Summary
כאן, אנו מתארים פרוטוקול ליישום שכבה אחת של גרפן על רשתות מיקרוסקופיית אלקטרונים וכיצד להכין אותם לשימוש בקביעת מבנה cryoEM.
Abstract
מיקרוסקופ אלקטרונים קריוגני (cryoEM) התגלה כטכניקה רבת עוצמה לחקר המבנה האטומי של קומפלקסים מקרומולקולריים. הכנת דגימות עבור cryoEM דורשת שימור דגימות בשכבה דקה של קרח זגוגית, בדרך כלל תלוי בתוך החורים של סרט תמיכה fenestrated. עם זאת, כל גישות הכנת הדגימות הנפוצות למחקרי cryoEM חושפות את הדגימה לממשק אוויר-מים, ומציגות השפעה הידרופובית חזקה על הדגימה שלעתים קרובות גורמת לדנטורציה, צבירה ודיסוציאציה מורכבת. יתר על כן, אינטראקציות הידרופוביות מועדפות בין אזורי הדגימה לבין ממשק אוויר-מים משפיעות על הכיוונים שאומצו על ידי המקרומולקולות, וכתוצאה מכך שחזורים תלת-ממדיים עם רזולוציה כיוונית אנאיזוטרופית.
ספיחה של דגימות cryoEM לשכבה אחת של גרפן הוכחה כמסייעת בהפחתת אינטראקציות עם ממשק אוויר-מים תוך מזעור הכנסת רעשי רקע. תמיכת גרפן מציעה גם את היתרון של הורדה משמעותית של הריכוז הנדרש של חלבונים הדרושים להדמיית cryoEM. למרות היתרונות של תמיכות אלה, רשתות מצופות גרפן אינן בשימוש נרחב על ידי קהילת cryoEM בשל ההוצאות האוסרות של אפשרויות מסחריות והאתגרים הקשורים לייצור בקנה מידה גדול בתוך הבית. מאמר זה מתאר שיטה יעילה להכנת קבוצות של רשתות cryoEM בעלות כיסוי כמעט מלא של גרפן חד-שכבתי.
Introduction
מיקרוסקופ אלקטרונים קריוגני של חלקיק יחיד (cryoEM) הוא טכנולוגיה ישימה יותר ויותר המשמשת לחקר המבנים התלת-ממדיים של ביומקרומולקולות. ההתקדמות הטכנולוגית באופטיקה של מיקרוסקופ אלקטרונים, גילוי אלקטרונים ישיר1 ואלגוריתמים ממוחשבים 2,3,4 במהלך העשור האחרון אפשרו למשתמשי cryoEM לקבוע את המבנים של קומפלקסים מקרומולקולריים יציבים ביוכימית לרזולוציה כמעט אטומית 5,6,7,8 . למרות התקדמות זו, עדיין קיימים מחסומים בולטים לשימור דגימות להדמיית cryoEM, המונעים מרוב הדגימות הביולוגיות להיפתר ברזולוציות כה גבוהות.
הכנת הדגימה לניתוח cryoEM ברזולוציה גבוהה כרוכה בלכידת מקרומולקולות המפוזרות באופן שווה במגוון רחב של כיוונים בתוך שכבה דקה של קרח מזוגג. שיטות הקפאה "כתם וצניחה" הן השיטות הנפוצות ביותר המשמשות ליצירת שכבות דקות של דגימות ביולוגיות על רשתות עבור מחקרי cryoEM 9,10. שיטות אלה כוללות יישום של כמה מיקרוליטרים של תמיסת דגימה על רשת EM המכילה סרט fenestrated שהפך הידרופילי ולאחר מכן למחוק את רוב הדגימה עם נייר מסנן לפני צלילה מהירה של הרשת לתוך קריוגן של אתאן נוזלי או תערובת אתאן-פרופאן9.
בעוד שיטה זו שימשה בהצלחה כדי לקבוע מבנים של מגוון רחב של דגימות ביולוגיות, כל שיטות הכנת דגימות cryoEM הנפוצות חושפות דגימות לממשק אוויר-מים הידרופובי (AWI), אשר לעתים קרובות מציג בעיות המגבילות קביעת מבנה ברזולוציה גבוהה. נקבע כי לדגימות ביולוגיות יש נטייה גבוהה לדנטורציה כאשר הן נחשפות ל- AWI, מה שיכול להוביל לצבירה מורכבת ופירוק11,12,13,14. יתר על כן, כתמים הידרופוביים על פני השטח של דגימות ביולוגיות גורמים לחלקיקים לאמץ אוריינטציות מועדפות בקרח12. בתרחישים רבים, אזור הידרופובי יחיד של הדגימה מאלץ את כל החלקיקים לאמץ אוריינטציה ייחודית בקרח, ובכך מבטל את היכולת ליצור שחזור אמין. בנוסף לבעיות עם AWI, דגימות עשויות להראות זיקה לפני השטח של שכבת היריעה המוגדרת, מה שמגביל את מספר החלקיקים המרחפים בקרח בתוך החורים15.
מספר פתרונות מתודולוגיים וטכנולוגיים פותחו כדי לצמצם בעיות אלה הנובעות מאינטראקציות עם AWI או הסרטים16,17. גישה פופולרית אחת היא לצפות את היריעה המחוספסת של רשתות הקרינה האלקטרומגנטית בשכבה דקה (עשרות ננומטרים) של פחמן אמורפי. ציפוי זה מספק משטח רציף על פני החורים שאליהם חלקיקים יכולים לספוח, עם היתרון של הגנה חלקית על הדגימה מפני אינטראקציות עם AWI15,18,19,20. עם זאת, שכבת הפחמן הנוספת מעלה את כמות אות הרקע באזורים המצולמים, ומציגה רעש שיכול לפגוע ברזולוציה הניתנת להשגה, במיוחד עבור דגימות קטנות (<150 kDa). בשנים האחרונות, השימוש בפתיתי תחמוצת גרפן (GO) לייצור יריעות תומכות על רשתות cryoEM הוכח כבעל יתרונות על פני פחמן אמורפי מסורתי. פתיתי GO מיוצרים באמצעות חמצון של שכבות גרפיט, וכתוצאה מכך יריעות פסאודו-גבישיות של גרפיט חד-שכבתי שהן הידרופיליות בשל תכולת החמצן המשמעותית שלהן בצורה של קבוצות קרבוקסיל, הידרוקסיל ואפוקסי על פני השטח והקצוות. פתיתי GO מסחריים במתלים מימיים אינם יקרים, וישנן שיטות רבות שפורסמו ליישום פתיתי GO על רשתות EM18,21. עם זאת, שיטות אלה גורמות לעתים קרובות לרשתות המכוסות רק חלקית בפתיתי GO, כמו גם אזורים המכילים שכבות מרובות של פתיתי GO. יתר על כן, פתיתי GO תורמים אות רקע בולט לתמונות cryoEM קרוב לזה שנצפה עם פחמן אמורפי דק22,23.
גרפן חד-שכבתי טהור, המורכב ממערך גבישי דו-ממדי יחיד של אטומי פחמן, נבדל מ-GO בכך שאינו מייצר ניגודיות פאזה במיקרוסקופ האלקטרונים. לפיכך ניתן להשתמש בגרפן חד-שכבתי ליצירת שכבת תמיכה בלתי נראית להדמיית דגימות ביולוגיות. גרפן חד-שכבתי הוא גם חזק יותר מ-GO וניתן ליישם אותו כשכבה חד-שכבתית יחידה ברשת EM, וההתקדמות האחרונה בייצור רשתות EM מצופות גרפן אפשרו להכין רשתות גרפן חד-שכבתיות בעלות כיסוי גבוה בתוך הבית 24,25,26,27,28,29,30. עם זאת, למרות היתרונות של שימוש ברשתות מצופות גרפן לקביעת מבנה cryoEM, הן אינן בשימוש נרחב בשל ההוצאה האוסרת של אפשרויות מסחריות והמורכבות של ייצור פנימי. במאמר זה אנו מתארים מדריך שלב אחר שלב לייצור יעיל של רשתות EM המכוסות בשכבה אחת של גרפן לצורך קביעת מבנה cryoEM של דגימות ביולוגיות (איור 1). על ידי ביצוע פרוטוקול מפורט זה, חוקרי cryoEM יכולים להכין באופן משכפל עשרות רשתות תמיכה גרפן באיכות גבוהה ביום אחד. ניתן לבחון בקלות את איכות הרשתות מצופות הגרפן באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים בהולכה נמוכה (TEM) המצויד בנימה LaB6.
Protocol
1. הכנת חומרים ואביזרים הדרושים לייצור רשתות גרפן
הערה: גרפן מזהם בקלות, מה שמקטין את יעילות ציפוי הגרפן ואת איכות רשתות הגרפן; לכן, חשוב לנקות ביסודיות את כל החומרים הבאים במגע עם הגרפן. הכנת החומרים וכל השלבים צריכים להיות מגולפים במכסה אדים.
- אספו את החומרים הדרושים שישמשו לציפוי הרשתות בגרפן (איור 2A).
- שטפו את כלי הזכוכית מספר פעמים במים שעברו דה-יוניזציה (DI) כדי להסיר אבק, מוך ושאריות שמנוניות.
- השתמשו במגבונים חד פעמיים כדי לנקות כיסויי זכוכית עם 75% אתנול והשתמשו באבק אוויר כדי להסיר מזהמים.
הערה: בלוק מחזיק רשת TEM מהדק המשמש בפרוטוקול זה יכול להכיל עד 45 רשתות. לייצור אצווה גדולה של רשתות גרפן, ניתן להכין 45 רשתות או פחות בבת אחת. עם זאת, מומלץ להתחיל בייצור אצווה קטנה (ארבע עד שש רשתות) עד לביסוס השיטה במעבדה.
2. הכנת אמוניום פרסולפט 0.2 M (APS) במים
הערה: פתרון APS זה משמש כחריטה להסרת תמיכת הנחושת (Cu) מיריעת הגרפן/Cu בשלב מאוחר יותר. הכן תמיד פתרון APS חדש. תמיסות בשימוש חוזר או ישנות לא יחרטו נחושת ביעילות ועלולות להשאיר שאריות נחושת על הגרפן בשלבים מאוחרים יותר.
- יש לשטוף בקבוק של 500 מ"ל במים נטולי יונים, ולאחר מכן להוסיף 200 מ"ל של מי DI ולחמם במיקרוגל בהגדרות מרביות למשך כדקה אחת כדי להוריד את הגז מהמים.
- הוסף 9 גרם של אמוניום פרסולפט ל 200 מ"ל של מים DI כדי לייצר תמיסה של 0.2 M APS.
התראה: APS רעיל, מומלץ ללבוש ציוד מגן אישי (PPE) בעת הטיפול ב-APS. יש להשליך את פסולת APS במתקן מאושר לסילוק פסולת. - ערבבו את התמיסה עם מוט ערבוב על מערבל מגנטי תוך חיבור הבקבוק למקור ואקום מתחת למכסה אדים.
הערה: פתרון APS להסרת גזים יסייע במניעת היווצרות בועות, מה שיכול להפחית את היעילות של חריטת Cu בשלב 6.
3. מעבירים גרפן/נחושת למכסה נקי בעזרת פיסת נייר ניקוי
הערה: אנו משתמשים בסרט גרפן תצהיר אדים כימי (CVD) בגודל 15 x 15 ס"מ על Cu מספק גרפן. יריעות גרפן/Cu חד-שכבתיות שנרכשו באופן מסחרי צריכות להיות מאוחסנות תחת ואקום. מכיוון שגרפן גדל משני צידי Cu בשיטת CVD, ספקי גרפן בדרך כלל מבצעים בדיקות איכות וממליצים על הצד הטוב יותר לשימוש. אנו מתייחסים לצד המומלץ הזה של הגרפן כאל הצד "העליון" ואילו הצד השני הוא הצד "האחורי" בפרוטוקול זה.
- חותכים פיסת נייר ניקוי לצורה מלבנית בערך 20 מ"מ x 40 מ"מ. נייר ניקוי זה משמש כריפוד ליריעת הגרפן/Cu ויספוג עודפי מתיל מתקרילט (MMA (8.5) MMA EL6) המשמש לציפוי יריעת הגרפן/Cu; לכן, הקפד לחתוך אותו לגודל גדול יותר מאשר יריעת גרפן/Cu לשימוש.
- השתמשו בסרט פולימיד כדי להדביק את ארבע הפינות של נייר הניקוי לחלק העליון של מכסה נקי שיתאים לקואטר מסתובב ביתי.
הערה: סרט פולימיד משמש מכיוון שהוא דק וניתן להסיר אותו בקלות, מה שמקל על הטיפול. - הסר חתיכה אחת של גיליון גרפן/Cu מאחסון הוואקום.
- השתמש מספריים נקיים ללא אבק לחתוך בזהירות ריבוע קטן של גיליון Cu-graphene כי יהיה מספיק כדי לכסות לחלוטין את מספר רשתות להיות מוכן. עבור 25 רשתות מסודרות במערך 5 x 5, למשל, לחתוך חתיכה כי הוא 18 מ"מ x 18 מ"מ. הניחו את גיליון הגרפן/Cu על גבי נייר הניקוי בפינצטה נקייה ויבשה. ודא שהצד האחורי של יריעת הגרפן/Cu פונה כלפי מטה והיזהר שלא להפוך בטעות את יריעת הגרפן/Cu מכיוון שקשה להבחין בין הצד העליון לצד האחורי.
- הדביקו את ארבע הפינות של גיליון הגרפן/Cu לנייר הניקוי/הכיסוי, תוך מזעור כמות המגע בין הסרט לבין יריעת הגרפן/Cu, מכיוון שכל האזורים המכוסים בסרט לא יכוסו ב-MMA בשלב הבא.
הערה: פריקה סטטית עלולה לפגוע ביריעות גרפן, ולכן מומלץ להישאר מוארקים חשמלית ולמזער את הצטברות המטען הסטטי בעת טיפול ברשתות גרפן או גרפן. ניתן להשיג זאת על ידי לבישת רצועת הארקה לפרק כף היד או נגיעה בחפץ מתכתי מוארק מיד לפני הטיפול ברשתות גרפן או גרפן.
4. מצפים את יריעת הגרפן/Cu החד-שכבתית בשכבה דקה של MMA(8.5)MMA EL6 (MMA)
הערה: לאחר חריטת ה-Cu, שכבה זו של MMA תתמוך בשכבה החד-שכבתית של הגרפן כדי לאפשר טיפול ביריעת הגרפן בשלבים עתידיים. ציפוי MMA מאפשר גם הדמיה של סרט הגרפן מכיוון ששכבה אחת של גרפן לבדה תהיה שקופה.
- הניחו את הכיסוי עם יריעת הגרפן/Cu המודבקת על מעיל ספין תוצרת בית (ניתן להרכיב אותו באמצעות מאוורר מחשב) בתוך מכסה אדים (איור 2B), כפי שתואר קודם לכן על-ידי Han et al.25.
- מרכיבים משקפי מגן, מוסיפים שתי טיפות MMA באמצעות פיפטת זכוכית על יריעת הגרפן ומיד מתחילים להסתובב במהירות מרבית.
- תוך כדי סיבוב, מוסיפים עוד שתי טיפות במרכז. סחרור במשך דקה אחת.
הערה: ודא כי נמרח מספיק MMA כדי לצפות את הגרפן במלואו. אם אינכם בטוחים, הוסיפו עוד כמה טיפות. אם הגרפן אינו מצופה במלואו, "חורים" מופיעים בסרט לאחר ש-Cu נחרט. - יש לתת לייבוש באוויר למשך 10 דקות בתוך מכסה אדים.
5. הסר גרפן בצד האחורי של יריעת הגרפן/Cu
הערה: גרפן שגדל בצד האחורי של הנחושת (הצד שאינו מצופה ב-MMA) חייב להיות מוסר לפני שתמשיך לשלבים הבאים מכיוון שעודף גרפן זה יפחית את יעילות תחריט Cu. אנו מסירים גרפן זה על ידי חשיפת הגרפן לפלזמה, אשר ניתן לבצע באמצעות כל מכשיר פריקה זוהר המשמש בדרך כלל להכנת רשתות EM להכנת דגימה ביולוגית.
- הסר בזהירות את סרט הדבק והרם את יריעת הגרפן/Cu המצופה MMA מהכיסוי בפינצטה נקייה ויבשה.
- הדביקו את פיסת יריעת ה-MMA/גרפן/Cu עם צד ה-MMA כלפי מטה לכיסוי זכוכית נקי ונטול אבק.
- הניחו את תלוש הכיסוי עם יריעת MMA/גרפן/Cu במכשיר הפריקה הזוהרת והחילו הגדרות שישמשו בדרך כלל בעת הכנת רשתות להכנת דגימת כתמים שליליים או קריוEM.
הערה: יש להימנע מפריקת זוהר ממושכת כדי למנוע חמצון של Cu בצד האחורי, אשר עלול לגרום לזיהום של חלקיקי תחמוצת נחושת (CuO) (ננו) על סרט גרפן.
6. חרוט את ה-Cu מגיליון MMA/גרפן/Cu בתמיסת APS
- במכסה אדים, שפכו 200 מ"ל של תמיסת APS טרייה לצלחת התגבשות נקייה ונטולת אבק (150 x 75 מ"מ).
- הסר את יריעת MMA/גרפן/Cu משקופית הזכוכית. עקוב אחר הצד המכיל את ה- MMA.
- כדי להתחיל בתחריט, הניחו את יריעת ה-MMA/גרפן/Cu עם צד Cu מטופל פלזמה כלפי מטה על פני תמיסת APS. כסו את הזכוכית הרחבה בחתיכת רדיד אלומיניום או מכסה כדי למנוע כניסת אבק.
- דגירה במשך 3 שעות. אם רוב ה- Cu אינו חרוט לאחר שעה אחת, חזור על השלבים בסעיפים 2-6 ולאחר מכן המשך לשלב הבא.
הערה: אם רוב ה-Cu לא נחרט לאחר שעה אחת, סביר להניח שצד ה-MMA/גרפן של היריעה הונח על פני השטח של תמיסת APS במקום בצד Cu. Cu צריך להיות חרוט לחלוטין לאחר 3 שעות, ואת הסרט MMA/גרפן הוא חסר צבע אם Cu נחרט לחלוטין. גרפן מזהם בקלות ולכן הקפד לכסות את כל המיכלים כדי למנוע הצטברות של מוך או כל שאריות שמנוניות על משטחים, שכן זה ישפיע לרעה על איכות הגרפן.
7. שטפו את סרט ה-MMA/גרפן במי DI
- במכסה אדים, מלאו צלחת התגבשות נקייה ונטולת אבק במי DI.
- גרפו בעדינות את סרט הגרפן-MMA עם כיסוי זכוכית נקי ונטול אבק הממוקם בזווית ~45° ביחס למשטח תמיסת APS.
- מקמו את מגלשת הזכוכית בזווית של כמעט 90° למים, והורידו בעדינות את מכסה הזכוכית לתוך המים, כך שה-MMA/גרפן יחליק באיטיות מהמגלשה ויצוף על פני המים.
- השאירו את סרט ה-MMA/גרפן על פני המים למשך שעה אחת כדי לשטוף את כל ה-APS.
8. נקו את הרשתות כדי להיות מצופים בשכבה אחת של גרפן
הערה: הרשתות שאליהן יועבר הגרפן חייבות להיות נקיות ככל האפשר כדי למקסם את החיבור של הגרפן למשטח רדיד הרשת. רשתות שנרכשות באופן מסחרי מכילות לעתים קרובות שאריות מזהמים שיש להסיר לפני העברת הגרפן.
- נקו וייבשו שלושה כלים מגבשים כך שיהיו נקיים מאבק.
- בתוך מכסה אדים, שפכו 200 מ"ל של כלורופורם, אצטון ואלכוהול איזופרופיל (IPA) לכל אחת משלוש המנות המתגבשות. כסו את הכלים המתגבשים ברדיד אלומיניום כדי למזער את אידוי הממיסים האורגניים.
אזהרה: כלורופורם ואצטון גורמים לגירוי בעור ועלולים להיות רעילים בשאיפה. יש להגביל את החשיפה לממיסים אורגניים אלה וללבוש PPE. - הניחו את הבסיס של בלוק מחזיק רשת TEM מהדק בתחתית צלחת ההתגבשות הראשונה המכילה 200 מ"ל כלורופורם.
- העבר כל רשת בנפרד מתיבת הרשת לבאר בבלוק מחזיק הרשת, כדי לוודא שצד הסרט עם ההגנה פונה כלפי מעלה. מכסים את הכלי המתגבש ברדיד אלומיניום, מניחים אותו על שייקר מסלולי, ומנערים בעדינות במשך 30 דקות.
- הניחו את מכסה המתכת על בלוק מחזיק הרשת, אשר יאבטח את הרשתות במהלך ההעברה לצלחת המתגבשת הבאה. הרימו בזהירות את בלוק מחזיק הרשת מהצלחת המתגבשת בעזרת מזלג כפוף ופינצטה ארוכה והניחו אותה בתחתית צלחת ההתגבשות השנייה המכילה 200 מ"ל אצטון. הסירו את המכסה מבלוק מחזיק הרשת ונערו בעדינות על שייקר אורביטלי למשך 30 דקות.
- מניחים את המכסה על בלוק מחזיק הרשת ומעבירים לצלחת מגבשת המכילה 200 מ"ל של תמיסת IPA לניקוי שאריות אצטון. הסירו את המכסה מבלוק מחזיק הרשת ונערו בעדינות במשך 20 דקות.
- העבירו בנפרד את הרשתות כשצד הסרט המנומר פונה כלפי מעלה מבלוק מחזיק הרשת לצלחת פטרי מזכוכית מכוסה בנייר ניקוי.
- יבשו את הרשתות למשך 30 דקות לפחות מתחת למכסה המנוע, וודאו שהרשתות מכוסות כדי למנוע נחיתת אבק עליהן.
9. העבירו את הרשתות הנקיות לנייר ניקוי המונח על רשת תיל מנירוסטה או מגש מחורר תחת מי DI
הערה: רשתות חייבות להיות שקועות תחת מי DI על משטח ישר כך שניתן יהיה לצוף על פני המים ולהוריד אותו אל הרשתות. זה יכול להתבצע באמצעות שוקת ציפוי רשת מסחרית או עם צלחת פטרי ומשאבה פריסטלטית, כפי שמשמש ליצירת רשתות תחמוצת גרפן, כפי שתואר על ידי Palovcak et al.18.
- הניחו את הרשת או המגש מפלדת אל-חלד בשוקת ציפוי רשת ושטפו במי DI.
- חתכו את נייר הניקוי הקטן מעט יותר מהרשת/המגש מפלדת אל-חלד והניחו אותו על גבי הרציף, שקוע במי DI.
הערה: נייר הניקוי קטן מעט מהפלטפורמה כדי לאפשר תנועה וטיפול. - העבירו בעדינות את הרשתות המנוקות כשצד הסרט המנוגן פונה כלפי מעלה על גבי נייר הניפוי. סביר להניח שהרשתות יהיו הידרופוביות, ולכן השקיעו את הרשתות במים אנכית או שהן עלולות להתכופף בגלל מתח המים. מקמו את הרשתות במערך ריבועי כך שהן יהיו קרובות ככל האפשר זו לזו, אך לא חופפות (איור 2C).
- הרשתות מוכנות כעת לציפוי חד-שכבתי של גרפן. מלאו את שוקת ציפוי הרשת ביותר מי DI כך שפני המים יהיו לפחות 5 מ"מ מעל הרשתות.
10. העברת גרפן לרשתות
- גרפו בזהירות את סרט ה-MMA/גרפן מהצלחת המתגבשת בעזרת כיסוי נקי על ידי הורדה איטית של הכיסוי לתוך השוקת בזווית, במרחק מה מסרט הגרפן. מקם את משטח הכיסוי מתחת ליריעת הגרפן-MMA כך שקצוות היריעה והכיסוי יהיו מקבילים, ולאחר מכן הרם את הכיסוי אנכית אל מחוץ למים, תוך שהוא מביא איתו את סרט ה-MMA/גרפן.
- העבירו את סרט ה-MMA/גרפן לשוקת על ידי הורדת הכיסוי למים בזווית ~45°, כך שסרט ה-MMA/גרפן יתנתק מהכיסוי ויצוף על פני המים.
- מקם את סרט ה-MMA/גרפן ישירות מעל הרשתות לפני הורדת מפלס המים. השתמש פיפטה פסטר זכוכית שקצהו נמס כדי לאטום את הפתח כדי לתפעל בזהירות את המיקום של סרט MMA/גרפן.
- הורידו לאט את מפלס המים עם המזרק, בערך 1.25 מ"ל/דקה, כך שסרט ה-MMA/גרפן יכסה באופן מלא את משטחי הרשת כשהוא נוחת על נייר הסינון
הערה: ייתכן שיהיה צורך במניפולציה נוספת של יריעת הגרפן-MMA כדי לשמור על מיקומה מעל הרשתות כאשר מפלס המים יורד. - השתמשו בזוג פינצטות נקיות ויבשות כדי להרים את נייר הניקוי המחזיק את הרשתות לצלחת פטרי נקייה, יבשה ונטולת אבק, או העבירו את כל פלטפורמת הנירוסטה.
- יבשו באוויר את רשתות ה-MMA/גרפן למשך 30 דקות לפחות מתחת למכסה המנוע. יש לכסות את הרשתות ברדיד אלומיניום או במכסה כדי למנוע זיהום מחלקיקי אבק.
- מעבירים את הרשתות לאינקובטור ואופים את הרשתות באינקובטור של 65 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
- מוציאים את הרשתות מהאינקובטור ומשאירים אותן מכוסות למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי לקרר את הרשתות לטמפרטורת החדר.
11. הסרת MMA וניקוי הרשתות
הערה: MMA חייב להישטף היטב באצטון כדי למנוע שאריות MMA על הרשתות מצופות הגרפן.
- במנדף מכינים שתי מנות מגבשות המכילות 200 מ"ל אצטון וצלחת מגבשת אחת המכילה 200 מ"ל איזופרופנול (IPA) בטמפרטורת החדר. כסו את הכלים המתגבשים ברדיד אלומיניום כדי למזער את אידוי הממיסים האורגניים.
אזהרה: יש להשתמש בציוד הגנה אישי בעת טיפול באצטון, שכן הוא עלול לגרום לגירוי בעור ועלול להזיק בשאיפה. - הניחו את הבסיס של בלוק מחזיק רשת TEM מהדק בתחתית צלחת ההתגבשות הראשונה המכילה 200 מ"ל של אצטון טרי.
- העבירו כל רשת בנפרד מנייר הניקוי לבאר בבלוק מחזיק הרשת, וודאו שצד ה-MMA פונה כלפי מעלה. מכסים את הכלי המתגבש בנייר כסף, מניחים אותו על שייקר מסלולי, ומנערים בעדינות במשך 30 דקות.
- הניחו את מכסה המתכת על בלוק מחזיק הרשת, אשר יאבטח את הרשתות במהלך ההעברה לצלחת המתגבשת הבאה. הרימו בזהירות את בלוק מחזיק הרשת מהכלי המתגבש בעזרת מזלג כפוף ופינצטה ארוכה והניחו אותו בתחתית צלחת המתגבשת השנייה המכילה 200 מ"ל אצטון טרי. הסירו את המכסה מבלוק מחזיק הרשת ונערו בעדינות על שייקר אורביטלי למשך 30 דקות.
- מניחים את המכסה על בלוק מחזיק הרשת ומעבירים לצלחת המתגבשת המכילה 200 מ"ל של תמיסת IPA לניקוי שאריות אצטון. הסירו את המכסה מבלוק מחזיק הרשת ונערו בעדינות במשך 20 דקות.
- מעבירים את הרשתות לצלחת פטרי קטנה מזכוכית מכוסה בנייר ניקוי ומייבשים את הרשתות באוויר למשך 10 דקות לפחות. שמור על הרשתות מכוסות במכסה כדי למנוע זיהום מחלקיקי אבק.
- הרשתות מוכנות לשימוש או להעברה לקופסת רשת עטופה ברדיד אלומיניום בתוך מייבש ואקום.
הערה: אחסון רשתות גרפן בתוך מייבש ואקום יכול למנוע זיהום של חלקיקים הידרופוביים מתנאי הסביבה. ניתן לאחסן רשתות אלה עד מספר חודשים לפני השימוש27.
12. הפיכת רשתות גרפן להידרופיליות עם טיפול UV / אוזון
הערה: גרפן הוא הידרופובי ביותר, שאינו תואם להכנת דגימת cryoEM, מכיוון שגישות צלילה של כתמים דורשות משטח הידרופילי שעליו טיפת דגימה יכולה להתפשט באופן שווה. בעוד שניתן להגדיר התקנים מסורתיים של פריקת זוהר לפעום פלזמה בעדינות כדי להפוך את פני השטח של הגרפן להידרופיליים, התקנים אלה נוטים להרוס את חד-שכבות הגרפן הדקות. בעבר הוכח כי ניתן להשתמש בשואב UV / אוזון כדי לחמצן חלקית את פני השטח של גרפן25, מה שהופך אותו הידרופילי להכנת דגימת cryoEM מבלי לפגוע בשכבה החד-שכבתית.
- אם אתם משתמשים במערכת UV/אוזון הדורשת פריימינג, הדליקו את המערכת והפעילו את המנורה למשך 10 דקות (בשלב זה, ודאו שאין רשתות חשופות). בזמן ששואב ה- UV / אוזון מתכונן, הסר רשתות ממייבש הוואקום והעבר אותן לכיסוי נקי.
- כאשר מערכת UV / אוזון מוכנה, הניחו את הכיסוי המכיל את הרשתות כאשר צד הגרפן פונה כלפי מעלה לתוך שואב UV / אוזון, וחשפו את הרשתות לגז האוזון למשך 4 דקות.
- לאחר החשיפה לאוזון, השתמש ברשתות באופן מיידי להכנת דגימת cryoEM.
הערה: אם משתמשים במערכת UV / אוזון הדורשת פריימינג, יש למקם רשתות בחומר הניקוי מיד לאחר שהמנורה הוכנה למשך 10 דקות, אחרת היא תהיה קרה מכדי לייצר מספיק גז אוזון כדי לחמצן את הגרפן להכנת דגימה. אין לחשוף את הרשתות לגז האוזון למשך יותר מ-6 דקות, מכיוון שהוא יהרוס את שכבת הגרפן.
Representative Results
ביצוע מוצלח של פרוטוקול ייצור רשת הגרפן המתואר כאן יביא לרשתות EM המצופות במלואן בשכבה אחת של גרפן. ניתן לבדוק את כיסוי הגרפן של הרשתות באמצעות כל TEM. מאחר ששכבה אחת של גרפן נקי היא כמעט בלתי נראית ב-TEM, יש לבחון אותה באמצעות מצב העקיפה של המיקרוסקופ ולצפות בכתמי בראג המתאימים לארגון המשושה של אטומי הפחמן המרכיבים את הגרפן (איור 3A). זה נורמלי לראות מדי פעם כמה קמטים של גרפן חד-שכבתי, אשר מוצגים במהלך ציפוי MMA (איור 3B). אפשר גם לבדוק את רמת הזיהום הקיימת בגרפן על-ידי קבלת תמונת הגדלה גבוהה במרכז אחד החורים המכוסים בגרפן (איור 3C). אם היא נרכשת עם גלאי ברזולוציה גבוהה, התמרת פורייה של תמונה זו צריכה להכיל כתמי בראג המתאימים לריווח פחמן-פחמן ב-2.14 Å (איור 4C). שכבה אחת של אטומי פחמן אינה מייצרת מספיק פיזור אלקטרונים כדי ליצור ניגודיות פאזה, ולכן תמונה של גרפן נקי לא תציג טבעות תון הקשורות לפונקציית העברת הניגודיות בהתמרת פורייה של התמונה. אולם קשה מאוד למנוע זיהום של רשתות גרפן לאחר ייצורן, ושטיפה לא מספקת של רשתות EM או הסרת MMA לאחר ציפוי גרפן תגרום למזהמים בולטים על הרשתות שנראים בתמונות החלל האמיתי (איור 3C). כפי שניתן לראות באיור 4, לרשתות גרפן יש השפעה מרוכזת על דגימה, כפי שנצפה כאשר משווים 0.5 מ"ג/מ"ל של אפופריטין מוחל על רשתות זהב חוריות עם (איור 4A) וללא תמיכת הגרפן (איור 4B). פרוטוקולים דומים לייצור גרפן תוארו בעבר כדי לפתור מבני cryoEM של חלבונים כגון אפופריטין ברזולוציה גבוהה25,27.
איור 1: סכמה להכנת רשתות cryoEM מצופות גרפן. מתוארים שלבים מרכזיים בתהליך ייצור רשת הגרפן. קיצורים: cryoEM = מיקרוסקופ אלקטרונים קריוגני; MMA = מתיל מתקרילט; APS = אמוניום פרסולפט. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: החומרים הדרושים ליצירת רשתות גרפן. (A) החומרים הדרושים לציפוי רשתות cryo-EM מסומנים בהתאם. (B) מבט מקרוב על המעיל עם גיליון גרפן/Cu מודבק על נייר כתמים על שקופית זכוכית. ניתן להרכיב את מעיל הספין על ידי רכישת חלקים מחנות מחשבים / חומרי בניין מקומית. (C) מבט מקרוב על שוקת ציפוי הרשת המחוברת למזרק שניתן להשתמש בו כדי לשלוט במפלס המים. רשתות מונחות על גבי נייר ניקוי על רשת נירוסטה. נייר הניקוי מסייע בתמרון מיקום הרשתות כך שניתן יהיה להתאים אליו את יריעת הגרפן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: תמונת תבנית עקיפה מייצגת ותמונות שדה בהירות של רשת גרפן המראות קמטים או זיהום MMA . (A) רשתות EM המכוסות בשכבה אחת של גרפן יראו פסגות בראג המתאימות לסריג המשושה של הגרפן כאשר הן מצולמות ב-TEM במצב עקיפה. פסגת בראג המתאימה לריווח פחמן-פחמן של 2.14 Å מוקפת ומסומנת בחץ. (B) תמונת שדה בהיר של רשת גרפן חד-שכבתית עם כמה קמטים (מסומנים בחץ) בחד-שכבה של גרפן. (C) תמונת שדה בהיר של גרפן חד-שכבתי עם זיהום MMA (מסומן בחץ). פסי קנה מידה = 100 ננומטר (B,C). קיצורים: EM = מיקרוסקופ אלקטרונים; MMA = מתיל מתקרילט. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: אפופריטין על רשתות זהב מכוסות גרפן: (A) מיקרוגרף CryoEM של 0.5 מ"ג/מ"ל אפופריטין על רשתות זהב מכוסות גרפן. (B) אפופריטין המצולם באותו ריכוז נראה בריכוז נמוך משמעותית כאשר מכינים אותו באמצעות רשתות זהב חוריות ללא גרפן. (C) FFT של מיקרוגרף cryoEM של 0.5 מ"ג/מ"ל אפופריטין על רשתות זהב מכוסות גרפן, כאשר פסגות בראג מתאימות לסריג הגרפן המשושה מסומן. פסי קנה מידה = 100 ננומטר (A,B). קיצורים: cryoEM = מיקרוסקופ אלקטרונים קריוגני; FFT = התמרת פורייה מהירה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Discussion
שימור דגימות ביולוגיות בשכבה דקה של קרח זגוגי הוא צעד חשוב ביותר לקביעת מבנה cryoEM ברזולוציה גבוהה. עם זאת, חוקרים נתקלים לעתים קרובות בבעיות הנובעות מאינטראקציות עם AWI, אשר מציג אוריינטציה מועדפת, פירוק מורכב, דנטורציה וצבירה. יתר על כן, לא תמיד ניתן לרכז את הדגימות במידה מספקת כדי לאכלס את הקרח הדק התלוי על פני חורי היריעה המוגדרת. מספר קבוצות מחקר פיתחו שיטות לצפות רשתות EM עם שכבה אחת של גרפן כדי לעזור להתגבר על חלק מהמגבלות הללו 24,25,26,27,28,29,30, ורשתות גרפן שימשו בהצלחה רבה. כאן, אנו מספקים הוראות שלב אחר שלב להכנת אצוות יעילות של רשתות גרפן בתוך החברה ובחינת איכות רשתות הגרפן על ידי TEM. נדגיש כי יש לנקוט משנה זהירות בחלק מהצעדים הקריטיים, אותם נפרט להלן.
לגרפן יש נטייה חזקה למשוך מזהמים הנישאים באוויר. לכן, בתהליך ייצור רשת הגרפן, חשוב לוודא שכל הכלים הבאים במגע עם יריעת הגרפן/Cu או עם הרשתות נקיים ונקיים מאבק. כיסויי זכוכית המשמשים להעברת גרפן ניתנים לניקוי על ידי שטיפה באתנול ומי DI או באמצעות דוסטר אוויר. מומלץ גם לעבוד מתחת למכסה מנוע מנדף ולשמור על יריעות גרפן ורשתות מכוסות בנייר כסף או צלחת זכוכית נקייה בכל עת. אבק או מזהמים על הרשתות עלולים למנוע מגרפן להיצמד ביסודיות לרשתות האלקטרומגנטיות. בעת טיפול ברשתות מצופות גרפן או גרפן, חשוב להיות מוארקים חשמלית כדי למנוע נזק לסרט הגרפן כתוצאה מפריקה סטטית. ניתן למנוע פריקה סטטית על ידי שימוש ברצועת הארקה לפרק כף היד, נגיעה בחפץ מתכתי מוארק בכל פעם שמטפלים ברשתות גרפן או גרפן, ו/או אי לבישת כפפה על היד האוחזת בפינצטה24.
מכיוון ששכבה אחת של גרפן היא דקה מאוד (רוחב של אטום פחמן), חשוב לתמוך בגרפן עם שכבה אורגנית כגון MMA או poly-MMA (PMMA) במהלך העברת גרפן לרשתות. PMMA הוא החומר הנפוץ ביותר להעברת גרפן. עם זאת, ל-PMMA יש זיקה חזקה לגרפן ולעתים קרובות הוא עלול לגרום לזיהום פולימרי על סרט הגרפן. MMA משמש בפרוטוקול זה, כפי שהוא משאיר פחות זיהום שיורי25. אולם גם ל-PMMA וגם ל-MMA יש את החיסרון של יצירת קמטים וסדקים שניתן לראות באזורים מסוימים של סרט הגרפן (איור 3B). זה יכול להיות מאתגר להימנע מקמטים אלה כפי שהם מתרחשים בדרך כלל במהלך צמיחת גרפן על ידי שיטת CVD31. לאחרונה פותחה שיטה לגידול גרפן שטוח במיוחד ללא קמטים, לפיה רדיד הנחושת מוחלף בפרוסת Cu(111)/ספיר כמצע צמיחה32.
בהתבסס על הניסיון שלנו, עדיף לרכוש יריעות גרפן/Cu ולתמוך בגרפן עם MMA בתוך הבית מאשר לרכוש יריעות Cu-graphene מכוסות פולימר מהיצרנים, אשר הופכות שבירות לאחר חריטת נחושת וקשה לטפל בהן בשלבים הבאים. את מעיל הספין בו השתמשנו לציפוי MMA ניתן לבנות בזול באמצעות חלקים מחנות מחשבים/חומרי בניין מקומית, כפי שתואר קודם לכן25.
במהלך שלב ציפוי MMA, חשוב לכסות את כל משטח הגרפן על יריעת Cu-graphene עם MMA. לאחר שה-Cu נחרט, MMA-גרפן יהפוך לשקוף למחצה, ואזורים ללא כיסוי MMA ייראו כמו חורים ריקים. כדי למנוע ציפוי MMA בצד הנחושת, חשוב להניח מתחתיו במהלך הציפוי פיסת נייר ניקוי קטנה, כך שהיא תספוג את עודפי ה-MMA שמסתובבים החוצה מסרט ה-CVD.
לאחר החריטה והשטיפה, יריעת MMA/גרפן מוכנה להעברה לרשתות EM באמצעות מערכת שוקת מסחרית או ביתית עם מזרק או משאבה פריסטלטית כדי לשלוט במפלס המים. לפני שלב ההעברה, חשוב לשטוף היטב את הרשתות באמבטיות עוקבות של כלורופורם, אצטון ו- IPA. אפיית רשתות מצופות גרפן בטמפרטורה של 65°C מסייעת בשמירה על שלמות הגרפן ומקדמת ספיחת גרפן לרשתות. לבסוף, כדי למנוע זיהום MMA ברשתות, חשוב להסיר ביסודיות MMA באמבט אצטון ולנקות את הרשתות ב- IPA. כל שאריות MMA לא שטופות ייצפו ברשתות EM ויקטינו את יחס האות לרעש של התמונות (איור 3C). ניתן לחזור על תהליך שטיפת אצטון-IPA כדי לנקות עוד יותר את משטחי הגרפן.
כדי להפוך את רשתות הגרפן להידרופיליות, חשפנו את הרשתות לקרינת UV/אוזון. מודלים שונים של שואבי UV / אוזון עשויים לדרוש אופטימיזציה כדי לחמצן מספיק את שכבת הגרפן להכנת דגימת cryoEM מבלי לפגוע בגרפן. ללא קשר למערכת, קריטי להשתמש ברשתות אלה ליישום דגימת cryoEM מיד לאחר טיפול UV / אוזון. שיטות חלופיות להפיכת רשתות גרפן להידרופיליות מתוארות במחקרים אחרים33,34.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים לד"ר שיאו פאן על דיונים מועילים בעת ביסוס שיטות אלה ב- Scripps Research. B.B נתמך על ידי מלגת מחקר פוסט-דוקטורט מקרן יואיט למחקר רפואי. W.C. נתמך על ידי מלגת קדם-דוקטורט של הקרן הלאומית למדע. D.E.P נתמך על ידי NS095892 המענק של המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) ל- G.C.L. פרויקט זה נתמך גם על ידי מענקי NIH GM142196, GM143805 ו-S10OD032467 ל-G.C.L.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70% EtOH | Pharmco (190 pf EtOH) | 241000190CSGL | |
| Acetone | Sigma Aldrich | 650501-4L | |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma Aldrich | 215589-500g | Hazardous; use extreme caution |
| Chloroform | Sigma Aldrich | C2432-1L | |
| Clamping TEM Grid Holder Block for 45 Grids | PELCO | 16830-45 | |
| Computer fan | Amazon (Noctua) | B07CG2PGY6 | |
| Cover slip | Bellco Glass | 1203J71 | Standard cover slips |
| Crystallizing dish | Pyrex | 3140-100 | |
| Electronics duster | Falcon Safety Products | 75-37-6 | |
| Falcon Dust-off Air Duster | Staples | N/A | |
| Filter papers | Whatman | 1001-055 | |
| Fine tip tweezer | Dumont | 0508-L4-PO | |
| Flask | Pyrex | 4980-500 | |
| Fork | Supermarket | N/A | |
| Glass pasteur pipette | VWR | 14672-608 | |
| Graphene/Cu | Graphenea | N/A | CVD monolayer graphene cu |
| Grid Coating Trough | Ladd Research Industries | 10840 | Fragile |
| Isopropanol | Fisher Scientific | 67-63-0 | |
| Kapton Tape | Amazon (MYJOR) | MY-RZY001 | Polyimide tape |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666 | |
| Long twzeer | Cole Parmer Essentials | UX-07387-15 | |
| Metal grid holder | Ted Pella | 16820-81 | |
| MMA(8.5)MMA EL 6 | KAYAKU Advanced Materials | M31006 0500L 1GL | Flammable |
| Model 10 Lab Oven | Quincy Lab, Inc. | FO19013 | |
| Petri dish | Pyrex | 3610-102 | |
| Plasma cleaner (Solarus 950) | Gatan, Inc. | N/A | |
| Scissors | Fiskars | 194813-1010 | |
| Standard Analog Orbital Shaker | VWR | 89032-088 | |
| UltrAuFoil R1.2/1.3 - Au300 | Quantifoil | N/A | Holey gold grids |
| Ultraviolet Ozone Cleaning Systems | UVOCS | model T10X10/OES |
References
- Li, X., Zheng, S. Q., Egami, K., Agard, D. A., Cheng, Y. Influence of electron dose rate on electron counting images recorded with the K2 camera. Journal of Structural Biology. 184 (2), 251-260 (2013).
- Tang, G., et al. EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).
- Zivanov, J., et al. New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3. eLife. 7, 1-22 (2018).
- Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. CryoSPARC: Algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
- Grigorieff, N., Harrison, S. C. Near-atomic resolution reconstructions of icosahedral viruses from electron cryo-microscopy. Current Opinion in Structural Biology. 21 (2), 265-273 (2011).
- Nakane, T., et al. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).
- Zhang, K., Pintilie, G. D., Li, S., Schmid, M. F., Chiu, W. Resolving individual atoms of protein complex by cryo-electron microscopy. Cell Research. 30 (12), 1136-1139 (2020).
- Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM. Nature. 587 (7832), 157-161 (2020).
- Schultz, P.
- Nguyen, H. P. M., McGuire, K. L., Cook, B. D., Herzik, M. A. Manual blot-and-plunge freezing of biological specimens for single-particle cryogenic electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. 2022 (180), 1-16 (2022).
- Glaeser, R. M. Proteins, interfaces, and cryo-em grids. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 25 (3), 289-313 (2016).
- Glaeser, R. M., Han, B. -G. Opinion: hazards faced by macromolecules when confined to thin aqueous films. Biophysics Reports. 3 (1-3), 1-7 (2017).
- Han, B. G., Watson, Z., Cate, J. H. D., Glaeser, R. M. Monolayer-crystal streptavidin support films provide an internal standard of cryo-EM image quality. Journal of Structural Biology. 200 (3), 307-313 (2017).
- Noble, A. J., et al. Routine single particle CryoEM sample and grid characterization by tomography. eLife. 7, 1-42 (2018).
- Drulyte, I., et al. Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 74 (6), 560-571 (2018).
- Liu, N., Wang, H. W. Better cryo-EM specimen preparation: how to deal with the air-water interface. Journal of Molecular Biology. 435 (9), 167926 (2022).
- Noble, A. J., et al. Reducing effects of particle adsorption to the air-water interface in cryo-EM. Nature Methods. 15 (10), 793-795 (2018).
- Palovcak, E., et al. A simple and robust procedure for preparing graphene-oxide cryo-EM grids. Journal of Structural Biology. 204 (1), 80-84 (2018).
- Patel, A., Toso, D., Litvak, A., Nogales, E. Efficient graphene oxide coating improves cryo-EM sample preparation and data collection from tilted grids. bioRxiv. , (2021).
- Marr, C. R., Benlekbir, S., Rubinstein, J. L. Fabrication of carbon films with ~500nm holes for cryo-EM with a direct detector device. Journal of Structural Biology. 185 (1), 42-47 (2014).
- Pantelic, R. S., Meyer, J. C., Kaiser, U., Baumeister, W., Plitzko, J. M. Graphene oxide: A substrate for optimizing preparations of frozen-hydrated samples. Journal of Structural Biology. 170 (1), 152-156 (2010).
- Pantelic, R. S., et al. Graphene: substrate preparation and introduction. Journal of Structural Biology. 174 (1), 234-238 (2011).
- Russo, C. J., Passmore, L. A. Progress towards an optimal specimen support for electron cryomicroscopy. Current Opinion in Structural Biology. 37, 81-89 (2016).
- Passmore, L. A., Russo, C. J. Specimen preparation for high-resolution cryo-EM. Methods in Enzymology. 579, 51-86 (2016).
- Han, Y., et al. High-yield monolayer graphene grids for near-atomic resolution cryoelectron microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (2), 1009-1014 (2020).
- Zheng, L., et al. Robust ultraclean atomically thin membranes for atomic-resolution electron microscopy. Nature Communications. 11 (1), 541 (2020).
- Ahn, E., Kim, B., Cho, U. -S. Batch production of high-quality graphene grids for cryo-EM: cryo-EM structure of Methylococcus capsulatus soluble methane monooxygenase hydroxylase. bioRxiv. (Cvd), (2021).
- Naydenova, K., Peet, M. J., Russo, C. J. Multifunctional graphene supports for electron cryomicroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (24), 11718-11724 (2019).
- Fan, H., Sun, F. Developing graphene grids for cryoelectron microscopy. Frontiers in Molecular Biosciences. 9, 937253 (2022).
- D'Imprima, E., et al. Protein denaturation at the air-water interface and how to prevent it. eLife. 8, e42747 (2019).
- Zhang, X., et al. Evolution of copper step beams during graphene growth by CVD method. Applied Surface Science. 610, 155518 (2023).
- Zheng, L., et al. Uniform thin ice on ultraflat graphene for high-resolution cryo-EM. Nature Methods. 20 (1), 123-130 (2023).
- Fujita, J., et al. Epoxidized graphene grid for highly efficient high-resolution cryoEM structural analysis. Scientific Reports. 13, 2279 (2023).
- Lu, Y., et al. Functionalized graphene grids with various charges for single-particle cryo-EM. Nature Communications. 13, 6718 (2022).
