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Biology

Fabricação de grades revestidas de grafeno monocamada para microscopia crioeletrônica

Published: September 8, 2023 doi: 10.3791/65702
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Department of Structural and Computational Biology, Scripps Research
* These authors contributed equally

Summary

Aqui, descrevemos um protocolo para aplicação de uma única monocamada de grafeno em grades de microscopia eletrônica e como prepará-las para uso na determinação da estrutura do crioEM.

Abstract

A microscopia eletrônica criogênica (crioEM) tem emergido como uma poderosa técnica para sondar a estrutura atômica de complexos macromoleculares. A preparação da amostra para crioEM requer a preservação de espécimes em uma fina camada de gelo vítreo, normalmente suspensa dentro dos orifícios de um filme de suporte fenestrado. No entanto, todas as abordagens de preparação de amostras comumente usadas para estudos de crioEM expõem o espécime à interface ar-água, introduzindo um forte efeito hidrofóbico no espécime que frequentemente resulta em desnaturação, agregação e dissociação complexa. Além disso, interações hidrofóbicas preferenciais entre regiões do espécime e a interface ar-água impactam as orientações adotadas pelas macromoléculas, resultando em reconstruções 3D com resolução direcional anisotrópica.

A adsorção de amostras de crioEM a uma monocamada de grafeno mostrou ajudar a mitigar as interações com a interface ar-água, minimizando a introdução de ruído de fundo. Os suportes de grafeno também oferecem o benefício de reduzir substancialmente a concentração necessária de proteínas necessárias para imagens crioEM. Apesar das vantagens desses suportes, as grades revestidas com grafeno não são amplamente utilizadas pela comunidade crioEM devido ao custo proibitivo de opções comerciais e aos desafios associados à produção interna em larga escala. Este trabalho descreve um método eficiente para a preparação de lotes de grades crioEM que possuem cobertura quase total de grafeno monocamada.

Introduction

A microscopia eletrônica criogênica de partícula única (crioEM) é uma tecnologia cada vez mais aplicável para investigar as estruturas 3D de biomacromoléculas. Os avanços tecnológicos em óptica de microscopia eletrônica, detecção direta de elétrons1 e algoritmos computacionais 2,3,4 na última década permitiram que usuários de crioEM determinassem estruturas de complexos macromoleculares bioquimicamente estáveis com resolução próxima à atômica 5,6,7,8 . Apesar desses avanços, ainda existem barreiras notáveis para a preservação de amostras para imagens por crioEM, que impedem que a maioria dos espécimes biológicos seja resolvida com resoluções tão altas.

A preparação de amostras para análise crioEM de alta resolução envolve o aprisionamento de macromoléculas que são uniformemente distribuídas em uma ampla gama de orientações dentro de uma fina camada de gelo vitrificado. Os métodos de congelamento "blot and plunge" são os métodos mais utilizados para gerar filmes finos de amostras biológicas em grades para estudos decrioEM9,10. Esses métodos envolvem a aplicação de alguns microlitros de solução de amostra em uma grade de EM contendo um filme fenestrado que foi tornado hidrofílico e, subsequentemente, a remoção da maior parte da amostra com papel de filtro antes de mergulhar rapidamente a grade em um criogênio de etano líquido ou mistura etano-propano9.

Embora este método tenha sido usado com sucesso para determinar estruturas de uma ampla gama de espécimes biológicos, todos os métodos de preparação de espécimes crioEM comumente usados expõem espécimes à interface hidrofóbica ar-água (AWI), que frequentemente introduz problemas que limitam a determinação de estruturas de alta resolução. Estabelece-se que espécimes biológicos têm alta propensão à desnaturação quando expostos ao AWI, o que pode levar a complexa agregação e desmontagem11,12,13,14. Além disso, manchas hidrofóbicas nas superfícies de espécimes biológicos fazem com que as partículas adotem orientações preferenciais no gelo12. Em muitos cenários, uma única região hidrofóbica da amostra força todas as partículas a adotar uma orientação singular no gelo, abolindo assim a capacidade de gerar uma reconstrução confiável. Além dos problemas com o AWI, os espécimes podem demonstrar afinidade pela superfície da camada fenestrada de filme, limitando o número de partículas suspensas no gelo dentro dos orifícios15.

Diversas soluções metodológicas e tecnológicas têm sido desenvolvidas para diminuir essas questões decorrentes das interações com o AWI ou com os filmes16,17. Uma abordagem popular é revestir o filme fenestrado das grades EM com uma fina (dezenas de nanômetros) camada de carbono amorfo. Esse revestimento fornece uma superfície contínua através dos orifícios aos quais as partículas podem adsorver, com o benefício de proteger parcialmente a amostra das interações com o AWI15,18,19,20. No entanto, a camada de carbono adicional eleva a quantidade de sinal de fundo nas regiões fotografadas, introduzindo ruídos que podem comprometer a resolução atingível, particularmente para amostras pequenas (<150 kDa). Nos últimos anos, o uso de flocos de óxido de grafeno (GO) para produzir filmes de suporte em grades crioEM tem mostrado vantagens sobre o carbono amorfo tradicional. Os flocos de GO são produzidos através da oxidação de camadas de grafite, resultando em folhas pseudocristalinas de grafite monocamada que são hidrofílicas devido ao seu substancial teor de oxigênio na forma de grupos carboxila, hidroxila e epóxi nas superfícies e bordas. Flocos comerciais de GO em suspensões aquosas são de baixo custo, e existem inúmeros métodos publicados para aplicação de flocos de GO em grades de EM18,21. No entanto, esses métodos geralmente resultam em grades que são apenas parcialmente cobertas com flocos de GO, bem como regiões que contêm várias camadas de flocos de GO. Além disso, os flocos de GO contribuem com um sinal de fundo perceptível para imagens crioEM que é próximo ao observado com carbono amorfo fino22,23.

O grafeno monocamada pura, que consiste em uma única matriz cristalina 2D de átomos de carbono, é distinto do GO por não produzir contraste de fase no microscópio eletrônico. Assim, o grafeno monocamada pode ser usado para gerar uma camada de suporte invisível para imagens de amostras biológicas. O grafeno monocamada também é mais forte que o GO e pode ser aplicado como uma única monocamada em uma grade EM, e avanços recentes na fabricação de grades EM revestidas com grafeno tornaram possível preparar internamente grades de grafeno monocamada de alta cobertura 24,25,26,27,28,29,30. No entanto, apesar dos benefícios do uso de grades revestidas com grafeno para determinação da estrutura crioEM, elas não são amplamente utilizadas devido ao custo proibitivo de opções comerciais e à complexidade da produção interna. Aqui, descrevemos um guia passo-a-passo para a produção efetiva de grades de EM cobertas com uma monocamada de grafeno para determinação da estrutura crioEM de espécimes biológicos (Figura 1). Seguindo este protocolo detalhado, os pesquisadores do cryoEM podem preparar de forma reprodutível dezenas de grades de suporte de grafeno de alta qualidade em um único dia. A qualidade das grades revestidas com grafeno pode ser facilmente examinada usando um microscópio eletrônico de transmissão (MET) de baixa potência equipado com um filamento de LaB6.

Protocol

1. Preparação de materiais e acessórios necessários para a fabricação de grades de grafeno

NOTA: O grafeno contamina facilmente, o que reduz a eficiência do revestimento de grafeno e a qualidade das grades de grafeno; Por isso, é importante limpar bem todos os materiais que entram em contato com o grafeno. A preparação dos materiais e todas as etapas devem ser feitas em uma coifa de fumaça.

  1. Reunir os materiais necessários que serão utilizados para o revestimento das grades com grafeno (Figura 2A).
  2. Lave os utensílios de vidro várias vezes com água deionizada (DI) para remover qualquer poeira, fiapos e resíduos oleosos.
  3. Use lenços descartáveis para limpar as tampas de vidro com etanol 75% e use um espanador de ar para remover quaisquer contaminantes.
    NOTA: O bloco de suporte de grade TEM de fixação usado neste protocolo pode conter até 45 grades. Para uma grande produção em lote de grades de grafeno, 45 grades ou menos podem ser preparadas de uma só vez. No entanto, recomenda-se começar com uma produção em pequenos lotes (quatro a seis grades) até que o método seja estabelecido em laboratório.

2. Preparo de persulfato de amônio 0,2 M (APS) em água

NOTA: Esta solução APS é usada como um etchant para remover o suporte de cobre () da folha de grafeno/em uma etapa posterior. Prepare sempre uma solução de APS fresca. Soluções reutilizadas ou antigas não gravam o cobre de forma eficaz e podem deixar resíduo de cobre no grafeno nas etapas posteriores.

  1. Enxaguar um frasco de 500 mL com água deionizada (DI) e, em seguida, adicionar 200 mL de água DI e micro-ondas usando ajustes máximos por aproximadamente 1 min para desgaseificar a água.
  2. Adicionar 9 g de persulfato de amônio a 200 mL de água DI para produzir uma solução de 0,2 M APS.
    CUIDADO: A SAF é tóxica, é aconselhável o uso de equipamentos de proteção individual (EPIs) ao manusear a SAF. Descarte os resíduos da APS em uma planta de descarte de resíduos aprovada.
  3. Agitar a solução com uma barra de agitação num agitador magnético enquanto liga o balão a uma fonte de vácuo sob um exaustor.
    NOTA: A solução de APS desgaseificadora ajudará a prevenir a formação de bolhas, o que pode reduzir a eficiência do condicionamento de Cu na etapa 6.

3. Transfira o grafeno/cobre para uma tampa limpa com um pedaço de papel mata-borrão

NOTA: Usamos um filme de grafeno de deposição química de vapor (CVD) de 15 x 15 cm em de um fornecedor de grafeno. As folhas de grafeno/monocamada compradas comercialmente devem ser armazenadas sob vácuo. Como o grafeno é cultivado em ambos os lados do pelo método CVD, os fornecedores de grafeno geralmente realizam verificações de qualidade e recomendam o melhor lado para uso. Nós nos referimos a este lado recomendado do grafeno como o lado "superior", enquanto o outro lado é o lado "traseiro" neste protocolo.

  1. Corte um pedaço de papel manchado em uma forma retangular de aproximadamente 20 mm x 40 mm. Este papel de borrifação é usado como preenchimento para a folha de grafeno/e absorverá o excesso de metacrilato de metila (MMA (8,5) MMA EL6) usado para revestir a folha de grafeno/; portanto, certifique-se de cortá-lo em um tamanho maior do que a folha de grafeno/a ser usada.
  2. Use fita de poliimida para colar os quatro cantos do papel manchado na parte superior de uma capa limpa que caberá em um revestidor de spin caseiro.
    NOTA: A fita de poliimida é usada porque é fina e pode ser removida facilmente, o que facilita o manuseio.
  3. Retire um pedaço da folha de grafeno/do armazenamento a vácuo.
  4. Use uma tesoura limpa e sem poeira para cortar cuidadosamente um pequeno quadrado da folha de-grafeno que será suficiente para cobrir completamente o número de grades a serem preparadas. Para 25 grades dispostas em uma matriz 5 x 5, por exemplo, corte uma peça que seja de 18 mm x 18 mm. Coloque a folha de grafeno/por cima do papel mata-borrão com uma pinça limpa e seca. Certifique-se de que o lado de trás da folha de grafeno/está virado para baixo e tenha cuidado para não virar acidentalmente a folha de grafeno/, pois é difícil discernir o lado superior do lado de trás.
  5. Tape os quatro cantos da folha de grafeno/no papel manchado/lamínula, minimizando a quantidade de contato entre a fita e a folha de grafeno/, pois quaisquer regiões cobertas com fita adesiva não serão cobertas com MMA na próxima etapa.
    NOTA: A descarga estática pode danificar os filmes de grafeno e, portanto, é aconselhável permanecer eletricamente aterrado e minimizar o acúmulo de carga estática ao manusear grades de grafeno ou grafeno. Isso pode ser feito usando uma pulseira de aterramento ou tocando um objeto de metal aterrado imediatamente antes de manusear grades de grafeno ou grafeno.

4. Revestir a folha de grafeno/de camada única com uma fina camada de MMA(8.5)MMA EL6 (MMA)

NOTA: Depois que o for gravado, esta camada de MMA suportará a monocamada de grafeno para permitir o manuseio da folha de grafeno em etapas futuras. O revestimento MMA também permite a visualização do filme de grafeno, uma vez que uma monocamada de grafeno sozinha seria transparente.

  1. Coloque a lamínula com a folha de grafeno/colada em um revestidor de spin caseiro (este pode ser montado usando um ventilador de computador) dentro de uma coifa de fumaça (Figura 2B), conforme descrito anteriormente por Han et al.25.
  2. Usando óculos de segurança, adicione duas gotas de MMA usando uma pipeta de vidro na folha de grafeno e comece imediatamente a girar na velocidade máxima.
  3. Ao girar, adicione mais duas gotas no centro. Gire por 1 min.
    NOTA: Certifique-se de que MMA suficiente foi aplicado para revestir totalmente o grafeno. Se não tiver certeza, adicione mais algumas gotas. Se o grafeno não estiver totalmente revestido, "buracos" aparecem no filme depois que é gravado.
  4. Deixe secar ao ar por 10 minutos dentro de um exaustor.

5. Remova o grafeno na parte de trás da folha de grafeno/

NOTA: O grafeno crescido na parte de trás do cobre (o lado não revestido com MMA) deve ser removido antes de prosseguir para as etapas subsequentes, pois esse excesso de grafeno reduzirá a eficácia do condicionamento de. Removemos esse grafeno expondo o grafeno ao plasma, o que pode ser feito usando qualquer dispositivo de descarga de brilho normalmente usado para preparar grades EM para preparação de amostras biológicas.

  1. Remova cuidadosamente a fita e levante a folha de grafeno/revestida de MMA da tampa com pinças limpas e secas.
  2. Tape o pedaço da folha de MMA/grafeno/com o lado MMA para baixo até uma tampa de vidro limpa e sem poeira.
  3. Coloque a lamínula com a folha de MMA/grafeno/no dispositivo de descarga de brilho e aplique as configurações que normalmente seriam usadas ao preparar grades para coloração negativa ou preparação de amostra de crioEM.
    NOTA: A descarga prolongada de brilho deve ser evitada para evitar a oxidação de Cu na parte traseira, que pode resultar na contaminação de partículas (nano)partículas de óxido de cobre (CuO) no filme de grafeno.

6. Condicione o da folha de MMA/grafeno/em solução de APS

  1. Em uma exaustora, despeje 200 mL da solução de APS recém-feita em uma placa de cristalização limpa e livre de poeira (150 x 75 mm).
  2. Remova a folha MMA/grafeno/da lâmina de vidro. Acompanhe de que lado está o MMA.
  3. Para iniciar o condicionamento condicionante, coloque a folha de MMA/grafeno/com o tratado com plasma para baixo na superfície da solução de APS. Cubra o copo de vidro largo com um pedaço de papel alumínio ou uma tampa para evitar a entrada de poeira.
  4. Incubar por 3 h. Se a maior parte do não estiver gravada após 1 h, repita as etapas nas seções 2-6 e, em seguida, continue para a próxima etapa.
    NOTA: Se a maior parte do Cu não for gravado após 1 h, é provável que o lado MMA/grafeno do filme tenha sido colocado na superfície da solução APS em vez do lado Cu. deve ser gravado completamente após 3 h, e o filme MMA/grafeno é incolor se estiver gravado completamente. O grafeno contamina facilmente, portanto, certifique-se de cobrir todos os recipientes para evitar o acúmulo de fiapos ou quaisquer resíduos gordurosos nas superfícies, pois isso afetará negativamente a qualidade do grafeno.

7. Enxágue o filme de MMA/grafeno em água DI

  1. Em uma coifa de fumaça, encha um prato de cristalização limpo e sem poeira com água DI.
  2. Recolha suavemente o filme de grafeno-MMA com uma tampa de vidro limpa e sem poeira, posicionada num ângulo de ~45° em relação à superfície da solução APS.
  3. Posicione a lâmina de vidro em um ângulo de quase 90° em relação à água e abaixe suavemente a tampa de vidro na água para que o MMA/grafeno deslize lentamente da lâmina e flutue na superfície da água.
  4. Deixe o filme MMA/grafeno na superfície da água por 1 h para lavar qualquer SAF.

8. Limpe as grades a serem revestidas com uma monocamada de grafeno

NOTA: As grades para as quais o grafeno será transferido devem ser o mais limpas possível para maximizar a fixação do grafeno à superfície da folha de grade. As grades compradas comercialmente geralmente contêm contaminantes residuais que devem ser removidos antes da transferência de grafeno.

  1. Limpe e seque três pratos cristalizadores para que fiquem livres de poeira.
  2. Em uma exaustora, despeje 200 mL de clorofórmio, acetona e álcool isopropílico (IPA) em cada um dos três pratos cristalizantes. Cubra as placas de cristalização com papel alumínio para minimizar a evaporação dos solventes orgânicos.
    CUIDADO: O clorofórmio e a acetona causam irritação da pele e podem ser tóxicos se inalados. Limite a exposição a esses solventes orgânicos e use EPIs.
  3. Coloque a base do bloco de fixação do suporte da grelha de MET no fundo da primeira placa de cristalização contendo 200 ml de clorofórmio.
  4. Transfira cada grade individualmente da caixa de grade para um poço no bloco de suporte da grade, garantindo que o lado da película fenestrada esteja voltado para cima. Cubra a placa de cristalização com papel alumínio, coloque-a em um agitador orbital e agite suavemente por 30 min.
  5. Coloque a tampa metálica no bloco do suporte da grade, que fixará as grades durante a transferência para a próxima placa de cristalização. Levante cuidadosamente o bloco do suporte da grade para fora da placa de cristalização com um garfo dobrado e uma pinça longa e coloque-o no fundo da segunda placa de cristalização contendo 200 mL de acetona. Retire a tampa do bloco do suporte da grade e agite suavemente em um agitador orbital por 30 minutos.
  6. Coloque a tampa no bloco do suporte da grade e transfira para uma placa de cristalização contendo 200 mL de solução de IPA para limpar o resíduo de acetona. Retire a tampa do bloco do suporte da grade e agite suavemente por 20 minutos.
  7. Transfira individualmente as grades com o lado da película fenestrada voltado para cima do bloco do suporte da grade para uma placa de Petri de vidro coberta com papel manchado.
  8. Seque as grades por pelo menos 30 minutos sob o exaustor, garantindo que as grades estejam cobertas para evitar que a poeira caia sobre ele.

9. Transfira as grades limpas para papel mata-borrão colocado em uma malha de arame de aço inoxidável ou bandeja perfurada sob água DI

NOTA: As grades devem ser submersas sob água DI em uma superfície plana para que o grafeno possa ser flutuado na água e abaixado nas grades. Isso pode ser realizado usando uma calha de revestimento de grade comercial ou com uma placa de Petri e uma bomba peristáltica, como usado para gerar grades de óxido de grafeno, como descrito por Palovcak et al.18.

  1. Coloque a malha ou bandeja de aço inoxidável em uma calha de revestimento de grade e enxágue com água DI.
  2. Corte o papel mata-borrão que é um pouco menor que a malha/bandeja de aço inoxidável e coloque-o em cima da plataforma, submerso na água DI.
    NOTA: O papel de mancha é ligeiramente menor do que a plataforma para permitir o movimento e o manuseio.
  3. Transfira suavemente as grades limpas com o lado da película fenestrada voltado para cima do papel manchado. As grades provavelmente serão hidrofóbicas, então submerja as grades na água verticalmente ou elas podem se dobrar devido à tensão da água. Posicione as grades em uma matriz quadrada de modo que fiquem o mais próximas possível umas das outras, mas sem sobreposição (Figura 2C).
  4. As grades agora estão prontas para serem revestidas com uma monocamada de grafeno. Encha a calha de revestimento da grade com mais água DI para que a superfície da água fique pelo menos 5 mm acima das grades.

10. Transfira o grafeno para as grades

  1. Retire cuidadosamente o filme MMA/grafeno da placa de cristalização com uma tampa limpa, baixando lentamente a lamínula na calha em um ângulo, a alguma distância da película de grafeno. Posicione a lamínula sob a folha de grafeno-MMA de modo que as bordas da folha e da lamínula fiquem paralelas e, em seguida, levante a lamínula verticalmente para fora da água, trazendo consigo a película de MMA/grafeno.
  2. Transfira o filme MMA/grafeno para a calha baixando a lamínula na água em um ângulo de ~45°, de modo que o filme MMA/grafeno se desprenda da lamínula e flutue na superfície da água.
  3. Posicione o filme MMA/grafeno diretamente acima das grades antes que o nível da água seja reduzido. Use uma pipeta de vidro Pasteur cuja ponta foi derretida para selar a abertura para manipular cuidadosamente a posição do filme MMA/grafeno.
  4. Abaixe lentamente o nível de água com a seringa, a aproximadamente 1,25 mL/min, de modo que o filme MMA/grafeno cubra totalmente as superfícies da grade ao pousar no papel de filtro
    NOTA: Pode ser necessária uma manipulação adicional da folha de grafeno-MMA para manter a sua posição acima das grades à medida que o nível da água cai.
  5. Use uma pinça limpa e seca para levantar o papel manchado que prende as grades a uma placa de Petri limpa, seca e sem poeira, ou transfira toda a plataforma de aço inoxidável.
  6. Seque ao ar as grades de MMA/grafeno por pelo menos 30 min sob o exaustor. Mantenha as grades cobertas com papel alumínio ou tampa para evitar qualquer contaminação por partículas de poeira.
  7. Transfira as grades para uma incubadora e asse as grades em uma incubadora de 65 °C por 30 min.
  8. Retire as grades da incubadora e deixe-as cobertas por 5 min à temperatura ambiente para resfriar as grades à temperatura ambiente.

11. Remoção do MMA e limpeza das grades

NOTA: O MMA deve ser cuidadosamente lavado em acetona para evitar qualquer MMA residual nas grades revestidas com grafeno.

  1. Em uma capela de fumaça, prepare duas placas cristalizadoras contendo 200 mL de acetona e uma placa cristalizadora contendo 200 mL de isopropanol (IPA) à temperatura ambiente. Cubra as placas de cristalização com papel alumínio para minimizar a evaporação dos solventes orgânicos.
    CUIDADO: Use EPI ao manusear acetona, pois pode causar irritação na pele e pode ser prejudicial se inalado.
  2. Colocar a base do bloco de fixação do suporte da grelha de MET no fundo da primeira placa de cristalização contendo 200 ml de acetona fresca.
  3. Transfira cada grade individualmente do papel de mancha para um poço no bloco de suporte da grade, garantindo que o lado do MMA esteja voltado para cima. Cubra a placa de cristalização com papel alumínio, coloque-a em uma coqueteleira orbital e agite suavemente por 30 min.
  4. Coloque a tampa metálica no bloco do suporte da grade, que fixará as grades durante a transferência para a próxima placa de cristalização. Levante cuidadosamente o bloco do suporte da grelha para fora da placa de cristalização com um garfo dobrado e uma pinça longa e coloque-o no fundo da segunda placa de cristalização contendo 200 ml de acetona fresca. Retire a tampa do bloco do suporte da grade e agite suavemente em um agitador orbital por 30 minutos.
  5. Coloque a tampa no bloco do suporte da grade e transfira para a placa de cristalização contendo 200 mL de solução de IPA para limpar o resíduo de acetona. Retire a tampa do bloco do suporte da grade e agite suavemente por 20 minutos.
  6. Transfira as grades para uma pequena placa de Petri de vidro coberta com papel mata-borrão e seque as grades ao ar por pelo menos 10 min. Mantenha as grades cobertas com uma tampa para evitar qualquer contaminação por partículas de poeira.
  7. As grades estão prontas para serem usadas ou transferidas para uma caixa de grade envolta com papel alumínio dentro de um dessecador a vácuo.
    NOTA: Armazenar grades de grafeno dentro de um exsicador a vácuo pode evitar a contaminação de partículas hidrofóbicas de condições ambientais. Essas grades podem ser armazenadas por até vários meses antes do uso27.

12. Tornar as grades de grafeno hidrofílicas com tratamento UV/Ozônio

NOTA: O grafeno é extremamente hidrofóbico, o que não é compatível com a preparação de amostras crioEM, uma vez que as abordagens blot-plunge requerem uma superfície hidrofílica sobre a qual uma gota de amostra pode se espalhar uniformemente. Enquanto os dispositivos tradicionais de descarga de brilho podem ser configurados para pulsar suavemente o plasma para tornar a superfície do grafeno hidrofílica, esses dispositivos tendem a destruir a fina monocamada de grafeno. Foi demonstrado anteriormente que um limpador UV/ozônio pode ser usado para oxigenar parcialmente a superfície do grafeno25, tornando-o hidrofílico para a preparação de amostras de crioEM sem danificar a monocamada.

  1. Se estiver usando um sistema UV/Ozônio que exija escorvamento, ligue o sistema e ligue a lâmpada por 10 min (nesta etapa, certifique-se de que nenhuma grade esteja exposta). Enquanto o limpador UV/ozônio estiver preparando, remova as grades do exsicador a vácuo e transfira-as para uma tampa limpa.
  2. Quando o sistema UV/Ozônio estiver pronto, coloque a lamínula contendo as grades com o lado do grafeno voltado para cima no limpador UV/ozônio e exponha as grades ao gás ozônio por 4 minutos.
  3. Após a exposição ao ozônio, use as grades imediatamente para a preparação da amostra de crioEM.
    NOTA: Se estiver usando um sistema UV/Ozônio que exija escorvamento, grades devem ser colocadas no limpador imediatamente após a lâmpada ter sido preparada por 10 min, ou será muito frio para produzir gás ozônio suficiente para oxigenar o grafeno para a preparação da amostra. Não exponha as grades ao gás ozônio por mais de 6 min, pois ele destruirá a camada de grafeno.

Representative Results

A execução bem-sucedida do protocolo de fabricação de grade de grafeno descrito aqui resultará em grades EM totalmente revestidas com uma única monocamada de grafeno. A cobertura de grafeno das grades pode ser verificada usando qualquer MET. Como uma monocamada de grafeno limpo é quase invisível no MET, deve-se examiná-lo usando o modo de difração do microscópio e observar pontos de Bragg correspondentes à organização hexagonal dos átomos de carbono que compõem o grafeno (Figura 3A). É normal ocasionalmente observar algumas rugas de grafeno monocamada, que são introduzidas durante o revestimento com MMA (Figura 3B). Pode-se também verificar o nível de contaminação presente no grafeno adquirindo uma imagem de alta magnificação no centro de um dos orifícios cobertos de grafeno (Figura 3C). Se adquirida com um detector de alta resolução, uma transformada de Fourier desta imagem deve conter pontos de Bragg correspondentes ao espaçamento carbono-carbono a 2,14 Å (Figura 4C). Uma monocamada de átomos de carbono não produz espalhamento de elétrons suficiente para gerar contraste de fase e, portanto, uma imagem de grafeno limpo não apresentará anéis de Thon associados à função de transferência de contraste em uma transformada de Fourier da imagem. No entanto, é muito difícil evitar a contaminação das grades de grafeno depois que elas são produzidas, e a lavagem insuficiente das grades EM ou a remoção de MMA após o revestimento de grafeno resultará em contaminantes notáveis nas grades que são visíveis nas imagens do espaço real (Figura 3C). Como mostrado na Figura 4, as grades de grafeno têm um efeito concentrador em uma amostra, como observado ao comparar 0,5 mg/mL de apoferritina aplicada a grades de ouro holey com (Figura 4A) e sem o suporte de grafeno (Figura 4B). Protocolos similares de fabricação de grafeno foram previamente descritos para resolver estruturas crioEM de proteínas como a apoferritina em alta resolução25,27.

Figure 1
Figura 1: Esquema para preparação de grades crioEM revestidas com grafeno. As principais etapas no processo de fabricação da grade de grafeno são ilustradas. Abreviações: cryoEM = microscopia eletrônica criogênica; MMA = metacrilato de metila; SAF = persulfato de amônio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Materiais necessários para fazer grades de grafeno. (A) Os materiais necessários para o revestimento de grades crio-EM são rotulados em conformidade. (B) Vista de perto do revestidor com folha de grafeno/colada em um papel manchado em uma lâmina de vidro. O revestidor de spin pode ser montado comprando peças de uma loja local de computadores/ferragens. (C) Vista de perto da calha de revestimento da grade presa a uma seringa que pode ser usada para controlar o nível da água. As grades são colocadas em cima de um papel manchado em uma malha de aço inoxidável. O papel de mancha ajuda a manobrar a localização das grades para que a folha de grafeno possa ser combinada com ele. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Imagem representativa do padrão de difração e imagens de campo brilhante de uma grade de grafeno mostrando rugas ou contaminação por MMA . (A) Grades EM cobertas com uma monocamada de grafeno mostrarão picos de Bragg correspondentes à rede hexagonal do grafeno quando imageados em um MET em modo de difração. O pico de Bragg correspondente ao espaçamento carbono-carbono de 2,14 Å é circundado e denotado com uma seta. (B) Imagem de campo brilhante de uma grade de grafeno monocamada com algumas rugas (denotadas com uma seta) na monocamada de grafeno. (C) Imagem de campo claro de grafeno monocamada com contaminação por MMA (indicada com uma seta). Barras de escala = 100 nm (B,C). Abreviações: EM = microscopia eletrônica; MMA = metacrilato de metila. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Apoferritina em grades de ouro cobertas de grafeno: (A) Micrografia de crioEM de 0,5 mg/mL de apoferritina em grades de ouro cobertas de grafeno. (B) A apoferritina fotografada na mesma concentração é visível em concentração substancialmente menor quando preparada usando grades de ouro holey sem grafeno. (C) FFT da micrografia crioEM de apoferritina 0,5 mg/mL sobre grades de ouro cobertas de grafeno, com os picos de Bragg correspondendo à rede hexagonal de grafeno denotada. Barras de escala = 100 nm (A,B). Abreviações: cryoEM = microscopia eletrônica criogênica; FFT = transformada rápida de Fourier. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

A preservação de amostras biológicas em uma fina camada de gelo vítreo é um passo criticamente importante para a determinação da estrutura crioEM de alta resolução. No entanto, os pesquisadores frequentemente encontram problemas decorrentes das interações com o AWI, que introduz orientação preferencial, desmontagem complexa, desnaturação e agregação. Além disso, as amostras nem sempre podem ser concentradas o suficiente para povoar o gelo fino suspenso através dos orifícios de um filme fenestrado. Vários grupos de pesquisa têm desenvolvido métodos para revestir grades de EM com uma monocamada de grafeno para ajudar a superar algumas dessas limitações24,25,26,27,28,29,30, e grades de grafeno têm sido utilizadas com grande sucesso. Aqui, fornecemos instruções passo a passo para preparar efetivamente lotes de grades de grafeno internamente e examinar a qualidade das grades de grafeno por TEM. Ressaltamos que um cuidado especial deve ser exercido durante algumas das etapas críticas, que descrevemos a seguir.

O grafeno tem uma forte tendência a atrair contaminantes transportados pelo ar. Portanto, durante o processo de fabricação da grade de grafeno, é importante certificar-se de que todas as ferramentas que entram em contato com a folha de grafeno/ou as grades estejam limpas e livres de poeira. As tampas de vidro usadas para transferir grafeno podem ser limpas enxaguando com etanol e água DI ou usando um air-duster. Também é aconselhável trabalhar sob um exaustor de fumaça e manter folhas e grades de grafeno cobertas com papel alumínio ou uma placa de vidro limpa o tempo todo. Poeira ou contaminantes nas grades podem impedir que o grafeno adera completamente às grades EM. Ao manusear grades revestidas de grafeno ou grafeno, é importante estar aterrado eletricamente para evitar danos ao filme de grafeno por descarga estática. A descarga estática pode ser evitada com o uso de uma alça de aterramento do pulso, o toque em um objeto metálico aterrado cada vez que as grades de grafeno ou grafeno são manuseadas e/ou o não uso de luva na mão que segura a pinça24.

Como uma monocamada de grafeno é muito fina (a largura de um átomo de carbono), é importante suportar o grafeno com uma camada orgânica como MMA ou poli-MMA (PMMA) durante a transferência do grafeno para grades. O PMMA é o material mais utilizado para transferência de grafeno. No entanto, o PMMA tem uma forte afinidade com o grafeno e muitas vezes pode resultar em contaminação do polímero no filme de grafeno. O MMA é utilizado nesse protocolo, pois deixa menos contaminação residual25. No entanto, tanto o PMMA quanto o MMA têm a desvantagem de formar rugas e rachaduras que podem ser observadas em algumas áreas do filme de grafeno (Figura 3B). Pode ser um desafio evitar essas rugas, pois elas ocorrem comumente durante o crescimento do grafeno pelo método da DCV31. Recentemente, foi desenvolvido um método para o cultivo de grafeno ultraplano sem rugas, pelo qual a folha de cobre é substituída por um wafer de(111)/safira como substrato de crescimento32.

Com base em nossa experiência, é melhor comprar folhas de grafeno/e apoiar o grafeno com MMA internamente do que comprar folhas de-grafeno cobertas de polímero de fabricantes, que se tornam quebradiças após a gravação de cobre e são difíceis de manusear nas etapas subsequentes. O revestidor de spin que usamos para revestimento MMA pode ser construído de forma barata usando peças de uma loja local de computadores/ferragens, como descrito anteriormente25.

Durante a etapa de revestimento do MMA, é importante cobrir toda a superfície do grafeno na folha de-grafeno com MMA. Depois que o for gravado, o MMA-grafeno se tornará semitransparente, e as áreas sem cobertura de MMA parecerão buracos vazios. Para evitar o revestimento de MMA no lado de cobre, é importante colocar um pequeno pedaço de papel manchado por baixo dele durante o revestimento, de modo que absorva qualquer excesso de MMA que saia do filme CVD.

Após a gravação e enxágue, a folha de MMA/grafeno está pronta para ser transferida para grades EM usando um sistema de calha comercial ou caseiro com uma seringa ou bomba peristáltica para controlar o nível de água. Antes da etapa de transferência, é importante pré-enxaguar cuidadosamente as grades em banhos sucessivos de clorofórmio, acetona e IPA. Assar grades revestidas de grafeno a 65 °C ajuda a preservar a integridade do grafeno e promove a adsorção de grafeno às grades. Por fim, para evitar a contaminação do MMA nas grades, é importante remover bem o MMA em um banho de acetona e limpar as grades no IPA. Qualquer resíduo de MMA não lavado será observado nas grades de EM e diminuirá a relação sinal-ruído das imagens (Figura 3C). O processo de lavagem acetona-IPA pode ser repetido para limpar ainda mais as superfícies de grafeno.

Para tornar as grades de grafeno hidrofílicas, expomos as grades ao UV/Ozônio. Diferentes modelos de limpadores UV/ozônio podem exigir otimização para oxigenar suficientemente a camada de grafeno para a preparação de amostras de crioEM sem danificar o grafeno. Independentemente do sistema, é fundamental usar essas grades para aplicação de amostras de crioEM imediatamente após o tratamento com UV/ozônio. Métodos alternativos para tornar hidrofílicas as grades de grafeno são descritas em outros estudos33,34.

Disclosures

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Acknowledgments

Agradecemos ao Dr. Xiao Fan pelas discussões úteis ao estabelecer esses métodos na Scripps Research. B.B. foi apoiado por uma bolsa de pesquisa de pós-doutorado da Fundação Hewitt para Pesquisa Médica. W.C. é apoiado por uma bolsa de pré-doutorado da National Science Foundation. O D.E.P é apoiado pelo NS095892 de concessão do National Institutes of Health (NIH) ao G.C.L. Este projeto também foi apoiado por subsídios do NIH GM142196, GM143805 e S10OD032467 para G.C.L.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
70% EtOH Pharmco (190 pf EtOH) 241000190CSGL
Acetone Sigma Aldrich 650501-4L
Ammonium persulfate (APS) Sigma Aldrich 215589-500g Hazardous; use extreme caution
Chloroform Sigma Aldrich C2432-1L
Clamping TEM Grid Holder Block for 45 Grids PELCO 16830-45
Computer fan Amazon (Noctua) B07CG2PGY6
Cover slip Bellco Glass 1203J71 Standard cover slips
Crystallizing dish Pyrex 3140-100
Electronics duster Falcon Safety Products 75-37-6
Falcon Dust-off Air Duster Staples N/A
Filter papers Whatman 1001-055
Fine tip tweezer Dumont 0508-L4-PO
Flask Pyrex 4980-500
Fork Supermarket N/A
Glass pasteur pipette VWR 14672-608
Graphene/Cu Graphenea N/A CVD monolayer graphene cu
Grid Coating Trough Ladd Research Industries 10840 Fragile
Isopropanol Fisher Scientific 67-63-0
Kapton Tape Amazon (MYJOR) MY-RZY001 Polyimide tape
Kimwipes Fisher Scientific 06-666
Long twzeer Cole Parmer Essentials UX-07387-15
Metal grid holder Ted Pella 16820-81
MMA(8.5)MMA EL 6 KAYAKU Advanced Materials M31006 0500L 1GL Flammable
Model 10 Lab Oven Quincy Lab, Inc. FO19013
Petri dish Pyrex 3610-102
Plasma cleaner (Solarus 950) Gatan, Inc. N/A
Scissors Fiskars 194813-1010
Standard Analog Orbital Shaker VWR 89032-088
UltrAuFoil R1.2/1.3 - Au300 Quantifoil N/A Holey gold grids
Ultraviolet Ozone Cleaning Systems UVOCS model T10X10/OES

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References

  1. Li, X., Zheng, S. Q., Egami, K., Agard, D. A., Cheng, Y. Influence of electron dose rate on electron counting images recorded with the K2 camera. Journal of Structural Biology. 184 (2), 251-260 (2013).
  2. Tang, G., et al. EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).
  3. Zivanov, J., et al. New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3. eLife. 7, 1-22 (2018).
  4. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. CryoSPARC: Algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  5. Grigorieff, N., Harrison, S. C. Near-atomic resolution reconstructions of icosahedral viruses from electron cryo-microscopy. Current Opinion in Structural Biology. 21 (2), 265-273 (2011).
  6. Nakane, T., et al. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).
  7. Zhang, K., Pintilie, G. D., Li, S., Schmid, M. F., Chiu, W. Resolving individual atoms of protein complex by cryo-electron microscopy. Cell Research. 30 (12), 1136-1139 (2020).
  8. Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM. Nature. 587 (7832), 157-161 (2020).
  9. Schultz, P. Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Quarterly Reviews of Biophysics. 21 (2), 129-228 (1988).
  10. Nguyen, H. P. M., McGuire, K. L., Cook, B. D., Herzik, M. A. Manual blot-and-plunge freezing of biological specimens for single-particle cryogenic electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. 2022 (180), 1-16 (2022).
  11. Glaeser, R. M. Proteins, interfaces, and cryo-em grids. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 25 (3), 289-313 (2016).
  12. Glaeser, R. M., Han, B. -G. Opinion: hazards faced by macromolecules when confined to thin aqueous films. Biophysics Reports. 3 (1-3), 1-7 (2017).
  13. Han, B. G., Watson, Z., Cate, J. H. D., Glaeser, R. M. Monolayer-crystal streptavidin support films provide an internal standard of cryo-EM image quality. Journal of Structural Biology. 200 (3), 307-313 (2017).
  14. Noble, A. J., et al. Routine single particle CryoEM sample and grid characterization by tomography. eLife. 7, 1-42 (2018).
  15. Drulyte, I., et al. Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 74 (6), 560-571 (2018).
  16. Liu, N., Wang, H. W. Better cryo-EM specimen preparation: how to deal with the air-water interface. Journal of Molecular Biology. 435 (9), 167926 (2022).
  17. Noble, A. J., et al. Reducing effects of particle adsorption to the air-water interface in cryo-EM. Nature Methods. 15 (10), 793-795 (2018).
  18. Palovcak, E., et al. A simple and robust procedure for preparing graphene-oxide cryo-EM grids. Journal of Structural Biology. 204 (1), 80-84 (2018).
  19. Patel, A., Toso, D., Litvak, A., Nogales, E. Efficient graphene oxide coating improves cryo-EM sample preparation and data collection from tilted grids. bioRxiv. , (2021).
  20. Marr, C. R., Benlekbir, S., Rubinstein, J. L. Fabrication of carbon films with ~500nm holes for cryo-EM with a direct detector device. Journal of Structural Biology. 185 (1), 42-47 (2014).
  21. Pantelic, R. S., Meyer, J. C., Kaiser, U., Baumeister, W., Plitzko, J. M. Graphene oxide: A substrate for optimizing preparations of frozen-hydrated samples. Journal of Structural Biology. 170 (1), 152-156 (2010).
  22. Pantelic, R. S., et al. Graphene: substrate preparation and introduction. Journal of Structural Biology. 174 (1), 234-238 (2011).
  23. Russo, C. J., Passmore, L. A. Progress towards an optimal specimen support for electron cryomicroscopy. Current Opinion in Structural Biology. 37, 81-89 (2016).
  24. Passmore, L. A., Russo, C. J. Specimen preparation for high-resolution cryo-EM. Methods in Enzymology. 579, 51-86 (2016).
  25. Han, Y., et al. High-yield monolayer graphene grids for near-atomic resolution cryoelectron microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (2), 1009-1014 (2020).
  26. Zheng, L., et al. Robust ultraclean atomically thin membranes for atomic-resolution electron microscopy. Nature Communications. 11 (1), 541 (2020).
  27. Ahn, E., Kim, B., Cho, U. -S. Batch production of high-quality graphene grids for cryo-EM: cryo-EM structure of Methylococcus capsulatus soluble methane monooxygenase hydroxylase. bioRxiv. (Cvd), (2021).
  28. Naydenova, K., Peet, M. J., Russo, C. J. Multifunctional graphene supports for electron cryomicroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (24), 11718-11724 (2019).
  29. Fan, H., Sun, F. Developing graphene grids for cryoelectron microscopy. Frontiers in Molecular Biosciences. 9, 937253 (2022).
  30. D'Imprima, E., et al. Protein denaturation at the air-water interface and how to prevent it. eLife. 8, e42747 (2019).
  31. Zhang, X., et al. Evolution of copper step beams during graphene growth by CVD method. Applied Surface Science. 610, 155518 (2023).
  32. Zheng, L., et al. Uniform thin ice on ultraflat graphene for high-resolution cryo-EM. Nature Methods. 20 (1), 123-130 (2023).
  33. Fujita, J., et al. Epoxidized graphene grid for highly efficient high-resolution cryoEM structural analysis. Scientific Reports. 13, 2279 (2023).
  34. Lu, Y., et al. Functionalized graphene grids with various charges for single-particle cryo-EM. Nature Communications. 13, 6718 (2022).

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Fabricação Grades revestidas de grafeno monocamada Microscopia crioeletrônica Preparação de amostras Gelo vítreo Filme de suporte fenestrado Efeito hidrofóbico Desnaturação Agregação Dissociação complexa Interações hidrofóbicas Reconstruções 3D Resolução direcional anisotrópica Suportes de grafeno Ruído de fundo Concentração de proteínas Imagem CryoEM Despesas Produção em larga escala
Fabricação de grades revestidas de grafeno monocamada para microscopia crioeletrônica
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Basanta, B., Chen, W., Pride, D. E., Lander, G. C. Fabrication of Monolayer Graphene-Coated Grids for Cryoelectron Microscopy. J. Vis. Exp. (199), e65702, doi:10.3791/65702 (2023).

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