muestras para la normalización

  1. Recolectar una alícuota de 1,000 μL del tejido homogeneizado para los recuentos celulares de Symbiodiniaceae, el análisis del contenido de proteínas del tejido huésped de coral y la estimación de clorofila. Conservar a -20 °C hasta que esté listo para analizar (sección 10).

6. Separación opcional del tejido huésped del coral-células Symbiodiniaceae

  1. Centrifugar el homogeneizado de coral a 2.500 × g durante 5 min a 4 °C utilizando una centrífuga refrigerada.
    NOTA: Esta velocidad es óptima para separar las células Symbiodiniaceae más pesadas, manteniendo intactas sus paredes celulares, del tejido huésped, que está suspendido en el sobrenadante.
  2. Retire el sobrenadante que contiene el material huésped y colóquelo en un nuevo tubo de 15 ml.
    NOTA: Los lípidos del tejido huésped suelen formar una estrecha capa rosa/blanca en la parte superior de las células simbiontes. Esta capa se puede recolectar junto con el sobrenadante huésped soluble mediante pipeteo (Figura 1B).
  3. Vórtice vigorosamente el huésped durante exactamente 1 minuto. Mantenga la muestra de gránulos de algas y la muestra del sobrenadante en hielo.
  4. Añadir 2 ml de agua ultrapura a 4 °C al gránulo de algas. Vórtice vigorosamente durante exactamente 2 minutos para resuspender el pellet.
    NOTA: Si no se recolectaron fragmentos individuales de 1 cm de la colonia de coral para el genotipado de Symbiodinaiceae, se puede recolectar aquí una alícuota de 200 μL de la suspensión celular de Symbiodinaiceae, conservarla en la solución tampón de ADN preferida y almacenarla como se describe en Thurber et al.30 para el genotipado de Symbiodiniaceae (por ejemplo, según González-Pech et al.12).
  5. Repita los pasos 6.1 a 6.4 una vez más.
    NOTA: La separación fiable del huésped y el simbionte depende de la biomasa y la especie de coral, ya que algunas especies pueden ser más viscosas que otras. Se recomienda un mínimo de tres pasos de lavado, pero esto se puede aumentar dependiendo del éxito de la separación. Repita los pasos de lavado 4.7-4.9 hasta que no se puedan ver células de Symbiodiniaceae en la parte inferior de la fracción del huésped y hasta que la fracción de Symbiodiniaceae esté visiblemente libre de material del huésped (p. ej., sin capa blanca en la parte superior) (Figura 1).
  6. Retire el sobrenadante que contiene el material huésped y colóquelo en un nuevo tubo de 15 ml.
  7. Retenga el gránulo de simbionte en el tubo de 15 ml.

7. Secado de muestras

  1. Congelar el homogeneizado holobionte o las fracciones separadas del huésped y de Symbiodiniaceae, a -80 °C durante ~120 min. Liofilizar las muestras durante la noche con un vacío de 0,01 mbar a -85 °C.
    NOTA: Para evitar la pérdida de muestras durante la liofilización, se recomienda utilizar una tapa cortada de otro tubo estéril, o parafilm estéril, con un orificio de ~2 mm perforado cuidadosamente con una aguja estéril de 25 G.
  2. Cuando esté seco, usando una balanza de laboratorio, pese uno de los siguientes: 1) 25 mg del holobionte; 2) 15 mg de la fracción simbionte; o 3) 30 mg del tejido huésped de cada muestra en tubos de microcentrífuga separados de 2 ml sin plastificante.
    NOTA: Paso crítico: La optimización de la biomasa para la extracción es esencial para garantizar que el GC-MS no se sobrecargue y al mismo tiempo garantizar una señal suficiente. El material de coral seco es muy estático. Para evitar la pérdida de muestras, utilice dispositivos antiestáticos para eliminar las cargas electrostáticas de las muestras y los recipientes de pesaje. Una alternativa simple y rentable es colocar una toallita para secadora de ropa debajo del tubo de muestra. El gránulo de simbionte seco se puede cortar al peso deseado con una cuchilla estéril.

8. Extracciones intracelulares de metabolitos

  1. Extracción intracelular de metabolitos a partir de holobionte liofilizado:
    1. Añadir 400 μL de metanol 100% frío (−20 °C) con patrón/es interno/s (IS; 13C6 sorbitol y/o 13C5-15 N valina, a 10μM) a cada tubo.
    2. Agregue una pequeña cantidad de perlas de vidrio lavadas con ácido de 710-1,180 μm (~ 10 mg) a cada muestra. Colocar en un molino de bolas a 50 Hz durante 3 min en un inserto de molino de bolas preenfriado (−20 °C).
    3. Añadir 600 μL adicionales de metanol 100% frío (−20 °C) con ISs (13 C6 sorbitol y/o 13C 5-15 N valina, a 10μM) a cada tubo.
    4. Vórtice para mezclar durante 1 min. Colocar en una coctelera a 4 °C durante 30 min.
  2. Extracción intracelular de metabolitos de células Symbiodiniaceae liofilizadas separadas:
    1. Añadir 200 μL de metanol 100% frío (−20 °C) con ISs (13 C6 sorbitol y/o 13C 5-15 N valina, a 10μM) al material seco de Symbiodiniaceae.
    2. Agregue una pequeña cantidad de perlas de vidrio lavadas con ácido de 710-1,180 μm (~ 10 mg). Colocar en un molino de bolas a 50 Hz durante 3 min en un inserto de molino de bolas preenfriado (−20 °C).
    3. Añadir otros 800 μL de metanol 100% frío (−20 °C) con IS y vórtice durante 30 s.
  3. Extracción intracelular de metabolitos del tejido liofilizado separado del huésped:
    1. Añadir 1 mL de metanol de grado LC 100% frío (−20 °C) que contiene IS (13 C6 sorbitol y/o 13C 5-15 N valina, a 10μM) al material huésped seco.
    2. Vórtice para mezclar durante 20 s. Colocar en un soporte de tubo flotante en un baño de sonicación a 4 °C durante 30 min.

9. Purificación del extracto de metabolitos

  1. Centrifugar las muestras (holobionte/huésped/simbionte) a 3.000 × g durante 30 min a 4 °C.
  2. Transfiera todo el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga de 2 ml, teniendo cuidado de no alterar el gránulo de restos celulares.
    NOTA: Estos son los extractos semipolares. Estos pueden mantenerse en hielo temporalmente, pero almacenarse a largo plazo a -80 °C en la oscuridad.
  3. A los restos celulares restantes, añadir 1.000 μL de metanol frío al 50% (-20 °C). Vórtice vigorosamente durante 1 minuto para volver a suspender.
  4. Centrifugar las muestras a 3.000 × g durante 30 min a 4 °C.
  5. Recoja y agrupe el sobrenadante (extractos polares) con los extractos semipolares de la misma muestra.
    NOTA: Los restos celulares pueden almacenarse a -80 °C y utilizarse para la normalización del contenido de proteínas (sección 11).
  6. Centrifugar los extractos agrupados a 16.100 g durante 15 min para eliminar todos los precipitados y trasladar el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga sin plastificante (2 mL).
    NOTA: Los extractos de muestra pueden almacenarse a -80 °C en la oscuridad.
  7. Cuando esté listo para analizar, alícuota 50 μL de cada extracto en un inserto de vidrio. Concentrar durante 30 min a 30 °C con un concentrador de vacío. Repita cuatro veces más (para 250 μL de extracto seco total).
    NOTA: Las muestras secas se pueden almacenar a temperatura ambiente en condiciones desecantes hasta el análisis.

10. Derivatización de metabolitos

NOTA: Se utiliza un proceso de derivatización en línea de dos pasos para la metoximación y trimetisililación de los metabolitos polares.

  1. Añadir 25 μL de clorhidrato de metoxiamina (30 mg/mL en piridina) a cada muestra.
  2. Agitar a 37 °C en un agitador orbital ajustado a 750 rpm durante 2 h.
  3. Añadir 25 μL de N,O-bis (trimetilsilil)trifluoroacetamida + trimeticlorosilano a cada muestra.
  4. Agitar de nuevo a 37 °C y 750 rpm durante 1 h.
  5. Deje que las muestras se equilibren a temperatura ambiente durante 1 h antes de inyectar 1 μL en una proporción de división de 1:10 en el GC.

11. Análisis de cromatografía de gases-espectrometría de masas

NOTA: El espectrómetro de masas debe ajustarse de acuerdo con las recomendaciones del fabricante utilizando tris-(perfluorobutil)-amina (CF43).

  1. Utilice helio de ultra alta pureza como gas portador a un caudal de columna constante de 1 mL/min.
  2. Utilice una columna DB-5 de 30 m con un espesor de película de 1 μm y un diámetro interno de 0,25 mm.
  3. Programa de hornos GC
    1. Ajuste la temperatura de entrada a 280 °C.
    2. Comience con la inyección a una temperatura del horno de 100 °C y manténgala durante 4 min.
    3. Aumente la temperatura en 10 °C/min hasta 320 °C y manténgala durante 11 min.
  4. Parámetros del espectrómetro de masas
    1. Ajuste la línea de transferencia MS a 280 °C y ajuste la fuente de iones a 200 °C.
    2. Utilice argón como gas de celda de colisión para generar el ion producto de monitoreo de reacción múltiple (MRM).
    3. Logre la detección de metabolitos en relación con una biblioteca MRM segmentada en el tiempo que contiene objetivos MRM.

12. Recuentos de células simbiodiniáceas, análisis del contenido de proteínas del tejido huésped de coral y estimación de clorofila

  1. Recuentos de células de Symbiodiniaceae:
    1. Tome una alícuota del homogeneizado del tejido coralino.
    2. Centrifugar las muestras a 2.000 × g para granular las algas.
    3. Retire el sobrenadante de ~ 200 μL del gránulo de algas y colóquelo en un nuevo tubo de microcentrífuga.
      NOTA: Esta será la muestra de proteína que se utilizará para normalizar los datos; guárdelo a -20 °C antes de analizarlo, si es necesario.
    4. Vuelva a suspender el gránulo de algas en 1 ml de agua de mar filtrada pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo. Si es necesario, diluya la suspensión de algas para facilitar el recuento de células.
    5. Realice un recuento de células con un hemocitómetro bajo un microscopio óptico añadiendo 10 μL a una de las cámaras. Complete de 8 a 10 recuentos por muestra.
      NOTA: También se pueden aplicar métodos alternativos para contar las células de algas cuando estén disponibles (p. ej., citometría de flujo, microscopía confocal de alto rendimiento).
    6. Calcular la concentración de las células simbiontes (mL−1), teniendo en cuenta los factores de dilución utilizados.
  2. Determinación del contenido de proteínas
    1. Cuantificar el contenido de proteínas de la muestra (por ejemplo, a través del ensayo colorimétrico de Bradford, descrito inicialmente por Bradford et al.33, o el ensayo de Lowry34,35, cuyo protocolo se ha descrito para cnidarios en otros lugares 36).
  3. Extracción de clorofila a
    1. Use un gránulo de celda de ~ 200, 000 celdas, congeladas o frescas.
    2. Transfiera cada gránulo de algas a 2 ml de dimetilformamida (DMF) en un vial de centelleo de vidrio e incube en la oscuridad a 4 °C durante 48 h.
      NOTA: El DMF es tóxico y cancerígeno, por lo que la preparación de la muestra debe completarse bajo una campana extractora lo más oscura posible y con hielo. Si hay <200.000 células, use menos DMF.
    3. Centrifugar durante 3 min a 16.000 × g.
    4. Transfiera 200 ml a una placa de pocillos UV-96 para realizar mediciones fotométricas. Ejecute cada muestra por triplicado con DMF como pieza en bruto.
    5. Mida la absorbancia en longitudes de onda (E) 663,8 nm, 646 nm y 750 nm. Reste la absorbancia a 750 nm de la absorbancia en las otras dos longitudes de onda.
      NOTA: La medición a 750 nm corrige cualquier dispersión o turbidez en la muestra.
    6. Calcular la concentración de clorofila a (μg/mL) utilizando la ecuación (1):
      Concentración de Chl a (μg/mL) = (12,00 × E 663,8) - (3,11 × E646,8) (1)

13. Cuantificación de la biomasa celular tras extracciones de metabolitos para su normalización

NOTA: Existen dos opciones para la cuantificación de la biomasa celular que se describen a continuación: la cuantificación de la proteína relacionada con la biomasa utilizando un método colorimétrico de Bradford modificado y la medición del peso seco de los restos celulares. Cualquiera de los dos métodos es apropiado, ya que ambos ofrecen una cuantificación precisa de la biomasa celular.

  1. Contenido proteico de los restos celulares
    1. Resuspender los restos celulares congelados con 1 mL de NaOH 0,2 M e incubar las muestras a 98 °C durante 20 min.
    2. Enfríe las muestras en hielo durante ~ 10 minutos y centrifugue a 3.000 × g durante 5 minutos a temperatura ambiente.
    3. Cuantificar el contenido de proteína de la muestra (p. ej., a través del ensayo colorimétrico de Bradford, descrito inicialmente por Bradford et al.33 y modificado por Smart et al.37).
  2. Medición del peso seco de los restos de la célula
    1. Resuspender los restos celulares de la extracción de metabolitos intracelulares en agua bidestilada (~10 mL).
    2. Filtrar la solución al vacío utilizando un filtro de membrana prepesado (poro de 0,22 μm, 47 mm).
    3. Lave los tubos que contienen biomasa dos veces con agua ultrapura para asegurar la transferencia completa de biomasa al filtro de membrana.
    4. Retire el filtro de membrana que contiene la biomasa y séquelo con un horno microondas (baja potencia; ~250 W durante 20 min).
    5. Guarde el papel de filtro en un desecador durante la noche. Registre el peso seco del papel de filtro y calcule el peso seco de la biomasa restando el peso del filtro de membrana seca (utilizando un filtro de membrana seca limpio secado junto con el filtro de muestra) del peso total.

14. Análisis de datos

  1. Analice las dianas de metabolitos utilizando bases de datos de metabolitos en las que cada diana se compone de un MRM cuantificador y calificador.
  2. Inspeccione visualmente los objetivos de metabolitos detectados e intégrelos manualmente según sea necesario.
  3. Utilice un área de pico de metabolito para calcular la abundancia relativa de cada muestra para cada grupo. Los valores se corrigen en blanco y se normalizan para muestrear el área de pico estándar interno y luego para muestrear el contenido de proteína de desechos celulares según Smart et al.37.
  4. Descartar metabolitos con una desviación estándar relativa superior al 35% en todos los grupos de tratamiento (N = 23 metabolitos).
  5. Transforme los datos (por ejemplo, la raíz cúbica) y céntrelos en el medio; confirman una distribución normal y homogeneidad de la varianza.
  6. Realizar el análisis de datos (ANOVA y construcción de mapas de calor; por ejemplo, utilizando https://www.metaboanalyst.ca)38. Agrupe las muestras para examinar la variabilidad dentro del tratamiento utilizando los paquetes "cluster", "factoextra" y "klustR". Calcule el estadístico gap (un método para determinar el número óptimo de clústeres39) utilizando la función "clusGap" en R y grafique utilizando el paquete de R "tidyverse". Realizar PERMANOVAs para examinar la importancia en la separación entre los perfiles de metabolitos del tratamiento (por ejemplo, en Primer).

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Representative Results

Todos los datos producidos durante este trabajo están disponibles en la información complementaria.

Separación huésped-simbionte

Figure 1
Figura 1: Configuración y validación de la separación de los tejidos del huésped de coral y las células de Symbiodiniaceae. (A) La configuración de la pistola de aire comprimido para la eliminación de tejido de coral del esqueleto de coral. Se fija una punta de pipeta a la pistola de aire comprimido con cinta aislante y se corta una pequeña sección (~5 mm) de la punta para permitir que escape más aire sin desprenderla. (B) Ejemplos del holobionte y el tejido huésped separado (sobrenadante) y las células de Symbiodiniaceae (pellet). El valor representa el número de pasos de centrifugación. La flecha apunta a la estrecha capa lipídica del huésped en la parte superior del gránulo del simbionte que se puede recolectar y combinar con la fracción del huésped. (C-E) Imágenes de microscopía de campo claro (arriba) y autofluorescencia de clorofila (abajo) de una alícuota del (C) holobionte con tejido huésped y células simbiontes, (D) la fracción huésped sin células simbiontes verificada por la ausencia de autofluorescencia de clorofila, y (E) células simbiontes intactas, lo que demuestra la eliminación del tejido huésped. Barras de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La visualización microscópica no mostró células de Symbiodiniaceae en las muestras de tejido huésped después de los tres pasos de lavado (Figura 1D). Del mismo modo, la presencia de tejido huésped en las fracciones simbiontes fue mínima (Figura 1E). Sin embargo, el homogeneizado de holobiontes (Figura 1C) mostró que las simbiodiáceas intracelulares pueden no haber sido liberadas adecuadamente de sus simbiosomas mediante un simple aerógrafo y, por lo tanto, no se han lisado lo suficiente durante la homogeneización mecánica (sección 4 del protocolo) o la extracción con disolventes (sección 8 del protocolo) en comparación con la separación centrífuga (Figura 1E). Esta limitación podría explicar parte de la gran variación dentro del grupo entre las muestras de holobiontes y las observaciones específicas en los perfiles de holobiontes. Por ejemplo, dos metabolitos (ácido glicólico y 1-hexadecanol) fueron significativamente más abundantes en el holobionte frente al simbionte, pero no en el huésped frente al simbionte; Esto puede haber sido el resultado de la gran variación dentro del grupo en la abundancia relativa de estos metabolitos en los perfiles de holobiontes. En particular, la muestra holobionte 3 tenía concentraciones relativamente más altas de ácido dodecanoico, ácido glicólico y 1-hexdecanol que cualquiera de las muestras de simbionte o huésped individualmente. A medida que los datos del área de pico del metabolito se normalizan al contenido de proteínas de la muestra, si las células simbiontes no se limpiaron lo suficiente del tejido huésped, entonces el contenido de proteína holobionte puede haber sido subestimado, lo que influyó en la normalización de la biomasa y condujo al cálculo de una mayor abundancia de metabolitos en relación con la biomasa en esta muestra. Esto pone aún más de relieve el potencial de una mayor variación en la metabolómica de los holobiontes.

Análisis del perfil de metabolitos
La elección del modo de espectrómetro de masas depende del análisis que se esté realizando. Para el perfil de metabolitos en estado estacionario, una metodología dirigida integral que utiliza un QqQ-MS en modo MRM permite una mejor detección e identificación de metabolitos debido a la eliminación del ruido de fondo que pueden generar altas concentraciones biológicas de sal. Para los enfoques de marcaje de isótopos estables, un espectrómetro de masas (es decir, cuadrupolo simple, cuadrupolo triple [QqQ], tiempo de vuelo del cuadrupolo [QTOF]) que funciona en modo de escaneo permite la detección de isótopos de masas que indican patrones de enriquecimiento isotópico estables.

El análisis de GC-MS dirigido se completó utilizando la base de datos de metabolitos inteligentes de Shimadzu (v3; que cubre aproximadamente 350 metabolitos endógenos y múltiples patrones internos estables marcados isotópicamente) y el software Shimadzu LabSolutions Insight. En todos los tratamientos, se identificaron 107 metabolitos anotados, incluyendo un conjunto de aminoácidos, ácidos orgánicos, carbohidratos, ácidos grasos y esteroles (Tabla suplementaria S1). Los pares de iones cualitativos y cuantitativos se proporcionan en la Tabla Suplementaria S2. El agrupamiento de Kmeans identificó tres grupos distintos de muestras (verificados mediante una prueba de estadística de brecha), con todas las muestras en grupos separados y distintos; los simbiontes estaban en el Cluster 1, el huésped en el Cluster 2 y las muestras de holobiontes en el Cluster 3 (Figura 2).

Figure 2
Figura 2: Análisis de conglomerados Kmeans de los perfiles de metabolitos . (A) Los perfiles de metabolitos de la muestra se agruparon por distancia euclidiana por el número óptimo de conglomerados (N = 3), que se verificó mediante un cálculo estadístico de brecha. (B) Visualización de coordenadas paralelas de la abundancia relativa media del metabolito (línea, coloreada según el clúster) y el intervalo de confianza (sombreado, coloreado según el clúster) para cada grupo (rojo = Clúster 1, verde = Clúster 2, azul = Clúster 3). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Comparación del perfil de metabolitos del huésped y del simbionte
Los perfiles de hospedero y simbionte fueron significativamente distintos entre sí (PERMANOVA, t = 16.909, p < .001; Tabla suplementaria S3), con 100 metabolitos individuales significativamente diferentes entre las fracciones huésped y simbionte (ANOVA, FDR < .05; Figura 3 y Cuadro complementario S1). De estos, 13 metabolitos fueron significativamente más abundantes en el simbionte que en los extractos del huésped, incluyendo los eicosanoides ácido docosahexaenoico (C22:6[ω-6]; DHA), ácido eicosapentaenoico (C20:5[ω-6]; EPA) y ácido araquidónico (C20:4[ω-6]; ARA) (ANOVA, FDR < 0,05; Figura 3 y Cuadro complementario S1). Un total de 87 metabolitos fueron menos abundantes en el simbionte que en los extractos del huésped (ANOVA, FDR < 0,05; Figura 3 y Cuadro complementario S1).

Figure 3
Figura 3: Visualización del mapa de calor de las abundancias relativas de metabolitos con los resultados del análisis post-hoc de las comparaciones de grupos. Las muestras de hospedador, simbionte y holobionte (N = 5 por grupo) se agruparon jerárquicamente a través del enlace de Ward, y los metabolitos se agruparon de acuerdo con la medida de distancia euclidiana. Los cuadrados coloreados indican diferencias significativas en las comparaciones de grupos detectadas a través de ANOVA con HSD post hoc de Tukey (Tabla Suplementaria S1). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Perfiles de metabolitos holobiontes comparados con perfiles separados de hospedadores y simbiontes
Los perfiles de metabolitos de holobiontes demostraron una gran variabilidad dentro del grupo, corroborada por la gran separación de muestras en el grupo de holobiontes en el análisis de Kmeans; específicamente, la Muestra 3 y la Muestra 4 se separaron a lo largo de la dimensión 2 de la Muestra 1, la Muestra 2 y la Muestra 5 (Figura 2A). Las muestras de holobiontes fueron intermedias entre las fracciones separadas del huésped y del simbionte (Figura 2A). Mientras que las distribuciones de conglomerados Kmeans (Figura 2A), las coordenadas paralelas (Figura 2B) y la visualización del mapa de calor de la abundancia relativa del metabolito (Figura 3), indicaron que el perfil de holobiontes coincidía más estrechamente con el perfil de la fracción del huésped, el perfil del holobionte difería significativamente tanto del huésped (PERMANOVA, t = 3,47, p < 0,001; Cuadro complementario S3) y perfiles simbiontes (PERMANOVA, t = 11,29, p < 0,001; Cuadro complementario S3). A nivel de metabolito individual, 66 y 82 metabolitos en el holobionte fueron significativamente diferentes a los perfiles de huésped y simbionte, respectivamente (ANOVA, FDR < 0.05, Tabla Suplementaria S1). De estos, 54 (81,8%) de los 66 metabolitos significativos tenían una abundancia relativa significativamente mayor en el huésped que la fracción holobionte, y 78 (95%) tenían una abundancia relativa significativamente mayor en la fracción holobionte que en la fracción simbionte; cuatro fueron más abundantes en las fracciones simbiontes, incluyendo DHA, glicerol-3-fosfato, fosfato de inositol y ácido fosfórico (Figura 3). Ocho metabolitos (incluidos dos ácidos grasos [ácidos linoleico (C18:1) y mirístico (C14:0)], cinco ácidos dicarboxílicos y el aminoácido guanina) fueron significativamente diferentes en abundancia entre el huésped y el simbionte, pero no cuando se compararon con la fracción holobionte (Figura 3).

Tabla suplementaria S1: La abundancia relativa de cada metabolito identificada mediante el análisis GC-MS en el holobionte y separó al huésped y al simbionte. Los valores son la media ± el error estándar, y los resultados de ANOVA proporcionados, incluido el análisis post hoc, se indican mediante las celdas coloreadas (columnas K, L y M). Haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla suplementaria S2: Pares de iones cualitativos y cuantitativos para los metabolitos identificados. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla complementaria S3: Resultados de PERMANOVA. Haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

La separación del huésped y el simbionte se puede lograr fácil y rápidamente a través de una simple centrifugación, y los resultados aquí muestran que la separación de las fracciones puede proporcionar información valiosa indicativa de contribuciones específicas de miembros holobiontes, que pueden contribuir al análisis funcional de la salud de los corales. En los corales adultos, la síntesis de lípidos es realizada principalmente por el simbionte de algas residente 40, que suministra lípidos (por ejemplo, triacilglicerol y fosfolípidos)41 y ácidos grasos que pueden promover la recuperación del estrés 11,42. De los 13 metabolitos que fueron más abundantes en los perfiles simbionte versus huésped en este trabajo, 9 fueron ácidos grasos, incluyendo los eicosanoides biológicamente relevantes DHA (C22:6[ω-6]), EPA (C20:5[ω-6]) y ARA (C20:4[ω-6]), que están implicados en la señalización de estrés interreino en la simbiosis coral-Symbiodiniaceae 9,10. El fosfato de inositol desempeña un papel crucial en diversas funciones celulares, como el crecimiento celular, la apoptosis, la endocitosis y la diferenciación celular. Se ha encontrado con frecuencia que las abundancias relativas de isoformas y derivados de inositol cambian durante la disfunción de la simbiosis 7,11,27,28, aunque el papel de estas isoformas y sus derivados en la simbiosis coral-Symbiodiniaceae sigue sin estar claro. Por lo tanto, la clara diferencia en la abundancia relativa entre los perfiles de hospedador y simbionte ayuda a contribuir a este conocimiento.

Muchos estudios han utilizado perfiles de metabolitos holobiontes para investigar las interacciones metabólicas y el rendimiento de los corales en condiciones ambientales y de estrés 13,43,44,45. Aquí, mostramos que el análisis del homogeneato de holobiontes puede dar lugar a una gran variabilidad dentro del tratamiento, y los perfiles resultantes pueden enmascarar patrones de abundancia específicos del huésped y/o simbionte y las contribuciones metabólicas al metaboloma general del holobionte. Por ejemplo, de los 13 metabolitos que fueron significativamente más abundantes en el simbionte en relación con la fracción del huésped, solo 4 fueron significativamente más abundantes en el simbionte en relación con el holobionte. Estos incluyeron el fosfato de DHA e inositol 7,9,10,11,27,28, potencialmente relevantes desde el punto de vista biológico; sin embargo, las claras diferencias observadas en los eicosanoides de señalización de estrés EPA y ARA entre el huésped y el simbionte no fueron significativas en las muestras de holobionte frente a simbionte. Estos metabolitos están siendo cada vez más reconocidos como metabolitos importantes en el lenguaje molecular de la simbiosis y como indicadores de las respuestas al estrés10, pero el examen de los perfiles de holobiontes por sí solo no revelaría los cambios distintivos en las proporciones de abundancia relativa de estos metabolitos en miembros específicos del holobionte. Por lo tanto, el análisis del holobionte puede enmascarar las diferencias que de otro modo serían evidentes cuando el huésped y el simbionte se analizan por separado, y estas diferencias podrían no detectarse como significativas en estudios que comparan tratamientos abióticos o bióticos utilizando únicamente perfiles de holobiontes. Esto podría dificultar la inferencia de contribuciones o funciones específicas de la pareja 7,8,9,11,12,22,28, particularmente cuando se intenta responder a preguntas biológicas para las cuales las interacciones simbióticas subyacen al fenotipo holobionte observado 46,47.

Una metodología alternativa sería separar los tejidos del huésped y las células simbiontes, tomar una alícuota del homogeneizado o un extracto de cada fracción para recombinarlo antes de la extracción, y analizarlo junto con las fracciones separadas; Este método aseguraría la liberación de simbiontes de los tejidos del huésped, pero aumentaría el potencial de error humano y/o pérdida de metabolitos48. Puede ser posible analizar las fracciones por separado e integrar los datos después del análisis, pero los cálculos tendrían que tener en cuenta la proporción de células simbiontes y huésped en el holobionte de coral original.

Si bien se puede obtener más información separando las fracciones del huésped y del simbionte para el análisis de metabolitos, especialmente en términos de las contribuciones de los miembros individuales al metabolismo y la función del holobionte, la separación del huésped y el simbionte en lugar de analizar el holobionte es, en última instancia, una decisión regida por la pregunta de investigación. Por ejemplo, el análisis del perfil de metabolitos del holobionte es relevante cuando se toman otras mediciones fisiológicas con el holobionte (por ejemplo, el análisis de las emisiones de metabolitos volátiles de las colonias de coral 49,50,51) y cuando los perfiles metabolómicos deben integrarse con conjuntos de datos de holobiontes. Además, la separación del huésped y el simbionte no está exenta de limitaciones; Por ejemplo, los pasos de manipulación adicionales podrían interferir con la estabilidad de los metabolitos y dar lugar a la pérdida de datos o a efectos de confusión48.

Además, hay pasos de optimización adicionales involucrados en el procedimiento de separación huésped-simbionte: 1) optimizar el número de lavados para la especie específica de coral; y 2) identificar la biomasa óptima a extraer de ambas fracciones para el análisis de GC-MS. Ambos pasos deben incluirse antes de que pueda comenzar el procesamiento final de la muestra, lo que aumenta los requisitos analíticos y de consumibles para el material, el tiempo y los costos. En este trabajo, la pérdida de metabolitos del huésped y las extracciones de simbiontes debido a los pasos adicionales pueden haber contribuido a las mayores abundancias relativas de algunos metabolitos observados en el holobionte en relación con el huésped o el simbionte, como el ácido glicólico, el 1-hexadecanol y el ácido dodecanoico. Sin embargo, la gran variación dentro del grupo en el grupo holobionte para estos metabolitos es, como se mencionó, una razón alternativa para estos patrones observados.

La aplicación de enfoques metabolómicos, aunque relativamente nueva, ha tenido un profundo impacto en nuestra capacidad para dilucidar la función de simbiosis específicas. Por ejemplo, este enfoque ha revelado la contribución de la hormona promotora del crecimiento del fitoplancton, el ácido indol-3 acético, que es sintetizado por bacterias en la simbiosis Pseudo-nitzschia multiseries-Sulfitobacter. Además, este enfoque ha dilucidado la translocación derivada del huésped y del simbionte en los corales 11,27,28,29, que tiene un potencial emocionante para la conservación y restauración de los arrecifes de coral 3, por ejemplo, a través de la detección de biomarcadores 19. Aquí, hemos proporcionado un procedimiento para ambos enfoques con la esperanza de que esto facilite y acelere la aplicación de la metabolómica para futuras investigaciones de arrecifes de coral.

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Disclosures

Los autores no tienen ningún conflicto de intereses que revelar.

Acknowledgments

J.L.M. recibió el apoyo de una beca de investigación del rector de UTS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100% LC-grade methanol Merck 439193 LC grade essential
2 mL microcentrifuge tubes, PP Eppendorf 30121880 Polypropylene provides high resistance to chemicals, mechanical stress and temperature extremes
2030 Shimadzu gas chromatograph Shimadzu GC-2030
710-1180 µm acid-washed glass beads Merck
G1152		 This size is optimal for breaking the Symbiodiniaceae cells
AOC-6000 Plus Multifunctional autosampler Shimadzu AOC6000
Bradford reagent Merck B6916 Any protein colourimetric reagent is acceptable
Compressed air gun Ozito 6270636 Similar design acceptable. Having a fitting to fit a 1 mL tip over is critical.
 DB-5 column with 0.25 mm internal diameter column and 1 µm film thickness Agilent 122-5013
DMF Merck RTC000098
D-Sorbitol-6-13C and/or 13C5–15N Valine Merck 605514/ 600148 Either or both internal standards can be added to the methanol.
Flat bottom 96-well plate Merck CLS3614
Glass scintillation vials Merck V7130 20 mL, with non-plastic seal
Immunoglogin G Merck 56834 if not availbe, Bovine Serum Albumin is acceptable
Primer v4
R v4.1.2
Shimadzu LabSolutions Insight software v3.6
Sodium Hydroxide Merck S5881 Pellets to make 1 M solution
tidyverse v1.3.1 R package
TissueLyser LT Qiagen 85600 Or similar
TQ8050NX triple quadrupole mass spectrometer Shimadzu GCMS-TQ8050 NX
UV-96 well plate Greiner M3812
Whirl-Pak sample bag Merck WPB01018WA Sample collection bag; Size: big enough to house a ~5 cm coral fragment, but not too big that the water is too spread

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