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Biology

Técnicas Eficazes para a Alimentação e Cultura Ex Situ de um Corais Escleractíneos Reprodutores, Pocillopora acuta

Published: June 23, 2023 doi: 10.3791/65395
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1,2
1Department of Planning and Research, National Museum of Marine Biology & Aquarium, 2Department of Marine Biotechnology and Resources, National Sun Yat-sen University

Summary

As mudanças climáticas estão impactando os ecossistemas de recifes de coral globalmente. Corais provenientes de sistemas de aquicultura ex situ podem ajudar a apoiar os esforços de restauração e pesquisa. Neste trabalho, são descritas técnicas de alimentação e cultura de corais que podem ser usadas para promover a manutenção a longo prazo de corais escleractíneos reprodutores ex situ .

Abstract

As mudanças climáticas estão afetando a sobrevivência, o crescimento e o recrutamento de corais globalmente, com mudanças em grande escala na abundância e composição da comunidade esperadas nos ecossistemas recifais nas próximas décadas. O reconhecimento dessa degradação dos recifes levou a uma série de novas intervenções ativas baseadas em pesquisa e restauração. A aquicultura ex situ pode desempenhar um papel de apoio através do estabelecimento de protocolos robustos de cultura de corais (por exemplo, para melhorar a saúde e a reprodução em experimentos de longo prazo) e através do fornecimento de um suprimento consistente de matrizes (por exemplo, para uso em projetos de restauração). Aqui, técnicas simples para a alimentação e cultivo ex situ de corais escleractíneos reprodutores são delineadas usando o coral comum e bem estudado, Pocillopora acuta, como exemplo. Para demonstrar essa abordagem, colônias de corais foram expostas a diferentes temperaturas (24 °C vs. 28 °C) e tratamentos alimentares (alimentados vs. não alimentados) e a produção e época reprodutivas, bem como a viabilidade de alimentar náuplios de Artemia para corais em ambas as temperaturas, foram comparadas. A produção reprodutiva apresentou alta variação entre as colônias, com diferentes tendências observadas entre os tratamentos térmicos; a 24 °C, as colônias alimentadas produziram mais larvas do que as colônias não alimentadas, mas o oposto foi encontrado nas colônias cultivadas a 28 °C. Todas as colônias se reproduziram antes da lua cheia, e diferenças no tempo reprodutivo só foram encontradas entre colônias não alimentadas no tratamento a 28 °C e colônias alimentadas no tratamento a 24 °C (média do dia lunar de reprodução ± desvio padrão: 6,5 ± 2,5 e 11,1 ± 2,6, respectivamente). As colônias de corais alimentaram-se eficientemente de náuplios de Artemia em ambas as temperaturas de tratamento. Essas técnicas propostas de alimentação e cultivo têm como foco a redução do estresse dos corais e a promoção da longevidade reprodutiva de forma econômica e customizável, com aplicabilidade versátil tanto em sistemas de escoamento quanto em sistemas de recirculação aquícola.

Introduction

Muitos ecossistemas de recifes de coral em todo o mundo estão sendo perdidos e degradados como resultado do estresse de altas temperaturas impulsionado pelas mudanças climáticas 1,2. O branqueamento de corais (isto é, a quebra da simbiose coral-algal3) foi considerado relativamente raro no passado4 mas agora está ocorrendo com mais frequência5, com expectativa de que o branqueamento anual ocorra em muitas regiões em meados do século 6,7. Esse encurtamento do período intermediário entre os eventos de branqueamento pode limitar a capacidade de resiliência dos recifes8. Os impactos diretos do estresse de altas temperaturas nas colônias de corais (por exemplo, dano tecidual9; depleção de energia10) estão intrinsecamente ligados a impactos indiretos no nível da escala dos recifes, dos quais uma redução na capacidade reprodutiva/de recrutamento é particularmente preocupante11. Isso estimulou uma série de pesquisas aplicadas explorando, por exemplo, o aumento ativo in situ do recrutamento (por exemplo, semeadura de recifes12), novas tecnologias para a restauração de corais em escala 13 e a simulação de pistas reprodutivas para induzir a reprodução em sistemas ex situ 14. Complementam essas intervenções ativas o recente reconhecimento das vantagens da alimentação heterotrófica em corais sob estresse térmico15 e a exploração do papel que a provisão alimentar pode desempenhar na reprodução16.

Sabe-se que a alimentação heterotrófica influencia o desempenho dos corais17 e tem sido especificamente associada ao aumento do crescimento dos corais18,19, bem como à resistência térmica e resiliência20,21. No entanto, os benefícios da heterotrofia não são onipresentes entre as espécies de corais22 e podem diferir de acordo com o tipo de alimento consumido 23, bem como o nível de exposição à luz24. No contexto da reprodução dos corais, a alimentação heterotrófica tem mostrado resultados variáveis, com observações de maior capacidade reprodutivade 25 e26 após alimentação heterotrófica. A influência da alimentação heterotrófica na reprodução de corais em um espectro de temperaturas é raramente avaliada, mas no coral temperado Cladocora caespitosa, a heterotrofia mostrou-se mais importante para a reprodução sob condições de temperatura mais baixa27. Uma melhor compreensão do papel da temperatura e da alimentação na produção reprodutiva é provavelmente necessária para determinar se recifes específicos (por exemplo, recifes associados à alta disponibilidade de alimento28) possuem uma maior capacidade de recrutamento sob as mudanças climáticas.

Semelhante à produção reprodutiva, o efeito da temperatura e da alimentação sobre o tempo reprodutivo em corais permanece relativamente pouco estudado, apesar da sincronização da reprodução com condições abióticas/bióticas ser uma consideração importante para o sucesso do recrutamento em um oceano em aquecimento29. Temperaturas mais quentes resultaram em reprodução mais precoce em estudos de condicionamento térmico de corais conduzidos em laboratório30, e isso também foi observado em corais coletados de recifes naturais ao longo das estações31. No entanto, curiosamente, a tendência oposta foi observada recentemente em corais alimentados cultivados ao longo de 1 ano em um sistema de fluxo ex situ (isto é, a reprodução ocorreu mais cedo no ciclo lunar em temperaturas mais frias de inverno e mais tarde no ciclo lunar em temperaturas mais quentes de verão)32. Esse resultado contrastante sugere que o tempo reprodutivo pode se afastar dos padrões típicos em condições associadas a recursos energéticos abundantes.

Experimentos controlados de longa duração sob diferentes cenários de temperatura podem contribuir para um melhor entendimento da influência da heterotrofia na reprodução em corais escleractíneos. Manter colônias de corais reprodutoras em condições ex situ para múltiplos ciclos reprodutivos, no entanto, pode ser um desafio (mas ver pesquisas anteriores32,33). Neste trabalho, são descritas técnicas simples e eficazes para a alimentação ativa (fonte alimentar: náuplios de Artemia) e o cultivo a longo prazo de um coral reprodutor (Pocillopora acuta) em um sistema de aquicultura de fluxo contínuo; No entanto, deve-se notar que todas as técnicas descritas também podem ser utilizadas em sistemas de aquicultura de recirculação. Para demonstrar essas técnicas, uma comparação preliminar da produção reprodutiva e da época de colônias de corais mantidas a 24 °C e 28 °C sob tratamentos "alimentado" e "não alimentado" foi conduzida. Essas temperaturas foram escolhidas para aproximar as temperaturas da água do mar no inverno e no verão, respectivamente, no sul de Taiwan30,34; Uma temperatura mais alta não foi escolhida porque a promoção de culturas ex situ de longo prazo, em vez de testar a resposta dos corais ao estresse térmico, foi um objetivo primário deste experimento. Além disso, a densidade de náuplios de Artemia antes e após as sessões de alimentação foi quantificada para comparar a viabilidade de alimentação heterotrófica em ambos os tratamentos de temperatura.

Especificamente, 24 colônias de P. acuta (extensão linear total média ± desvio padrão: 21,3 cm ± 2,8 cm) foram obtidas de tanques de fluxo nas instalações de pesquisa do Museu Nacional de Biologia Marinha e Aquário, sul de Taiwan. Pocillopora acuta é uma espécie de coral comum que possui tanto uma estratégia de desova de transmissão, mas tipicamente reprodutiva35,36. As colônias parentais desses corais foram originalmente coletadas no recife Outlet (21,931°E, 120,745°N) aproximadamente 2 anos antes para outro experimento32. Consequentemente, as colônias de corais utilizadas no presente experimento foram criadas por toda a vida em condições de cultura ex situ; especificamente, as colônias foram expostas à temperatura ambiente e a um ciclo claro: escuro de 12 h:12 h a 250 μmol quanta m−2·s−1 e foram alimentadas com náuplios de Artemia duas vezes por semana. Reconhecemos que essa cultura ex situ de longo prazo pode ter afetado a forma como as colônias responderam às condições de tratamento neste experimento. Gostaríamos, portanto, de enfatizar que o objetivo principal aqui é ilustrar como as técnicas descritas podem ser efetivamente utilizadas para o cultivo de corais ex situ, demonstrando um exemplo aplicado em que os efeitos da temperatura e da alimentação na reprodução dos corais foram avaliados.

As colônias de corais foram distribuídas uniformemente em seis tanques de cultura do sistema flow-through (comprimento interior do tanque x largura x altura: 175 cm x 62 cm x 72 cm; regime de luz do tanque: 12 h:12h ciclo claro:escuro a 250 μmol quanta m−2·s−1) (Figura 1A). A temperatura em três dos tanques foi fixada em 28 °C, e a temperatura nos outros três tanques foi fixada em 24 °C; cada tanque tinha um registrador que registrava a temperatura a cada 10 min (veja a Tabela de Materiais). A temperatura foi controlada independentemente em cada tanque usando chillers e aquecedores, e a circulação da água foi mantida usando motores de fluxo (veja a Tabela de Materiais). Metade das colônias em cada tanque (n = 2 colônias/tanque) foi alimentada com náuplios de Artemia duas vezes por semana, enquanto as outras colônias não foram alimentadas. Cada sessão de alimentação teve duração de 4 h e foi conduzida em dois tanques de alimentação independentes com temperatura específica. Durante a alimentação, todas as colônias foram movidas para os tanques de alimentação, incluindo as colônias não alimentadas, para padronizar o efeito de estresse potencial de mover as colônias entre os tanques. As colônias nos tratamentos alimentado e não alimentado foram posicionadas em seu próprio compartimento usando uma estrutura de malha dentro dos tanques de alimentação com temperatura específica para que apenas as colônias na condição de alimentado recebessem alimento. A produção e o tempo reprodutivo dos corais foram avaliados para cada colônia diariamente às 09:00 da manhã, contando-se o número de larvas que foram liberadas nos recipientes de coleta de larvas durante a noite.

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Protocol

1. Colónias de coral suspensasem tanques de aquicultura ex situ

  1. Posicione uma barra entalada (comprimento x largura x altura: 75 cm x 1 cm x 3 cm), doravante denominada "barra suspensa", em todo o tanque de cultura em preparação para pendurar as colônias de corais.
    NOTA: A barra suspensa usada neste experimento foi feita sob medida, mas um tubo de PVC simples com parafusos salientes (ou seja, para atuar como entalhes) seria suficiente, desde que pudesse ser posicionado de maneira estável na parte superior do tanque de cultura e fosse forte o suficiente para segurar os corais.
  2. Meça um pedaço de linha de pesca (consulte a Tabela de Materiais) com ~1,5 m de comprimento e, em seguida, dobre-o ao meio duas vezes.
    NOTA: O comprimento inicial da linha de pesca deve ser escolhido com base na posição final desejada da colônia de corais no tanque de cultura.
  3. Faça um pequeno nó overhand no final da linha de pesca dobrada que tem as extremidades iniciais da linha de pesca.
    NOTA: Depois de fazer o nó, deve haver dois laços grandes na parte inferior e um pequeno laço na parte superior.
  4. Coloque a colônia de corais no meio das duas grandes alças, de modo que as alças sejam posicionadas ao redor da colônia e possam segurar o coral quando ele estiver pendurado na água.
  5. Encaixe o pequeno laço superior da linha de pesca em um entalhe na barra suspensa (Figura 1B).

2. Alimentação de corais

  1. Fazendo o recipiente de alimentação
    1. Construa uma estrutura retangular usando tubo de acrílico (comprimento x largura x altura: 25 cm x 60 cm x 25 cm). Faça dois compartimentos separados na estrutura onde os corais alimentados e não alimentados podem ser colocados, respectivamente (Figura 1C).
      OBS: O tubo de acrílico foi utilizado por ser leve (ou seja, ao contrário do tubo de PVC mais pesado) e, portanto, facilitar a movimentação do recipiente de alimentação para dentro/para fora dos tanques de cultura.
    2. Use uma pistola de cola quente para aderir 100 μm de malha de plâncton na parte inferior e nas laterais do quadro.
    3. Faça um total de ~10 pequenos furos (0,5 cm de diâmetro) nos tubos (especialmente ao longo das laterais e na parte inferior da estrutura) para evitar que o recipiente de alimentação flutue quando colocado no tanque de cultura.
    4. Faça furos (~0,5 cm de diâmetro) através da malha de plâncton em cada canto do recipiente de alimentação.
    5. Coloque uma tubulação de 8 cm de comprimento de 0,5 cm de diâmetro através dos orifícios de canto e use uma pistola de cola quente para fixá-la na posição.
      NOTA: Estes pedaços de tubos serão ligados a uma bomba de ar e pedras de bolhas durante a alimentação (ver passo 2.3.2 para obter mais detalhes).
  2. Cultivo de Artemia
    1. Coletar 2 L de água do mar de um tanque de alimentação independente e despejar a água do mar em um recipiente de eclosão Artemia (Figura 1D).
      NOTA: No presente experimento utilizado para demonstrar os protocolos, foram utilizados dois tanques de alimentação independentes específicos para tratamento, o que exigiu a preparação de dois recipientes para incubação para o cultivo de Artemia .
    2. Conecte uma bomba de ar à tubulação conectada ao fundo do recipiente de eclosão por aproximadamente 10 minutos antes de adicionar cistos Artemia .
    3. Enquanto espera, use uma balança para medir 8 g de cistos de Artemia (veja a Tabela de Materiais).
      NOTA: Para obter uma densidade média de 35 náuplios de Artemia individuais/mL, como sugerido por Huang et al.19, use uma proporção de 4 g de cistos de Artemia para 1 L de água do mar.
    4. Após 10 min, despeje os 8 g de cistos de Artemia no recipiente de eclosão.
    5. Incubar os cistos de Artemia por 48 h.
  3. Preparação do tanque de alimentação
    1. Coloque o recipiente de alimentação no tanque de alimentação de tal forma que a parte superior do recipiente esteja acima da superfície da água.
    2. Conecte a parte externa da tubulação de canto do recipiente de alimentação a uma bomba de ar, que fornecerá ar para pedras de bolhas para facilitar a circulação de água durante a alimentação.
    3. Ligue a bomba de ar ~5 min antes do início da alimentação.
  4. Enriquecimento e coleta de náuplios de Artemia
    1. Adicionar 1,5 mL de dieta de enriquecimento (consulte a Tabela de Materiais) ao recipiente de eclosão 2 h antes do horário de alimentação desejado.
      NOTA: Uma proporção de 0,75 mL de dieta de enriquecimento para 1 L de água do mar é recomendada por Huang et al.19.
    2. Após 2 h, desligue a válvula que fornece ar ao recipiente de eclosão.
    3. Cubra o recipiente de eclosão com uma caixa de papelão para excluir a luz ambiente e coloque uma fonte de luz (uma lanterna de telefone celular é suficiente) na base do recipiente de eclosão por 5 minutos para atrair náuplios Artemia para o fundo do recipiente e, assim, facilitar a separação de náuplios vivos de Artemia de conchas vazias.
    4. Após 5 min, retire a caixa e a fonte de luz.
    5. Coloque um jarro de medição de 3 L abaixo do recipiente de incubação.
    6. Retire a tubulação do recipiente de eclosão para permitir que os náuplios Artemia e a solução de água do mar fluam para o jarro de medição; recolher 1 L da solução de náuplios Artemia e água do mar.
      NOTA: Colete apenas metade do volume no recipiente de incubação para excluir invólucros vazios indesejados.
    7. Enquanto estiver próximo ao tanque de alimentação, despeje os náuplios Artemia e a solução de água do mar através de um filtro de 100 μm para separar os náuplios Artemia (que permanecerão no filtro) da água do mar.
    8. Enxágue os náuplios Artemia mantidos dentro do filtro duas vezes com água do tanque de alimentação.
    9. Os náuplios Artemia já estão prontos para serem usados.
  5. Alimentando as colônias de corais
    1. Descarregar os náuplios Artemia colocando o filtro do passo 2.4.8 no tanque de alimentação.
    2. Mexa a água no tanque à mão para distribuir uniformemente os náuplios Artemia .
      NOTA: Recolher amostras para a quantificação "pré-alimentação" da densidade de náuplios de Artemia após esta etapa (ver passo 3.1 para mais detalhes).
    3. Mova cada barra suspensa (com as colônias de corais ainda penduradas na barra) do tanque de cultura para o tanque de alimentação e posicione a barra de modo que ela fique firmemente apoiada na parte superior do tanque de alimentação. O período de exposição dos corais ao ar deve ser o mais curto possível.
      NOTA: Certifique-se de que as colônias não estão se tocando e têm espaço suficiente para capturar alimentos (por exemplo, ~5 cm de distância).
    4. Desligue as luzes dos tanques de alimentação ou use uma tampa não hermética para cobrir o tanque de alimentação para evitar distúrbios leves durante a alimentação.
    5. Deixe as colônias se alimentarem sem serem perturbadas por 4 h.
    6. Após 4 h, recolher as amostras para a quantificação "pós-alimentação" da densidade de náuplios de Artemia (ver passo 3.1 para mais pormenores).
  6. Limpeza pós-alimentação
    1. Após a conclusão da sessão de alimentação, remova as colônias de corais. Retire as barras suspensas do tanque de alimentação individualmente e lave completamente cada coral com água do mar de seu respectivo tanque de cultura para remover qualquer nauplii Artemia residual.
      NOTA: Lave as colônias em uma superfície estável em vez de pendurada para reduzir o risco de danos que poderiam ocorrer se as colônias balançassem para frente e para trás durante o enxágue. De acordo com a transferência inicial, mantenha o tempo de exposição dos corais ao ar o mais curto possível.
    2. Coloque as barras suspensas (com corais pendurados) de volta nos tanques de cultura.
    3. Retire os tubos que conectam o recipiente de alimentação à bomba de ar e remova o recipiente de alimentação do tanque de alimentação.
    4. Lave bem o recipiente de alimentação com água fresca para remover todos os náuplios Artemia restantes.

3. Quantificação da densidade de náuplios de Artemia pré e pós-alimentação

  1. Coleta das amostras
    1. Recolher amostras em dois momentos: primeiro, quando os náuplios de Artemia tiverem sido descarregados e distribuídos uniformemente no recipiente de alimentação (passo 2.5.2), e novamente após a sessão de alimentação ter sido concluída (passo 2.5.6).
    2. Para cada ponto de tempo, use três seringas para retirar 20 mL de água da superfície, da camada intermediária e da camada inferior do recipiente de alimentação, respectivamente.
  2. Diluição da amostra
    1. Para cada seringa, transfira os 20 mL de amostra de água para um copo independente de 500 mL.
    2. Adicionar 180 ml de água quente (~60 °C) ao copo (diluição 1:10).
      NOTA: A água quente é usada para imobilizar os náuplios Artemia para aumentar a precisão da enumeração.
    3. Adicionar 2 mL da amostra de água do copo em cada poço de uma placa de 9 poços.
      NOTA: Misture a amostra no copo para distribuir uniformemente os náuplios de Artemia na coluna de água antes de retirar os 2 mL de amostra.
    4. Conte o número de náuplios Artemia em cada poço sob um microscópio estéreo usando aumento de 6,5x (consulte a Tabela de Materiais).
  3. Calculando a densidade de náuplios de Artemia
    1. Divida o número de náuplios de Artemia em cada poço por 2 para obter o número de náuplios de Artemia por mL. Em seguida, multiplique esse número por 10 (para contabilizar a diluição) para calcular a densidade de náuplios de Artemia.
    2. Calcular a densidade média de náuplios de Artemia (ou seja, densidade média ao longo das 27 réplicas de poço antes vs. depois da alimentação) para comparar a densidade de náuplios de Artemia entre pré e pós-alimentação.

4. Coleta de larvas de coral

  1. Confecção do recipiente de coleta de larvas (Figura 1E)
    1. Selecione uma garrafa de água plástica de 6 L e corte o fundo da garrafa completamente.
      NOTA: Esta abertura será utilizada para transferir as colônias para dentro e para fora do recipiente de coleta de larvas.
    2. Crie duas janelas cortando um retângulo de ~15 cm x 20 cm de cada lado da garrafa.
      NOTA: Uma garrafa de água plástica de 6 L é apropriada para corais com ~15 cm de diâmetro; Modificar o tamanho da garrafa com base no tamanho dos corais em estudo.
    3. Use uma pistola de cola quente e, em seguida, epóxi para aderir uma malha de plâncton de 100 μm em cada uma das janelas.
    4. Crie dois pequenos orifícios (~0,5 cm de diâmetro) em cada lado do fundo da garrafa.
    5. Coloque uma corda através dos dois pequenos orifícios e amarre ambas as extremidades para criar uma alça para prender o recipiente de coleta de larvas na barra suspensa.
    6. Antes do uso inicial, coloque os frascos em um tanque de fluxo (sem corais) por pelo menos 24 h para remover qualquer resíduo de cola.
  2. Preparando-se para a coleta de corais
    1. Mergulhe completamente o recipiente de coleta de larvas no tanque de cultura.
    2. Coloque a colônia no recipiente de coleta de larvas, mantendo a colônia e o recipiente submersos em água.
    3. Encaixe a alça do recipiente de coleta de larvas na barra suspensa.
      NOTA: Depois de pendurado, certifique-se de que a parte superior do recipiente de coleta esteja ~3 cm acima da água.
    4. Repita as etapas 4.2.1-4.2.3 até que todas as colônias estejam em seus recipientes de coleta de larvas.
  3. Coleta e enumeração das larvas de coral
    1. Prepare um jarro de medição de 3 L, uma tigela, uma pipeta de 3 mL e tubos de 50 mL.
    2. Desconecte a linha de pesca da barra suspensa e remova uma colônia de seu recipiente de coleta de larvas. Coloque a colônia de volta no tanque de cultura imediatamente.
      NOTA: Certifique-se de que a duração da exposição ao ar é a mais curta possível.
    3. Coloque uma das mãos na extremidade da tampa do recipiente de coleta de larvas.
      NOTA: Quando o recipiente de coleta de larvas está cheio de água, ele pode ser pesado. Sem o suporte adequado, o recipiente pode quebrar quando está sendo retirado da água.
    4. Desconecte a "alça" do recipiente de coleta de larvas da barra suspensa.
    5. Levante lentamente o recipiente de coleta de larvas para fora da água.
    6. Segure o recipiente de coleta em um ângulo de aproximadamente 45° acima do tanque de cultura por alguns segundos para permitir que o excesso de água flua de volta para o tanque através das janelas do recipiente de coleta de larvas.
      NOTA: Não incline o recipiente além de 45° para mitigar a chance de despejar larvas do topo do recipiente.
    7. Retire o recipiente de coleta de larvas do tanque e posicione-o em cima do jarro de medição.
    8. Antes de desaparafusar a tampa, use um dedo para aplicar uma quantidade moderada de pressão contra a tampa e, em seguida, desaparafuse a tampa.
      NOTA: A água dentro do recipiente de coleta pode ser liberada rapidamente quando a tampa é removida se não for apoiada primeiro pelo dedo (ou seja, potencialmente resultando em uma perda de larvas).
    9. Transfira um pouco da água dentro do jarro de medição para uma tigela.
    10. Conte manualmente o número de larvas na tigela usando uma pipeta de 3 mL para mover as larvas para um tubo de 50 mL.
      NOTA: Esteja ciente de que algumas das larvas podem ficar presas dentro da pipeta. Se isso acontecer, retire um pouco de água do mar para dentro da pipeta e agite suavemente enquanto sela a pipeta com um dedo para soltar as larvas.
    11. Continue os passos 4.3.9 e 4.3.10 até que todas as larvas tenham sido contadas. Nesta fase, as larvas podem ser utilizadas em experimentos subsequentes.
    12. Repita as etapas 4.3.2-4.3.10 para todas as outras colônias de corais.
      NOTA: O jarro medidor e a tigela devem ser enxaguados entre as colônias.
    13. Após o término da contagem, enxágue bem cada recipiente coletor com água fresca, especialmente as janelas.

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Representative Results

Os protocolos descritos permitiram (1) a comparação da produção reprodutiva e época de colônias individuais de corais entre diferentes tratamentos de alimentação e temperatura e (2) uma avaliação da viabilidade da alimentação de náuplios de Artemia em diferentes temperaturas. Aqui, uma breve visão geral dos resultados é dada, mas deve-se ter cautela com relação à interpretação ampla dos efeitos relatados da temperatura e da alimentação sobre a reprodução dos corais devido à natureza de curto prazo deste experimento (ou seja, apenas um ciclo reprodutivo) e ao uso de colônias de corais aclimatadas a condições ex situ .

Cada colônia se reproduziu ao longo do nosso período de monitoramento (setembro lunar de 2022), e a produção reprodutiva mensal total mostrou alta variação entre as colônias. O número total de larvas liberadas pelas colônias variou de 6 a 319, com exceção de uma colônia (no tratamento não alimentado a 24 °C) que produziu 528 larvas; os dados de todas as colônias são mostrados na Figura 2, mas a colônia de outlier de alta produção não foi incluída na análise dos dados. O rendimento reprodutivo foi afetado pela temperatura (modelo linear generalizado de efeitos mistos; z = 5,35, p < 0,001) e alimentação (z = 3,01, p < 0,003), com interação significativa encontrada entre a temperatura e os tratamentos alimentares (z = 12,22, p < 0,001). Colônias cultivadas a 28 °C liberaram mais larvas quando não alimentadas (média ± desvio padrão; 151 ± 82) do que quando alimentadas (131 ± 133) (modelo linear generalizado de efeitos mistos, contraste post hoc; z = 3,01, p = 0,014), mas a tendência oposta foi encontrada em colônias cultivadas a 24 °C, em que as colônias alimentadas (80 ± 78) produziram mais larvas do que as colônias não alimentadas (12 ± 6) (z = 11,91, p < 0,001).

A reprodução em todas as colônias ocorreu antes da lua cheia (dia lunar 15) (Figura 3). A média do dia lunar (DML) de liberação larval (ponderada pela produção reprodutiva) variou do dia lunar 6,5 ao dia lunar 11,1, com uma diferença significativa entre os tratamentos sendo detectada apenas entre as colônias "não alimentadas a 28 °C", que se reproduziram mais cedo no ciclo lunar, e as colônias "alimentadas a 24 °C", que se reproduziram mais tarde no ciclo lunar (modelo linear de efeitos mistos, contraste post hoc, t = 4,10, p = 0,006).

No mês anterior ao monitoramento formal da reprodução (agosto lunar de 2022), a densidade de náuplios de Artemia foi avaliada antes e após as sessões de alimentação; isso foi repetido em três momentos: no início da cultura dos corais para este experimento (T0) e 2 semanas e 4 semanas na cultura dos corais em condições de tratamento (Figura 4). A avaliação inicial no T0 mostrou que não houve diferença entre a densidade pré e pós-alimentação de náuplios de Artemia em ambos os tratamentos térmicos. Após 2 semanas e 4 semanas de cultivo, a densidade de náuplios de Artemia foi menor após a alimentação em ambos os tratamentos de temperatura (semana 2: ANOVA two-way, F 1.104 = 128,45, p < 0,001; semana 4: ANOVA two-way, F1.104 = 294,71, p < 0,001). Não houve diferença na densidade pré-alimentação entre os tratamentos de temperatura (p > 0,05) ou na densidade pós-alimentação entre os tratamentos de temperatura (p > 0,05) em nenhum dos três momentos avaliados.

Todas as análises foram realizadas em R utilizando os pacotes lme437, lmerTest 38, emmeans39, car 40 e Hmisc41. Os dados e o script R usados para as análises estão disponíveis publicamente no GitHub (https://github.com/CJ-McRae/Lam-et-al_JoVE-submission).

Figure 1
Figura 1: Esquema do planejamento experimental e materiais representativos para a alimentação e cultura ex situ de um coral escleractíneo reprodutor. (A) Colônias de Pocillopora acuta foram cultivadas em tanques de aquicultura de fluxo a 24 °C ou 28 °C sob condições de alimentação e não alimentação; os círculos pretos representam as colônias. (B) As colônias foram penduradas com linhas de pesca para reduzir o estresse de manuseio e promover a movimentação eficiente entre os tanques de cultura e de alimentação. (C) Durante as sessões de alimentação, todas as colônias foram movidas para uma estrutura de malha dentro de tanques de alimentação com temperatura específica. As colônias alimentadas foram posicionadas em um compartimento da armação, e as colônias não alimentadas foram posicionadas no outro compartimento da armação; apenas colônias alimentadas receberam alimento. (D) Náuplios de Artemia enriquecidos foram administrados às colônias no tratamento alimentado duas vezes por semana. (E) As colônias foram colocadas em recipientes de coleta de larvas durante a noite para quantificar a produção reprodutiva diariamente ao longo de um ciclo lunar. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Produção reprodutiva de colônias de Pocillopora acuta sob diferentes temperaturas (24 °C vs. 28 °C) e tratamentos alimentares (alimentados vs. não alimentados). As letras são representativas de diferenças significativas na produção reprodutiva entre os tratamentos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Época reprodutiva de colônias de Pocillopora acuta sob diferentes temperaturas (24 °C vs. 28 °C) e tratamentos alimentares (alimentados vs. não alimentados). A linha tracejada vertical mostra a média do dia lunar (DML) de reprodução para cada tratamento. Os tons de cor dentro de cada barra das parcelas específicas de tratamento (A-D) indicam a contribuição das colônias individuais para a reprodução total diária. As letras são representativas de diferenças significativas no tempo reprodutivo entre os tratamentos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Densidade de náuplios de Artemia antes e após as sessões de alimentação dos corais dentro dos tratamentos de temperatura de 24 °C e 28 °C. A densidade pré-alimentação foi calculada antes da alimentação dos corais, e a densidade pós-alimentação foi calculada após a conclusão de uma sessão de 4 h de alimentação dos corais. A densidade de náuplios de Artemia foi avaliada no início da cultura dos corais (T0) e após 2 semanas e 4 semanas sob condições de tratamento em sistema de escoamento aquícola. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Esta avaliação preliminar do efeito da temperatura e da alimentação sobre a reprodução dos corais revelou diferenças na produção reprodutiva e na época entre colônias cultivadas sob diferentes condições de tratamento. Além disso, verificou-se que a alimentação de náuplios de Artemia para colônias de corais pareceu ser eficaz em temperaturas relativamente frias (24°C), bem como quentes (28°C). Esses resultados combinados destacam a aplicabilidade dessas técnicas simples para a alimentação e cultivo de corais escleractínicos reprodutores (usando P. acuta como exemplo) em sistemas de aquicultura ex situ .

No contexto da produção reprodutiva, verificou-se que a alimentação teve uma influência diferente dependendo do tratamento térmico em que as colónias foram cultivadas, pelo que a alimentação só pareceu ter um efeito positivo sobre a produção reprodutiva nas colónias mantidas no tratamento a 24 °C. Esse resultado é um tanto surpreendente, uma vez que, em outros organismos marinhos, a oferta limitada de alimentos em altas temperaturas tem mostrado um efeito negativo sobre a reprodução (por exemplo, redução na desova em damselfish42) e tem sido associada a um mau desenvolvimento no estágio inicial de vida (por exemplo, maior mortalidade e crescimento reduzido em caranguejos durante a metamorfose43). Em corais, avaliações específicas dos efeitos interativos da alimentação e da temperatura têm sido focadas principalmente no desempenho fotoquímico dos simbiontes algais dos corais44,45, e esses efeitos interativos são raramente explorados no contexto da reprodução. Estudos futuros visando uma avaliação abrangente dos efeitos baseados na reprodução da alimentação em diferentes temperaturas ao longo de múltiplos ciclos reprodutivos são necessários. Esse, no entanto, não foi o objetivo do presente experimento. Em vez disso, este experimento foi usado principalmente para demonstrar a eficácia das técnicas de alimentação e cultura apresentadas. Através do uso dessas técnicas, tendências reprodutivas claras de colônias individuais podem ser facilmente avaliadas, o que é importante, uma vez que a variação intercolônia na produção reprodutiva não é incomum. Por exemplo, uma ampla variação de produção reprodutiva tem sido encontrada entre colônias, bem como ao longo do tempo para uma mesma colônia individual, em múltiplos estudos 30,32,46,47. Possíveis explicações para a alta variabilidade na produção reprodutiva incluem plasticidade nas estratégias reprodutivas e/ou mudanças na priorização da alocação de energia48,49. Técnicas que permitem avaliações específicas da produção reprodutiva de colônias, como as descritas neste experimento, podem ajudar a identificar os fatores ambientais/genéticos da capacidade reprodutiva, pertinentes à nossa compreensão do recrutamento de corais (ou seja, relevantes para a resiliência natural dos recifes) e do potencial de suprimento de reprodutores (ou seja, relevantes para o cultivo ex situ destinado a apoiar a restauração de corais).

A avaliação da época reprodutiva neste experimento revelou que apenas as colônias no tratamento "não alimentado a 28 °C" liberaram larvas significativamente mais cedo do que as colônias no tratamento "alimentado a 24 °C"; O tempo permaneceu semelhante entre os outros tratamentos. A plasticidade impulsionada pela temperatura no tempo reprodutivo tem sido observada em várias espécies de corais, com tempo avançado observado em temperaturas mais quentes50,51,52. Essa mudança no tempo é provavelmente explicada pelo desenvolvimento acelerado dos gametas e embriões em temperaturas mais quentes53, que, sob as mudanças climáticas, poderiam, em última análise, ter uma influência adaptativa ou disruptiva na reprodução e recrutamento de corais54,55,56. Experimentos que examinem explicitamente a possível relação interativa entre alimentação e temperatura no tempo reprodutivo poderiam fornecer uma melhor compreensão das consequências das mudanças de tempo e também poderiam testar a praticidade de aumentar a frequência dos ciclos reprodutivos para melhorar a produção aquícola ex situ.

Técnicas eficazes de alimentação ex situ são necessárias para conduzir experimentos controlados explorando a potencial relação interativa entre temperatura e alimentação na reprodução de corais. Neste experimento, colônias de corais foram alimentadas em tanques de alimentação com temperatura específica a 24 °C e 28 °C, e padrões semelhantes na densidade pré e pós-alimentação de náuplios de Artemia foram encontrados em todos os tratamentos de temperatura (isto é, menor densidade de náuplios de Artemia pós-alimentação vs. pré-alimentação). Isso é indicativo de três pontos importantes: (1) o tratamento térmico não pareceu afetar a saúde dos náuplios de Artemia; (2) as taxas de alimentação das colônias de corais foram aproximadamente as mesmas em ambas as temperaturas; e (3) as colônias de corais consumiram náuplios de Artemia durante as sessões de alimentação em ambas as temperaturas (exceto no ponto T0, que pode ser indicativo de estresse da colônia ao se aclimatar às condições experimentais). É importante ressaltar que a interpretação das tendências de densidade entre os tratamentos de temperatura e ao longo do tempo serve apenas como uma avaliação baseada em proxy. Uma investigação robusta para confirmar a alimentação (por exemplo, exame do conteúdo intestinal57) e a fisiologia dos náuplios de Artemia (por exemplo, expressão da proteína de choque térmico58) seriam necessárias para tirar conclusões definitivas sobre a viabilidade alimentar; Uma avaliação dessa natureza estava fora do escopo deste experimento. No entanto, com base nos dados do experimento juntamente com a confirmação visual durante a alimentação, estamos confiantes de que as colônias de corais neste experimento estavam se alimentando ativamente sob ambas as temperaturas de tratamento. Os corais podem apresentar respostas contrastantes à alimentação em altas temperaturas, com algumas espécies apresentando redução e outras com aumento na taxa de alimentação45. Portanto, a tolerância à temperatura específica da espécie e do local deve ser levada em consideração ao determinar as temperaturas de alimentação em experimentos futuros.

As técnicas de alimentação e cultivo descritas proporcionam diversas vantagens que buscam melhorar tanto a qualidade da saúde dos corais quanto a longevidade da reprodução na aquicultura ex situ. O objetivo geral que orienta esta abordagem descrita foi baseado na minimização de potenciais fontes de estresse de corais. Para começar, a necessidade de manejo direto das colônias de corais foi eliminada com o uso de linhas de pesca para pendurar os corais. Isso facilita o movimento eficiente das colônias entre os tanques de cultura e alimentação e permite ajustes simples e rápidos na posição da colônia (por exemplo, encurtando ou alongando a linha de pesca para alterar a profundidade da colônia no tanque). Em contraste com as colônias sendo colocadas em um suporte ou no fundo de um tanque de cultura, pendurar as colônias promove o crescimento em todas as dimensões, reduz o acúmulo de algas e cria mais espaço utilizável no tanque (por exemplo, vários corais podem ser suspensos verticalmente em uma única linha de pesca, se necessário)59. Além de reduzir a necessidade de trade-offs energéticos60, que podem ajudar a promover a reprodução a longo prazo32, as técnicas de alimentação descritas também ajudaram a reduzir o estresse dos corais. Recomenda-se a alimentação em tanques independentes19,61 (em oposição aos tanques de cultura) para mitigar a exposição dos corais a níveis potencialmente elevados de nutrientes, o que pode ser prejudicial à saúde dos corais e levar ao crescimento abundante de algas62,63,64,65. Além disso, se surgirem problemas de qualidade da água, a manutenção e a troca da água dentro dos tanques de alimentação podem ser feitas facilmente sem perturbar as colônias de corais. Os recipientes de coleta de larvas também foram projetados com a redução do estresse dos corais em mente, de modo que a reprodução específica da colônia poderia ser alcançada sem o manuseio direto ou a necessidade de cultura em tanques de colônia única. A existência de múltiplas colônias em grandes tanques de cultura pode ajudar a melhorar a longevidade reprodutiva (especialmente em espécies de corais com modos reprodutivos mistos49), que tem demonstrado declínio ao longo do tempo em sistemas ex situ 66,67. Além disso, o uso de grandes garrafas plásticas como recipientes de coleta de larvas proporciona às larvas espaço abundante, o que pode reduzir o assentamento no próprio recipiente de coleta; a liquidação rápida pode ser problemática quando pequenos recipientes de coleta são usados (McRae e Lam, observações pessoais). Por fim, essas técnicas de alimentação e cultura ex situ usam materiais que são econômicos, fáceis de fazer e podem ser personalizados de acordo com as necessidades específicas do experimento.

As principais limitações das técnicas de alimentação e cultivo descritas incluem 1) um limite finito no número de colônias que podem ser cultivadas devido às necessidades de espaço no tanque, 2) a incapacidade de padronizar o modo reprodutivo (sexual vs. assexuado) devido a múltiplas colônias sendo cultivadas dentro do mesmo tanque, e 3) o uso de uma única espécie de um único sítio recifal para testar a eficácia das técnicas descritas. Pesquisas futuras se beneficiariam de testar como outras espécies de corais se comportam usando essas técnicas de alimentação e cultura, bem como explorar o uso de outros tipos de alimentos para melhor atender às necessidades dietéticas específicas da espécie.

Em conclusão, reconhece-se que críticas a outras intervenções ativas68,69,70 provavelmente também são aplicáveis à promoção de cultura ex situ para reprodução de corais, uma vez que as principais limitações (por exemplo, escalabilidade, diversidade genética) permanecem relevantes. No entanto, à semelhança de outras intervenções activas, a cultura de corais ex situ não pretende ser vista como uma solução singular, mas sim como uma abordagem de apoio que deve ser explorada em conjunto com atenuações significativas das alterações climáticas. Através do uso das técnicas descritas, o estresse dos corais pode ser reduzido para melhorar a longevidade reprodutiva de um coral escleractíneo, P. acuta, em sistemas de aquicultura ex situ, a partir dos quais as colônias (e seus descendentes) podem contribuir para esforços de pesquisa e restauração.

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Disclosures

Os autores não têm interesses financeiros concorrentes ou outros conflitos de interesse.

Acknowledgments

Esta pesquisa foi financiada pelo Ministério da Ciência e Tecnologia (Taiwan), números de processo MOST 111-2611-M-291-005 e MOST 111-2811-M-291-001.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Artemia cysts  Supreme plus NA Food source 
Chiller Resun CL650 To cool down water temperature if needed
Conductivity portable meter WTW Cond 3110 To measure salinity
Enrichment diets Omega NA Used in Artemia cultivation
Fishing line Super Nylon monofilament To hang the coral colonies
Flow motors Maxspect GP03 To create water flow
Heater 350 W ISTA NA Heaters used in tanks
HOBO pendant temperature logger Onset Computer UA-002-08 To record water temperature
LED lights Mean Well FTS: HLG-185H-36B NA
Light portable meter LI-COR LI-250A Device used with light sensor to measure light intensity in PAR
Light sensor LI-COR LI-193SA NA
Plankton net 100 µm mesh size Omega NA To collect larvae and artemia 
Primary pump 6000 L/H Mr. Aqua BP6000 To draw water from tanks into chiller
Propeller-type current meter KENEK GR20 Device used with propeller-type detector to measure flow rate
Propeller-type detector KENEK GR3T-2-20N NA
Stereo microscope Zeiss Stemi 2000-C  To count the number of artemia 
Temperature controller 1000 W Rep Park O-RP-SDP-1 To set and maintain water temperature

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Técnicas Eficazes para a Alimentação e Cultura <em>Ex Situ</em> de um Corais Escleractíneos Reprodutores, <em>Pocillopora acuta</em>
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Lam, K. W., McRae, C. J., Liu, Z. T., Zhang, X. C., Fan, T. Y. Effective Techniques for the Feeding and Ex Situ Culture of a Brooding Scleractinian Coral, Pocillopora acuta. J. Vis. Exp. (196), e65395, doi:10.3791/65395 (2023).

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