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Biology

우울한 Scleractinian 산호, Pocillopora acuta의 먹이 및 Ex Situ 배양을 위한 효과적인 기술

Published: June 23, 2023 doi: 10.3791/65395
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1,2
1Department of Planning and Research, National Museum of Marine Biology & Aquarium, 2Department of Marine Biotechnology and Resources, National Sun Yat-sen University

Summary

기후 변화는 전 세계적으로 산호초 생태계에 영향을 미치고 있습니다. 현장 양식 시스템에서 공급되는 산호는 복원 및 연구 노력을 지원하는 데 도움이 될 수 있습니다. 여기에서, 부 화하는 경피성 산호의 장기적인 유지를 현장에서 촉진하는 데 사용될 수 있는 먹이 및 산호 배양 기술이 요약되어 있습니다.

Abstract

기후 변화는 전 세계적으로 산호의 생존, 성장 및 모집에 영향을 미치고 있으며, 향후 수십 년 동안 산호초 생태계에서 산호의 풍부함과 군집 구성에 큰 변화가 있을 것으로 예상됩니다. 이러한 산호초 황폐화에 대한 인식은 다양한 새로운 연구 및 복원 기반 적극적인 개입을 촉발했습니다. Ex situ 양식업은 강력한 산호 배양 프로토콜(예: 장기 실험에서 건강 및 번식 개선)의 수립과 일관된 육추 공급(예: 복원 프로젝트에 사용)을 통해 지원 역할을 할 수 있습니다. 여기에서는 잘 연구된 흔한 산호인 Pocillopora acuta를 예로 들어 알을 낳는 경피성 산호의 먹이 주기 및 현장 배양을 위한 간단한 기술을 간략하게 설명합니다. 이 접근법을 입증하기 위해 산호 군락을 서로 다른 온도(24°C 대 28°C)와 먹이 처리(먹이 대 먹이지 않음)에 노출시켰고, 번식 생산량과 타이밍, 그리고 두 온도 모두에서 산호에 아르테미아 나우플리를 먹이는 타당성을 비교했습니다. 번식 생산량은 군체에 걸쳐 높은 변동을 보였으며 온도 처리 간에 관찰된 다른 경향을 보였습니다. 24°C에서 먹이를 먹은 군집은 먹이를 먹지 않은 군체보다 더 많은 유충을 생산했지만 28°C에서 배양된 군체에서는 그 반대가 발견되었습니다. 모든 군체는 보름달 이전에 번식했으며, 번식 시기의 차이는 28°C 처리에서 먹이를 먹지 않은 군체와 24°C 처리에서 먹이를 먹은 군체 사이에서만 발견되었습니다(평균 번식 ± 표준 편차: 각각 6.5 ± 2.5 및 11.1 ± 2.6). 산호 군락은 두 처리 온도 모두에서 Artemia nauplii를 효율적으로 먹었습니다. 이러한 제안된 먹이 및 배양 기술은 산호 스트레스의 감소와 비용 효율적이고 맞춤형 방식으로 생식 수명을 촉진하는 데 중점을 두고 있으며, 유동 및 재순환 양식 시스템 모두에 다양한 적용 가능성이 있습니다.

Introduction

전 세계적으로 많은 산호초 생태계가 기후 변화로 인한 고온 스트레스의 결과로 손실되고 악화되고 있습니다 1,2. 산호 백화 현상(즉, 산호-조류 공생의 붕괴3)은 과거에는 비교적 드문 것으로 여겨졌으나,4 현재는 더 빈번하게 발생하고 있다.5 매년 백화 현상이 세기 중반에서 후반까지 많은 지역에서 발생할 것으로 예상된다6,7. 백화 현상 사이의 중간 기간의 이러한 단축은 산호초 복원력의 능력을 제한할 수 있다8. 산호 군락에 대한 고온 스트레스의 직접적인 영향(예: 조직 손상9; 에너지 고갈10)은 산호초 규모 수준에서의 간접적인 영향과 본질적으로 연관되어 있으며, 그 중 번식/모집 능력의 감소가 특히 우려된다11. 이는 예를 들어, 적극적인 in situ 모집 강화(예: 리프 파종(reef seeding)12), 산호 복원(coral restoration)13 및 제자리 시스템(ex situ system)14에서 번식을 유도하기 위한 생식 단서의 시뮬레이션을 탐구하는 다양한 응용 연구에 박차를 가했다. 이러한 적극적인 개입을 보완하는 것은 고온 스트레스 하에서 산호의 종속영양 섭식(heterotrophic feeding)의 이점에 대한 최근의 인식과 번식16에서 먹이 공급이 할 수 있는 역할에 대한 탐구이다.

종속영양 섭식은 산호의 성능에 영향을 미치는 것으로 알려져 있으며17 특히 산호 성장(18,19)과 열 저항성 및 복원력(20,21)의 증가와 관련이 있다. 그러나, 종속영양의 이점은 산호 종들 사이에서22 어디에나 있지 않으며, 섭취되는 음식의 종류23 및 빛 노출의 수준24에 따라 달라질 수 있다. 산호 번식의 맥락에서, 종속영양 섭식은 종속영양 섭식 후 더 높은25 및 더 낮은26 번식 능력의 관찰과 함께 다양한 결과를 보여주었습니다. 다양한 온도에서 종속영양 섭식이 산호 번식에 미치는 영향은 거의 평가되지 않지만, 온대 산호 Cladocora caespitosa에서는 종속영양이 저온 조건에서 번식에 더 중요한 것으로 밝혀졌다27. 온도의 역할과 번식 생산량에 대한 먹이에 대한 더 나은 이해는 특정 산호초(예: 높은 식량 가용성과 관련된 산호초28)가 기후 변화 하에서 더 높은 모집 능력을 가지고 있는지 여부를 결정하기 위해 필요할 수 있다.

번식 출력과 유사하게, 산호의 번식 시기와 온도와 섭식의 영향은 온난화되는 바다에서 모집 성공에 중요한 고려 사항임에도 불구하고 비생물적/생물적 조건과 번식의 동기화가 상대적으로 덜 연구된 상태로 남아 있다29. 따뜻한 온도는 실험실에서 수행된 산호 열 조절 연구에서 더 일찍 번식하는 것으로 나타났으며(30), 이는 계절31에 걸쳐 자연 산호초에서 채취한 산호에서도 관찰되었습니다. 그러나 흥미롭게도, 최근 현장 유동 시스템( ex situ flow-through system)에서 1년 동안 배양된 먹이 산호(faed corals)에서는 이와 반대의 경향을 관찰했다(즉, 번식은 더 시원한 겨울 기온에서 달의 주기 초기에 발생했고, 더 따뜻한 여름 기온에서 달의 주기에서 더 늦게 발생했다)32. 이 대조적인 결과는 번식 시기가 풍부한 에너지 자원과 관련된 조건 하에서 전형적인 패턴에서 벗어날 수 있음을 시사한다.

다양한 온도 시나리오에서 장기적으로 통제된 실험은 경화성 산호의 번식에 대한 종속영양의 영향을 더 잘 이해하는 데 기여할 수 있습니다. 그러나 여러 번식 주기 동안 현장 조건에서 번식하는 산호 군체를 유지하는 것은 어려울 수 있습니다(그러나 이전 연구32,33 참조). 본원에서, 유동 양식 시스템에서 육화 산호(Pocillopora acuta)의 활성 섭식(먹이 공급원: Artemia nauplii) 및 장기 배양을 위한 간단하고 효과적인 기술이 설명됩니다. 그러나 설명된 모든 기술은 재순환 양식 시스템에도 사용할 수 있습니다. 이러한 기술을 입증하기 위해 24 °C 및 28 °C에서 "먹이를주는"및 "먹이를주지 않은"처리하에서 산호 군집의 번식 생산량과 타이밍을 예비 비교했습니다. 이 온도는 대만 남부의 겨울과 여름에 각각 해수 온도를 근사화하기 위해 선택되었습니다30,34; 열 스트레스에 대한 산호 반응을 테스트하는 대신 장기적인 현장 배양을 촉진하는 것이 이 실험의 주요 목표였기 때문에 더 높은 온도를 선택하지 않았습니다. 또한, 섭식 세션 전후의 Artemia nauplii의 밀도를 정량화하여 두 온도 처리에서 종속영양 섭식의 타당성을 비교했습니다.

구체적으로, 대만 남부에 있는 국립 해양 생물학 및 수족관 박물관(National Museum of Marine Biology & Aquarium)의 연구 시설에 있는 유동 탱크에서 P. acuta(평균 총 선형 연장 ± 표준 편차: 21.3cm ± 2.8cm)의 24개 콜로니를 얻었습니다. Pocillopora acuta는 방송 산란이지만 일반적으로 번식 전략을 모두 가지고 있는 일반적인 산호 종입니다35,36. 이 산호들의 모체는 원래 다른 실험32를 위해 약 2년 전에 아울렛 암초(21.931°E, 120.745°N)에서 수집되었다. 결과적으로, 본 실험에 사용된 산호 군집은 현장 배양 조건 하에서 평생을 동안 사육되었다. 구체적으로, 콜로니는 주변 온도와 250μmol 양자 m−2·s−1에서 12시간 : 12시간 빛: 암흑 주기에 노출되고 일주일에 두 번 Artemia nauplii를 먹였습니다. 우리는 이 장기간의 현장 외 배양이 이 실험의 처리 조건에 군체가 반응하는 방식에 영향을 미쳤을 수 있다는 것을 알고 있습니다. 그러므로, 우리는 여기서 일차적인 목적이 산호 번식에 대한 온도와 먹이의 영향을 평가한 응용 예를 보여줌으로써 설명된 기술이 현장에서 산호를 배양하는 데 어떻게 효과적으로 사용될 수 있는지 설명하는 것임을 강조하고 싶습니다.

산호 군집은 6개의 유동 시스템 배양 탱크(탱크 내부 길이 x 너비 x 높이: 175cm x 62cm x 72cm, 탱크 조명 체제: 12시간:12시간 빛:250μmol 양자 m−2·s−1)에 고르게 분포되었습니다(그림 1A). 탱크 중 3 개의 온도는 28 °C로 설정되었고 다른 3 개의 탱크의 온도는 24 °C로 설정되었습니다. 각 탱크에는 10분마다 온도를 기록하는 로거가 있었습니다( 재료 표 참조). 온도는 냉각기 및 히터를 사용하여 각 탱크에서 독립적으로 제어되었으며 물 순환은 유량 모터를 사용하여 유지되었습니다( 재료 표 참조). 각 탱크의 콜로니의 절반(n = 2개의 콜로니/탱크)은 일주일에 두 번 Artemia nauplii를 먹였고 다른 콜로니는 먹이를 주지 않았습니다. 각 공급 세션은 4시간 동안 지속되었으며 두 개의 독립적인 온도별 공급 탱크에서 수행되었습니다. 먹이를 주는 동안, 먹이를 주지 않은 집체를 포함하여 모든 집체를 먹이 탱크로 이동시켜 탱크 사이에서 집체를 이동하는 잠재적인 스트레스 효과를 표준화했습니다. 먹이를 먹은 집락과 먹이를 주지 않은 처리의 군집은 온도별 공급 탱크 내의 메쉬 프레임을 사용하여 자체 구획에 배치되어 먹이를 먹은 상태의 집락만 먹이를 받았습니다. 산호 번식 생산량과 타이밍은 매일 오전 09:00에 밤새 유충 수집 용기에 방출된 유충의 수를 계산하여 각 군체에 대해 평가되었습니다.

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Protocol

1. 거는 산호 colonies in ex situ 양식 탱크

  1. 산호 군락을 걸 준비를 위해 배양 탱크를 가로질러 노치 막대(길이 x 너비 x 높이: 75cm x 1cm x 3cm)를 배치합니다.
    참고: 이 실험에 사용된 행잉 바는 맞춤 제작되었지만 배양 탱크 상단을 가로질러 안정적인 방식으로 배치할 수 있고 산호를 담을 수 있을 만큼 충분히 강하다면 돌출된 나사가 있는 간단한 PVC 파이프(즉, 노치 역할)로 충분합니다.
  2. 낚싯줄 조각( 재료 표 참조)을 길이가 ~1.5m로 측정한 다음 반으로 두 번 접습니다.
    알림: 낚싯줄의 초기 길이는 배양 탱크에서 산호 군집의 원하는 최종 위치에 따라 선택해야 합니다.
  3. 낚싯줄의 초기 끝이 있는 접힌 낚싯줄 끝에 작은 오버핸드 매듭을 만듭니다.
    알림: 매듭을 만든 후 하단에 두 개의 큰 고리가 있고 상단에 하나의 작은 고리가 있어야 합니다.
  4. 두 개의 큰 고리 중간에 산호 군체를 배치하여 고리가 군체 주위에 배치되고 산호가 물에 매달렸을 때 산호를 단단히 고정할 수 있도록 합니다.
  5. 낚싯줄의 작은 상단 고리를 행잉 바의 노치에 연결합니다(그림 1B).

2. 산호 먹이 주기

  1. 사료 용기 만들기
    1. 아크릴 파이프를 사용하여 직사각형 프레임을 구성합니다 (길이 x 너비 x 높이 : 25cm x 60cm x 25cm). 먹이를 먹은 산호와 먹이를 먹지 않은 산호를 각각 놓을 수 있는 프레임에 두 개의 별도 구획을 만듭니다(그림 1C).
      알림: 아크릴 파이프는 가볍기 때문에(즉, 더 무거운 PVC 파이프와 반대로) 배양 탱크 안팎으로 공급 용기를 더 쉽게 이동할 수 있기 때문에 사용되었습니다.
    2. 핫 글루건을 사용하여 100μm의 플랑크톤 메쉬를 프레임의 바닥과 측면에 부착합니다.
    3. 파이프(특히 프레임의 측면과 바닥을 따라)에 총 10~10개의 작은 구멍(직경 0.5cm)을 뚫어 배양 탱크에 넣을 때 공급 용기가 뜨지 않도록 합니다.
    4. 사료 용기의 각 모서리에 있는 플랑크톤 메쉬를 통해 구멍(직경 ~0.5cm)을 뚫습니다.
    5. 모서리 구멍을 통해 직경 8cm 길이의 0.5cm 튜브를 놓고 뜨거운 글루건을 사용하여 제자리에 고정합니다.
      알림: 이 튜브 조각은 공급하는 동안 공기 펌프와 버블 스톤에 연결됩니다(자세한 내용은 2.3.2단계 참조).
  2. 쑥 재배
    1. 독립 공급 탱크에서 2L의 해수를 모아 아르테미아 부화 용기에 바닷물을 붓습니다(그림 1D).
      참고: 프로토콜을 시연하는 데 사용된 본 실험에서는 두 개의 독립적인 처리 별 공급 탱크가 사용되었으며, 이는 아르테미아 재배를 위한 두 개의 부화 용기를 준비해야 했습니다.
    2. 쑥 낭종을 추가하기 전에 약 10분 동안 부화 용기 바닥에 연결된 튜브에 공기 펌프를 연결합니다.
    3. 기다리는 동안 저울을 사용하여 8g의 아르테미아 낭종을 측정합니다( 재료 표 참조).
      참고: Huang et al.19이 제안한 대로 35개의 개별 Artemia nauplii/mL의 평균 밀도를 얻으려면 4g의 Artemia 낭종과 1L의 바닷물의 비율을 사용합니다.
    4. 10분 후 쑥 낭종 8g을 부화 용기에 붓습니다.
    5. 쑥 낭종을 48시간 동안 배양합니다.
  3. 공급 탱크 준비
    1. 용기의 상단이 수면 위에 오도록 공급 용기를 공급 탱크에 넣습니다.
    2. 먹이 용기 모서리 튜브의 바깥쪽 부분을 공기 펌프에 연결하면 먹이는 동안 물 순환을 촉진하기 위해 버블 스톤에 공기를 공급합니다.
    3. 수유 시작 ~5분 전에 공기 펌프를 켜십시오.
  4. Artemia nauplii 농축 및 수집
    1. 원하는 먹이 시간 2시간 전에 1.5mL의 농축 식단( 재료 표 참조)을 부화 용기에 추가합니다.
      참고: 0.75mL의 농축 식단과 1L의 해수 비율은 Huang et al.19에서 권장합니다.
    2. 2시간 후 해칭 컨테이너에 공기를 공급하는 밸브를 끕니다.
    3. 부화 용기를 판지 상자로 덮어 주변광을 차단하고 부화 용기 바닥에 광원(휴대폰 손전등이면 충분함)을 5분 동안 놓아 Artemia nauplii를 용기 바닥으로 끌어들여 빈 껍질에서 살아있는 Artemia nauplii를 쉽게 분리할 수 있습니다.
    4. 5분 후 상자와 광원을 제거합니다.
    5. 해칭 용기 아래에 3L 계량 용기를 놓습니다.
    6. Artemia nauplii와 해수 용액이 측정 용기로 흐를 수 있도록 해화 용기에서 튜브를 분리합니다. Artemia nauplii 1L와 해수 용액을 수집합니다.
      알림: 원치 않는 빈 쉘을 제외하기 위해 해칭 컨테이너에서 부피의 절반만 수집하십시오.
    7. 공급 탱크에 가까이 서서 100μm 스트레이너를 통해 Artemia nauplii와 해수 용액을 부어 Artemia nauplii(여과기에 남아 있음)를 해수에서 분리합니다.
    8. 여과기 안에 있는 Artemia nauplii를 공급 탱크의 물로 두 번 헹굽니다.
    9. 이제 Artemia nauplii를 사용할 준비가 되었습니다.
  5. 산호 군락에 먹이주기
    1. 2.4.8 단계의 여과기를 공급 탱크에 넣어 Artemia nauplii를 내립니다.
    2. Artemia nauplii가 고르게 분포되도록 탱크의 물을 손으로 저어줍니다.
      알림: 이 단계 후에 Artemia nauplii 밀도의 "사전 공급" 정량화를 위해 샘플을 수집합니다(자세한 내용은 3.1단계 참조).
    3. 각 행잉 바(산호 군락이 여전히 바에 매달려 있는 상태)를 배양 탱크에서 공급 탱크로 옮기고 바가 공급 탱크 상단에 단단히 놓이도록 배치합니다. 산호가 공기에 노출되는 시간은 가능한 한 짧게 유지해야 합니다.
      알림: 군체가 서로 닿지 않고 음식을 담을 수 있는 충분한 공간(예: ~5cm 간격)이 있는지 확인하십시오.
    4. 공급 탱크의 조명을 끄거나 밀폐되지 않은 뚜껑을 사용하여 공급 탱크를 덮어 공급 중 빛의 방해를 방지하십시오.
    5. 식민지가 4시간 동안 방해받지 않고 먹이를 먹도록 합니다.
    6. 4시간 후 Artemia nauplii 밀도의 "수유 후" 정량화를 위해 샘플을 수집합니다(자세한 내용은 3.1단계 참조).
  6. 수유 후 청소
    1. 먹이 주기가 끝나면 산호 군락을 제거합니다. 공급 탱크에서 행잉 바를 개별적으로 꺼내고 각 산호를 해당 배양 탱크의 바닷물로 철저히 헹구어 잔류 아르테미아 나우플리를 제거합니다.
      알림: 헹구는 동안 콜로니가 앞뒤로 흔들릴 경우 발생할 수 있는 손상 위험을 줄이기 위해 매달리는 동안이 아닌 안정된 표면에서 콜로니를 헹굽니다. 초기 이동에 따라 산호가 공기에 노출되는 시간을 가능한 한 짧게 유지하십시오.
    2. 행잉 바(산호가 매달린 상태)를 배양 탱크에 다시 넣습니다.
    3. 공급 용기를 공기 펌프에 연결하는 튜브를 분리하고 공급 탱크에서 공급 용기를 제거합니다.
    4. 먹이 용기를 깨끗한 물로 철저히 헹구어 남아 있는 모든 Artemia nauplii를 제거합니다.

3. 수유 전후 Artemia nauplii 밀도 정량화

  1. 시료 채취
    1. 두 가지 시점에서 샘플을 수집합니다: 첫 번째, Artemia nauplii가 하역되어 공급 용기에 고르게 분포되었을 때(2.5.2 단계), 그리고 다시 공급 세션이 완료된 후(2.5.6 단계).
    2. 각 시점에 대해 3개의 주사기를 사용하여 공급 용기의 표면, 중간층 및 바닥층에서 각각 20mL의 물을 끌어옵니다.
  2. 시료 희석
    1. 각 주사기에 대해 20mL의 물 샘플을 독립적인 500mL 비커로 옮깁니다.
    2. 180mL의 뜨거운 물(~60°C)을 비커에 넣습니다(1:10 희석).
      알림: 뜨거운 물은 열거의 정확도를 높이기 위해 Artemia nauplii를 고정하는 데 사용됩니다.
    3. 비커의 물 샘플 2mL를 9웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다.
      참고: 샘플을 2mL의 샘플을 추출하기 전에 비커에 샘플을 혼합하여 Artemia nauplii를 물 기둥에 고르게 분포시킵니다.
    4. 6.5x 배율을 사용하여 실체 현미경으로 각 웰의 Artemia nauplii 수를 계산합니다( 재료 표 참조).
  3. 쑥(Artemia nauplii)의 밀도 계산
    1. 각 웰의 Artemia nauplii 수를 2로 나누어 mL당 Artemia nauplii 수를 구합니다. 그런 다음 그 숫자에 10을 곱하여(희석을 고려하여) Artemia nauplii 밀도를 계산합니다.
    2. Artemia nauplii의 평균 밀도(즉, 먹이 주기 전과 후의 27개 우물 복제에 걸친 평균 밀도)를 계산하여 먹이 전과 후 사이의 Artemia nauplii 밀도를 비교합니다.

4. 산호 유충 수집

  1. 유충 수집 용기 만들기(그림 1E)
    1. 6L 플라스틱 물병을 선택하고 병의 바닥을 완전히 잘라냅니다.
      알림: 이 개구부는 유충 수집 용기 안팎으로 군체를 옮기는 데 사용됩니다.
    2. 병의 양쪽에서 ~ 15cm x 20cm 직사각형을 잘라내어 두 개의 창을 만듭니다.
      알림: 6L 플라스틱 물병은 직경이 ~15cm인 산호에 적합합니다. 연구 중인 산호의 크기에 따라 병의 크기를 수정합니다.
    3. 뜨거운 글루건을 사용한 다음 에폭시를 사용하여 각 창에 100μm 플랑크톤 메쉬를 부착합니다.
    4. 병 바닥의 양쪽에 두 개의 작은 구멍(직경 ~0.5cm)을 만듭니다.
    5. 두 개의 작은 구멍에 끈을 넣고 양쪽 끝을 묶어 유충 수집 용기를 행잉 바에 걸 수 있는 손잡이를 만듭니다.
    6. 처음 사용하기 전에 병을 유동 탱크(산호 없음)에 최소 24시간 동안 넣어 접착제 잔여물을 제거하십시오.
  2. 산호 채취 준비
    1. 유충 수집 용기를 배양 탱크에 완전히 담그십시오.
    2. 군체와 용기를 모두 물에 담근 상태에서 군체를 유충 수집 용기에 넣습니다.
    3. 유충 수집 용기의 손잡이를 행잉 바에 걸어주세요.
      알림: 걸기 후에는 수집 용기의 상단이 물에서 ~3cm 위에 있는지 확인하십시오.
    4. 모든 군체가 유충 수집 용기에 들어갈 때까지 4.2.1-4.2.3 단계를 반복합니다.
  3. 산호 유충 수집 및 열거
    1. 3L 계량 용기, 용기, 3mL 피펫 및 50mL 튜브를 준비합니다.
    2. 행잉 바에서 낚싯줄을 풀고 유충 수집 용기에서 군체 하나를 제거합니다. 콜로니를 즉시 배양 탱크에 다시 넣으십시오.
      알림: 공기 노출 시간은 가능한 한 짧아야 합니다.
    3. 한 손을 유충 수집 용기의 뚜껑 끝에 올려 놓습니다.
      알림: 유충 수집 용기에 물이 채워지면 무거울 수 있습니다. 적절한 지지대가 없으면 용기를 물에서 꺼낼 때 용기가 파손될 수 있습니다.
    4. 행잉 바에서 유충 수집 용기 "손잡이"를 풉니다.
    5. 유충 수집 용기를 물 밖으로 천천히 들어 올립니다.
    6. 수집 용기를 배양 탱크 위로 약 45° 각도로 몇 초 동안 유지하여 과도한 물이 유충 수집 용기 창을 통해 탱크로 다시 흐르도록 합니다.
      알림: 용기 상단에서 유충이 쏟아질 가능성을 줄이기 위해 용기를 45° 이상으로 기울이지 마십시오.
    7. 탱크에서 유충 수집 용기를 꺼내 측정 용기 위에 놓습니다.
    8. 캡을 풀기 전에 한 손가락을 사용하여 캡에 적당한 압력을 가한 다음 캡을 푸십시오.
      알림: 수집 용기 내부의 물은 먼저 손가락으로 지지하지 않으면 캡을 제거할 때 빠르게 방출될 수 있습니다(즉, 잠재적으로 유충이 손실될 수 있음).
    9. 계량기 내부의 물 일부를 그릇에 옮깁니다.
    10. 3mL 피펫을 사용하여 유충을 50mL 튜브로 옮겨 보울에 있는 유충의 수를 수동으로 계산합니다.
      알림: 일부 유충이 피펫 내부에 끼일 수 있습니다. 이 경우 피펫에 약간의 바닷물을 끌어들이고 한 손가락으로 피펫을 밀봉하면서 부드럽게 흔들어 유충을 풉니다.
    11. 모든 유충이 계산될 때까지 4.3.9단계와 4.3.10단계를 계속합니다. 이 단계에서 유충은 후속 실험에 사용될 수 있습니다.
    12. 다른 모든 산호 군락에 대해 4.3.2-4.3.10 단계를 반복합니다.
      알림: 측정 용기와 그릇은 콜로니 사이에서 헹궈야 합니다.
    13. 계산이 끝나면 각 수집 용기, 특히 창문을 깨끗한 물로 철저히 헹굽니다.

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Representative Results

설명된 프로토콜은 (1) 별개의 먹이 및 온도 처리 중에서 개별 산호 군집의 번식 생산량 및 타이밍을 비교하고 (2) 다양한 온도에서 Artemia nauplii 먹이의 타당성 평가를 허용했습니다. 여기에서, 발견에 대한 간략한 개요가 제공되지만, 이 실험의 단기적 특성(즉, 단 하나의 번식 주기)과 현장 조건에 적응된 산호 군집의 사용으로 인해 산호 번식에 대한 온도와 섭식의 보고된 효과에 대한 광범위한 해석과 관련하여 주의를 기울여야 합니다.

각 군집은 모니터링 기간(음력 2022년 9월) 동안 번식했으며, 총 월간 번식 생산량은 군집 간에 높은 편차를 보였습니다. 군체에 의해 방출된 유충의 총 수는 528마리의 유충을 생산한 1개의 군집(먹이를 주지 않은 24°C 처리에서)을 제외하고는 6개에서 319개까지 다양했습니다. 모든 콜로니에 대한 데이터는 그림 2에 나와 있지만, 생산량이 높은 이상치 콜로니는 데이터 분석에 포함되지 않았습니다. 생식 출력은 온도(일반화 선형 혼합 효과 모델; z = 5.35, p < 0.001)와 섭식(z = 3.01, p < 0.003)의 영향을 받았으며, 온도와 섭식 처리 사이에는 유의한 상호 작용이 발견되었습니다(z = 12.22, p < 0.001). 28°C에서 배양한 군체는 먹이를 먹었을 때(131 ± 133)보다 먹이를 주지 않았을 때(평균 ± 표준편차; 151 ± 82) 더 많은 유충을 방류했지만(일반화 선형 혼합 효과 모델, 사후 대비; z = 3.01, p = 0.014), 24°C에서 배양된 군체에서는 그 반대의 경향을 보였는데, 먹이를 먹은 군체(80 ± 78)가 먹이를 먹지 않은 군체(12 ± 6)보다 더 많은 유충을 생산했다(z = 11.91, p < 0.001)입니다.

모든 군체에서의 번식은 보름달(음력 15일) 이전에 일어났다(그림 3). 유충 방출의 평균 음력일(MLD)(번식 생산량에 의해 가중됨)은 음력 6.5일에서 음력 11.1일 사이였으며, 음력 주기 초기에 번식한 "먹이를 먹지 않은 28°C" 군체와 달의 주기 후반에 번식한 "먹이를 먹은 24°C" 군집 사이에서만 발견된 처리 간에 상당한 차이가 있었습니다(선형 혼합 효과 모델, 사후 대비, t = 4.10, p = 0.006).

공식적인 번식 모니터링(음력 2022년 8월) 전 한 달 동안 Artemia nauplii 밀도는 수유 세션 전후에 평가되었습니다. 이것은 세 가지 시점에서 반복되었습니다: 이 실험을 위한 산호 배양 시작(T0)과 처리 조건 하에서 산호 배양 2주 및 4주(그림 4). T0에서의 초기 평가는 두 온도 처리에서 Artemia nauplii의 먹이 전후 밀도 사이에 차이가 없음을 보여주었습니다. 2주 및 4주 배양 후, 두 가지 온도 처리에서 먹이를 준 후 Artemia nauplii 밀도가 낮아졌습니다(2주차: 양방향 ANOVA, F 1,104 = 128.45, p < 0.001; 4주차: 양방향 ANOVA, F1,104 = 294.71, p < 0.001 ). 평가된 세 가지 시점 중 어느 곳에서도 온도 처리 간의 사전 공급 밀도(p > 0.05) 또는 온도 처리 간의 공급 후 밀도(p > 0.05)에는 차이가 없었습니다.

모든 분석은 lme437, lmerTest 38, emmeans39, car 40 및 Hmisc41 패키지를 사용하여 R에서 수행되었습니다. 분석에 사용되는 데이터 및 R 스크립트는 GitHub(https://github.com/CJ-McRae/Lam-et-al_JoVE-submission)에서 공개적으로 사용할 수 있습니다.

Figure 1
그림 1: 실험 설계 및 육추 경피성 산호의 먹이 및 현장 배양을 위한 대표 재료의 개략도. (A) Pocillopora acuta 의 콜로니는 24°C 또는 28°C의 유동 양식 탱크에서 먹이고 먹지 않은 조건에서 배양했습니다. 검은색 원은 식민지를 나타냅니다. (B) 군체는 취급 스트레스를 줄이고 배양 탱크와 공급 탱크 사이의 효율적인 이동을 촉진하기 위해 낚싯줄로 매달렸습니다. (C) 먹이 주기 세션 동안, 모든 콜로니는 온도별 먹이 탱크 내의 그물망 프레임으로 이동되었습니다. 먹이를 먹은 콜로니는 프레임의 한 구획에 배치되었고, 먹이를 먹지 않은 콜로니는 프레임의 다른 구획에 배치되었습니다. 식량을 공급받은 식민지에만 식량이 제공되었습니다. (D) 농축 아르테미아 나우플리(Artemia nauplii)를 일주일에 두 번 먹이 처리로 식민지에 투여했습니다. (E) 군체를 하룻밤 동안 유충 수집 용기에 넣어 한 달 주기 동안 매일 번식 생산량을 정량화했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 다양한 온도(24°C 대 28°C) 및 수유 처리(먹이 대 비먹이)에서 Pocillopora acuta 군집의 번식 출력. 이 글자는 치료법 간의 생식 생산량에 상당한 차이가 있음을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: 다양한 온도(24°C 대 28°C) 및 수유 처리(수유 대 비수유)에서 Pocillopora acuta 군집의 번식 시기. 수직 점선은 각 처리에 대한 평균 생식일(MLD)을 보여줍니다. 처리별 플롯(A-D)의 각 막대 내의 색조는 일일 총 번식에 대한 개별 콜로니의 기여도를 나타냅니다. 이 편지는 치료법 간의 생식 시기의 중요한 차이를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: 24°C 및 28°C 온도 처리 내에서 산호 먹이 주기 세션 전후의 Artemia nauplii의 밀도. 사전 먹이 밀도는 산호 먹이 주기 전에 계산되었고, 먹이 후 밀도는 4시간의 산호 먹이 주기 세션이 완료된 후에 계산되었습니다. Artemia nauplii의 밀도는 산호 배양 (T0) 초기에 평가 한 다음 2 주 및 4 주 후에 유동 양식 시스템의 처리 조건에서 평가했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

온도와 먹이가 산호 번식에 미치는 영향에 대한 이 예비 평가는 뚜렷한 처리 조건에서 배양된 군체 간의 번식 생산량과 시기의 차이를 보여주었습니다. 또한, 산호 군락에 아르테미아 나우플리(Artemia nauplii)를 먹이는 것은 따뜻한 온도(28°C)뿐만 아니라 상대적으로 시원한 온도(24°C)에서도 효과적인 것으로 나타났습니다. 이러한 결합된 발견은 현장 양식 시스템에서 (P. acuta를 예로 들면) 경피성 산호를 번식하는 먹이 및 배양을 위한 이러한 간단한 기술의 적용 가능성을 강조합니다.

번식 출력의 맥락에서, 섭식은 군체를 배양한 온도 처리에 따라 다른 영향을 미치는 것으로 나타났으며, 이에 따라 섭식은 24°C 처리에서 유지된 군체의 생식 생산량에 긍정적인 영향을 미치는 것으로 나타났습니다. 이 결과는 다소 놀라운 것인데, 다른 해양생물의 경우, 고온에서의 제한된 먹이 공급은 번식에 부정적인 영향을 미치고(예: 담셀피시42 산란 감소) 초기 생애 단계 발달 불량(예: 변태 중 게의 높은 사망률 및 성장 감소)과 관련이 있기 때문이다43). 산호에서 먹이와 온도의 상호 작용 효과에 대한 특정 평가는 주로 산호의 조류 공생체44,45의 광화학적 성능에 중점을 두었으며 이러한 상호 작용 효과는 번식의 맥락에서 거의 탐구되지 않았습니다. 여러 번식 주기에 걸쳐 다양한 온도에서 먹이를 먹는 번식 기반 효과에 대한 포괄적인 평가를 목표로 하는 향후 연구가 필요합니다. 그러나 이것은 본 실험의 목표가 아니었다. 대신, 이 실험은 제시된 먹이 및 배양 기술의 효능을 입증하는 데 주로 사용되었습니다. 이러한 기술을 사용하면 개별 군집의 명확한 번식 추세를 쉽게 평가할 수 있으며, 이는 번식 생산량의 군집 간 변동이 드문 일이 아니기 때문에 중요합니다. 예를 들어, 광범위한 번식 생산량은 여러 연구에서 동일한 개별 군체에 대해 시간이 지남에 따라 식민지 사이에서 발견되었습니다30,32,46,47. 생식 산출의 높은 변동성에 대한 가능한 설명에는 생식 전략의 가소성 및/또는 에너지 할당의 우선 순위 이동이 포함된다48,49. 이 실험에서 설명한 것과 같이 번식 생산량에 대한 군집별 평가를 가능하게 하는 기술은 산호 모집(즉, 자연 산호초 회복력과 관련됨) 및 번식 자원 공급 잠재력(즉, 산호 복원을 지원하기 위한 현장 재배와 관련됨)에 대한 우리의 이해와 관련된 번식 능력의 환경적/유전적 동인을 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 실험에서 번식 시기를 평가한 결과, "먹이를 주지 않은 28°C" 처리의 군체만이 "먹이를 준 24°C" 처리의 군체보다 훨씬 일찍 유충을 방출하는 것으로 나타났습니다. 시기는 다른 치료법에서도 비슷하게 유지되었습니다. 번식 시기의 온도 주도 가소성은 여러 산호 종에서 관찰되었으며, 더 따뜻한 온도에서 고급 타이밍이 관찰되었습니다50,51,52. 이러한 시기의 변화는 기후 변화 하에서 더 따뜻한 온도에서 배우자와 배아의 발달이 가속화됨에 의해 설명될 수 있으며,53 이는 궁극적으로 산호의 번식과 모집에 적응적 또는 파괴적인 영향을 미칠 수 있다54,55,56. 번식 타이밍에 대한 섭식과 온도 사이의 가능한 상호 작용 관계를 명시적으로 조사하는 실험은 타이밍 변화의 결과를 더 잘 이해할 수 있으며 현장 양식 생산을 향상시키기 위해 번식 주기의 빈도를 높이는 실용성을 테스트할 수도 있습니다.

산호 번식에 대한 온도와 먹이 사이의 잠재적인 상호 작용 관계를 탐구하는 통제된 실험을 수행하려면 효과적인 현장 먹이 기술이 필요합니다. 이 실험에서 산호 군집은 24°C 및 28°C의 온도별 공급 탱크에서 공급되었으며, 온도 처리 전반에 걸쳐 Artemia nauplii의 먹이 전후 밀도에서 유사한 패턴이 발견되었습니다(즉, 먹이 후 대비 Artemia nauplii의 밀도가 낮음). 이것은 세 가지 중요한 점을 나타냅니다 : (1) 온도 처리는 Artemia nauplii의 건강에 영향을 미치지 않는 것으로 보입니다. (2) 산호 군집의 먹이 비율은 두 온도 모두에서 거의 동일했다. (3) 산호 군집은 두 온도 모두에서 먹이를 먹는 동안 Artemia nauplii를 섭취했습니다(실험 조건에 적응할 때 군체 스트레스를 나타낼 수 있는 T0 시점 제외). 온도 처리 사이와 시간 경과에 따른 밀도 추세의 해석은 프록시 기반 평가로만 사용된다는 점을 지적하는 것이 중요합니다. 섭식 타당성에 대한 결정적인 결론을 내리기 위해서는 섭식(예: 장 내용물 검사(예: 장 내용물검사57) 및 Artemia nauplii 생리학(예: 열충격 단백질 발현(58))을 확인하기 위한 강력한 조사가 필요하다. 이러한 성격의 평가는 이 실험의 범위를 벗어났다. 그러나 먹이를 먹는 동안 시각적 확인과 결합된 실험 데이터를 기반으로 이 실험에서 산호 군집은 두 처리 온도 모두에서 활발하게 먹이를 먹었다고 확신합니다. 산호는 고온에서 먹이를 먹었을 때 대조적인 반응을 보일 수 있는데, 어떤 종은 먹이 속도가 감소하고 다른 종은 먹이 비율이 증가한다45. 따라서 향후 실험에서 먹이 온도를 결정할 때 종 및 위치별 온도 허용 오차를 고려해야 합니다.

기술된 먹이 및 배양 기술은 산호 건강의 질과 현장 양식에서 번식의 수명을 모두 향상시키려는 몇 가지 이점을 제공합니다. 이 설명된 접근 방식을 이끄는 가장 중요한 목표는 산호 스트레스의 잠재적 원인을 최소화하는 데 기반을 두고 있습니다. 우선, 산호 군락을 직접 다룰 필요가 없어졌는데, 낚싯줄을 사용하여 산호를 매달아 놓았습니다. 이를 통해 배양 탱크와 먹이 탱크 사이의 콜로니의 효율적인 이동을 촉진하고 콜로니 위치를 간단하고 빠르게 조정할 수 있습니다(예: 탱크의 콜로니 깊이를 변경하기 위해 낚싯줄을 줄이거나 늘림). 군체를 스탠드 또는 배양 탱크의 바닥에 배치하는 것과는 대조적으로, 군체를 매달면 모든 차원에서 성장을 촉진하고 조류의 축적을 줄이며 수조에 더 많은 사용 가능한 공간을 만듭니다(예: 필요한 경우 여러 산호를 단일 낚싯줄에 수직으로 매달아 놓을 수 있음)59. 장기간의 번식(32)을 촉진하는 데 도움이 될 수 있는 에너지적인 트레이드오프(trade-off)60의 필요성을 감소시키는 것에 더하여, 설명된 먹이 공급기술들은 또한 산호의 스트레스를 감소시키는 데 도움이 되었다. 산호의 건강에 해로울 수 있고 풍부한 조류 성장으로 이어질 수 있는 잠재적으로 높은 영양 수준에 대한 산호의 노출을 완화하기 위해 독립적인 탱크에서 먹이를 주는 것이 권장된다19,61 (배양 탱크에서 직접 먹이는 것과는 반대로) 62,63,64,65. 또한 수질 문제가 발생하면 산호 군체를 방해하지 않고 공급 탱크 내의 물을 쉽게 유지 및 변경할 수 있습니다. 유충 수집 용기는 또한 산호 스트레스 감소를 염두에 두고 설계되었으며, 이를 통해 단일 군집 탱크에서 직접 취급하거나 배양할 필요 없이 군체 특이적 번식을 달성할 수 있습니다. 대형 배양 탱크에 다수의 군체를 갖는 것은 번식 수명(특히 혼합된 번식 모드(49)을 갖는 산호 종에서)을 개선하는 데 도움이 될 수 있으며, 이는 현장 외 시스템(ex situ system)에서 시간이 지남에 따라 감소하는 것으로 나타났다(66, 67). 또한 대형 플라스틱 병을 유충 수집 용기로 사용하면 유충에게 풍부한 공간을 제공하여 수집 용기 자체에 침전되는 것을 줄일 수 있습니다. 작은 수집 용기를 사용할 때 빠른 정산이 문제가 될 수 있습니다(McRae and Lam, 개인적 관찰). 마지막으로, 이러한 현장 공급 및 배양 기술은 비용 효율적이고 만들기 쉬우며 실험별 요구 사항에 따라 맞춤화할 수 있는 재료를 사용합니다.

설명된 먹이 및 배양 기술의 주요 한계는 1) 수조 공간 요구 사항으로 인해 배양할 수 있는 군체의 수에 대한 유한한 제한, 2) 동일한 수조 내에서 배양되는 여러 군체로 인해 번식 모드(유성 대 무성생식)를 표준화할 수 없음, 3) 설명된 기술의 효능을 테스트하기 위해 단일 암초 사이트에서 단일 종을 사용하는 것입니다. 향후 연구는 다른 산호 종들이 이러한 먹이 및 배양 기술을 사용하여 어떻게 행동하는지 테스트하고 종별 식이 요구를 가장 잘 충족시키기 위해 다른 식품 유형의 사용을 탐구하는 데 도움이 될 것입니다.

결론적으로, 다른 적극적인 개입(68,69,70)에 대한 비판은 주요 한계(예: 확장성, 유전적 다양성)가 여전히 관련성이 있기 때문에 산호 번식을 위한 현장 배양의 촉진에도 적용될 수 있는 것으로 인식된다. 그러나 다른 적극적인 개입과 마찬가지로 현장 산호 배양은 단일 솔루션으로 간주되어서는 안 되며 의미 있는 기후 변화 완화와 함께 탐색되어야 하는 지원적인 접근 방식으로 간주되어야 합니다. 기술된 기술의 사용을 통해, 산호 스트레스는 군체(및 그 자손)가 연구 및 복원 노력에 기여할 수 있는 현장 양식 시스템에서 경화성 산호, P. acuta의 생식 수명을 향상시키기 위해 감소될 수 있습니다.

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Disclosures

저자는 경쟁하는 재정적 이익이나 기타 이해 상충이 없습니다.

Acknowledgments

이 연구는 대만 과학기술부(Ministry of Science and Technology)의 지원을 받았으며 보조금 번호는 MOST 111-2611-M-291-005 및 MOST 111-2811-M-291-001입니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Artemia cysts  Supreme plus NA Food source 
Chiller Resun CL650 To cool down water temperature if needed
Conductivity portable meter WTW Cond 3110 To measure salinity
Enrichment diets Omega NA Used in Artemia cultivation
Fishing line Super Nylon monofilament To hang the coral colonies
Flow motors Maxspect GP03 To create water flow
Heater 350 W ISTA NA Heaters used in tanks
HOBO pendant temperature logger Onset Computer UA-002-08 To record water temperature
LED lights Mean Well FTS: HLG-185H-36B NA
Light portable meter LI-COR LI-250A Device used with light sensor to measure light intensity in PAR
Light sensor LI-COR LI-193SA NA
Plankton net 100 µm mesh size Omega NA To collect larvae and artemia 
Primary pump 6000 L/H Mr. Aqua BP6000 To draw water from tanks into chiller
Propeller-type current meter KENEK GR20 Device used with propeller-type detector to measure flow rate
Propeller-type detector KENEK GR3T-2-20N NA
Stereo microscope Zeiss Stemi 2000-C  To count the number of artemia 
Temperature controller 1000 W Rep Park O-RP-SDP-1 To set and maintain water temperature

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먹이 기술 Ex Situ Culture 육추 Scleractinian 산호 Pocillopora acuta 기후 변화 산호초 분해 산호 배양 프로토콜 건강 및 번식 육추 공급 복원 프로젝트 온도 효과 먹이 처리 생식 출력
우울한 Scleractinian 산호, <em>Pocillopora acuta</em>의 먹이 및 <em>Ex Situ</em> 배양을 위한 효과적인 기술
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Lam, K. W., McRae, C. J., Liu, Z.… More

Lam, K. W., McRae, C. J., Liu, Z. T., Zhang, X. C., Fan, T. Y. Effective Techniques for the Feeding and Ex Situ Culture of a Brooding Scleractinian Coral, Pocillopora acuta. J. Vis. Exp. (196), e65395, doi:10.3791/65395 (2023).

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