Summary
هنا ، نصف بروتوكولا لتطبيق طبقة أحادية واحدة من الجرافين على شبكات المجهر الإلكتروني وكيفية تحضيرها للاستخدام في تحديد بنية cryoEM.
Abstract
برز المجهر الإلكتروني المبرد (cryoEM) كتقنية قوية لفحص التركيب الذري للمجمعات الجزيئية الكبيرة. يتطلب تحضير العينة ل cryoEM حفظ العينات في طبقة رقيقة من الجليد الزجاجي ، وعادة ما يتم تعليقها داخل فتحات فيلم دعم مزخرف. ومع ذلك ، فإن جميع طرق تحضير العينات شائعة الاستخدام لدراسات cryoEM تعرض العينة لواجهة الهواء والماء ، مما يؤدي إلى تأثير قوي كاره للماء على العينة التي غالبا ما تؤدي إلى تمسخ وتجميع وتفكك معقد. علاوة على ذلك ، تؤثر التفاعلات المفضلة الكارهة للماء بين مناطق العينة وواجهة الهواء والماء على الاتجاهات التي تعتمدها الجزيئات الكبيرة ، مما يؤدي إلى إعادة بناء 3D بدقة اتجاهية متباينة الخواص.
وقد تبين أن امتزاز عينات cryoEM إلى طبقة أحادية من الجرافين يساعد في تخفيف التفاعلات مع واجهة الهواء والماء مع تقليل إدخال ضوضاء الخلفية. توفر دعامات الجرافين أيضا فائدة خفض التركيز المطلوب للبروتينات المطلوبة للتصوير بالتبريد. على الرغم من مزايا هذه الدعامات ، لا يتم استخدام الشبكات المطلية بالجرافين على نطاق واسع من قبل مجتمع cryoEM بسبب التكلفة الباهظة للخيارات التجارية والتحديات المرتبطة بالإنتاج الداخلي على نطاق واسع. تصف هذه الورقة طريقة فعالة لإعداد دفعات من شبكات cryoEM التي تتمتع بتغطية كاملة تقريبا من الجرافين أحادي الطبقة.
Introduction
المجهر الإلكتروني المبرد أحادي الجسيمات (cryoEM) هو تقنية قابلة للتطبيق بشكل متزايد تستخدم للتحقيق في هياكل 3D للجزيئات الحيوية. مكنت التطورات التكنولوجية في بصريات المجهر الإلكتروني ، والكشف المباشر عن الإلكترون1 ، وخوارزميات الكمبيوتر2،3،4 على مدار العقد الماضي مستخدمي cryoEM من تحديد هياكل المعقدات الجزيئية الكبيرة المستقرة كيميائيا إلى الدقة شبه الذرية5،6،7،8. على الرغم من هذه التطورات ، لا تزال هناك حواجز ملحوظة أمام الحفاظ على عينات التصوير بالتبريد ، والتي تمنع حل غالبية العينات البيولوجية إلى مثل هذه الدقة العالية.
يتضمن تحضير العينة لتحليل cryoEM عالي الدقة محاصرة الجزيئات الكبيرة الموزعة بالتساوي في مجموعة واسعة من الاتجاهات داخل طبقة رقيقة من الجليد المزجج. طرق "اللطخة والغطس" للتجميد هي أكثر الطرق المستخدمة على نطاق واسع لتوليد أغشية رقيقة من العينات البيولوجية على الشبكات لدراسات cryoEM 9,10. تتضمن هذه الطرق تطبيق بضعة ميكرولترات من محلول العينة على شبكة EM تحتوي على فيلم مزخرف تم تصنيعه محبا للماء ثم مسح غالبية العينة بورق الترشيح قبل غمر الشبكة بسرعة في كريوجين من خليط الإيثان السائل أو خليط الإيثانوالبروبان 9.
في حين تم استخدام هذه الطريقة بنجاح لتحديد هياكل مجموعة واسعة من العينات البيولوجية ، فإن جميع طرق تحضير العينات cryoEM شائعة الاستخدام تعرض العينات لواجهة الهواء والماء الكارهة للماء (AWI) ، والتي غالبا ما تقدم مشكلات تحد من تحديد الهيكل عالي الدقة. ثبت أن العينات البيولوجية لديها ميل كبير للتشوه عند تعرضها ل AWI ، مما قد يؤدي إلى تجميع وتفكيك معقد11،12،13،14. علاوة على ذلك ، تتسبب البقع الكارهة للماء على أسطح العينات البيولوجية في تبني الجسيمات للاتجاهات المفضلة في الجليد12. في العديد من السيناريوهات ، تجبر منطقة واحدة كارهة للماء في العينة جميع الجسيمات على تبني اتجاه واحد في الجليد ، وبالتالي إلغاء القدرة على توليد إعادة بناء موثوقة. بالإضافة إلى المشكلات المتعلقة ب AWI ، قد تظهر العينات تقاربا لسطح الطبقة المحفوزة من الفيلم ، مما يحد من عدد الجسيمات المعلقة في الجليد داخل الثقوب15.
تم تطوير العديد من الحلول المنهجية والتكنولوجية لتقليل هذه القضايا الناشئة عن التفاعلات مع AWI أو الأفلام16،17. تتمثل إحدى الطرق الشائعة في طلاء الفيلم المزخرف لشبكات EM بطبقة رقيقة (عشرات النانومترات) من الكربون غير المتبلور. يوفر هذا الطلاء سطحا مستمرا عبر الثقوب التي يمكن للجزيئات أن تمتز لها ، مع الاستفادة من حماية العينة جزئيا من التفاعلات مع AWI15،18،19،20. ومع ذلك ، فإن طبقة الكربون الإضافية ترفع من كمية إشارة الخلفية في المناطق المصورة ، مما يؤدي إلى حدوث ضوضاء يمكن أن تؤثر على الدقة التي يمكن تحقيقها ، خاصة بالنسبة للعينات الصغيرة (<150 كيلو دالتون). في السنوات الأخيرة ، ثبت أن استخدام رقائق أكسيد الجرافين (GO) لإنتاج أغشية داعمة على شبكات cryoEM له مزايا على الكربون غير المتبلور التقليدي. يتم إنتاج رقائق GO من خلال أكسدة طبقات الجرافيت ، مما ينتج عنه صفائح بلورية زائفة من الجرافيت أحادي الطبقة محبة للماء بسبب محتواها الكبير من الأكسجين في شكل مجموعات كربوكسيل وهيدروكسيل وإيبوكسي على الأسطح والحواف. رقائق GO التجارية في المعلقات المائية غير مكلفة ، وهناك العديد من الطرق المنشورة لتطبيق رقائق GO على شبكات EM18,21. ومع ذلك ، غالبا ما تؤدي هذه الطرق إلى شبكات مغطاة جزئيا فقط برقائق GO ، بالإضافة إلى المناطق التي تحتوي على طبقات متعددة من رقائق GO. علاوة على ذلك ، تساهم رقائق GO بإشارة خلفية ملحوظة لصور cryoEM قريبة من تلك التي لوحظت مع الكربون غير المتبلورالرقيق 22,23.
الجرافين أحادي الطبقة البكر ، والذي يتكون من مجموعة بلورية 2D واحدة من ذرات الكربون ، يختلف عن GO في أنه لا ينتج تباين الطور في المجهر الإلكتروني. وبالتالي يمكن استخدام الجرافين أحادي الطبقة لتوليد طبقة دعم غير مرئية لتصوير العينات البيولوجية. الجرافين أحادي الطبقة أقوى أيضا من GO ويمكن تطبيقه كطبقة أحادية واحدة على شبكة EM ، وقد جعلت التطورات الحديثة في تصنيع شبكات EM المطلية بالجرافين من الممكن إعداد شبكات الجرافين أحادية الطبقة عالية التغطية في المنزل24،25،26،27،28،29،30. ومع ذلك ، على الرغم من فوائد استخدام الشبكات المطلية بالجرافين لتحديد هيكل cryoEM ، إلا أنها لا تستخدم على نطاق واسع بسبب النفقات الباهظة للخيارات التجارية وتعقيد الإنتاج الداخلي. هنا ، نصف دليلا تفصيليا لإنتاج شبكات EM بشكل فعال مغطاة بطبقة أحادية من الجرافين لتحديد بنية cryoEM للعينات البيولوجية (الشكل 1). باتباع هذا البروتوكول المفصل ، يمكن لباحثي cryoEM إعداد العشرات من شبكات دعم الجرافين عالية الجودة في يوم واحد. يمكن فحص جودة الشبكات المطلية بالجرافين بسهولة باستخدام مجهر إلكتروني منخفض النهاية (TEM) مزود بخيوط LaB6.
Protocol
1. إعداد المواد والملحقات اللازمة لتصنيع شبكات الجرافين
ملاحظة: يلوث الجرافين بسهولة ، مما يقلل من كفاءة طلاء الجرافين وجودة شبكات الجرافين ؛ لذلك ، من المهم تنظيف جميع المواد التي تتلامس مع الجرافين تماما. يجب إعداد المواد وجميع الخطوات في غطاء الدخان.
- اجمع المواد اللازمة التي سيتم استخدامها لطلاء الشبكات بالجرافين (الشكل 2 أ).
- اشطف الأواني الزجاجية عدة مرات بالماء منزوع الأيونات (DI) لإزالة أي غبار ونسالة وبقايا زيتية.
- استخدم مناديل يمكن التخلص منها لتنظيف أغطية الزجاج التي تحتوي على 75٪ من الإيثانول واستخدم منفضة الهواء لإزالة أي ملوثات.
ملاحظة: يمكن أن تستوعب كتلة حامل شبكة TEM المثبتة المستخدمة في هذا البروتوكول ما يصل إلى 45 شبكة. لإنتاج دفعة كبيرة من شبكات الجرافين ، يمكن تحضير 45 شبكة أو أقل في وقت واحد. ومع ذلك ، يوصى بالبدء بإنتاج دفعة صغيرة (من أربع إلى ست شبكات) حتى يتم إنشاء الطريقة في المختبر.
2. تحضير 0.2 متر من كبريتات الأمونيوم (APS) في الماء
ملاحظة: يستخدم حل APS هذا كنقش لإزالة دعم النحاس (Cu) من ورقة الجرافين / النحاس في خطوة لاحقة. دائما إعداد جديد APS الحل. لن تقوم المحاليل المعاد استخدامها أو القديمة بحفر النحاس بشكل فعال وقد تترك بقايا النحاس على الجرافين في الخطوات اللاحقة.
- اشطف قارورة سعة 500 مل بالماء منزوع الأيونات (DI) ، ثم أضف 200 مل من ماء DI والميكروويف باستخدام الإعدادات القصوى لمدة 1 دقيقة تقريبا لإزالة الغازات من الماء.
- أضف 9 جم من بيرسلفات الأمونيوم إلى 200 مل من ماء DI لإنتاج محلول 0.2 M APS.
تنبيه: APS سامة ، ينصح بارتداء معدات الحماية الشخصية (PPE) عند التعامل معها APS. تخلص من APS النفايات في مصنع معتمد للتخلص من النفايات. - حرك المحلول بقضيب تحريك على محرك مغناطيسي أثناء توصيل القارورة بمصدر فراغ تحت غطاء الدخان.
ملاحظة: التفريغ APS سيساعد الحل على منع تكوين الفقاعات ، مما قد يقلل من كفاءة حفر النحاس في الخطوة 6.
3. انقل الجرافين / النحاس إلى غطاء نظيف بقطعة من الورق النشاف
ملاحظة: نستخدم فيلم جرافين ترسيب بخار كيميائي (CVD) مقاس 15 × 15 سم على النحاس من مورد الجرافين. يجب تخزين صفائح الجرافين / النحاس أحادية الطبقة المشتراة تجاريا تحت فراغ. نظرا لأن الجرافين يزرع على جانبي النحاس بطريقة الأمراض القلبية الوعائية ، يقوم موردو الجرافين عموما بإجراء فحوصات الجودة ويوصون بالجانب الأفضل للاستخدام. نشير إلى هذا الجانب الموصى به من الجرافين على أنه الجانب "العلوي" بينما الجانب الآخر هو الجانب "الخلفي" في هذا البروتوكول.
- قطع قطعة من الورق النشاف في شكل مستطيل حوالي 20 مم × 40 مم. يستخدم ورق النشاف هذا كحشوة لورقة الجرافين / النحاس وسوف يمتص ميثاكريلات الميثيل الزائدة (MMA (8.5) MMA EL6) المستخدمة لطلاء ورقة الجرافين / النحاس ؛ لذلك ، تأكد من قصها إلى حجم أكبر من ورقة الجرافين / النحاس المراد استخدامها.
- استخدم شريط بوليميد للصق الزوايا الأربع للورق النشاف بالجزء العلوي من غطاء نظيف يتناسب مع مغلف الدوران محلي الصنع.
ملاحظة: يستخدم شريط بوليميد لأنه رقيق ويمكن إزالته بسهولة ، مما يجعل التعامل معه سهلا. - قم بإزالة قطعة واحدة من ورقة الجرافين / النحاس من مخزن التفريغ.
- استخدم مقصا نظيفا وخاليا من الغبار لقطع مربع صغير من لوح Cu-graphene بعناية والذي سيكون كافيا لتغطية عدد الشبكات المراد تحضيرها بالكامل. بالنسبة إلى 25 شبكة مرتبة في صفيف 5 × 5 ، على سبيل المثال ، قم بقص قطعة بحجم 18 مم × 18 مم. ضع ورقة الجرافين / النحاس فوق ورق النشاف بملاقط نظيفة وجافة. تأكد من أن الجانب الخلفي من ورقة الجرافين / النحاس متجها لأسفل واحرص على عدم قلب ورقة الجرافين / النحاس عن طريق الخطأ لأنه من الصعب تمييز الجانب العلوي من الجانب الخلفي.
- قم بلصق الزوايا الأربع لورقة الجرافين / النحاس على الورق النشاف / قسيمة الغطاء ، مما يقلل من مقدار التلامس بين الشريط وورقة الجرافين / النحاس ، حيث لن يتم تغطية أي مناطق مغطاة بشريط MMA في الخطوة التالية.
ملاحظة: يمكن أن يؤدي التفريغ الساكن إلى إتلاف أغشية الجرافين ، وبالتالي ، ينصح بالبقاء مؤرضا كهربائيا وتقليل تراكم الشحنة الساكنة عند التعامل مع شبكات الجرافين أو الجرافين. يمكن تحقيق ذلك عن طريق ارتداء حزام تأريض المعصم أو لمس جسم معدني مؤرض مباشرة قبل التعامل مع شبكات الجرافين أو الجرافين.
4. قم بتغطية ورقة الجرافين / النحاس أحادية الطبقة بطبقة رقيقة من MMA (8.5) MMA EL6 (MMA)
ملاحظة: بعد حفر النحاس بعيدا ، ستدعم طبقة MMA هذه طبقة الجرافين أحادية الطبقة لتمكين معالجة ورقة الجرافين في الخطوات المستقبلية. يتيح طلاء MMA أيضا تصور فيلم الجرافين لأن الطبقة الأحادية من الجرافين وحدها ستكون شفافة.
- ضع غطاء الغطاء مع ورقة الجرافين / النحاس المسجلة على طبقة دوارة محلية الصنع (يمكن تجميعها باستخدام مروحة كمبيوتر) داخل غطاء دخان (الشكل 2 ب) ، كما وصفه Han et al.25 سابقا.
- عند ارتداء نظارات السلامة ، أضف قطرتين من MMA باستخدام ماصة زجاجية على لوح الجرافين وابدأ على الفور في الدوران بأقصى سرعة.
- أثناء الدوران ، أضف قطرتين أخريين في الوسط. تدور لمدة 1 دقيقة.
ملاحظة: تأكد من تطبيق MMA كاف لتغطية الجرافين بالكامل. إذا لم تكن متأكدا ، أضف بضع قطرات أخرى. إذا لم يكن الجرافين مطليا بالكامل ، تظهر "ثقوب" في الفيلم بعد حفر النحاس بعيدا. - اتركيه يجف في الهواء لمدة 10 دقائق داخل غطاء الدخان.
5. قم بإزالة الجرافين على الجانب الخلفي من ورقة الجرافين / النحاس
ملاحظة: يجب إزالة الجرافين المزروع على الجانب الخلفي من النحاس (الجانب غير المطلي ب MMA) قبل المتابعة إلى الخطوات اللاحقة لأن هذا الجرافين الزائد سيقلل من فعالية حفر النحاس. نقوم بإزالة هذا الجرافين عن طريق تعريض الجرافين للبلازما ، والتي يمكن تحقيقها باستخدام أي جهاز تفريغ توهج يستخدم عادة لإعداد شبكات EM لإعداد العينات البيولوجية.
- قم بإزالة الشريط بعناية وارفع ورقة الجرافين / النحاس المطلية ب MMA من غطاء الغطاء باستخدام ملاقط نظيفة وجافة.
- قم بلصق قطعة ورقة MMA / الجرافين / النحاس بحيث يكون جانب MMA لأسفل إلى غطاء زجاجي نظيف وخالي من الغبار.
- ضع غطاء الغطاء مع ورقة MMA / الجرافين / النحاس في جهاز تفريغ التوهج وقم بتطبيق الإعدادات التي يمكن استخدامها عادة عند تحضير الشبكات للبقع السالبة أو تحضير عينة cryoEM.
ملاحظة: يجب تجنب تفريغ التوهج لفترات طويلة لمنع أكسدة النحاس على الجانب الخلفي ، مما قد يؤدي إلى تلوث جزيئات أكسيد النحاس (CuO) (النانو) على فيلم الجرافين.
6. احفر النحاس بعيدا عن ورقة MMA / الجرافين / النحاس في APS الحل
- في غطاء الدخان ، صب 200 مل من محلول APS الطازج في طبق تبلور نظيف وخالي من الغبار (150 × 75 مم).
- قم بإزالة ورقة MMA / الجرافين / النحاس من الشريحة الزجاجية. تتبع الجانب الذي يحتوي على MMA.
- لبدء الحفر ، ضع ورقة MMA / الجرافين / النحاس مع جانب النحاس المعالج بالبلازما لأسفل على سطح محلول APS. قم بتغطية الدورق الزجاجي العريض بقطعة من ورق الألمنيوم أو غطاء لمنع دخول الغبار.
- احتضان لمدة 3 ساعات. إذا لم يتم حفر معظم النحاس بعد 1 ساعة ، كرر الخطوات الواردة في الأقسام 2-6 ثم تابع إلى الخطوة التالية.
ملاحظة: إذا لم يتم حفر معظم النحاس بعد 1 ساعة ، فمن المحتمل أن يكون جانب MMA / الجرافين من الفيلم قد تم وضعه على سطح محلول APS بدلا من جانب النحاس. يجب حفر النحاس بالكامل بعد 3 ساعات ، ويكون فيلم MMA / الجرافين عديم اللون إذا تم حفر النحاس تماما. يلوث الجرافين بسهولة ، لذا تأكد من تغطية أي حاويات لتجنب تراكم الوبر أو أي بقايا دهنية على الأسطح ، لأن ذلك سيؤثر سلبا على جودة الجرافين.
7. شطف فيلم MMA / الجرافين في الماء DI
- في غطاء الدخان ، املأ طبق تبلور نظيف وخالي من الغبار بماء DI.
- اغرف فيلم الجرافين-MMA برفق باستخدام غطاء زجاجي نظيف وخالي من الغبار تم وضعه بزاوية ~ 45 درجة بالنسبة لسطح محلول APS.
- ضع الشريحة الزجاجية بزاوية 90 درجة تقريبا على الماء ، وقم بخفض الغطاء الزجاجي برفق في الماء بحيث ينزلق MMA / الجرافين ببطء عن الشريحة ويطفو على سطح الماء.
- اترك فيلم MMA / الجرافين على سطح الماء لمدة 1 ساعة لغسل أي APS.
8. تنظيف الشبكات المراد طلاءها بطبقة أحادية من الجرافين
ملاحظة: يجب أن تكون الشبكات التي سيتم نقل الجرافين إليها نظيفة قدر الإمكان لزيادة ارتباط الجرافين بسطح رقائق الشبكة. غالبا ما تحتوي الشبكات المشتراة تجاريا على ملوثات متبقية يجب إزالتها قبل نقل الجرافين.
- نظف وجفف ثلاثة أطباق متبلورة بحيث تكون خالية من الغبار.
- في غطاء الدخان ، صب 200 مل من الكلوروفورم والأسيتون وكحول الأيزوبروبيل (IPA) في كل من الأطباق الثلاثة المتبلورة. قم بتغطية الأطباق المتبلورة بورق الألمنيوم لتقليل تبخر المذيبات العضوية.
تنبيه: الكلوروفورم والأسيتون يسببان تهيج الجلد ويمكن أن يكونا سامين إذا تم استنشاقهما. الحد من التعرض لهذه المذيبات العضوية وارتداء معدات الوقاية الشخصية. - ضع قاعدة كتلة حامل شبكة TEM في الجزء السفلي من أول طبق بلورة يحتوي على 200 مل من الكلوروفورم.
- انقل كل شبكة على حدة من صندوق الشبكة إلى بئر في كتلة حامل الشبكة ، مع التأكد من أن جانب الفيلم المزخرف متجها لأعلى. غطي طبق التبلور بورق الألمنيوم ، ضعيه على شاكر مداري ، ورجيه برفق لمدة 30 دقيقة.
- ضع الغطاء المعدني على كتلة حامل الشبكة ، والتي ستؤمن الشبكات أثناء النقل إلى طبق التبلور التالي. ارفع كتلة حامل الشبكة بعناية من الطبق المتبلور بشوكة منحنية وملاقط طويلة وضعها في قاع طبق التبلور الثاني الذي يحتوي على 200 مل من الأسيتون. قم بإزالة الغطاء من كتلة حامل الشبكة ورج برفق على شاكر مداري لمدة 30 دقيقة.
- ضع الغطاء على كتلة حامل الشبكة وانقله إلى طبق متبلور يحتوي على 200 مل من محلول IPA لتنظيف بقايا الأسيتون. قم بإزالة الغطاء من كتلة حامل الشبكة ورجه برفق لمدة 20 دقيقة.
- انقل الشبكات بشكل فردي بحيث يكون جانب الفيلم المزخرف متجها لأعلى من كتلة حامل الشبكة إلى طبق زجاجي بتري مغطى بورق النشاف.
- قم بتجفيف الشبكات لمدة 30 دقيقة على الأقل تحت غطاء الدخان ، مع التأكد من تغطية الشبكات لمنع الغبار من الهبوط عليها.
9. انقل الشبكات النظيفة إلى ورق نشاف موضوع على شبكة سلكية من الفولاذ المقاوم للصدأ أو صينية مثقبة تحت ماء DI
ملاحظة: يجب غمر الشبكات تحت ماء DI على سطح مستو بحيث يمكن تعويم الجرافين على الماء وخفضه على الشبكات. يمكن إجراء ذلك باستخدام حوض طلاء شبكي تجاري أو مع طبق بتري ومضخة تمعجية ، كما هو مستخدم لتوليد شبكات أكسيد الجرافين ، كما وصفها Palovcak et al.18.
- ضع الشبكة أو الصينية المصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ في حوض طلاء شبكي واشطفها بماء DI.
- اقطع الورق النشاف الأصغر قليلا من شبكة / صينية الفولاذ المقاوم للصدأ وضعه أعلى المنصة ، مغمورا في ماء DI.
ملاحظة: الورق النشاف أصغر قليلا من المنصة لتمكين الحركة والمناولة. - انقل الشبكات التي تم تنظيفها برفق بحيث يكون جانب الفيلم المزخرف متجها لأعلى أعلى الورق النشاف. من المحتمل أن تكون الشبكات كارهة للماء ، لذا اغمر الشبكات في الماء عموديا أو قد تنحني بسبب توتر الماء. ضع الشبكات في مصفوفة مربعة بحيث تكون قريبة من بعضها البعض قدر الإمكان ، ولكن لا تتداخل (الشكل 2C).
- الشبكات جاهزة الآن للطلاء بطبقة أحادية من الجرافين. املأ حوض طلاء الشبكة بمزيد من ماء DI بحيث يكون سطح الماء 5 مم على الأقل فوق الشبكات.
10. نقل الجرافين إلى الشبكات
- استخرج بعناية فيلم MMA / الجرافين من الطبق المتبلور باستخدام غطاء نظيف عن طريق خفض انزلاق الغطاء ببطء في الحوض بزاوية ، على بعد مسافة من فيلم الجرافين. ضع غطاء الغطاء أسفل ورقة الجرافين-MMA بحيث تكون حواف الورقة وغطاء الغطاء متوازيين ، ثم ارفع غطاء الغطاء عموديا خارج الماء ، مع إحضار فيلم MMA / الجرافين معه.
- انقل فيلم MMA / الجرافين إلى الحوض الصغير عن طريق خفض غطاء الغطاء في الماء بزاوية ~ 45 درجة ، بحيث ينفصل فيلم MMA / الجرافين عن غطاء الغطاء ويطفو على سطح الماء.
- ضع فيلم MMA / الجرافين مباشرة فوق الشبكات قبل خفض مستوى الماء. استخدم ماصة باستور الزجاجية التي تم صهر طرفها لإغلاق الفتحة للتعامل بعناية مع موضع فيلم MMA / الجرافين.
- اخفض مستوى الماء ببطء باستخدام المحقنة ، عند حوالي 1.25 مل / دقيقة بحيث يغطي فيلم MMA / الجرافين أسطح الشبكة بالكامل أثناء هبوطه على ورق الترشيح
ملاحظة: قد يكون من الضروري إجراء مزيد من التلاعب بورقة الجرافين-MMA للحفاظ على موقعها فوق الشبكات مع انخفاض مستوى الماء. - استخدم زوجا من الملقط النظيف والجاف لرفع الورق النشاف الذي يثبت الشبكات إلى طبق بتري نظيف وجاف وخالي من الغبار ، أو انقل منصة الفولاذ المقاوم للصدأ بالكامل.
- جفف شبكات MMA / الجرافين في الهواء لمدة 30 دقيقة على الأقل تحت غطاء الدخان. حافظ على الشبكات مغطاة بورق الألمنيوم أو غطاء لمنع أي تلوث من جزيئات الغبار.
- انقل الشبكات إلى حاضنة واخبز الشبكات في حاضنة 65 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- قم بإزالة الشبكات من الحاضنة واتركها مغطاة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة لتبريد الشبكات إلى درجة حرارة الغرفة.
11. إزالة MMA وتنظيف الشبكات
ملاحظة: يجب غسل MMA جيدا في الأسيتون لمنع أي MMA متبقي على الشبكات المطلية بالجرافين.
- في غطاء الدخان ، قم بإعداد طبقين متبلورين يحتويان على 200 مل من الأسيتون وطبق تبلور واحد يحتوي على 200 مل من الأيزوبروبانول (IPA) في درجة حرارة الغرفة. قم بتغطية الأطباق المتبلورة بورق الألمنيوم لتقليل تبخر المذيبات العضوية.
تنبيه: ارتد معدات الوقاية الشخصية عند التعامل مع الأسيتون لأنه يمكن أن يسبب تهيج الجلد ويمكن أن يكون ضارا إذا تم استنشاقه. - ضع قاعدة كتلة حامل شبكة TEM المثبتة في الجزء السفلي من طبق التبلور الأول الذي يحتوي على 200 مل من الأسيتون الطازج.
- انقل كل شبكة على حدة من ورق النشاف إلى بئر في كتلة حامل الشبكة ، مع التأكد من أن جانب MMA متجها لأعلى. غطي طبق التبلور بورق القصدير ، ضعيه على شاكر مداري ، ورجيه برفق لمدة 30 دقيقة.
- ضع الغطاء المعدني على كتلة حامل الشبكة ، والتي ستؤمن الشبكات أثناء النقل إلى طبق التبلور التالي. ارفع كتلة حامل الشبكة بعناية من طبق التبلور بشوكة مثنية وملاقط طويلة وضعها في قاع طبق التبلور الثاني الذي يحتوي على 200 مل من الأسيتون الطازج. قم بإزالة الغطاء من كتلة حامل الشبكة ورج برفق على شاكر مداري لمدة 30 دقيقة.
- ضع الغطاء على كتلة حامل الشبكة وانقله إلى طبق التبلور الذي يحتوي على 200 مل من محلول IPA لتنظيف بقايا الأسيتون. قم بإزالة الغطاء من كتلة حامل الشبكة ورجه برفق لمدة 20 دقيقة.
- انقل الشبكات إلى طبق بتري زجاجي صغير مغطى بورق النشاف وجفف الشبكات بالهواء لمدة 10 دقائق على الأقل. حافظ على تغطية الشبكات بغطاء لمنع أي تلوث من جزيئات الغبار.
- الشبكات جاهزة للاستخدام أو نقلها إلى صندوق شبكي ملفوف بورق الألمنيوم داخل مجفف مفرغ.
ملاحظة: يمكن أن يؤدي تخزين شبكات الجرافين داخل مجفف مفرغ إلى منع تلوث الجسيمات الكارهة للماء من الظروف المحيطة. يمكن تخزين هذه الشبكات لمدة تصل إلى عدة أشهر قبل الاستخدام27.
12. جعل شبكات الجرافين محبة للماء مع معالجة الأشعة فوق البنفسجية / الأوزون
ملاحظة: الجرافين كاره للماء للغاية ، وهو غير متوافق مع تحضير عينة cryoEM ، لأن نهج الغطس باللطخة يتطلب سطحا محبا للماء يمكن أن تنتشر عليه قطرة من العينة بالتساوي. بينما يمكن تكوين أجهزة تفريغ التوهج التقليدية لنبض البلازما بلطف لجعل سطح الجرافين محبا للماء ، تميل هذه الأجهزة إلى تدمير طبقة الجرافين الرقيقة أحادية. وقد تبين سابقا أنه يمكن استخدام منظف الأشعة فوق البنفسجية / الأوزون لأكسجة سطح الجرافين25 جزئيا ، مما يجعله محبا للماء لإعداد عينة cryoEM دون الإضرار بالطبقة الأحادية.
- في حالة استخدام نظام الأشعة فوق البنفسجية / الأوزون الذي يتطلب التحضير ، قم بتشغيل النظام وتجهيز المصباح لمدة 10 دقائق (في هذه الخطوة ، تأكد من عدم تعرض أي شبكات). أثناء تحضير منظف الأشعة فوق البنفسجية / الأوزون ، قم بإزالة الشبكات من مجفف الفراغ وانقلها إلى غطاء نظيف.
- عندما يكون نظام الأشعة فوق البنفسجية / الأوزون جاهزا ، ضع غطاء الغطاء الذي يحتوي على الشبكات بحيث يكون جانب الجرافين متجها لأعلى في منظف الأشعة فوق البنفسجية / الأوزون ، وقم بتعريض الشبكات لغاز الأوزون لمدة 4 دقائق.
- بعد التعرض للأوزون ، استخدم الشبكات على الفور لإعداد عينة cryoEM.
ملاحظة: في حالة استخدام نظام الأشعة فوق البنفسجية / الأوزون الذي يتطلب التحضير ، يجب وضع الشبكات في المنظف فور تحضير المصباح لمدة 10 دقائق ، أو سيكون باردا جدا لإنتاج غاز الأوزون الكافي لأكسجة الجرافين لإعداد العينة. لا تعرض الشبكات لغاز الأوزون لأكثر من 6 دقائق ، لأنه سيدمر طبقة الجرافين.
Representative Results
سيؤدي التنفيذ الناجح لبروتوكول تصنيع شبكة الجرافين الموصوف هنا إلى شبكات EM مغلفة بالكامل بطبقة أحادية واحدة من الجرافين. يمكن التحقق من تغطية الجرافين للشبكات باستخدام أي TEM. نظرا لأن الطبقة الأحادية من الجرافين النظيف غير مرئية تقريبا في TEM ، يجب على المرء فحصها باستخدام وضع الحيود للمجهر ومراقبة بقع Bragg المقابلة للتنظيم السداسي لذرات الكربون التي تشكل الجرافين (الشكل 3A). من الطبيعي أن نلاحظ أحيانا بعض تجاعيد الجرافين أحادي الطبقة ، والتي يتم إدخالها أثناء طلاء MMA (الشكل 3 ب). يمكن للمرء أيضا التحقق من مستوى التلوث الموجود على الجرافين من خلال الحصول على صورة تكبير عالية في وسط أحد الثقوب المغطاة بالجرافين (الشكل 3C). إذا تم الحصول عليها باستخدام كاشف عالي الدقة ، فيجب أن يحتوي تحويل فورييه لهذه الصورة على بقع براغ المقابلة لتباعد الكربون والكربون عند 2.14 Å (الشكل 4C). لا تنتج الطبقة الأحادية من ذرات الكربون تشتتا إلكترونيا كافيا لتوليد تباين الطور ، وبالتالي فإن صورة الجرافين النظيف لن تقدم حلقات Thon المرتبطة بوظيفة نقل التباين في تحويل فورييه للصورة. ومع ذلك ، من الصعب جدا منع تلوث شبكات الجرافين بعد إنتاجها ، كما أن الغسيل غير الكافي لشبكات EM أو إزالة MMA بعد طلاء الجرافين سيؤدي إلى ملوثات ملحوظة على الشبكات التي يمكن رؤيتها في صور الفضاء الحقيقي (الشكل 3C). كما هو موضح في الشكل 4 ، فإن شبكات الجرافين لها تأثير مركز على العينة ، كما لوحظ عند مقارنة 0.5 مجم / مل من الأبوفيريتين يتم تطبيقه على شبكات الذهب الهولي مع (الشكل 4 أ) وبدون دعم الجرافين (الشكل 4 ب). تم وصف بروتوكولات تصنيع الجرافين المماثلة سابقا لحل هياكل cryoEM للبروتينات مثل apoferritin بدقةعالية 25,27.
الشكل 1: رسم تخطيطي لتحضير شبكات cryoEM المطلية بالجرافين. يتم توضيح الخطوات الرئيسية في عملية تصنيع شبكة الجرافين. الاختصارات: cryoEM = المجهر الإلكتروني المبرد. MMA = ميثيل ميثاكريلات. APS = بيرسلفات الأمونيوم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: المواد المطلوبة لصنع شبكات الجرافين . (أ) يتم تمييز المواد اللازمة لطلاء شبكات cryo-EM وفقا لذلك. ( ب) منظر عن قرب للطلاء مع ورقة من الجرافين / النحاس مثبتة على ورق نشاف على شريحة زجاجية. يمكن تجميع طلاء الدوران عن طريق شراء قطع غيار من متجر كمبيوتر / جهاز كمبيوتر محلي. (ج) منظر عن قرب لحوض طلاء الشبكة المتصل بحقنة يمكن استخدامها للتحكم في مستوى الماء. يتم وضع الشبكات فوق ورقة نشاف على شبكة من الفولاذ المقاوم للصدأ. يساعد الورق النشاف في مناورة موقع الشبكات بحيث يمكن مطابقة ورقة الجرافين معها. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: صورة نمط حيود تمثيلي وصور حقل ساطع لشبكة جرافين تظهر التجاعيد أو تلوث MMA . (أ) ستظهر شبكات EM المغطاة بطبقة أحادية من الجرافين قمم براغ المقابلة للشبكة السداسية للجرافين عند تصويرها في TEM في وضع الحيود. قمة Bragg المقابلة لتباعد الكربون والكربون 2.14 Å محاطة بدائرة ويشار إليها بسهم. (ب) صورة المجال الساطع لشبكة جرافين أحادية الطبقة بها بعض التجاعيد (يشار إليها بسهم) في طبقة الجرافين الأحادية. (ج) صورة حقل ساطع للجرافين أحادي الطبقة مع تلوث MMA (يشار إليه بسهم). أشرطة المقياس = 100 نانومتر (B ، C). الاختصارات: EM = المجهر الإلكتروني. MMA = ميثيل ميثاكريلات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: أبوفيريتين على شبكات الذهب المغطاة بالجرافين: (أ) صورة مجهرية بالتبريد EM ل 0.5 ملغم / مل أبوفيريتين على شبكات الذهب المغطاة بالجرافين. (ب) يكون الأبوفيريتين المصور بنفس التركيز مرئيا بتركيز أقل بكثير عند تحضيره باستخدام شبكات ذهبية هولية بدون جرافين. (C) FFT للصورة المجهرية cryoEM من 0.5 ملغ / مل من الأبوفيريتين على شبكات الذهب المغطاة بالجرافين ، مع قمم Bragg المقابلة لشبكة الجرافين السداسية المشار إليها. أشرطة المقياس = 100 نانومتر (أ ، ب). الاختصارات: cryoEM = المجهر الإلكتروني المبرد. FFT = تحويل فورييه السريع. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
يعد الحفاظ على العينات البيولوجية في طبقة رقيقة من الجليد الزجاجي خطوة مهمة للغاية لتحديد بنية cryoEM عالية الدقة. ومع ذلك ، غالبا ما يواجه الباحثون مشاكل ناشئة عن التفاعلات مع AWI ، والتي تقدم الاتجاه المفضل ، والتفكيك المعقد ، والتمسخ ، والتجميع. علاوة على ذلك ، لا يمكن دائما تركيز العينات بشكل كاف لملء الجليد الرقيق المعلق عبر ثقوب فيلم محصن. طورت العديد من المجموعات البحثية طرقا لطلاء شبكات EM بطبقة أحادية من الجرافين للمساعدة في التغلب على بعض هذه القيود24،25،26،27،28،29،30 ، وقد تم استخدام شبكات الجرافين بنجاح كبير. هنا ، نقدم إرشادات خطوة بخطوة لإعداد دفعات شبكات الجرافين بشكل فعال داخل الشركة وفحص جودة شبكات الجرافين بواسطة TEM. ونشدد على أنه ينبغي توخي الحذر بشكل خاص خلال بعض الخطوات الحاسمة، التي نوجزها أدناه.
الجرافين لديه ميل قوي لجذب الملوثات المحمولة جوا. لذلك ، أثناء عملية تصنيع شبكة الجرافين ، من المهم التأكد من أن جميع الأدوات التي تتلامس مع ورقة الجرافين / النحاس أو الشبكات نظيفة وخالية من الغبار. يمكن تنظيف أغطية الزجاج المستخدمة لنقل الجرافين عن طريق الشطف بالإيثانول وماء DI أو باستخدام منفضة الهواء. ينصح أيضا بالعمل تحت غطاء دخان والحفاظ على صفائح وشبكات الجرافين مغطاة بورق أو لوحة زجاجية نظيفة في جميع الأوقات. قد يمنع الغبار أو الملوثات الموجودة على الشبكات الجرافين من الالتصاق التام بشبكات EM. عند التعامل مع الشبكات المطلية بالجرافين أو الجرافين ، من المهم أن تكون مؤرضة كهربائيا لمنع تلف فيلم الجرافين من التفريغ الساكن. يمكن تجنب التفريغ الساكن باستخدام حزام تأريض المعصم ، ولمس جسم معدني مؤرض في كل مرة يتم فيها التعامل مع شبكات الجرافين أو الجرافين ، و / أو عدم ارتداء قفاز على اليد التي تحمل الملقط24.
نظرا لأن الطبقة الأحادية من الجرافين رقيقة جدا (عرض ذرة الكربون) ، فمن المهم دعم الجرافين بطبقة عضوية مثل MMA أو poly-MMA (PMMA) أثناء نقل الجرافين إلى الشبكات. PMMA هي المادة الأكثر استخداما لنقل الجرافين. ومع ذلك ، فإن PMMA له تقارب قوي مع الجرافين ويمكن أن يؤدي في كثير من الأحيان إلى تلوث البوليمر على فيلم الجرافين. يستخدم MMA في هذا البروتوكول ، لأنه يترك تلوثا أقلمتبقيا 25. ومع ذلك ، فإن كلا من PMMA و MMA لهما عيب في تكوين التجاعيد والشقوق التي يمكن ملاحظتها في بعض مناطق فيلم الجرافين (الشكل 3 ب). قد يكون من الصعب تجنب هذه التجاعيد لأنها تحدث عادة أثناء نمو الجرافين بطريقة الأمراض القلبية الوعائية31. تم تطوير طريقة مؤخرا لزراعة الجرافين المسطح للغاية بدون تجاعيد ، حيث يتم استبدال رقائق النحاس برقاقة Cu (111) / الياقوت كركيزة نمو32.
بناء على تجربتنا ، من الأفضل شراء صفائح الجرافين / النحاس ودعم الجرافين باستخدام MMA داخليا بدلا من شراء صفائح الجرافين المغطاة بالبوليمر من الشركات المصنعة ، والتي تصبح هشة بعد النقش على النحاس ويصعب التعامل معها في الخطوات اللاحقة. يمكن بناء طلاء الدوران الذي استخدمناه لطلاء MMA بثمن بخس باستخدام أجزاء من متجر كمبيوتر / جهاز كمبيوتر محلي ، كما هو موضح سابقا25.
أثناء خطوة طلاء MMA ، من المهم تغطية كامل سطح الجرافين على لوح Cu-graphene باستخدام MMA. بعد حفر النحاس بعيدا ، سيصبح MMA-graphene شبه شفاف ، وستبدو المناطق التي تفتقر إلى تغطية MMA وكأنها ثقوب فارغة. لمنع طلاء MMA على الجانب النحاسي ، من المهم وضع قطعة صغيرة من الورق النشاف تحتها أثناء الطلاء بحيث تمتص أي MMA زائد ينبثق من فيلم CVD.
بعد النقش والشطف ، تكون ورقة MMA / الجرافين جاهزة للنقل إلى شبكات EM باستخدام نظام حوض تجاري أو محلي الصنع مع حقنة أو مضخة تمعجية للتحكم في مستوى الماء. قبل خطوة النقل ، من المهم شطف الشبكات جيدا في الحمامات المتتالية من الكلوروفورم والأسيتون و IPA. يساعد خبز الشبكات المطلية بالجرافين عند 65 درجة مئوية في الحفاظ على سلامة الجرافين ويعزز امتصاص الجرافين للشبكات. أخيرا ، لمنع تلوث MMA على الشبكات ، من المهم إزالة MMA تماما في حمام الأسيتون وتنظيف الشبكات في IPA. سيتم ملاحظة أي بقايا MMA غير مغسولة على شبكات EM وتقليل نسبة الإشارة إلى الضوضاء للصور (الشكل 3C). يمكن تكرار عملية غسيل الأسيتون-IPA لتنظيف أسطح الجرافين بشكل أكبر.
لجعل شبكات الجرافين محبة للماء ، قمنا بتعريض الشبكات للأشعة فوق البنفسجية / الأوزون. قد تتطلب النماذج المختلفة لمنظفات الأشعة فوق البنفسجية / الأوزون تحسينا لتزويد طبقة الجرافين بالأكسجين بشكل كاف لإعداد عينة cryoEM دون إتلاف الجرافين. بغض النظر عن النظام ، من الأهمية بمكان استخدام هذه الشبكات لتطبيق عينة cryoEM مباشرة بعد معالجة الأشعة فوق البنفسجية / الأوزون. تم وصف الطرق البديلة لجعل شبكات الجرافين محبة للماء في دراسات أخرى33،34.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.
Acknowledgments
نشكر الدكتور شياو فان على المناقشات المفيدة أثناء إنشاء هذه الأساليب في Scripps Research. تم دعم B.B. من خلال زمالة أبحاث ما بعد الدكتوراه من مؤسسة هيويت للأبحاث الطبية. يتم دعم WC من قبل زمالة ما قبل الدكتوراه في مؤسسة العلوم الوطنية. يتم دعم D.E.P من خلال منحة المعاهد الوطنية للصحة (NIH) NS095892 إلى GCL تم دعم هذا المشروع أيضا من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة GM142196 و GM143805 و S10OD032467 إلى G.C.L.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70% EtOH | Pharmco (190 pf EtOH) | 241000190CSGL | |
| Acetone | Sigma Aldrich | 650501-4L | |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma Aldrich | 215589-500g | Hazardous; use extreme caution |
| Chloroform | Sigma Aldrich | C2432-1L | |
| Clamping TEM Grid Holder Block for 45 Grids | PELCO | 16830-45 | |
| Computer fan | Amazon (Noctua) | B07CG2PGY6 | |
| Cover slip | Bellco Glass | 1203J71 | Standard cover slips |
| Crystallizing dish | Pyrex | 3140-100 | |
| Electronics duster | Falcon Safety Products | 75-37-6 | |
| Falcon Dust-off Air Duster | Staples | N/A | |
| Filter papers | Whatman | 1001-055 | |
| Fine tip tweezer | Dumont | 0508-L4-PO | |
| Flask | Pyrex | 4980-500 | |
| Fork | Supermarket | N/A | |
| Glass pasteur pipette | VWR | 14672-608 | |
| Graphene/Cu | Graphenea | N/A | CVD monolayer graphene cu |
| Grid Coating Trough | Ladd Research Industries | 10840 | Fragile |
| Isopropanol | Fisher Scientific | 67-63-0 | |
| Kapton Tape | Amazon (MYJOR) | MY-RZY001 | Polyimide tape |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666 | |
| Long twzeer | Cole Parmer Essentials | UX-07387-15 | |
| Metal grid holder | Ted Pella | 16820-81 | |
| MMA(8.5)MMA EL 6 | KAYAKU Advanced Materials | M31006 0500L 1GL | Flammable |
| Model 10 Lab Oven | Quincy Lab, Inc. | FO19013 | |
| Petri dish | Pyrex | 3610-102 | |
| Plasma cleaner (Solarus 950) | Gatan, Inc. | N/A | |
| Scissors | Fiskars | 194813-1010 | |
| Standard Analog Orbital Shaker | VWR | 89032-088 | |
| UltrAuFoil R1.2/1.3 - Au300 | Quantifoil | N/A | Holey gold grids |
| Ultraviolet Ozone Cleaning Systems | UVOCS | model T10X10/OES |
References
- Li, X., Zheng, S. Q., Egami, K., Agard, D. A., Cheng, Y. Influence of electron dose rate on electron counting images recorded with the K2 camera. Journal of Structural Biology. 184 (2), 251-260 (2013).
- Tang, G., et al. EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).
- Zivanov, J., et al. New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3. eLife. 7, 1-22 (2018).
- Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. CryoSPARC: Algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
- Grigorieff, N., Harrison, S. C. Near-atomic resolution reconstructions of icosahedral viruses from electron cryo-microscopy. Current Opinion in Structural Biology. 21 (2), 265-273 (2011).
- Nakane, T., et al. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).
- Zhang, K., Pintilie, G. D., Li, S., Schmid, M. F., Chiu, W. Resolving individual atoms of protein complex by cryo-electron microscopy. Cell Research. 30 (12), 1136-1139 (2020).
- Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM. Nature. 587 (7832), 157-161 (2020).
- Schultz, P.
- Nguyen, H. P. M., McGuire, K. L., Cook, B. D., Herzik, M. A. Manual blot-and-plunge freezing of biological specimens for single-particle cryogenic electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. 2022 (180), 1-16 (2022).
- Glaeser, R. M. Proteins, interfaces, and cryo-em grids. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 25 (3), 289-313 (2016).
- Glaeser, R. M., Han, B. -G. Opinion: hazards faced by macromolecules when confined to thin aqueous films. Biophysics Reports. 3 (1-3), 1-7 (2017).
- Han, B. G., Watson, Z., Cate, J. H. D., Glaeser, R. M. Monolayer-crystal streptavidin support films provide an internal standard of cryo-EM image quality. Journal of Structural Biology. 200 (3), 307-313 (2017).
- Noble, A. J., et al. Routine single particle CryoEM sample and grid characterization by tomography. eLife. 7, 1-42 (2018).
- Drulyte, I., et al. Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 74 (6), 560-571 (2018).
- Liu, N., Wang, H. W. Better cryo-EM specimen preparation: how to deal with the air-water interface. Journal of Molecular Biology. 435 (9), 167926 (2022).
- Noble, A. J., et al. Reducing effects of particle adsorption to the air-water interface in cryo-EM. Nature Methods. 15 (10), 793-795 (2018).
- Palovcak, E., et al. A simple and robust procedure for preparing graphene-oxide cryo-EM grids. Journal of Structural Biology. 204 (1), 80-84 (2018).
- Patel, A., Toso, D., Litvak, A., Nogales, E. Efficient graphene oxide coating improves cryo-EM sample preparation and data collection from tilted grids. bioRxiv. , (2021).
- Marr, C. R., Benlekbir, S., Rubinstein, J. L. Fabrication of carbon films with ~500nm holes for cryo-EM with a direct detector device. Journal of Structural Biology. 185 (1), 42-47 (2014).
- Pantelic, R. S., Meyer, J. C., Kaiser, U., Baumeister, W., Plitzko, J. M. Graphene oxide: A substrate for optimizing preparations of frozen-hydrated samples. Journal of Structural Biology. 170 (1), 152-156 (2010).
- Pantelic, R. S., et al. Graphene: substrate preparation and introduction. Journal of Structural Biology. 174 (1), 234-238 (2011).
- Russo, C. J., Passmore, L. A. Progress towards an optimal specimen support for electron cryomicroscopy. Current Opinion in Structural Biology. 37, 81-89 (2016).
- Passmore, L. A., Russo, C. J. Specimen preparation for high-resolution cryo-EM. Methods in Enzymology. 579, 51-86 (2016).
- Han, Y., et al. High-yield monolayer graphene grids for near-atomic resolution cryoelectron microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (2), 1009-1014 (2020).
- Zheng, L., et al. Robust ultraclean atomically thin membranes for atomic-resolution electron microscopy. Nature Communications. 11 (1), 541 (2020).
- Ahn, E., Kim, B., Cho, U. -S. Batch production of high-quality graphene grids for cryo-EM: cryo-EM structure of Methylococcus capsulatus soluble methane monooxygenase hydroxylase. bioRxiv. (Cvd), (2021).
- Naydenova, K., Peet, M. J., Russo, C. J. Multifunctional graphene supports for electron cryomicroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (24), 11718-11724 (2019).
- Fan, H., Sun, F. Developing graphene grids for cryoelectron microscopy. Frontiers in Molecular Biosciences. 9, 937253 (2022).
- D'Imprima, E., et al. Protein denaturation at the air-water interface and how to prevent it. eLife. 8, e42747 (2019).
- Zhang, X., et al. Evolution of copper step beams during graphene growth by CVD method. Applied Surface Science. 610, 155518 (2023).
- Zheng, L., et al. Uniform thin ice on ultraflat graphene for high-resolution cryo-EM. Nature Methods. 20 (1), 123-130 (2023).
- Fujita, J., et al. Epoxidized graphene grid for highly efficient high-resolution cryoEM structural analysis. Scientific Reports. 13, 2279 (2023).
- Lu, Y., et al. Functionalized graphene grids with various charges for single-particle cryo-EM. Nature Communications. 13, 6718 (2022).
