Summary
Her beskriver vi en protokol til anvendelse af et enkelt monolag grafen på elektronmikroskopigitre, og hvordan man forbereder dem til brug i kryoEM-strukturbestemmelse.
Abstract
Kryogen elektronmikroskopi (cryoEM) har vist sig som en kraftfuld teknik til at undersøge atomstrukturen af makromolekylære komplekser. Prøveforberedelse til cryoEM kræver konservering af prøver i et tyndt lag glasagtig is, typisk suspenderet i hullerne i en fenestreret støttefilm. Imidlertid udsætter alle almindeligt anvendte prøveforberedelsesmetoder til kryoEM-undersøgelser prøven for luft-vand-grænsefladen, hvilket introducerer en stærk hydrofob effekt på prøven, der ofte resulterer i denaturering, aggregering og kompleks dissociation. Endvidere påvirker foretrukne hydrofobe interaktioner mellem prøvens regioner og luft-vand-grænsefladen de orienteringer, der er vedtaget af makromolekylerne, hvilket resulterer i 3D-rekonstruktioner med anisotrop retningsopløsning.
Adsorption af kryoEM-prøver til et monolag af grafen har vist sig at hjælpe med at afbøde interaktioner med luft-vand-grænsefladen, samtidig med at introduktionen af baggrundsstøj minimeres. Grafenunderstøtninger giver også fordelen ved væsentligt at sænke den krævede koncentration af proteiner, der kræves til kryoEM-billeddannelse. På trods af fordelene ved disse understøtninger anvendes grafenbelagte gitre ikke i vid udstrækning af cryoEM-samfundet på grund af de uoverkommelige omkostninger ved kommercielle muligheder og udfordringerne forbundet med storskala intern produktion. Dette papir beskriver en effektiv metode til fremstilling af batches af cryoEM-gitre, der har næsten fuld dækning af monolagsgrafen.
Introduction
Enkeltpartikelkryogenelektronmikroskopi (cryoEM) er en stadig mere anvendelig teknologi, der bruges til at undersøge 3D-strukturer af biomakromolekyler. Teknologiske fremskridt inden for elektronmikroskopoptik, direkte elektrondetektion1 og computeralgoritmer 2,3,4 i løbet af det sidste årti har gjort det muligt for kryoEM-brugere at bestemme strukturerne af biokemisk stabile makromolekylære komplekser til næratomopløsning 5,6,7,8 . På trods af disse fremskridt er der stadig bemærkelsesværdige barrierer for at bevare prøver til kryoEM-billeddannelse, hvilket forhindrer størstedelen af biologiske prøver i at blive opløst til så høje opløsninger.
Prøveforberedelse til kryoEM-analyse med høj opløsning involverer fangst af makromolekyler, der er jævnt fordelt i en lang række retninger inden for et tyndt lag forglasset is. "Blot and plunge"-metoderne til frysning er de mest anvendte metoder til at generere tynde film af biologiske prøver på gitre til kryoEM-undersøgelser 9,10. Disse metoder involverer påføring af et par mikroliter prøveopløsning på et EM-gitter, der indeholder en fenestreret film, der er gjort hydrofil, og derefter blottet størstedelen af prøven væk med filterpapir, før gitteret hurtigt kastes ned i et kryogen af flydende ethan eller ethan-propanblanding9.
Mens denne metode med succes er blevet brugt til at bestemme strukturer af en lang række biologiske prøver, udsætter alle almindeligt anvendte kryoEM-prøveforberedelsesmetoder prøver for den hydrofobe luft-vand-grænseflade (AWI), som ofte introducerer problemer, der begrænser strukturbestemmelse med høj opløsning. Det er fastslået, at biologiske prøver har en høj tilbøjelighed til denaturering, når de udsættes for AWI, hvilket kan føre til kompleks aggregering og demontering11,12,13,14. Desuden får hydrofobe pletter på overfladerne af biologiske prøver partikler til at vedtage foretrukne retninger i isen12. I mange scenarier tvinger en enkelt hydrofob region af prøven alle partikler til at vedtage en entydig orientering i isen og derved afskaffe evnen til at generere en pålidelig rekonstruktion. Ud over problemer med AWI kan prøver vise en affinitet for overfladen af det fenestrerede lag af film, hvilket begrænser antallet af partikler suspenderet i isen inden for hullerne15.
Flere metodologiske og teknologiske løsninger er blevet udviklet for at mindske disse problemer, der opstår som følge af interaktioner med AWI eller filmene16,17. En populær tilgang er at belægge den fenestrerede film af EM-gitterne med et tyndt (titalls nanometer) lag af amorft kulstof. Denne belægning giver en kontinuerlig overflade på tværs af hullerne, som partikler kan adsorbere til, med fordelen ved delvist at beskytte prøven mod interaktioner med AWI15,18,19,20. Det ekstra kulstoflag hæver imidlertid mængden af baggrundssignal i de afbildede områder og introducerer støj, der kan kompromittere opnåelig opløsning, især for små (<150 kDa) prøver. I de senere år har brugen af grafenoxidflager (GO) til fremstilling af understøttende film på kryoEM-gitter vist sig at have fordele i forhold til traditionelt amorft kulstof. GO-flager produceres ved oxidation af grafitlag, hvilket resulterer i pseudokrystallinske plader af monolagsgrafit, der er hydrofile på grund af deres betydelige iltindhold i form af carboxyl-, hydroxyl- og epoxygrupper på overflader og kanter. Kommercielle GO-flager i vandige suspensioner er billige, og der er adskillige offentliggjorte metoder til påføring af GO-flager på EM-gitter18,21. Disse metoder resulterer dog ofte i gitre, der kun er delvist dækket af GO-flager, samt regioner, der indeholder flere lag GO-flager. Desuden bidrager GO-flager med et mærkbart baggrundssignal til kryoEM-billeder, der er tæt på det, der observeres med tyndt amorft kulstof22,23.
Uberørt monolagsgrafen, som består af et enkelt 2D-krystallinsk array af carbonatomer, adskiller sig fra GO, idet det ikke producerer fasekontrast i elektronmikroskopet. Monolagsgrafen kan således bruges til at generere et usynligt støttelag til billeddannelse af biologiske prøver. Monolagsgrafen er også stærkere end GO og kan anvendes som et enkelt monolag på et EM-gitter, og nylige fremskridt inden for fremstilling af grafenbelagte EM-gitre har gjort det muligt at forberede monolagsgrafengitter med høj dækning internt 24,25,26,27,28,29,30. På trods af fordelene ved at bruge grafenbelagte gitre til bestemmelse af kryoEM-strukturen anvendes de imidlertid ikke i vid udstrækning på grund af de uoverkommelige omkostninger ved kommercielle muligheder og kompleksiteten af intern produktion. Her beskriver vi en trin-for-trin guide til effektiv produktion af EM-gitre dækket med et monolag grafen til kryoEM-strukturbestemmelse af biologiske prøver (figur 1). Ved at følge denne detaljerede protokol kan cryoEM-forskere reproducere snesevis af grafenstøttegitre af høj kvalitet på en enkelt dag. Kvaliteten af de grafenbelagte gitre kan let undersøges ved hjælp af et low-end transmissionselektronmikroskop (TEM) udstyret med et LaB6-filament.
Protocol
1. Forberedelse af materialer og tilbehør, der er nødvendige til fremstilling af grafengitter
BEMÆRK: Grafen forurener let, hvilket reducerer effektiviteten af grafenbelægning og kvaliteten af grafengitterne; Derfor er det vigtigt at rengøre alle materialer, der kommer i kontakt med grafen, grundigt. Forberedelse af materialer og alle trin skal udføres i en røghætte.
- Saml de nødvendige materialer, der skal bruges til belægning af gitterene med grafen (figur 2A).
- Skyl glasvarerne flere gange med deioniseret (DI) vand for at fjerne støv, fnug og olieagtige rester.
- Brug engangsservietter til at rengøre glasdæksler med 75% ethanol, og brug en luftstøver til at fjerne forurenende stoffer.
BEMÆRK: Den fastspændings TEM-gitterholderblok, der bruges i denne protokol, kan rumme op til 45 gitre. For en stor batchproduktion af grafengitter kan 45 gitre eller mindre fremstilles på én gang. Det anbefales dog at starte med en lille batchproduktion (fire til seks gitre), indtil metoden er etableret i laboratoriet.
2. Fremstilling af 0,2 M ammoniumpersulfat (APS) i vand
BEMÆRK: Denne APS-løsning bruges som en ætsning til at fjerne kobberstøtten (Cu) fra grafen/Cu-arket i et senere trin. Tilbered altid frisk APS-opløsning. Genbrugte eller gamle opløsninger ætser ikke kobber effektivt og kan efterlade kobberrester på grafen i de senere trin.
- Skyl en 500 ml kolbe med deioniseret vand (DI) vand, tilsæt derefter 200 ml DI vand og mikrobølgeovn ved hjælp af maksimale indstillinger i ca. 1 min for at afgasse vandet.
- Tilsæt 9 g ammoniumpersulfat til 200 ml DI-vand for at producere en opløsning af 0,2 M APS.
FORSIGTIG: APS er giftigt, det anbefales at bære personlige værnemidler (PPE) ved håndtering af APS. Bortskaf APS-affald i et godkendt affaldsbortskaffelsesanlæg. - Opløsningen omrøres med en omrøring på en magnetisk omrører, mens kolben tilsluttes en vakuumkilde under en stinkhætte.
BEMÆRK: Afgasning af APS-opløsning hjælper med at forhindre dannelse af bobler, hvilket kan reducere effektiviteten af Cu-ætsning i trin 6.
3. Overfør grafen/kobber til en ren dækseddel med et stykke blottingpapir
BEMÆRK: Vi bruger en 15 x 15 cm kemisk dampaflejring (CVD) grafenfilm på Cu fra en grafenleverandør. Kommercielt indkøbte monolags grafen/Cu-ark skal opbevares under vakuum. Da grafen dyrkes på begge sider af Cu ved CVD-metoden, udfører grafenleverandører generelt kvalitetskontrol og anbefaler den bedre side til brug. Vi henviser til denne anbefalede side af grafen som den "øverste" side, mens den anden side er den "bageste" side i denne protokol.
- Skær et stykke blottingpapir i en rektangulær form ca. 20 mm x 40 mm. Dette blottingpapir bruges som polstring til grafen/Cu-arket og absorberer overskydende methylmethacrylat (MMA (8.5) MMA EL6), der bruges til at belægge grafen/Cu-arket; Sørg derfor for at skære det i en størrelse, der er større end grafen / Cu-arket, der skal bruges.
- Brug polyimidtape til at tape de fire hjørner af blottingpapiret til toppen af en ren dæksel, der passer ind i en hjemmelavet spincoater.
BEMÆRK: Polyimidtape bruges, fordi den er tynd og let kan fjernes, hvilket gør håndteringen let. - Fjern et stykke grafen/Cu-arket fra vakuumlageret.
- Brug ren og støvfri saks til omhyggeligt at klippe en lille firkant af Cu-graphen-arket, der vil være tilstrækkeligt til helt at dække antallet af gitter, der skal forberedes. For 25 gitter arrangeret i et 5 x 5 array, for eksempel, skære et stykke, der er 18 mm x 18 mm. Placer grafen/Cu-arket oven på blottingpapiret med en ren, tør pincet. Sørg for, at bagsiden af grafen / Cu-arket vender nedad, og pas på ikke ved et uheld at vende grafen / Cu-arket, da det er svært at skelne oversiden fra bagsiden.
- Tape de fire hjørner af grafen / Cu-arket til blottingpapiret / omslaget, hvilket minimerer mængden af kontakt mellem båndet og grafen / Cu-arket, da alle regioner, der er dækket med tape, ikke dækkes med MMA i næste trin.
BEMÆRK: Statisk udladning kan beskadige grafenfilm, og det tilrådes derfor at forblive elektrisk jordforbundet og minimere akkumuleringen af statisk ladning ved håndtering af grafen- eller grafengitter. Dette kan opnås ved at bære en håndledsjordingsrem eller røre ved en jordet metalgenstand umiddelbart inden håndtering af grafen- eller grafengitter.
4. Overtræk enkeltlags grafen / Cu-arket med et tyndt lag MMA (8.5) MMA EL6 (MMA)
BEMÆRK: Når Cu er ætset væk, understøtter dette lag MMA grafenmonolaget for at muliggøre håndtering af grafenarket i fremtidige trin. MMA-belægning muliggør også visualisering af grafenfilmen, da et monolag af grafen alene ville være gennemsigtigt.
- Placer dæksedlen med det tapede grafen/Cu-ark på en hjemmelavet spincoater (denne kan samles ved hjælp af en computerventilator) inde i en stinkhætte (figur 2B), som tidligere beskrevet af Han et al.25.
- Brug sikkerhedsbriller, tilsæt to dråber MMA ved hjælp af en glaspipette på grafenarket og begynd straks at dreje med maksimal hastighed.
- Mens du spinder, skal du tilføje yderligere to dråber i midten. Spin i 1 min.
BEMÆRK: Sørg for, at der er anvendt tilstrækkelig MMA til at belægge grafen fuldt ud. Hvis du er usikker, skal du tilføje et par dråber mere. Hvis grafen ikke er fuldt belagt, vises "huller" i filmen, efter at Cu er ætset væk. - Lad lufttørre i 10 min inde i en stinkhætte.
5. Fjern grafen på bagsiden af grafen / Cu-arket
BEMÆRK: Grafen dyrket på bagsiden af kobberet (den side, der ikke er belagt med MMA) skal fjernes, før du fortsætter til de efterfølgende trin, fordi dette overskydende grafen reducerer effektiviteten af Cu-ætsning. Vi fjerner denne grafen ved at udsætte grafen for plasma, hvilket kan opnås ved hjælp af enhver glødudladningsanordning, der typisk bruges til at forberede EM-gitter til biologisk prøveforberedelse.
- Fjern forsigtigt tapen og løft det MMA-belagte grafen/Cu-ark fra dæksedlen med ren, tør pincet.
- Tape stykket af MMA / grafen / Cu-arket med MMA-siden nedad til et rent og støvfrit glasdæksel.
- Placer dæksedlen med MMA / grafen / Cu-arket i glødudladningsanordningen, og anvend indstillinger, der typisk vil blive brugt, når du forbereder gitter til negativ plet eller forberedelse af kryoEM-prøver.
BEMÆRK: Langvarig glødudladning bør undgås for at forhindre oxidation af Cu på bagsiden, hvilket kan resultere i forurening af kobberoxid (CuO) (nano) partikler på grafenfilm.
6. Æts Cu væk fra MMA / grafen / Cu-arket i APS-opløsning
- I en stinkhætte hældes 200 ml af den frisklavede APS-opløsning i en ren og støvfri krystalliserende skål (150 x 75 mm).
- Fjern MMA / grafen / Cu-arket fra glasglasset. Hold styr på, hvilken side der indeholder MMA.
- For at starte ætsningen skal du placere MMA/grafen/Cu-arket med den plasmabehandlede Cu-side nedad på overfladen af APS-opløsningen. Dæk det brede glasbæger med et stykke aluminiumsfolie eller et låg for at forhindre støv i at trænge ind.
- Inkuber i 3 timer. Hvis det meste af Cu ikke er ætset efter 1 time, skal du gentage trinnene i afsnit 2-6 og derefter fortsætte til næste trin.
BEMÆRK: Hvis det meste af Cu ikke ætses efter 1 time, er det sandsynligt, at MMA/grafensiden af filmen er blevet placeret ned på overfladen af APS-opløsningen i stedet for Cu-siden. Cu skal ætses helt efter 3 timer, og MMA / grafenfilmen er farveløs, hvis Cu ætses fuldstændigt. Grafen forurener let, så sørg for at dække eventuelle beholdere for at undgå ophobning af fnug eller fedtede rester på overflader, da dette vil påvirke grafens kvalitet negativt.
7. Skyl MMA/grafenfilmen i DI-vand
- I en stinkhætte fyldes en ren og støvfri krystalliserende skål med DI-vand.
- Skub forsigtigt grafen-MMA-filmen op med et rent, støvfrit glasdæksel placeret i ~ 45 ° vinkel i forhold til APS-opløsningens overflade.
- Placer glasglideren i en næsten 90 ° vinkel i forhold til vandet, og sænk forsigtigt glasdækslet ned i vandet, så MMA / grafen langsomt glider af glideren og flyder på vandoverfladen.
- Lad MMA / grafenfilmen stå på vandoverfladen i 1 time for at vaske APS af.
8. Rengør gitterene, der skal belægges med et monolag grafen
BEMÆRK: De gitre, som grafen overføres til, skal være så rene som muligt for at maksimere grafens fastgørelse til gitterfolieoverfladen. Kommercielt købte net indeholder ofte resterende forurenende stoffer, der skal fjernes inden grafenoverførsel.
- Rengør og tør tre krystalliserende skåle, så de er fri for støv.
- I en damphætte hældes 200 ml chloroform, acetone og isopropylalkohol (IPA) i hver af de tre krystalliserende skåle. Dæk de krystalliserende skåle med aluminiumsfolie for at minimere fordampningen af de organiske opløsningsmidler.
FORSIGTIG: Chloroform og acetone forårsager hudirritation og kan være giftige ved indånding. Begræns eksponeringen for disse organiske opløsningsmidler, og brug personlige værnemidler. - Bunden af klemmeblokken TEM-gitterholderen anbringes i bunden af den første krystalliserende skål, der indeholder 200 ml chloroform.
- Overfør hvert gitter individuelt fra gitterboksen til en brønd i gitterholderblokken, og sørg for, at den fenestrerede filmside vender opad. Dæk den krystalliserende skål med aluminiumsfolie, læg den på en orbitalryster, og ryst forsigtigt i 30 minutter.
- Placer metallåget på gitterholderblokken, som fastgør gitterene under overførslen til den næste krystalliserende skål. Løft forsigtigt gitterholderblokken ud af krystalliseringsskålen med en bøjet gaffel og en lang pincet, og læg den i bunden af den anden krystalliserende skål, der indeholder 200 ml acetone. Fjern låget fra gitterholderblokken, og ryst forsigtigt på en orbitalryster i 30 minutter.
- Låget anbringes på gitterholderblokken og overføres til en krystalliserende skål indeholdende 200 ml IPA-opløsning for at rense acetonerester. Fjern låget fra gitterholderblokken og ryst forsigtigt i 20 min.
- Overfør ristene individuelt med den fenestrerede filmside opad fra gitterholderblokken til et petrifad af glas dækket med blottingpapir.
- Tør ristene i mindst 30 minutter under stinkdækslet, og sørg for, at ristene er dækket for at forhindre støv i at lande på det.
9. Overfør de rene riste til blottingpapir, der er anbragt på et trådnet i rustfrit stål eller en perforeret bakke under DI-vand
BEMÆRK: Gitre skal nedsænkes under DI-vand på en plan overflade, så grafen kan flyde på vandet og sænkes ned på gitterene. Dette kan udføres ved hjælp af et kommercielt gitterbelægningstrug eller med en petriskål og en peristaltisk pumpe, som anvendes til generering af grafenoxidgitter, som beskrevet af Palovcak et al.18.
- Placer det rustfrie stålnet eller bakke i et gitterbelægningstrug og skyl med DI-vand.
- Klip blottingpapiret, der er lidt mindre end masken/bakken i rustfrit stål, og læg det oven på platformen, nedsænket i DI-vandet.
BEMÆRK: Blottingpapiret er lidt mindre end platformen for at muliggøre bevægelse og håndtering. - Overfør forsigtigt de rensede gitre med den fenestrerede filmside opad oven på blottingpapiret. Gitterene vil sandsynligvis være hydrofobe, så nedsænk gitterene i vandet lodret, eller de kan bøje på grund af vandspænding. Placer gitterene i en firkantet matrix, så de er så tæt på hinanden som muligt, men ikke overlapper hinanden (figur 2C).
- Gitrene er nu klar til at blive belagt med et grafenmonolag. Fyld gitterbelægningstruget med mere DI-vand, så vandoverfladen er mindst 5 mm over ristene.
10. Overfør grafen til gitterene
- Skub forsigtigt MMA / grafenfilmen ud af krystalliseringsskålen med en ren dæksel ved langsomt at sænke dækslet ned i truget i en vinkel, et stykke væk fra grafenfilmen. Placer dækselen under grafen-MMA-arket, så arkets kanter og dækselen er parallelle, og løft derefter dækslet lodret ud af vandet, og bring MMA / grafenfilmen med sig.
- Overfør MMA / grafenfilmen til truget ved at sænke dækselen i vandet i en ~ 45 ° vinkel, så MMA / grafenfilmen løsner sig fra dæksedlen og flyder på vandets overflade.
- Placer MMA / grafenfilmen direkte over gitterene, før vandstanden sænkes. Brug en Pasteur-pipette af glas, hvis spids er smeltet om, til at forsegle åbningen for omhyggeligt at manipulere placeringen af MMA/grafenfilmen.
- Sænk langsomt vandstanden med sprøjten ved ca. 1,25 ml/min., således at MMA/grafenfilmen dækker gitterfladerne fuldt ud, når den lander på filterpapiret
BEMÆRK: Yderligere manipulation af grafen-MMA-arket kan være nødvendigt for at opretholde sin position over gitterene, når vandstanden falder. - Brug en ren, tør pincet til at løfte blottingpapiret, der holder ristene, til en ren, tør, støvfri petriskål, eller overfør hele platformen i rustfrit stål.
- Lufttør MMA/grafenristene i mindst 30 minutter under røghætten. Hold gitterene dækket med aluminiumsfolie eller et låg for at forhindre forurening fra støvpartikler.
- Overfør ristene til en inkubator og bag ristene i en 65 °C inkubator i 30 min.
- Fjern gitterene fra inkubatoren og lad dem være dækket i 5 minutter ved stuetemperatur for at afkøle gitterene til stuetemperatur.
11. Fjernelse af MMA og rengøring af gitterene
BEMÆRK: MMA skal vaskes grundigt af i acetone for at forhindre resterende MMA på de grafenbelagte gitter.
- I en damphætte tilberedes to krystalliserende skåle indeholdende 200 ml acetone og en krystalliserende skål indeholdende 200 ml isopropanol (IPA) ved stuetemperatur. Dæk de krystalliserende skåle med aluminiumsfolie for at minimere fordampningen af de organiske opløsningsmidler.
FORSIGTIG: Brug PPE, når du håndterer acetone, da det kan forårsage hudirritation og kan være skadeligt ved indånding. - Placer bunden af klemmen TEM-gitterholderblokken i bunden af den første krystalliserende skål, der indeholder 200 ml frisk acetone.
- Overfør hvert gitter individuelt fra blottingpapiret til en brønd i gitterholderblokken, og sørg for, at MMA-siden vender opad. Dæk den krystalliserende skål med folie, læg den på en orbitalryster og ryst forsigtigt i 30 min.
- Placer metallåget på gitterholderblokken, som fastgør gitterene under overførslen til den næste krystalliserende skål. Løft forsigtigt gitterholderblokken ud af krystalliseringsskålen med en bøjet gaffel og en lang pincet, og læg den i bunden af den anden krystalliserende skål, der indeholder 200 ml frisk acetone. Fjern låget fra gitterholderblokken, og ryst forsigtigt på en orbitalryster i 30 minutter.
- Låget anbringes på gitterholderblokken og overføres til krystalliseringsskålen indeholdende 200 ml IPA-opløsning for at rense acetonerester. Fjern låget fra gitterholderblokken og ryst forsigtigt i 20 min.
- Overfør ristene til et lille petrifad af glas dækket med blottingpapir, og lufttør ristene i mindst 10 minutter. Hold gitterene dækket med et låg for at forhindre forurening fra støvpartikler.
- Gitter er klar til brug eller overføres til en gitterkasse indpakket med aluminiumsfolie inde i en vakuumekssikkator.
BEMÆRK: Opbevaring af grafengitter inde i en vakuumekssikkator kan forhindre forurening af hydrofobe partikler fra omgivelsesforhold. Disse gitre kan opbevares i op til flere måneder før brug27.
12. Gengiv grafengitter hydrofile med UV/ozonbehandling
BEMÆRK: Grafen er ekstremt hydrofob, hvilket ikke er kompatibelt med kryoEM-prøveforberedelse, da blot-spring-tilgange kræver en hydrofil overflade, hvorpå en dråbe prøve kan spredes jævnt. Mens traditionelle glødudladningsanordninger kan konfigureres til forsigtigt at pulsere plasma for at gøre grafenoverfladen hydrofil, har disse enheder en tendens til at ødelægge det tynde grafenmonolag. Det blev tidligere vist, at en UV/ozonrenser kan bruges til delvist at ilte overfladen af grafen25, hvilket gør den hydrofil til forberedelse af kryoEM-prøver uden at beskadige monolaget.
- Hvis du bruger et UV/ozon-system, der kræver klargøring, skal du tænde systemet og prime lampen i 10 minutter (på dette trin skal du sikre dig, at ingen gitre eksponeres). Mens UV/ozonrenseren primer, skal du fjerne gitre fra støvsugerekssikkatoren og overføre dem til en ren dæksel.
- Når UV/ozon-systemet er klar, anbringes dækslet med gitterene med grafensiden opad i UV/ozon-renseren, og nettene udsættes for ozongassen i 4 min.
- Efter eksponering for ozon anvendes straks ristene til forberedelse af kryoEM-prøver.
BEMÆRK: Hvis der anvendes et UV/ozon-system, der kræver grunding, skal ristene anbringes i renseapparatet umiddelbart efter, at lampen er blevet grundet i 10 minutter, ellers vil det være for køligt til at producere tilstrækkelig ozongas til at ilte grafen til prøveforberedelse. Udsæt ikke gitterene for ozongassen i mere end 6 minutter, da det vil ødelægge grafenlaget.
Representative Results
En vellykket udførelse af grafengitterfabrikationsprotokollen, der er beskrevet her, vil resultere i EM-gitre, der er fuldt belagt med et enkelt monolag grafen. Grafendækningen af gitterene kan kontrolleres ved hjælp af enhver TEM. Da et monolag af ren grafen er næsten usynligt i TEM, skal man undersøge det ved hjælp af mikroskopets diffraktionstilstand og observere Bragg-pletter svarende til den sekskantede organisering af carbonatomerne, der omfatter grafen (figur 3A). Det er normalt at lejlighedsvis observere nogle rynker af monolags grafen, som introduceres under MMA-belægning (figur 3B). Man kan også kontrollere forureningsniveauet på grafen ved at erhverve et højt forstørrelsesbillede i midten af et af de grafendækkede huller (figur 3C). Hvis den erhverves med en detektor med høj opløsning, skal en Fourier-transformation af dette billede indeholde Bragg-pletter svarende til kulstof-kulstofafstand ved 2,14 Å (figur 4C). Et monolag af kulstofatomer producerer ikke tilstrækkelig elektronspredning til at generere fasekontrast, og derfor vil et billede af ren grafen ikke præsentere Thon-ringe forbundet med kontrastoverførselsfunktionen i en Fourier-transformation af billedet. Det er imidlertid meget vanskeligt at forhindre forurening af grafengitter, efter at de er produceret, og utilstrækkelig vask af EM-gitterene eller fjernelse af MMA efter grafenbelægning vil resultere i bemærkelsesværdige forurenende stoffer på de gitre, der er synlige i billederne i det virkelige rum (figur 3C). Som vist i figur 4 har grafengitter en koncentrerende effekt på en prøve, som observeret ved sammenligning af 0,5 mg / ml apoferritin påføres hullede guldgitter med (figur 4A) og uden grafenunderstøttelse (figur 4B). Lignende grafenfabrikationsprotokoller er tidligere blevet beskrevet for at løse kryoEM-strukturer af proteiner såsom apoferritin ved høj opløsning25,27.
Figur 1: Skematisk oversigt over fremstilling af grafenbelagte kryoEM-gitre. Nøgletrin i processen med fremstilling af grafengitter illustreres. Forkortelser: cryoEM = kryogen elektronmikroskopi; MMA = methylmethacrylat; APS = ammoniumpersulfat. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Nødvendige materialer til fremstilling af grafengitter. (A) Nødvendige materialer til belægning af kryo-EM-gitre er mærket i overensstemmelse hermed. (B) Nærbillede af coateren med grafen/Cu-ark tapet på et blottingpapir på et glasglas. Spincoateren kan samles ved at købe dele fra en lokal computer/isenkræmmer. (C) Nærbillede af gitterbelægningstruget, der er fastgjort til en sprøjte, der kan bruges til at kontrollere vandstanden. Gitter placeres oven på et blottingpapir på et rustfrit stålnet. Blottingpapiret hjælper med at manøvrere placeringen af gitterne, så grafenarket kan matches med det. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Et repræsentativt diffraktionsmønsterbillede og lyse feltbilleder af et grafengitter, der viser rynker eller MMA-forurening . (A) EM-gitre dækket med et monolag af grafen vil vise Bragg-toppe svarende til grafens sekskantede gitter, når de afbildes i en TEM i diffraktionstilstand. Bragg-toppen svarende til 2,14 Å kulstof-kulstof-afstanden er cirklet og betegnet med en pil. (B) Et lysfeltbillede af et enkeltlags grafengitter med nogle rynker (betegnet med en pil) i grafenmonolaget. (C) Et lysfeltbillede af monolagsgrafen med MMA-kontaminering (angivet med en pil). Skalastænger = 100 nm (B,C). Forkortelser: EM = elektronmikroskopi; MMA = methylmethacrylat. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Apoferritin på grafendækkede guldgitre: (A) KryoEM-mikrografi af 0,5 mg/ml apoferritin på grafendækkede guldgitre. (B) Apoferritin afbildet i samme koncentration er synlig ved væsentligt lavere koncentration, når det fremstilles ved hjælp af hullede guldgitre uden grafen. (C) FFT af kryoEM-mikrografiet på 0,5 mg/ml apoferritin på grafendækkede guldgitre, hvor Bragg-toppene svarer til det sekskantede grafengitter angivet. Skalastænger = 100 nm (A,B). Forkortelser: cryoEM = kryogen elektronmikroskopi; FFT = hurtig Fourier-transformation. Klik her for at se en større version af denne figur.
Discussion
Konservering af biologiske prøver i et tyndt lag glasagtig is er et kritisk vigtigt skridt til bestemmelse af kryoEM-struktur med høj opløsning. Imidlertid støder forskere ofte på problemer som følge af interaktioner med AWI, som introducerer foretrukken orientering, kompleks adskillelse, denaturering og aggregering. Desuden kan prøverne ikke altid koncentreres tilstrækkeligt til at befolke den tynde is, der er suspenderet over hullerne i en fenestreret film. Flere forskergrupper har udviklet metoder til at belægge EM-gitre med et monolag grafen for at hjælpe med at overvinde nogle af disse begrænsninger 24,25,26,27,28,29,30, og grafengitter er blevet brugt med stor succes. Her giver vi trinvise instruktioner til effektiv forberedelse af batcher af grafengitre internt og undersøgelse af kvaliteten af grafengitterene af TEM. Vi understreger, at der skal udvises særlig omhu under nogle af de kritiske trin, som vi skitserer nedenfor.
Grafen har en stærk tendens til at tiltrække luftbårne forurenende stoffer. Derfor er det under grafengitterfremstillingsprocessen vigtigt at sikre, at alle de værktøjer, der kommer i kontakt med grafen / Cu-arket eller gitterne, er rene og støvfrie. Glasdæksler, der bruges til at overføre grafen, kan rengøres ved skylning med ethanol og DI-vand eller ved hjælp af en luftstøver. Det anbefales også at arbejde under en stinkhætte og altid holde grafenplader og gitter dækket med folie eller en ren glasplade. Støv eller forurenende stoffer på gitterene kan forhindre grafen i at klæbe grundigt til EM-gitterene. Ved håndtering af grafen- eller grafenbelagte gitre er det vigtigt at være elektrisk jordforbundet for at forhindre beskadigelse af grafenfilmen fra statisk udladning. Statisk afladning kan undgås ved at bruge en håndledsjordingsrem, røre ved en jordet metalgenstand, hver gang grafen- eller grafengitter håndteres, og / eller ikke bære en handske på hånden, der holder pincetten24.
Da et monolag af grafen er meget tyndt (bredden af et carbonatom), er det vigtigt at understøtte grafen med et organisk lag som MMA eller poly-MMA (PMMA) under overførslen af grafen til gitter. PMMA er det mest anvendte materiale til grafenoverførsel. PMMA har imidlertid en stærk affinitet med grafen og kan ofte resultere i polymerforurening på grafenfilmen. MMA anvendes i denne protokol, da det efterlader mindre resterende forurening25. Imidlertid har både PMMA og MMA ulempen ved at danne rynker og revner, der kan observeres i nogle områder af grafenfilmen (figur 3B). Det kan være udfordrende at undgå disse rynker, da de ofte forekommer under grafenvækst ved CVD-metode31. Der er for nylig udviklet en metode til dyrkning af ultraflad grafen uden rynker, hvorved kobberfolien erstattes af en Cu(111)/safirskive som vækstsubstrat32.
Baseret på vores erfaring er det bedre at købe grafen / Cu-ark og understøtte grafen med MMA internt end at købe polymerdækkede Cu-graphenplader fra producenter, som bliver sprøde efter kobberætsning og er vanskelige at håndtere i efterfølgende trin. Den spincoater, vi brugte til MMA-belægning, kan billigt bygges ved hjælp af dele fra en lokal computer / hardwarebutik, som tidligere beskrevet25.
Under MMA-belægningstrinnet er det vigtigt at dække hele grafenoverfladen på Cu-grafenarket med MMA. Efter at Cu er ætset væk, bliver MMA-grafen halvgennemsigtig, og områder, der mangler MMA-dækning, vil ligne tomme huller. For at forhindre MMA-belægning på kobbersiden er det vigtigt at placere et lille stykke blottingpapir under det under belægningen, så det opsuger overskydende MMA, der spinder ud fra CVD-filmen.
Efter ætsning og skylning er MMA / grafenarket klar til at blive overført til EM-gitter ved hjælp af et kommercielt eller hjemmelavet trugsystem med en sprøjte eller peristaltisk pumpe til styring af vandstanden. Før overførselstrinnet er det vigtigt at forskylle gitterene grundigt i successive bade af chloroform, acetone og IPA. Bagning af grafenbelagte riste ved 65 °C hjælper med at bevare grafenintegriteten og fremmer adsorptionen af grafen til ristene. Endelig er det vigtigt at fjerne MMA grundigt i et acetonebad og rense gitterene i IPA for at forhindre MMA-forurening på gitterene. Eventuelle uvaskede MMA-rester vil blive observeret på EM-gitter og mindske billedernes signal-støj-forhold (figur 3C). Acetone-IPA-vaskeprocessen kan gentages for yderligere at rengøre grafenoverfladerne.
For at gøre grafengitter hydrofile udsatte vi nettene for UV / ozon. Forskellige modeller af UV/ozon-rengøringsmidler kan kræve optimering for at ilte grafenlaget tilstrækkeligt til forberedelse af kryoEM-prøver uden at beskadige grafen. Uanset systemet er det afgørende at bruge disse gitre til påføring af kryoEM-prøver umiddelbart efter UV/ozonbehandling. Alternative metoder til at gøre grafengitter hydrofile er beskrevet i andre undersøgelser33,34.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Xiao Fan for nyttige diskussioner, mens vi etablerede disse metoder hos Scripps Research. B.B. blev støttet af et postdoc-forskningsstipendium fra Hewitt Foundation for Medical Research. W.C. er støttet af et National Science Foundation predoctoral fellowship. D.E.P støttes af National Institutes of Health (NIH) tilskud NS095892 til GCL Dette projekt blev også støttet af NIH-tilskud GM142196, GM143805 og S10OD032467 til GCL.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70% EtOH | Pharmco (190 pf EtOH) | 241000190CSGL | |
| Acetone | Sigma Aldrich | 650501-4L | |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma Aldrich | 215589-500g | Hazardous; use extreme caution |
| Chloroform | Sigma Aldrich | C2432-1L | |
| Clamping TEM Grid Holder Block for 45 Grids | PELCO | 16830-45 | |
| Computer fan | Amazon (Noctua) | B07CG2PGY6 | |
| Cover slip | Bellco Glass | 1203J71 | Standard cover slips |
| Crystallizing dish | Pyrex | 3140-100 | |
| Electronics duster | Falcon Safety Products | 75-37-6 | |
| Falcon Dust-off Air Duster | Staples | N/A | |
| Filter papers | Whatman | 1001-055 | |
| Fine tip tweezer | Dumont | 0508-L4-PO | |
| Flask | Pyrex | 4980-500 | |
| Fork | Supermarket | N/A | |
| Glass pasteur pipette | VWR | 14672-608 | |
| Graphene/Cu | Graphenea | N/A | CVD monolayer graphene cu |
| Grid Coating Trough | Ladd Research Industries | 10840 | Fragile |
| Isopropanol | Fisher Scientific | 67-63-0 | |
| Kapton Tape | Amazon (MYJOR) | MY-RZY001 | Polyimide tape |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666 | |
| Long twzeer | Cole Parmer Essentials | UX-07387-15 | |
| Metal grid holder | Ted Pella | 16820-81 | |
| MMA(8.5)MMA EL 6 | KAYAKU Advanced Materials | M31006 0500L 1GL | Flammable |
| Model 10 Lab Oven | Quincy Lab, Inc. | FO19013 | |
| Petri dish | Pyrex | 3610-102 | |
| Plasma cleaner (Solarus 950) | Gatan, Inc. | N/A | |
| Scissors | Fiskars | 194813-1010 | |
| Standard Analog Orbital Shaker | VWR | 89032-088 | |
| UltrAuFoil R1.2/1.3 - Au300 | Quantifoil | N/A | Holey gold grids |
| Ultraviolet Ozone Cleaning Systems | UVOCS | model T10X10/OES |
References
- Li, X., Zheng, S. Q., Egami, K., Agard, D. A., Cheng, Y. Influence of electron dose rate on electron counting images recorded with the K2 camera. Journal of Structural Biology. 184 (2), 251-260 (2013).
- Tang, G., et al. EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).
- Zivanov, J., et al. New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3. eLife. 7, 1-22 (2018).
- Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. CryoSPARC: Algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
- Grigorieff, N., Harrison, S. C. Near-atomic resolution reconstructions of icosahedral viruses from electron cryo-microscopy. Current Opinion in Structural Biology. 21 (2), 265-273 (2011).
- Nakane, T., et al. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).
- Zhang, K., Pintilie, G. D., Li, S., Schmid, M. F., Chiu, W. Resolving individual atoms of protein complex by cryo-electron microscopy. Cell Research. 30 (12), 1136-1139 (2020).
- Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM. Nature. 587 (7832), 157-161 (2020).
- Schultz, P.
- Nguyen, H. P. M., McGuire, K. L., Cook, B. D., Herzik, M. A. Manual blot-and-plunge freezing of biological specimens for single-particle cryogenic electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. 2022 (180), 1-16 (2022).
- Glaeser, R. M. Proteins, interfaces, and cryo-em grids. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 25 (3), 289-313 (2016).
- Glaeser, R. M., Han, B. -G. Opinion: hazards faced by macromolecules when confined to thin aqueous films. Biophysics Reports. 3 (1-3), 1-7 (2017).
- Han, B. G., Watson, Z., Cate, J. H. D., Glaeser, R. M. Monolayer-crystal streptavidin support films provide an internal standard of cryo-EM image quality. Journal of Structural Biology. 200 (3), 307-313 (2017).
- Noble, A. J., et al. Routine single particle CryoEM sample and grid characterization by tomography. eLife. 7, 1-42 (2018).
- Drulyte, I., et al. Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 74 (6), 560-571 (2018).
- Liu, N., Wang, H. W. Better cryo-EM specimen preparation: how to deal with the air-water interface. Journal of Molecular Biology. 435 (9), 167926 (2022).
- Noble, A. J., et al. Reducing effects of particle adsorption to the air-water interface in cryo-EM. Nature Methods. 15 (10), 793-795 (2018).
- Palovcak, E., et al. A simple and robust procedure for preparing graphene-oxide cryo-EM grids. Journal of Structural Biology. 204 (1), 80-84 (2018).
- Patel, A., Toso, D., Litvak, A., Nogales, E. Efficient graphene oxide coating improves cryo-EM sample preparation and data collection from tilted grids. bioRxiv. , (2021).
- Marr, C. R., Benlekbir, S., Rubinstein, J. L. Fabrication of carbon films with ~500nm holes for cryo-EM with a direct detector device. Journal of Structural Biology. 185 (1), 42-47 (2014).
- Pantelic, R. S., Meyer, J. C., Kaiser, U., Baumeister, W., Plitzko, J. M. Graphene oxide: A substrate for optimizing preparations of frozen-hydrated samples. Journal of Structural Biology. 170 (1), 152-156 (2010).
- Pantelic, R. S., et al. Graphene: substrate preparation and introduction. Journal of Structural Biology. 174 (1), 234-238 (2011).
- Russo, C. J., Passmore, L. A. Progress towards an optimal specimen support for electron cryomicroscopy. Current Opinion in Structural Biology. 37, 81-89 (2016).
- Passmore, L. A., Russo, C. J. Specimen preparation for high-resolution cryo-EM. Methods in Enzymology. 579, 51-86 (2016).
- Han, Y., et al. High-yield monolayer graphene grids for near-atomic resolution cryoelectron microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (2), 1009-1014 (2020).
- Zheng, L., et al. Robust ultraclean atomically thin membranes for atomic-resolution electron microscopy. Nature Communications. 11 (1), 541 (2020).
- Ahn, E., Kim, B., Cho, U. -S. Batch production of high-quality graphene grids for cryo-EM: cryo-EM structure of Methylococcus capsulatus soluble methane monooxygenase hydroxylase. bioRxiv. (Cvd), (2021).
- Naydenova, K., Peet, M. J., Russo, C. J. Multifunctional graphene supports for electron cryomicroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (24), 11718-11724 (2019).
- Fan, H., Sun, F. Developing graphene grids for cryoelectron microscopy. Frontiers in Molecular Biosciences. 9, 937253 (2022).
- D'Imprima, E., et al. Protein denaturation at the air-water interface and how to prevent it. eLife. 8, e42747 (2019).
- Zhang, X., et al. Evolution of copper step beams during graphene growth by CVD method. Applied Surface Science. 610, 155518 (2023).
- Zheng, L., et al. Uniform thin ice on ultraflat graphene for high-resolution cryo-EM. Nature Methods. 20 (1), 123-130 (2023).
- Fujita, J., et al. Epoxidized graphene grid for highly efficient high-resolution cryoEM structural analysis. Scientific Reports. 13, 2279 (2023).
- Lu, Y., et al. Functionalized graphene grids with various charges for single-particle cryo-EM. Nature Communications. 13, 6718 (2022).
