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Biology

Tecniche efficaci per l'alimentazione e la coltura ex situ di un corallo scleractiniano in cova, Pocillopora acuta

Published: June 23, 2023 doi: 10.3791/65395
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1,2
1Department of Planning and Research, National Museum of Marine Biology & Aquarium, 2Department of Marine Biotechnology and Resources, National Sun Yat-sen University

Summary

Il cambiamento climatico sta avendo un impatto sugli ecosistemi delle barriere coralline a livello globale. I coralli provenienti da sistemi di acquacoltura ex situ possono contribuire a sostenere gli sforzi di ripristino e di ricerca. In questo articolo, vengono delineate le tecniche di alimentazione e coltura dei coralli che possono essere utilizzate per promuovere il mantenimento a lungo termine dei coralli scleractini in cova ex situ .

Abstract

Il cambiamento climatico sta influenzando la sopravvivenza, la crescita e il reclutamento dei coralli a livello globale, con cambiamenti su larga scala nell'abbondanza e nella composizione della comunità negli ecosistemi delle barriere coralline previsti nei prossimi decenni. Il riconoscimento di questo degrado della barriera corallina ha stimolato una serie di nuovi interventi attivi basati sulla ricerca e sul ripristino. L'acquacoltura ex situ può svolgere un ruolo di supporto attraverso la definizione di solidi protocolli di coltura del corallo (ad esempio, per migliorare la salute e la riproduzione in esperimenti a lungo termine) e attraverso la fornitura di una fornitura costante di riproduttori (ad esempio, per l'uso in progetti di ripristino). Qui, vengono delineate semplici tecniche per l'alimentazione e la coltura ex situ di coralli scleractini in cova utilizzando come esempio il corallo comune e ben studiato, Pocillopora acuta. Per dimostrare questo approccio, le colonie di coralli sono state esposte a diverse temperature (24 °C vs. 28 °C) e sono stati confrontati i trattamenti di alimentazione (alimentati vs. non nutriti) e la produzione e i tempi riproduttivi, nonché la fattibilità di somministrare naupli di Artemia ai coralli a entrambe le temperature. La produzione riproduttiva ha mostrato un'elevata variazione tra le colonie, con tendenze diverse osservate tra i trattamenti termici; a 24 °C, le colonie alimentate hanno prodotto più larve rispetto alle colonie non nutrite, ma l'opposto è stato riscontrato nelle colonie coltivate a 28 °C. Tutte le colonie si sono riprodotte prima della luna piena e le differenze nei tempi riproduttivi sono state riscontrate solo tra le colonie non nutrite nel trattamento a 28 °C e le colonie alimentate nel trattamento a 24 °C (giorno medio lunare di riproduzione ± deviazione standard: 6,5 ± 2,5 e 11,1 ± 2,6, rispettivamente). Le colonie di coralli si sono nutrite in modo efficiente di naupli di Artemia a entrambe le temperature di trattamento. Queste tecniche di alimentazione e coltura proposte si concentrano sulla riduzione dello stress dei coralli e sulla promozione della longevità riproduttiva in modo economico e personalizzabile, con un'applicabilità versatile sia nei sistemi di acquacoltura a flusso continuo che in quelli a ricircolo.

Introduction

Molti ecosistemi delle barriere coralline a livello globale si stanno perdendo e degradando a causa dello stress da alte temperature causato dai cambiamenti climatici 1,2. Lo sbiancamento dei coralli (cioè la rottura della simbiosi corallo-algale3) è stato considerato relativamente raro negli ultimi4 anni, ma ora si sta verificando più frequentemente5, con uno sbiancamento annuale che dovrebbe verificarsi in molte regioni entro la metà o la fine del secolo 6,7. Questo accorciamento del periodo intermedio tra gli eventi di sbiancamento può limitare la capacità di resilienza della barriera corallina8. Gli impatti diretti dello stress da alte temperature sulle colonie di corallo (ad esempio, danno tissutale9; esaurimento energetico10) sono intrinsecamente legati a impatti indiretti a livello di barriera corallina, di cui una riduzione della capacità riproduttiva/di reclutamento è di particolare interesse11. Ciò ha stimolato una serie di ricerche applicate che esplorano, ad esempio, il miglioramento attivo in situ del reclutamento (ad esempio, la semina della barriera corallina12), nuove tecnologie per il ripristino dei coralli su larga scala13 e la simulazione di segnali riproduttivi per indurre la riproduzione in sistemi ex situ 14. Complementari a questi interventi attivi sono il recente riconoscimento dei vantaggi dell'alimentazione eterotrofica nei coralli sottoposti a stress ad alta temperatura15 e l'esplorazione del ruolo che la fornitura di cibo può svolgere nella riproduzione16.

È noto che l'alimentazione eterotrofica influenza le prestazioni dei coralli17 ed è stata specificamente collegata all'aumento della crescita dei coralli18,19, nonché alla resistenza termica e alla resilienza20,21. Tuttavia, i benefici dell'eterotrofia non sono onnipresenti tra le specie di corallo 22 e possono differire in base al tipo di cibo consumato23, nonché al livello di esposizione alla luce24. Nel contesto della riproduzione dei coralli, l'alimentazione eterotrofica ha mostrato risultati variabili, con osservazioni di capacità riproduttive superiori a25 e inferiori a26 a seguito dell'alimentazione eterotrofica. L'influenza dell'alimentazione eterotrofica sulla riproduzione dei coralli attraverso uno spettro di temperature è raramente valutata, ma nel corallo temperato Cladocora caespitosa, l'eterotrofia è risultata più importante per la riproduzione in condizioni di temperatura più bassa27. Una migliore comprensione del ruolo della temperatura e dell'alimentazione sulla produzione riproduttiva è probabilmente necessaria per determinare se specifiche barriere coralline (ad esempio, barriere coralline associate ad un'elevata disponibilità di cibo28) possiedono una maggiore capacità di reclutamento sotto il cambiamento climatico.

Analogamente alla produzione riproduttiva, l'effetto della temperatura e dell'alimentazione sui tempi riproduttivi nei coralli rimane relativamente poco studiato, nonostante la sincronizzazione della riproduzione con le condizioni abiotiche/biotiche sia una considerazione importante per il successo del reclutamento in un oceano che si sta riscaldando29. È stato dimostrato che temperature più calde si traducono in una riproduzione più precoce negli studi di condizionamento termico dei coralli condotti in laboratorio30, e questo è stato osservato anche nei coralli raccolti dalle barriere coralline naturali durante le stagioni31. Tuttavia, è interessante notare che la tendenza opposta è stata recentemente osservata nei coralli nutriti coltivati nel corso di 1 anno in un sistema di flusso ex situ (cioè, la riproduzione è avvenuta prima nel ciclo lunare a temperature invernali più fredde e più tardi nel ciclo lunare a temperature estive più calde)32. Questo risultato contrastante suggerisce che i tempi riproduttivi possono allontanarsi dai modelli tipici in condizioni associate a abbondanti risorse energetiche.

Esperimenti controllati a lungo termine in diversi scenari di temperatura potrebbero contribuire a una migliore comprensione dell'influenza dell'eterotrofia sulla riproduzione nei coralli scleractiniani. Mantenere le colonie di coralli che si riproducono in condizioni ex situ per cicli riproduttivi multipli, tuttavia, può essere difficile (ma si vedano ricerche precedenti32,33). In questo articolo vengono descritte tecniche semplici ed efficaci per l'alimentazione attiva (fonte alimentare: naupli di Artemia) e la coltura a lungo termine di un corallo in cova (Pocillopora acuta) in un sistema di acquacoltura a flusso continuo; Tuttavia, va notato che tutte le tecniche descritte possono essere utilizzate anche nei sistemi di acquacoltura a ricircolo. Per dimostrare queste tecniche, è stato condotto un confronto preliminare della produzione riproduttiva e dei tempi delle colonie di coralli mantenute a 24 °C e 28 °C sotto trattamenti "nutriti" e "non nutriti". Queste temperature sono state scelte per approssimare le temperature dell'acqua di mare in inverno e in estate, rispettivamente, nel sud di Taiwan30,34; Non è stata scelta una temperatura più alta perché la promozione di una coltura ex situ a lungo termine, piuttosto che testare la risposta dei coralli allo stress termico, era un obiettivo primario di questo esperimento. Inoltre, è stata quantificata la densità dei naupli di Artemia prima e dopo le sessioni di alimentazione per confrontare la fattibilità dell'alimentazione eterotrofica a entrambi i trattamenti di temperatura.

In particolare, 24 colonie di P. acuta (estensione lineare totale media ± deviazione standard: 21,3 cm ± 2,8 cm) sono state ottenute da vasche a flusso continuo presso le strutture di ricerca del Museo Nazionale di Biologia Marina e Acquario, nel sud di Taiwan. Pocillopora acuta è una specie di corallo comune che possiede sia una strategia riproduttiva di trasmissione, ma tipicamente cova35,36. Le colonie parentali di questi coralli sono state originariamente raccolte dalla barriera corallina di Outlet (21.931°E, 120.745°N) circa 2 anni prima per unaltro esperimento. Di conseguenza, le colonie di corallo utilizzate nel presente esperimento sono state allevate per tutta la loro vita in condizioni di coltura ex situ; in particolare, le colonie sono state esposte a temperatura ambiente e a un ciclo luce:buio di 12 h:12 h a 250 μmol quanti m−2·s−1 e sono state alimentate con naupli di Artemia due volte a settimana. Riconosciamo che questa coltura ex situ a lungo termine potrebbe aver influenzato il modo in cui le colonie hanno risposto alle condizioni di trattamento in questo esperimento. Vorremmo quindi sottolineare che l'obiettivo principale qui è quello di illustrare come le tecniche descritte possano essere efficacemente utilizzate per la coltura dei coralli ex situ, dimostrando un esempio applicato in cui sono stati valutati gli effetti della temperatura e dell'alimentazione sulla riproduzione dei coralli.

Le colonie di corallo sono state distribuite uniformemente in sei vasche di coltura del sistema a flusso continuo (lunghezza interna vasca x larghezza x altezza: 175 cm x 62 cm x 72 cm; regime di luce della vasca: 12 h:12h ciclo luce:buio a 250 μmol quanti m−2·s−1) (Figura 1A). La temperatura in tre dei serbatoi è stata fissata a 28 °C e la temperatura negli altri tre serbatoi è stata fissata a 24 °C; ogni serbatoio aveva un logger che registrava la temperatura ogni 10 minuti (vedi Tabella dei Materiali). La temperatura è stata controllata in modo indipendente in ogni serbatoio utilizzando refrigeratori e riscaldatori e la circolazione dell'acqua è stata mantenuta utilizzando motori di flusso (vedere la tabella dei materiali). Metà delle colonie in ogni vasca (n = 2 colonie/vasca) sono state nutrite con naupli di Artemia due volte a settimana, mentre le altre colonie non sono state nutrite. Ogni sessione di alimentazione ha avuto una durata di 4 ore ed è stata condotta in due vasche di alimentazione indipendenti e specifiche per la temperatura. Durante l'alimentazione, tutte le colonie sono state spostate nelle vasche di alimentazione, comprese le colonie non alimentate, per standardizzare il potenziale effetto di stress dello spostamento delle colonie tra le vasche. Le colonie nei trattamenti alimentati e non alimentati sono state posizionate nel proprio compartimento utilizzando un telaio a rete all'interno delle vasche di alimentazione specifiche per la temperatura, in modo che solo le colonie in condizioni di alimentazione ricevessero cibo. La produzione riproduttiva dei coralli e i tempi sono stati valutati per ogni colonia ogni giorno alle 09:00 contando il numero di larve che erano state rilasciate nei contenitori di raccolta larvale durante la notte.

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Protocol

1. Colonie di corallo sospesein vasche di acquacoltura ex situ

  1. Posizionare una barra dentellata (lunghezza x larghezza x altezza: 75 cm x 1 cm x 3 cm), di seguito denominata "barra sospesa", attraverso la vasca di coltura in preparazione per appendere le colonie di coralli.
    NOTA: La barra appendiabiti utilizzata in questo esperimento è stata realizzata su misura, ma un semplice tubo in PVC con viti sporgenti (cioè per fungere da tacche) sarebbe sufficiente purché possa essere posizionato in modo stabile sulla parte superiore della vasca di coltura e sia abbastanza forte da contenere i coralli.
  2. Misurare un pezzo di lenza (vedere la tabella dei materiali) a ~1,5 m di lunghezza, quindi piegarlo a metà due volte.
    NOTA: La lunghezza iniziale della lenza deve essere scelta in base alla posizione finale desiderata della colonia di corallo nella vasca di coltura.
  3. Fai un piccolo nodo a rovescio all'estremità della lenza piegata che ha le estremità iniziali della lenza.
    NOTA: Dopo aver fatto il nodo, dovrebbero esserci due anelli grandi nella parte inferiore e un anello piccolo nella parte superiore.
  4. Posiziona la colonia di coralli al centro dei due grandi anelli in modo che gli anelli siano posizionati intorno alla colonia e possano trattenere saldamente il corallo quando è appeso nell'acqua.
  5. Agganciare il piccolo anello superiore della lenza in una tacca sulla barra di sospensione (Figura 1B).

2. Alimentazione dei coralli

  1. Preparazione del contenitore di alimentazione
    1. Costruisci una cornice rettangolare usando un tubo acrilico (lunghezza x larghezza x altezza: 25 cm x 60 cm x 25 cm). Realizzare due compartimenti separati nel telaio in cui possono essere collocati rispettivamente i coralli nutriti e non nutriti (Figura 1C).
      NOTA: Il tubo acrilico è stato utilizzato perché è leggero (cioè al contrario del tubo in PVC più pesante) e, quindi, potrebbe facilitare il movimento del contenitore di alimentazione dentro/fuori dalle vasche di coltura.
    2. Utilizzare una pistola per colla a caldo per far aderire 100 μm di rete di plancton al fondo e ai lati del telaio.
    3. Praticare un totale di ~10 piccoli fori (0,5 cm di diametro) nei tubi (soprattutto lungo i lati e il fondo del telaio) per evitare che il contenitore di alimentazione galleggi quando viene posizionato nella vasca di coltura.
    4. Praticare dei fori (~0,5 cm di diametro) attraverso la rete di plancton in ogni angolo del contenitore di alimentazione.
    5. Posizionare un tubo di 8 cm di lunghezza di 0,5 cm di diametro attraverso i fori angolari e utilizzare una pistola per colla a caldo per fissarlo in posizione.
      NOTA: Questi pezzi di tubo saranno collegati a una pompa ad aria e a pietre a bolle durante l'alimentazione (vedere il passaggio 2.3.2 per maggiori dettagli).
  2. Coltivazione dell'artemia
    1. Raccogliere 2 litri di acqua di mare da una vasca di alimentazione indipendente e versare l'acqua di mare in un contenitore per la schiusa di Artemia (Figura 1D).
      NOTA: Nel presente esperimento utilizzato per dimostrare i protocolli, sono state utilizzate due vasche di alimentazione indipendenti specifiche per il trattamento, che hanno richiesto la preparazione di due contenitori di schiusa per la coltivazione dell'Artemia .
    2. Collegare una pompa ad aria al tubo collegato al fondo del contenitore di schiusa per circa 10 minuti prima di aggiungere le cisti di artemia .
    3. Durante l'attesa, utilizzare una bilancia per misurare 8 g di cisti di Artemia (vedi Tabella dei Materiali).
      NOTA: Per ottenere una densità media di 35 singoli naupli di Artemia/mL, come suggerito da Huang et al.19, utilizzare un rapporto di 4 g di cisti di Artemia per 1 L di acqua di mare.
    4. Dopo 10 minuti, versare gli 8 g di cisti di Artemia nel contenitore di schiusa.
    5. Incubare le cisti di Artemia per 48 ore.
  3. Preparazione della vasca di alimentazione
    1. Posizionare il contenitore di alimentazione nel serbatoio di alimentazione in modo che la parte superiore del contenitore sia sopra la superficie dell'acqua.
    2. Collegare la parte esterna del tubo angolare del contenitore di alimentazione a una pompa ad aria, che fornirà aria alle pietre a bolle per facilitare la circolazione dell'acqua durante l'alimentazione.
    3. Accendere la pompa dell'aria ~5 minuti prima dell'inizio dell'alimentazione.
  4. Arricchimento e raccolta dei naupli di Artemia
    1. Aggiungere 1,5 ml di dieta di arricchimento (vedere la tabella dei materiali) nel contenitore di schiusa 2 ore prima dell'ora di alimentazione desiderata.
      NOTA: Un rapporto di 0,75 ml di dieta di arricchimento per 1 litro di acqua di mare è raccomandato da Huang et al.19.
    2. Dopo 2 ore, chiudere la valvola che fornisce aria al contenitore di schiusa.
    3. Coprire il contenitore di schiusa con una scatola di cartone per escludere la luce ambientale e posizionare una fonte di luce (è sufficiente una torcia per cellulare) alla base del contenitore di schiusa per 5 minuti per attirare i naupli di Artemia sul fondo del contenitore e facilitare così la separazione dei naupli di Artemia vivi dai gusci vuoti.
    4. Dopo 5 minuti, rimuovere la scatola e la fonte di luce.
    5. Posizionare una caraffa graduata da 3 L sotto il contenitore di schiusa.
    6. Staccare il tubo dal contenitore di schiusa per consentire ai naupli di Artemia e alla soluzione di acqua di mare di fluire nel misurino; raccogliere 1 L di soluzione di naupli e acqua di mare di Artemia .
      NOTA: Raccogliere solo metà del volume nel contenitore di tratteggio per escludere i gusci vuoti indesiderati.
    7. In prossimità della vasca di alimentazione, versare i naupli di Artemia e la soluzione di acqua di mare attraverso un colino da 100 μm per separare i naupli di Artemia (che rimarranno nel filtro) dall'acqua di mare.
    8. Sciacquare due volte i naupli di Artemia tenuti all'interno del colino con l'acqua del serbatoio di alimentazione.
    9. I naupli di Artemia sono ora pronti per essere utilizzati.
  5. Nutrire le colonie di coralli
    1. Scaricare i naupli di Artemia posizionando il filtro dal punto 2.4.8 nel serbatoio di alimentazione.
    2. Mescolare a mano l'acqua nel serbatoio per distribuire uniformemente i naupli di Artemia .
      NOTA: Raccogliere campioni per la quantificazione "pre-alimentazione" della densità dei naupli di Artemia dopo questa fase (vedere il passaggio 3.1 per maggiori dettagli).
    3. Sposta ogni barra sospesa (con le colonie di corallo ancora appese alla barra) dalla vasca di coltura alla vasca di alimentazione e posiziona la barra in modo che sia saldamente appoggiata sulla parte superiore della vasca di alimentazione. La durata dell'esposizione dei coralli all'aria deve essere la più breve possibile.
      NOTA: Assicurarsi che le colonie non si tocchino e che abbiano spazio sufficiente per catturare il cibo (ad esempio, ~5 cm di distanza).
    4. Spegnere le luci nei serbatoi di alimentazione o utilizzare un coperchio non ermetico per coprire il serbatoio di alimentazione per evitare disturbi leggeri durante l'alimentazione.
    5. Lasciare che le colonie si nutrano indisturbate per 4 ore.
    6. Dopo 4 ore, raccogliere i campioni per la quantificazione "post-alimentazione" della densità dei naupli di Artemia (vedere il punto 3.1 per maggiori dettagli).
  6. Pulizia post-alimentazione
    1. Al termine della sessione di alimentazione, rimuovere le colonie di corallo. Estrarre singolarmente le barre sospese dalla vasca di alimentazione e sciacquare accuratamente ogni corallo con acqua di mare dalla rispettiva vasca di coltura per rimuovere eventuali naupli residui di Artemia .
      NOTA: Sciacquare le colonie su una superficie stabile piuttosto che appese per ridurre il rischio di danni che potrebbero verificarsi se le colonie dovessero oscillare avanti e indietro durante il risciacquo. Come per il trasferimento iniziale, mantieni la durata per la quale i coralli sono esposti all'aria il più breve possibile.
    2. Rimetti le barre sospese (con i coralli appesi) nelle vasche di coltura.
    3. Staccare i tubi che collegano il contenitore di alimentazione alla pompa dell'aria e rimuovere il contenitore di alimentazione dal serbatoio di alimentazione.
    4. Sciacquare accuratamente il contenitore di alimentazione con acqua dolce per rimuovere tutti i naupli di Artemia rimanenti.

3. Quantificazione della densità dei naupli di Artemia prima e dopo l'alimentazione

  1. Raccolta dei campioni
    1. Raccogliere i campioni in due momenti: in primo luogo, quando i naupli di Artemia sono stati scaricati e distribuiti uniformemente nel contenitore di alimentazione (passaggio 2.5.2) e di nuovo dopo che la sessione di alimentazione è stata completata (passaggio 2.5.6).
    2. Per ogni punto temporale, utilizzare tre siringhe per prelevare 20 ml di acqua rispettivamente dalla superficie, dallo strato intermedio e dallo strato inferiore del contenitore di alimentazione.
  2. Diluizione del campione
    1. Per ogni siringa, trasferire i 20 mL di campione d'acqua in un becher indipendente da 500 mL.
    2. Aggiungere 180 mL di acqua calda (~60 °C) nel becher (diluizione 1:10).
      NOTA: L'acqua calda viene utilizzata per immobilizzare i naupli di Artemia per aumentare l'accuratezza dell'enumerazione.
    3. Aggiungere 2 ml del campione d'acqua dal becher in ciascun pozzetto di una piastra a 9 pozzetti.
      NOTA: Mescolare il campione nel becher per distribuire uniformemente i naupli di Artemia nella colonna d'acqua prima di prelevare i 2 ml di campione.
    4. Contare il numero di naupli di Artemia in ciascun pozzetto sotto uno stereomicroscopio utilizzando un ingrandimento 6,5x (vedere la tabella dei materiali).
  3. Calcolo della densità dei naupli di Artemia
    1. Dividere il numero di naupli di Artemia in ciascun pozzetto per 2 per ottenere il numero di naupli di Artemia per ml. Quindi, moltiplica quel numero per 10 (per tenere conto della diluizione) per calcolare la densità dei naupli di Artemia .
    2. Calcolare la densità media dei naupli di Artemia (cioè la densità media tra le repliche dei 27 pozzetti prima e dopo l'alimentazione) per confrontare la densità dei naupli di Artemia tra pre e post-alimentazione.

4. Raccolta delle larve di corallo

  1. Realizzazione del contenitore per la raccolta delle larve (Figura 1E)
    1. Scegli una bottiglia d'acqua di plastica da 6 L e taglia completamente il fondo della bottiglia.
      NOTA: Questa apertura verrà utilizzata per trasferire le colonie dentro e fuori dal contenitore di raccolta delle larve.
    2. Crea due finestre ritagliando un rettangolo di ~15 cm x 20 cm da ciascun lato della bottiglia.
      NOTA: Una bottiglia d'acqua in plastica da 6 L è adatta per coralli di ~15 cm di diametro; Modificare la dimensione della bottiglia in base alla dimensione dei coralli studiati.
    3. Utilizzare una pistola per colla a caldo e poi resina epossidica per far aderire una rete di plancton da 100 μm su ciascuna delle finestre.
    4. Crea due piccoli fori (~0,5 cm di diametro) su ciascun lato del fondo della bottiglia.
    5. Metti uno spago attraverso i due piccoli fori e lega entrambe le estremità per creare una maniglia per agganciare il contenitore di raccolta delle larve alla barra appendiabiti.
    6. Prima dell'uso iniziale, posizionare i flaconi in una vasca a flusso continuo (senza coralli) per almeno 24 ore per rimuovere eventuali residui di colla.
  2. Preparazione per la raccolta dei coralli
    1. Immergere completamente il contenitore di raccolta delle larve nella vasca di coltura.
    2. Posizionare la colonia nel contenitore di raccolta delle larve mantenendo sia la colonia che il contenitore immersi nell'acqua.
    3. Agganciare la maniglia del contenitore per la raccolta delle larve alla barra appendiabiti.
      NOTA: Dopo averlo appeso, assicurarsi che la parte superiore del contenitore di raccolta sia ~3 cm sopra l'acqua.
    4. Ripetere i passaggi da 4.2.1 a 4.2.3 fino a quando tutte le colonie sono nei loro contenitori di raccolta delle larve.
  3. Raccolta ed enumerazione delle larve di corallo
    1. Preparare un misurino da 3 litri, una ciotola, una pipetta da 3 ml e provette da 50 ml.
    2. Sganciare la lenza dalla barra sospesa e rimuovere una colonia dal contenitore di raccolta delle larve. Rimetti immediatamente la colonia nella vasca di coltura.
      NOTA: Assicurarsi che la durata dell'esposizione all'aria sia la più breve possibile.
    3. Posizionare una mano sull'estremità del tappo del contenitore di raccolta delle larve.
      NOTA: Quando il contenitore di raccolta delle larve è pieno d'acqua, può essere pesante. Senza un supporto adeguato, il contenitore può rompersi quando viene rimosso dall'acqua.
    4. Sganciare la "maniglia" del contenitore di raccolta delle larve dalla barra appendiabiti.
    5. Sollevare lentamente il contenitore di raccolta delle larve dall'acqua.
    6. Tenere il contenitore di raccolta con un angolo di circa 45° sopra il serbatoio di coltura per alcuni secondi per consentire all'acqua in eccesso di rifluire nel serbatoio attraverso le finestre del contenitore di raccolta delle larve.
      NOTA: Non inclinare il contenitore oltre i 45° per mitigare la possibilità di fuoriuscire larve dalla parte superiore del contenitore.
    7. Rimuovere il contenitore di raccolta delle larve dal serbatoio e posizionarlo sopra la caraffa graduata.
    8. Prima di svitare il tappo, utilizzare un dito per applicare una moderata pressione contro il tappo, quindi svitare il tappo.
      NOTA: L'acqua all'interno del contenitore di raccolta può essere rilasciata rapidamente quando il tappo viene rimosso se non viene prima sostenuto da un dito (ad esempio, con conseguente potenziale perdita di larve).
    9. Trasferisci un po' d'acqua all'interno della caraffa graduata in una ciotola.
    10. Contare manualmente il numero di larve nella ciotola utilizzando una pipetta da 3 ml per spostare le larve in una provetta da 50 ml.
      NOTA: Tenere presente che alcune larve potrebbero rimanere bloccate all'interno della pipetta. In tal caso, aspirare un po' di acqua di mare nella pipetta e agitare delicatamente sigillando la pipetta con un dito per sciogliere le larve.
    11. Continuare i passaggi 4.3.9 e 4.3.10 fino a contare tutte le larve. In questa fase, le larve possono essere utilizzate in esperimenti successivi.
    12. Ripetere i passaggi 4.3.2-4.3.10 per tutte le altre colonie di corallo.
      NOTA: Il misurino e la ciotola devono essere risciacquati tra una colonia e l'altra.
    13. Al termine del conteggio, sciacquare accuratamente ogni contenitore di raccolta con acqua dolce, in particolare le finestre.

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Representative Results

I protocolli descritti hanno permesso (1) il confronto della produzione riproduttiva e dei tempi delle singole colonie di coralli tra diversi trattamenti di alimentazione e temperatura e (2) una valutazione della fattibilità dell'alimentazione dei naupli di Artemia a diverse temperature. Di seguito, viene fornita una breve panoramica dei risultati, ma è necessario prestare attenzione per quanto riguarda l'interpretazione estensiva degli effetti riportati della temperatura e dell'alimentazione sulla riproduzione dei coralli a causa della natura a breve termine di questo esperimento (cioè, un solo ciclo riproduttivo) e dell'uso di colonie di coralli acclimatate a condizioni ex situ .

Ogni colonia si è riprodotta nel corso del nostro periodo di monitoraggio (settembre lunare 2022) e la produzione riproduttiva mensile totale ha mostrato un'elevata variazione tra le colonie. Il numero totale di larve rilasciate dalle colonie variava da 6 a 319, ad eccezione di una colonia (nel trattamento non nutrito a 24 °C) che ha prodotto 528 larve; i dati per tutte le colonie sono mostrati nella Figura 2, ma la colonia anomala ad alta produzione non è stata inclusa nell'analisi dei dati. La produzione riproduttiva è stata influenzata dalla temperatura (modello lineare generalizzato a effetti misti; z = 5,35, p < 0,001) e dall'alimentazione (z = 3,01, p < 0,003), con una significativa interazione riscontrata tra la temperatura e i trattamenti di alimentazione (z = 12,22, p < 0,001). Le colonie coltivate a 28 °C hanno rilasciato più larve quando non sono state nutrite (media ± deviazione standard; 151 ± 82) rispetto a quando sono state alimentate (131 ± 133) (modello lineare generalizzato a effetti misti, contrasto post hoc; z = 3,01, p = 0,014), ma la tendenza opposta è stata riscontrata nelle colonie coltivate a 24 °C, per cui le colonie alimentate (80 ± 78) hanno prodotto più larve rispetto alle colonie non nutrite (12 ± 6) (z = 11,91, p < 0,001).

La riproduzione in tutte le colonie avveniva prima della luna piena (giorno lunare 15) (Figura 3). Il giorno lunare medio (MLD) di rilascio larvale (ponderato in base alla produzione riproduttiva) variava dal giorno lunare 6,5 al giorno lunare 11,1, con una differenza significativa tra i trattamenti rilevata solo tra le colonie "non nutrite a 28 °C", che si riproducevano all'inizio del ciclo lunare, e le colonie "alimentate a 24 °C", che si riproducevano più tardi nel ciclo lunare (modello lineare a effetti misti, Contrasto post hoc, t = 4,10, p = 0,006).

Nel mese precedente al monitoraggio formale della riproduzione (agosto lunare 2022), la densità dei naupli di Artemia è stata valutata prima e dopo le sessioni di alimentazione; questo è stato ripetuto in tre momenti: all'inizio della coltura del corallo per questo esperimento (T0) e 2 settimane e 4 settimane nella coltura del corallo in condizioni di trattamento (Figura 4). La valutazione iniziale a T0 non ha mostrato alcuna differenza tra la densità pre e post-alimentazione dei naupli di Artemia in entrambi i trattamenti di temperatura. Dopo 2 settimane e 4 settimane di coltura, la densità dei naupli di Artemia era inferiore dopo l'alimentazione in entrambi i trattamenti termici (settimana 2: ANOVA a due vie, F 1.104 = 128,45, p < 0,001; settimana 4: ANOVA a due vie, F1.104 = 294,71, p < 0,001). Non c'è stata alcuna differenza nella densità di pre-alimentazione tra i trattamenti di temperatura (p > 0,05) o nella densità di post-alimentazione tra i trattamenti di temperatura (p > 0,05) in nessuno dei tre punti temporali valutati.

Tutte le analisi sono state condotte in R utilizzando i pacchetti lme437, lmerTest 38, emmeans39, car 40 e Hmisc41. I dati e lo script R usati per le analisi sono disponibili pubblicamente su GitHub (https://github.com/CJ-McRae/Lam-et-al_JoVE-submission).

Figure 1
Figura 1: Schema del disegno sperimentale e dei materiali rappresentativi per l'alimentazione e la coltura ex situ di un corallo scleractiniano in cova. (A) Le colonie di Pocillopora acuta sono state coltivate in vasche di acquacoltura a flusso continuo a 24 °C o 28 °C in condizioni di alimentazione e non alimentazione; I cerchi neri rappresentano le colonie. (B) Le colonie sono state appese con lenze da pesca per ridurre lo stress da manipolazione e per promuovere un movimento efficiente tra la coltura e le vasche di alimentazione. (C) Durante le sessioni di alimentazione, tutte le colonie sono state spostate in un telaio a maglie all'interno di vasche di alimentazione specifiche per la temperatura. Le colonie alimentate sono state posizionate in un compartimento del telaio, mentre le colonie non alimentate sono state posizionate nell'altro compartimento del telaio; Solo le colonie nutrite ricevevano cibo. (D) I naupli di Artemia arricchita sono stati somministrati alle colonie in trattamento alimentare due volte a settimana. (E) Le colonie sono state messe in contenitori per la raccolta delle larve durante la notte per quantificare la produzione riproduttiva giornaliera nel corso di un ciclo lunare. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Produzione riproduttiva delle colonie di Pocillopora acuta a diverse temperature (24 °C vs. 28 °C) e trattamenti di alimentazione (fed vs. non fused). Le lettere sono rappresentative di differenze significative nella produzione riproduttiva tra i trattamenti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Tempi riproduttivi delle colonie di Pocillopora acuta a diverse temperature (24 °C vs. 28 °C) e trattamenti di alimentazione (fed vs. non fused). La linea tratteggiata verticale mostra il giorno lunare medio (MLD) di riproduzione per ogni trattamento. Le tonalità di colore all'interno di ciascuna barra degli appezzamenti specifici per il trattamento (A-D) indicano il contributo delle singole colonie alla riproduzione totale giornaliera. Le lettere sono rappresentative di differenze significative nei tempi riproduttivi tra i trattamenti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Densità dei naupli di Artemia prima e dopo le sessioni di alimentazione dei coralli all'interno dei trattamenti di temperatura di 24 °C e 28 °C. La densità di pre-alimentazione è stata calcolata prima dell'alimentazione dei coralli e la densità di post-alimentazione è stata calcolata dopo il completamento di una sessione di alimentazione dei coralli di 4 ore. La densità dei naupli di Artemia è stata valutata all'inizio della coltura del corallo (T0) e poi dopo 2 settimane e 4 settimane in condizioni di trattamento in un sistema di acquacoltura a flusso continuo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Questa valutazione preliminare dell'effetto della temperatura e dell'alimentazione sulla riproduzione dei coralli ha rivelato differenze nella produzione riproduttiva e nei tempi tra le colonie coltivate in condizioni di trattamento distinte. Inoltre, è stato riscontrato che l'alimentazione di naupli di Artemia alle colonie di coralli sembrava essere efficace a temperature relativamente fresche (24 °C) e calde (28 °C). Questi risultati combinati evidenziano l'applicabilità di queste semplici tecniche per l'alimentazione e la coltura di coralli scleractiniani riproduttori (usando P. acuta come esempio) in sistemi di acquacoltura ex situ .

Nel contesto della produzione riproduttiva, è stato riscontrato che l'alimentazione ha un'influenza diversa a seconda del trattamento termico in cui le colonie sono state coltivate, per cui l'alimentazione sembra avere un effetto positivo sulla produzione riproduttiva solo nelle colonie tenute nel trattamento a 24 °C. Questo risultato è in qualche modo sorprendente poiché in altri organismi marini, la limitata fornitura di cibo ad alte temperature ha mostrato un effetto negativo sulla riproduzione (ad esempio, riduzione della deposizione delle uova nelle castagnole42) ed è stato associato a uno scarso sviluppo delle prime fasi di vita (ad esempio, maggiore mortalità e ridotta crescita nei granchi durante la metamorfosi43). Nei coralli, valutazioni specifiche degli effetti interattivi dell'alimentazione e della temperatura si sono concentrate principalmente sulle prestazioni fotochimiche dei simbionti algali del corallo44,45, e questi effetti interattivi sono raramente esplorati nel contesto della riproduzione. Sono necessari studi futuri che mirino a una valutazione completa degli effetti basati sulla riproduzione dell'alimentazione a temperature diverse nel corso di più cicli riproduttivi. Questo, tuttavia, non era l'obiettivo del presente esperimento. Invece, questo esperimento è stato utilizzato principalmente per dimostrare l'efficacia delle tecniche di alimentazione e coltura presentate. Attraverso l'uso di queste tecniche, è possibile valutare facilmente chiare tendenze riproduttive delle singole colonie, il che è importante, poiché la variazione tra colonie nella produzione riproduttiva non è rara. Ad esempio, è stata riscontrata un'ampia gamma di output riproduttivo tra le colonie, così come nel tempo per la stessa singola colonia, in più studi 30,32,46,47. Le possibili spiegazioni per l'elevata variabilità nella produzione riproduttiva includono la plasticità nelle strategie riproduttive e/o i cambiamenti nella priorità dell'allocazione dell'energia48,49. Le tecniche che consentono valutazioni specifiche della produzione riproduttiva per colonia, come quelle descritte in questo esperimento, possono aiutare a identificare i driver ambientali/genetici della capacità riproduttiva, pertinenti alla nostra comprensione del reclutamento dei coralli (cioè rilevanti per la resilienza naturale della barriera corallina) e del potenziale di approvvigionamento dei riproduttori (cioè rilevanti per la coltivazione ex situ volta a sostenere il ripristino dei coralli).

La valutazione dei tempi riproduttivi in questo esperimento ha rivelato che solo le colonie nel trattamento "non nutrite a 28 °C" hanno rilasciato le larve significativamente prima rispetto alle colonie nel trattamento "nutrite a 24 °C"; La tempistica è rimasta simile tra gli altri trattamenti. La plasticità guidata dalla temperatura nei tempi riproduttivi è stata osservata in più specie di coralli, con tempi avanzati osservati a temperature più calde50,51,52. Questo cambiamento di tempo è probabilmente spiegato dallo sviluppo accelerato dei gameti e degli embrioni a temperature più calde53, che sotto il cambiamento climatico, potrebbe in ultima analisi avere un'influenza adattativa o dirompente sulla riproduzione e sul reclutamento dei coralli54,55,56. Gli esperimenti che esaminano esplicitamente la possibile relazione interattiva tra alimentazione e temperatura sui tempi riproduttivi potrebbero fornire una migliore comprensione delle conseguenze dei cambiamenti temporali e potrebbero anche testare la praticità di aumentare la frequenza dei cicli riproduttivi per migliorare la produzione dell'acquacoltura ex situ.

Sono necessarie efficaci tecniche di alimentazione ex situ per condurre esperimenti controllati che esplorino la potenziale relazione interattiva tra temperatura e alimentazione sulla riproduzione dei coralli. In questo esperimento, le colonie di coralli sono state alimentate in vasche di alimentazione a temperatura specifica a 24 °C e 28 °C, e modelli simili nella densità pre e post-alimentazione dei naupli di Artemia sono stati trovati in tutti i trattamenti di temperatura (ad esempio, una minore densità di naupli di Artemia post-alimentazione rispetto a pre-alimentazione). Ciò è indicativo di tre punti importanti: (1) il trattamento termico non sembra influire sulla salute dei naupli di Artemia; (2) i tassi di alimentazione delle colonie di coralli erano approssimativamente gli stessi ad entrambe le temperature; e (3) le colonie di corallo hanno consumato naupli di Artemia durante le sessioni di alimentazione a entrambe le temperature (ad eccezione del punto temporale T0, che può essere indicativo dello stress della colonia durante l'acclimatazione alle condizioni sperimentali). È importante sottolineare che l'interpretazione delle tendenze di densità tra i trattamenti di temperatura e nel tempo serve solo come valutazione basata su proxy. Sarebbe necessaria un'indagine approfondita per confermare l'alimentazione (ad esempio, l'esame del contenuto intestinale57) e la fisiologia dei naupli di Artemia (ad esempio, l'espressione della proteina da shock termico58) per trarre conclusioni definitive sulla fattibilità dell'alimentazione; Una valutazione di questa natura esula dall'ambito di questo esperimento. Tuttavia, sulla base dei dati dell'esperimento e della conferma visiva durante l'alimentazione, siamo fiduciosi che le colonie di coralli in questo esperimento si stessero nutrendo attivamente a entrambe le temperature di trattamento. I coralli possono mostrare risposte contrastanti all'alimentazione ad alte temperature, con alcune specie che mostrano una riduzione e altre che mostrano un aumento del tasso di alimentazione45. Pertanto, la tolleranza alla temperatura specifica della specie e del luogo dovrebbe essere presa in considerazione quando si determinano le temperature di alimentazione negli esperimenti futuri.

Le tecniche di alimentazione e coltura descritte offrono diversi vantaggi che cercano di migliorare sia la qualità della salute dei coralli che la longevità della riproduzione nell'acquacoltura ex situ. L'obiettivo generale che ha guidato questo approccio descritto è stato fondato sulla riduzione al minimo delle potenziali fonti di stress dei coralli. Per cominciare, la necessità di gestire direttamente le colonie di coralli è stata eliminata utilizzando lenze da pesca per appendere i coralli. Ciò facilita il movimento efficiente delle colonie tra le vasche di coltura e di alimentazione e consente di regolare in modo semplice e veloce la posizione della colonia (ad esempio, accorciare o allungare la lenza per modificare la profondità della colonia nella vasca). A differenza delle colonie posizionate su un supporto o sul fondo di una vasca di coltura, appendere le colonie promuove la crescita in tutte le dimensioni, riduce l'accumulo di alghe e crea più spazio utilizzabile nella vasca (ad esempio, più coralli possono essere sospesi verticalmente su una singola lenza, se necessario)59. Oltre a ridurre la necessità di compromessi energetici60, che possono aiutare a promuovere la riproduzione a lungo termine32, le tecniche di alimentazione descritte hanno anche contribuito a ridurre lo stress dei coralli. Si raccomanda l'alimentazione in vasche indipendenti19,61 (al contrario di direttamente nelle vasche di coltura) per mitigare l'esposizione dei coralli a livelli di nutrienti potenzialmente elevati, che possono essere dannosi per la salute dei coralli e portare a un'abbondante crescita algale62,63,64,65. Inoltre, se sorgono problemi di qualità dell'acqua, la manutenzione e il cambio dell'acqua all'interno delle vasche di alimentazione possono essere eseguiti facilmente senza disturbare le colonie di corallo. I contenitori per la raccolta delle larve sono stati progettati anche pensando alla riduzione dello stress dei coralli, in modo che la riproduzione specifica della colonia potesse essere ottenuta senza manipolazione diretta o la necessità di coltura in vasche a colonia singola. Avere più colonie in grandi vasche di coltura può aiutare a migliorare la longevità riproduttiva (specialmente nelle specie di corallo con modalità riproduttive miste49), che ha dimostrato di diminuire nel tempo nei sistemi ex situ 66,67. Inoltre, l'utilizzo di bottiglie di plastica di grandi dimensioni come contenitori per la raccolta delle larve fornisce alle larve uno spazio abbondante, che può ridurre l'assestamento sul contenitore di raccolta stesso; La liquidazione rapida può essere problematica quando si utilizzano piccoli contenitori di raccolta (McRae e Lam, osservazioni personali). Infine, queste tecniche di alimentazione e coltura ex situ utilizzano materiali economici, facili da realizzare e personalizzabili in base alle esigenze specifiche dell'esperimento.

I principali limiti delle tecniche di alimentazione e coltura descritte includono 1) un limite finito al numero di colonie che possono essere coltivate a causa dei requisiti di spazio in vasca, 2) l'incapacità di standardizzare la modalità riproduttiva (sessuale vs. asessuata) a causa di più colonie coltivate all'interno della stessa vasca e 3) l'uso di una singola specie da un singolo sito di barriera corallina per testare l'efficacia delle tecniche descritte. La ricerca futura trarrebbe vantaggio dal testare come si comportano altre specie di corallo utilizzando queste tecniche di alimentazione e coltura, nonché dall'esplorare l'uso di altri tipi di cibo per soddisfare al meglio le esigenze dietetiche specifiche della specie.

In conclusione, si riconosce che le critiche ad altri interventi attivi 68,69,70 sono probabilmente applicabili anche alla promozione della coltura ex situ per la riproduzione dei coralli, poiché le limitazioni chiave (ad esempio, scalabilità, diversità genetica) rimangono rilevanti. Tuttavia, analogamente ad altri interventi attivi, la coltura del corallo ex situ non è destinata a essere vista come una soluzione singolare, ma piuttosto come un approccio di supporto che dovrebbe essere esplorato in tandem con significative mitigazioni del cambiamento climatico. Attraverso l'uso delle tecniche descritte, lo stress dei coralli può essere ridotto per migliorare la longevità riproduttiva di un corallo scleractiniano, P. acuta, in sistemi di acquacoltura ex situ, da cui le colonie (e la loro prole) possono contribuire alla ricerca e agli sforzi di ripristino.

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Disclosures

Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti o altri conflitti di interesse.

Acknowledgments

Questa ricerca è stata finanziata dal Ministero della Scienza e della Tecnologia (Taiwan), con i numeri di sovvenzione MOST 111-2611-M-291-005 e MOST 111-2811-M-291-001.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Artemia cysts  Supreme plus NA Food source 
Chiller Resun CL650 To cool down water temperature if needed
Conductivity portable meter WTW Cond 3110 To measure salinity
Enrichment diets Omega NA Used in Artemia cultivation
Fishing line Super Nylon monofilament To hang the coral colonies
Flow motors Maxspect GP03 To create water flow
Heater 350 W ISTA NA Heaters used in tanks
HOBO pendant temperature logger Onset Computer UA-002-08 To record water temperature
LED lights Mean Well FTS: HLG-185H-36B NA
Light portable meter LI-COR LI-250A Device used with light sensor to measure light intensity in PAR
Light sensor LI-COR LI-193SA NA
Plankton net 100 µm mesh size Omega NA To collect larvae and artemia 
Primary pump 6000 L/H Mr. Aqua BP6000 To draw water from tanks into chiller
Propeller-type current meter KENEK GR20 Device used with propeller-type detector to measure flow rate
Propeller-type detector KENEK GR3T-2-20N NA
Stereo microscope Zeiss Stemi 2000-C  To count the number of artemia 
Temperature controller 1000 W Rep Park O-RP-SDP-1 To set and maintain water temperature

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Tecniche di alimentazione Coltura ex situ Corallo sclerattino in cova Pocillopora Acuta Cambiamento climatico Degrado della barriera corallina Protocolli di coltura dei coralli Salute e riproduzione Fornitura di riproduttori Progetti di ripristino Effetti della temperatura Trattamenti di alimentazione Produzione riproduttiva
Tecniche efficaci per l'alimentazione e la coltura <em>ex situ</em> di un corallo scleractiniano in cova, <em>Pocillopora acuta</em>
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Lam, K. W., McRae, C. J., Liu, Z.… More

Lam, K. W., McRae, C. J., Liu, Z. T., Zhang, X. C., Fan, T. Y. Effective Techniques for the Feeding and Ex Situ Culture of a Brooding Scleractinian Coral, Pocillopora acuta. J. Vis. Exp. (196), e65395, doi:10.3791/65395 (2023).

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