Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

क्रायोइलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए मोनोलेयर ग्राफीन-लेपित ग्रिड का निर्माण

Published: September 8, 2023 doi: 10.3791/65702
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Department of Structural and Computational Biology, Scripps Research
* These authors contributed equally

Summary

यहां, हम इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी ग्रिड के लिए ग्राफीन के एकल मोनोलेयर को लागू करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं और क्रायोईएम संरचना निर्धारण में उपयोग के लिए उन्हें कैसे तैयार करें।

Abstract

क्रायोजेनिक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायोईएम) मैक्रोमोलेक्यूलर कॉम्प्लेक्स की परमाणु संरचना की जांच के लिए एक शक्तिशाली तकनीक के रूप में उभरा है। क्रायोईएम के लिए नमूना तैयार करने के लिए विट्रस बर्फ की एक पतली परत में नमूनों को संरक्षित करने की आवश्यकता होती है, जो आमतौर पर एक फेनेस्टेड सपोर्ट फिल्म के छेद के भीतर निलंबित होती है। हालांकि, क्रायोईएम अध्ययनों के लिए आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले सभी नमूना तैयारी दृष्टिकोण नमूने को वायु-जल इंटरफ़ेस में उजागर करते हैं, जिससे नमूने पर एक मजबूत हाइड्रोफोबिक प्रभाव पेश होता है जिसके परिणामस्वरूप अक्सर विकृतीकरण, एकत्रीकरण और जटिल पृथक्करण होता है। इसके अलावा, नमूना और वायु-जल इंटरफ़ेस के क्षेत्रों के बीच पसंदीदा हाइड्रोफोबिक इंटरैक्शन मैक्रोमोलेक्यूल द्वारा अपनाए गए झुकाव को प्रभावित करते हैं, जिसके परिणामस्वरूप अनिसोट्रोपिक दिशात्मक संकल्प के साथ 3 डी पुनर्निर्माण होता है।

ग्राफीन के एक मोनोलेयर में क्रायोईएम नमूनों के सोखने को पृष्ठभूमि शोर की शुरूआत को कम करते हुए वायु-जल इंटरफ़ेस के साथ बातचीत को कम करने में मदद करने के लिए दिखाया गया है। ग्राफीन समर्थन क्रायोईएम इमेजिंग के लिए आवश्यक प्रोटीन की आवश्यक एकाग्रता को काफी हद तक कम करने का लाभ भी प्रदान करता है। इन समर्थनों के फायदों के बावजूद, वाणिज्यिक विकल्पों के निषेधात्मक खर्च और बड़े पैमाने पर इन-हाउस उत्पादन से जुड़ी चुनौतियों के कारण क्रायोईएम समुदाय द्वारा ग्राफीन-लेपित ग्रिड का व्यापक रूप से उपयोग नहीं किया जाता है। यह पेपर क्रायोईएम ग्रिड के बैच तैयार करने के लिए एक कुशल विधि का वर्णन करता है जिसमें मोनोलेयर ग्राफीन का लगभग पूर्ण कवरेज होता है।

Introduction

एकल-कण क्रायोजेनिक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायोईएम) एक तेजी से लागू तकनीक है जिसका उपयोग बायोमैक्रोमोलेक्यूल्स की 3 डी संरचनाओं की जांच के लिए किया जाता है। पिछले एक दशक में इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप ऑप्टिक्स, प्रत्यक्ष इलेक्ट्रॉन पहचान1, और कंप्यूटर एल्गोरिदम 2,3,4 में तकनीकी प्रगति ने क्रायोईएम उपयोगकर्ताओं को जैव रासायनिक रूप से स्थिर मैक्रोमोलेक्यूलर कॉम्प्लेक्स की संरचनाओं को निकट-परमाणु रिज़ॉल्यूशन 5,6,7,8 तक निर्धारित करने में सक्षम बनाया है।. इन प्रगति के बावजूद, क्रायोईएम इमेजिंग के लिए नमूनों को संरक्षित करने के लिए उल्लेखनीय बाधाएं बनी हुई हैं, जो अधिकांश जैविक नमूनों को इस तरह के उच्च रिज़ॉल्यूशन तक हल करने से रोकती हैं।

उच्च-रिज़ॉल्यूशन क्रायोईएम विश्लेषण के लिए नमूना तैयारी में मैक्रोमोलेक्यूल्स को फंसाना शामिल है जो विट्रीफाइड बर्फ की एक पतली परत के भीतर झुकाव की एक विस्तृत श्रृंखला में समान रूप से वितरित होते हैं। फ्रीजिंग के "ब्लॉट एंड प्लांक" तरीके क्रायोईएम अध्ययन 9,10 के लिए ग्रिड पर जैविक नमूनों की पतली फिल्मों को उत्पन्न करने के लिए नियोजित सबसे व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले तरीके हैं। इन विधियों में एक ईएम ग्रिड में नमूना समाधान के कुछ माइक्रोलीटर को लागू करना शामिल है जिसमें एक फेनेस्टेड फिल्म होती है जिसे हाइड्रोफिलिक बनाया गया है और बाद में ग्रिड को तरल ईथेन या ईथेन-प्रोपेन मिश्रण9 के क्रायोजेन में तेजी से डुबोने से पहले फिल्टर पेपर के साथ अधिकांश नमूने को सोख लेना शामिल है।

जबकि इस विधि का उपयोग जैविक नमूनों की एक विस्तृत श्रृंखला की संरचनाओं को निर्धारित करने के लिए सफलतापूर्वक किया गया है, सभी आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले क्रायोईएम नमूना तैयारी विधियां नमूनों को हाइड्रोफोबिक एयर-वाटर इंटरफेस (एडब्ल्यूआई) में उजागर करती हैं, जो अक्सर उन मुद्दों का परिचय देती हैं जो उच्च-रिज़ॉल्यूशन संरचना निर्धारण को सीमित करते हैं। यह स्थापित किया गया है कि जैविक नमूनों में एडब्ल्यूआई के संपर्क में आने पर प्रकृति को नष्ट करने की उच्च प्रवृत्ति होती है, जिससे जटिल एकत्रीकरण और विघटन 11,12,13,14 हो सकता है। इसके अलावा, जैविक नमूनों की सतहों पर हाइड्रोफोबिक पैच कणों को बर्फ12 में पसंदीदा झुकाव अपनाने का कारण बनता है। कई परिदृश्यों में, नमूने का एक एकल हाइड्रोफोबिक क्षेत्र सभी कणों को बर्फ में एक विलक्षण अभिविन्यास अपनाने के लिए मजबूर करता है, जिससे एक विश्वसनीय पुनर्निर्माण उत्पन्न करने की क्षमता समाप्त हो जाती है। एडब्ल्यूआई के साथ मुद्दों के अलावा, नमूने फिल्म की फेनेस्टेड परत की सतह के लिए एक आत्मीयता प्रदर्शित कर सकते हैं, छेद15 के भीतर बर्फ में निलंबित कणों की संख्या को सीमित कर सकते हैं।

एडब्ल्यूआई या फिल्म16,17 के साथ बातचीत से उत्पन्न होने वाले इन मुद्दों को कम करने के लिए कई पद्धतिऔर तकनीकी समाधान विकसित किए गए हैं। एक लोकप्रिय दृष्टिकोण ईएम ग्रिड की फेनेस्टेड फिल्म को अनाकार कार्बन की एक पतली (दसियों नैनोमीटर) परत के साथ कोट करना है। यह कोटिंग छिद्रों में एक निरंतर सतह प्रदान करती है जिसमें कण सोख सकते हैं, जिसमें एडब्ल्यूआई15,18,19,20 के साथ बातचीत से नमूने को आंशिक रूप से परिरक्षित करने का लाभ होता है। हालांकि, अतिरिक्त कार्बन परत छवि वाले क्षेत्रों में पृष्ठभूमि संकेत की मात्रा को बढ़ाती है, शोर पेश करती है जो प्राप्य संकल्प से समझौता कर सकती है, खासकर छोटे (<150 केडीए) नमूनों के लिए। हाल के वर्षों में, क्रायोईएम ग्रिड पर सहायक फिल्मों का उत्पादन करने के लिए ग्राफीन ऑक्साइड (जीओ) फ्लेक्स का उपयोग पारंपरिक अनाकार कार्बन पर फायदे दिखाया गया है। जीओ फ्लेक्स ग्रेफाइट परतों के ऑक्सीकरण के माध्यम से उत्पन्न होते हैं, जिसके परिणामस्वरूप मोनोलेयर ग्रेफाइट की छद्म-क्रिस्टलीय चादरें होती हैं जो सतहों और किनारों पर कार्बोक्सिल, हाइड्रॉक्सिल और एपॉक्सी समूहों के रूप में उनकी पर्याप्त ऑक्सीजन सामग्री के कारण हाइड्रोफिलिक होती हैं। जलीय निलंबन में वाणिज्यिक जीओ फ्लेक्स सस्ती हैं, और ईएम ग्रिड18,21 पर जीओ फ्लेक्स लागू करने के लिए कई प्रकाशित तरीके हैं। हालांकि, इन विधियों के परिणामस्वरूप अक्सर ग्रिड होते हैं जो केवल आंशिक रूप से जीओ फ्लेक्स के साथ कवर होते हैं, साथ ही ऐसे क्षेत्र जिनमें जीओ फ्लेक्स की कई परतें होती हैं। इसके अलावा, जीओ फ्लेक्स क्रायोईएम छवियों के लिए एक ध्यान देने योग्य पृष्ठभूमि संकेत का योगदान करते हैं जो पतली अनाकार कार्बन22,23 के साथ देखे जाने के करीब है।

प्राचीन मोनोलेयर ग्राफीन, जिसमें कार्बन परमाणुओं की एक 2 डी क्रिस्टलीय सरणी होती है, जीओ से अलग है क्योंकि यह इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप में चरण कंट्रास्ट का उत्पादन नहीं करता है। इस प्रकार मोनोलेयर ग्राफीन का उपयोग इमेजिंग जैविक नमूनों के लिए एक अदृश्य समर्थन परत उत्पन्न करने के लिए किया जा सकता है। मोनोलेयर ग्राफीन भी जीओ की तुलना में मजबूत है और इसे ईएम ग्रिड पर एकल मोनोलेयर के रूप में लागू किया जा सकता है, और ग्राफीन-लेपित ईएम ग्रिड के निर्माण में हालिया प्रगति ने24,25,26,27,28,29,30 में उच्च कवरेज मोनोलेयर ग्राफीन ग्रिड तैयार करना संभव बना दिया है।. हालांकि, क्रायोईएम संरचना निर्धारण के लिए ग्राफीन-लेपित ग्रिड का उपयोग करने के लाभों के बावजूद, वाणिज्यिक विकल्पों के निषेधात्मक खर्च और इन-हाउस उत्पादन की जटिलता के कारण उनका व्यापक रूप से उपयोग नहीं किया जाता है। यहां, हम जैविक नमूनों के क्रायोईएम संरचना निर्धारण के लिए ग्राफीन के मोनोलेयर के साथ कवर किए गए ईएम ग्रिड को प्रभावी ढंग से उत्पादन करने के लिए एक चरण-दर-चरण मार्गदर्शिका का वर्णन करते हैं (चित्रा 1)। इस विस्तृत प्रोटोकॉल का पालन करके, क्रायोईएम शोधकर्ता एक ही दिन में दर्जनों उच्च गुणवत्ता वाले ग्राफीन सपोर्ट ग्रिड तैयार कर सकते हैं। ग्राफीन-लेपित ग्रिड की गुणवत्ता को एलएबी 6 फिलामेंट से लैस कम अंत ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (टीईएम) का उपयोग करके आसानी से जांच की जा सकती है।

Protocol

1. ग्राफीन ग्रिड के निर्माण के लिए आवश्यक सामग्री और सहायक उपकरण की तैयारी

नोट: ग्राफीन आसानी से दूषित हो जाता है, जो ग्राफीन कोटिंग की दक्षता और ग्राफीन ग्रिड की गुणवत्ता को कम करता है; इसलिए, ग्राफीन के संपर्क में आने वाली सभी सामग्रियों को अच्छी तरह से साफ करना महत्वपूर्ण है। सामग्री की तैयारी और सभी चरणों को फ्यूम हुड में किया जाना चाहिए।

  1. आवश्यक सामग्रियों को इकट्ठा करें जिनका उपयोग ग्रेफेन के साथ ग्रिड को कोटिंग के लिए किया जाएगा (चित्रा 2 ए)।
  2. किसी भी धूल, लिंट और तैलीय अवशेषों को हटाने के लिए विआयनीकृत (डीआई) पानी के साथ ग्लासवेयर को कई बार कुल्ला करें।
  3. 75% इथेनॉल के साथ ग्लास कवरलिप्स को साफ करने के लिए डिस्पोजेबल वाइप्स का उपयोग करें और किसी भी दूषित पदार्थों को हटाने के लिए एयर-डस्टर का उपयोग करें।
    नोट: इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले क्लैंपिंग टीईएम ग्रिड होल्डर ब्लॉक में 45 ग्रिड तक हो सकते हैं। ग्राफीन ग्रिड के एक बड़े बैच उत्पादन के लिए, एक बार में 45 ग्रिड या उससे कम तैयार किए जा सकते हैं। हालांकि, प्रयोगशाला में विधि स्थापित होने तक एक छोटे बैच उत्पादन (चार से छह ग्रिड) के साथ शुरू करने की सिफारिश की जाती है।

2. पानी में 0.2 एम अमोनियम परसल्फेट (एपीएस) की तैयारी

नोट: इस एपीएस समाधान का उपयोग बाद के चरण में ग्राफीन / क्यू शीट से कॉपर (सीयू) समर्थन को हटाने के लिए एक एटचंट के रूप में किया जाता है। हमेशा ताजा एपीएस समाधान तैयार करें। पुन: उपयोग किए गए या पुराने समाधान तांबे को प्रभावी ढंग से नहीं चलाएंगे और बाद के चरणों में ग्राफीन पर तांबे के अवशेष छोड़ सकते हैं।

  1. विआयनीकृत पानी (डीआई) पानी के साथ 500 एमएल फ्लास्क को कुल्ला करें, फिर 200 एमएल डीआई पानी जोड़ें और पानी को निकालने के लिए लगभग 1 मिनट के लिए अधिकतम सेटिंग्स का उपयोग करके माइक्रोवेव करें।
  2. 0.2 एम एपीएस के घोल का उत्पादन करने के लिए 200 एमएल डीआई पानी में 9 ग्राम अमोनियम परसल्फेट जोड़ें।
    चेतावनी: एपीएस विषाक्त है, एपीएस को संभालते समय व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई) पहनने की सलाह दी जाती है। एपीएस कचरे का निपटान एक अनुमोदित अपशिष्ट निपटान संयंत्र में करें।
  3. फ्लास्क को फ्यूम हुड के नीचे वैक्यूम स्रोत से जोड़ते समय चुंबकीय हलचल पर एक हलचल बार के साथ घोल को हिलाएं।
    नोट: एपीएस समाधान को डिगैसिंग करने से बुलबुले के गठन को रोकने में मदद मिलेगी, जो चरण 6 में क्यू एचिंग की दक्षता को कम कर सकता है।

3. ब्लोटिंग पेपर के एक टुकड़े के साथ ग्राफीन / तांबे को एक साफ कवरस्लिप में स्थानांतरित करें

नोट: हम एक ग्राफीन आपूर्तिकर्ता से क्यू पर 15 x 15 सेमी रासायनिक वाष्प जमाव (सीवीडी) ग्राफीन फिल्म का उपयोग करते हैं। व्यावसायिक रूप से खरीदे गए मोनोलेयर ग्राफीन / क्यू शीट को वैक्यूम के तहत संग्रहीत किया जाना चाहिए। चूंकि सीवीडी विधि द्वारा सीयू के दोनों किनारों पर ग्राफीन उगाया जाता है, ग्राफीन आपूर्तिकर्ता आम तौर पर गुणवत्ता की जांच करते हैं और उपयोग के लिए बेहतर पक्ष की सिफारिश करते हैं। हम ग्राफीन के इस अनुशंसित पक्ष को "शीर्ष" पक्ष के रूप में संदर्भित करते हैं जबकि दूसरा पक्ष इस प्रोटोकॉल में "पीछे" पक्ष है।

  1. ब्लॉटिंग पेपर के एक टुकड़े को लगभग 20 मिमी x 40 मिमी के आयताकार आकार में काटें। इस ब्लॉटिंग पेपर का उपयोग ग्राफीन / क्यू शीट के लिए पैडिंग के रूप में किया जाता है और ग्राफीन / क्यू शीट को कोट करने के लिए उपयोग किए जाने वाले अतिरिक्त मिथाइल मेथैक्रिलेट (एमएमए (8.5) एमएमए ईएल 6) को अवशोषित करेगा; इसलिए, इसे एक आकार में काटना सुनिश्चित करें जो उपयोग किए जाने वाले ग्राफीन / क्यू शीट से बड़ा है।
  2. ब्लॉटिंग पेपर के चार कोनों को एक साफ कवरस्लिप के शीर्ष पर टेप करने के लिए पॉलीमाइड टेप का उपयोग करें जो होममेड स्पिन कोटर में फिट होगा।
    नोट: पॉलीमाइड टेप का उपयोग किया जाता है क्योंकि यह पतला है और इसे आसानी से हटाया जा सकता है, जो हैंडलिंग को आसान बनाता है।
  3. वैक्यूम स्टोरेज से ग्राफीन / क्यू शीट का एक टुकड़ा निकालें।
  4. क्यू-ग्राफीन शीट के एक छोटे वर्ग को सावधानीपूर्वक काटने के लिए स्वच्छ और धूल मुक्त कैंची का उपयोग करें जो तैयार किए जाने वाले ग्रिड की संख्या को पूरी तरह से कवर करने के लिए पर्याप्त होगा। उदाहरण के लिए, 5 x 5 सरणी में व्यवस्थित 25 ग्रिड के लिए, एक टुकड़ा काटें जो 18 मिमी x 18 मिमी है। सीयू शीट को सोख्ता पेपर के शीर्ष पर साफ, सूखी चिमटी के साथ रखें। सुनिश्चित करें कि ग्राफीन / क्यू शीट का पिछला हिस्सा नीचे की ओर है और सावधान रहें कि गलती से ग्राफीन / क्यू शीट को फ्लिप न करें क्योंकि पीछे की तरफ से शीर्ष पक्ष को समझना मुश्किल है।
  5. ग्राफीन / क्यू शीट के चार कोनों को ब्लॉटिंग पेपर / कवरस्लिप पर टेप करें, टेप और ग्राफीन / क्यू शीट के बीच संपर्क की मात्रा को कम करें, क्योंकि टेप के साथ कवर किए गए किसी भी क्षेत्र को अगले चरण में एमएमए के साथ कवर नहीं किया जाएगा।
    नोट: स्थैतिक निर्वहन ग्राफीन फिल्मों को नुकसान पहुंचा सकता है, और इस प्रकार, ग्राफीन या ग्राफीन ग्रिड को संभालते समय विद्युत रूप से जमीन पर बने रहने और स्थिर चार्ज के संचय को कम करने की सलाह दी जाती है। यह ग्राफीन या ग्राफीन ग्रिड को संभालने से तुरंत पहले कलाई ग्राउंडिंग स्ट्रैप पहनने या ग्राउंडेड धातु की वस्तु को छूने से पूरा किया जा सकता है।

4. एमएमए (8.5) एमएमए ईएल 6 (एमएमए) की एक पतली परत के साथ एकल-परत ग्राफीन / क्यू शीट को कोट करें।

नोट: क्यू को दूर करने के बाद, एमएमए की यह परत भविष्य के चरणों में ग्राफीन शीट की हैंडलिंग को सक्षम करने के लिए ग्राफीन मोनोलेयर का समर्थन करेगी। एमएमए कोटिंग ग्राफीन फिल्म के विज़ुअलाइज़ेशन को भी सक्षम बनाता है क्योंकि अकेले ग्राफीन का एक मोनोलेयर पारदर्शी होगा।

  1. सीयू शीट के साथ कवरस्लिप को एक होममेड स्पिन कोटर (इसे कंप्यूटर फैन का उपयोग करके इकट्ठा किया जा सकता है) पर फ्यूम हुड (चित्रा 2 बी) के अंदर रखें, जैसा कि पहले हान एट अल .25 द्वारा वर्णित किया गया था।
  2. सुरक्षा चश्मे पहनकर, ग्राफीन शीट पर एक ग्लास पिपेट का उपयोग करके एमएमए की दो बूंदें जोड़ें और तुरंत अधिकतम गति से घूमना शुरू करें।
  3. घूमते समय, केंद्र में दो और बूंदें जोड़ें। 1 मिनट के लिए स्पिन करें।
    नोट: सुनिश्चित करें कि ग्राफीन को पूरी तरह से कोट करने के लिए पर्याप्त एमएमए लागू किया गया है। यदि अनिश्चित है, तो कुछ और बूंदें जोड़ें। यदि ग्राफीन पूरी तरह से लेपित नहीं है, तो क्यू को दूर करने के बाद फिल्म में "छेद" दिखाई देते हैं।
  4. फ्यूम हुड के अंदर 10 मिनट के लिए हवा में सूखने दें।

5. ग्राफीन / क्यू शीट के पीछे की तरफ ग्राफीन निकालें

नोट: तांबे के पीछे की तरफ उगाए गए ग्राफीन (एमएमए के साथ लेपित पक्ष) को बाद के चरणों में आगे बढ़ने से पहले हटा दिया जाना चाहिए क्योंकि यह अतिरिक्त ग्राफीन क्यू एचिंग की प्रभावशीलता को कम कर देगा। हम ग्राफीन को प्लाज्मा में उजागर करके इस ग्राफीन को हटा देते हैं, जिसे आमतौर पर जैविक नमूना तैयारी के लिए ईएम ग्रिड तैयार करने के लिए उपयोग किए जाने वाले किसी भी ग्लो डिस्चार्ज डिवाइस का उपयोग करके पूरा किया जा सकता है।

  1. टेप को ध्यान से निकालें और एमएमए-लेपित ग्राफीन / क्यू शीट को साफ, सूखे चिमटी के साथ कवरस्लिप से उठाएं।
  2. एमएमए / ग्राफीन / क्यू शीट के टुकड़े को एमएमए साइड के साथ एक साफ और धूल मुक्त ग्लास कवरस्लिप पर टेप करें।
  3. सीयू शीट के साथ कवरस्लिप को ग्लो डिस्चार्ज डिवाइस में रखें और उन सेटिंग्स को लागू करें जिनका उपयोग आमतौर पर नकारात्मक दाग या क्रायोईएम नमूना तैयारी के लिए ग्रिड तैयार करते समय किया जाएगा।
    नोट: पीछे की तरफ क्यू के ऑक्सीकरण को रोकने के लिए लंबे समय तक चमक निर्वहन से बचा जाना चाहिए, जिसके परिणामस्वरूप ग्राफीन फिल्म पर कॉपर ऑक्साइड (क्यूओ) (नैनो) कणों का संदूषण हो सकता है।

6. एपीएस समाधान में एमएमए / ग्राफीन / क्यू शीट से क्यू को हटा दें।

  1. फ्यूम हुड में, ताजा बने एपीएस समाधान के 200 एमएल को एक साफ और धूल मुक्त क्रिस्टलाइजिंग डिश (150 x 75 मिमी) में डालें।
  2. ग्लास स्लाइड से एमएमए / ग्राफीन / क्यू शीट को हटा दें। इस बात का ट्रैक रखें कि किस तरफ एमएमए है।
  3. नक़्क़ाशी शुरू करने के लिए, एमएमए / ग्राफीन / क्यू शीट को प्लाज्मा-उपचारित क्यू साइड के साथ एपीएस समाधान की सतह पर रखें। धूल को प्रवेश करने से रोकने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी या ढक्कन के एक टुकड़े के साथ चौड़े ग्लास बीकर को कवर करें।
  4. 3 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। यदि 1 घंटे के बाद अधिकांश सीयू अंकित नहीं है, तो अनुभाग 2-6 में चरणों को दोहराएं और फिर अगले चरण में जारी रखें।
    नोट: यदि अधिकांश क्यू 1 घंटे के बाद अंकित नहीं किया गया है, तो यह संभावना है कि फिल्म के एमएमए / ग्राफीन पक्ष को क्यू साइड के बजाय एपीएस समाधान की सतह पर रखा गया है। सीयू को 3 घंटे के बाद पूरी तरह से उकेरा जाना चाहिए, और एमएमए / ग्राफीन फिल्म रंगहीन है यदि क्यू पूरी तरह से अंकित है। ग्राफीन आसानी से दूषित हो जाता है इसलिए सतहों पर लिंट या किसी भी चिकना अवशेषों के संचय से बचने के लिए किसी भी कंटेनर को कवर करना सुनिश्चित करें, क्योंकि यह ग्राफीन की गुणवत्ता को नकारात्मक रूप से प्रभावित करेगा।

7. डीआई पानी में एमएमए / ग्राफीन फिल्म को कुल्ला करें

  1. फ्यूम हुड में, डीआई पानी के साथ एक साफ और धूल मुक्त क्रिस्टलीकरण पकवान भरें।
  2. एपीएस समाधान सतह के सापेक्ष ~ 45 ° कोण पर स्थित एक साफ, धूल मुक्त ग्लास कवरस्लिप के साथ ग्राफीन-एमएमए फिल्म को धीरे से खींचें।
  3. ग्लास स्लाइड को पानी के लगभग 90 डिग्री कोण पर रखें, और धीरे से ग्लास कवरस्लिप को पानी में कम करें ताकि एमएमए / ग्राफीन धीरे-धीरे स्लाइड से फिसल जाए और पानी की सतह पर तैरने लगे।
  4. किसी भी एपीएस को धोने के लिए एमएमए / ग्राफीन फिल्म को 1 घंटे के लिए पानी की सतह पर छोड़ दें।

8. ग्राफीन के मोनोलेयर के साथ लेपित होने के लिए ग्रिड को साफ करें

नोट: ग्रिड पन्नी की सतह पर ग्राफीन के लगाव को अधिकतम करने के लिए ग्राफीन को स्थानांतरित करने वाले ग्रिड जितना संभव हो उतना साफ होना चाहिए। व्यावसायिक रूप से खरीदे गए ग्रिड में अक्सर अवशिष्ट संदूषक होते हैं जिन्हें ग्राफीन हस्तांतरण से पहले हटा दिया जाना चाहिए।

  1. तीन क्रिस्टलीकरण व्यंजनों को साफ और सूखा लें ताकि वे धूल से मुक्त हों।
  2. फ्यूम हुड में, तीन क्रिस्टलीकरण व्यंजनों में से प्रत्येक में क्लोरोफॉर्म, एसीटोन और आइसोप्रोपिल अल्कोहल (आईपीए) के 200 एमएल डालें। कार्बनिक सॉल्वैंट्स के वाष्पीकरण को कम करने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी के साथ क्रिस्टलीकरण व्यंजनों को कवर करें।
    सावधानी: क्लोरोफॉर्म और एसीटोन त्वचा में जलन पैदा करते हैं और साँस लेने पर विषाक्त हो सकते हैं। इन कार्बनिक सॉल्वैंट्स के संपर्क को सीमित करें और पीपीई पहनें।
  3. क्लैंपिंग टीईएम ग्रिड होल्डर ब्लॉक के आधार को 200 एमएल क्लोरोफॉर्म युक्त पहले क्रिस्टलीकरण डिश के तल पर रखें।
  4. प्रत्येक ग्रिड को ग्रिड बॉक्स से ग्रिड होल्डर ब्लॉक में एक कुएं में व्यक्तिगत रूप से स्थानांतरित करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि फेनेस्टेड फिल्म साइड का सामना कर रहा है। एल्यूमीनियम पन्नी के साथ क्रिस्टलीकरण पकवान को कवर करें, इसे कक्षीय शेकर पर रखें, और धीरे से 30 मिनट के लिए हिलाएं।
  5. ग्रिड होल्डर ब्लॉक पर धातु का ढक्कन रखें, जो अगले क्रिस्टलीकरण डिश में स्थानांतरण के दौरान ग्रिड को सुरक्षित करेगा। ग्रिड होल्डर ब्लॉक को एक मुड़े हुए फोर्क और लंबे चिमटी के साथ क्रिस्टलीकरण डिश से सावधानीपूर्वक उठाएं और इसे एसीटोन के 200 एमएल युक्त दूसरे क्रिस्टलीकरण डिश के तल पर रखें। ग्रिड होल्डर ब्लॉक से ढक्कन निकालें और 30 मिनट के लिए ऑर्बिटल शेकर पर धीरे से हिलाएं।
  6. ग्रिड होल्डर ब्लॉक पर ढक्कन रखें और एसीटोन अवशेषों को साफ करने के लिए 200 एमएल आईपीए समाधान युक्त क्रिस्टलाइजिंग डिश में स्थानांतरित करें। ग्रिड होल्डर ब्लॉक से ढक्कन निकालें और 20 मिनट के लिए धीरे से हिलाएं।
  7. व्यक्तिगत रूप से ग्रिड होल्डर ब्लॉक से एक ग्लास पेट्री डिश में फेनेस्टेड फिल्म साइड के साथ ग्रिड को स्थानांतरित करें, जो ब्लॉटिंग पेपर से ढका हुआ है।
  8. फ्यूम हुड के नीचे कम से कम 30 मिनट के लिए ग्रिड को सुखाएं, यह सुनिश्चित करें कि धूल को उस पर उतरने से रोकने के लिए ग्रिड को कवर किया गया है।

9. साफ ग्रिड को स्टेनलेस-स्टील तार जाल या डीआई पानी के नीचे छिद्रित ट्रे पर रखे ब्लोटिंग पेपर में स्थानांतरित करें।

नोट: ग्रिड को एक सपाट सतह पर डीआई पानी के नीचे डुबोया जाना चाहिए ताकि ग्राफीन को पानी पर तैरकर ग्रिड पर उतारा जा सके। यह एक वाणिज्यिक ग्रिड कोटिंग गर्त या पेट्री डिश और एक पेरिस्टालिक पंप के साथ किया जा सकता है, जैसा कि ग्राफीन-ऑक्साइड ग्रिड उत्पन्न करने के लिए उपयोग किया जाता है, जैसा कि पालोवकाक एट अल .18 द्वारा वर्णित है।

  1. स्टेनलेस स्टील जाल या ट्रे को ग्रिड कोटिंग गर्त में रखें और डीआई पानी से कुल्ला करें।
  2. ब्लॉटिंग पेपर को काटें जो स्टेनलेस-स्टील जाल / ट्रे से थोड़ा छोटा है और इसे डीआई पानी में डूबे हुए प्लेटफॉर्म के शीर्ष पर रखें।
    नोट: आंदोलन और हैंडलिंग को सक्षम करने के लिए ब्लॉटिंग पेपर प्लेटफॉर्म से थोड़ा छोटा है।
  3. धीरे-धीरे साफ किए गए ग्रिड को ब्लोटिंग पेपर के शीर्ष पर फेनेस्टेड फिल्म साइड के साथ स्थानांतरित करें। ग्रिड संभवतः हाइड्रोफोबिक होंगे, इसलिए ग्रिड को लंबवत रूप से पानी में डुबो दें या वे पानी के तनाव के कारण झुक सकते हैं। ग्रिड को एक वर्ग सरणी में रखें ताकि वे यथासंभव एक दूसरे के करीब हों, लेकिन अतिव्यापी न हों (चित्रा 2 सी)।
  4. ग्रिड अब ग्राफीन मोनोलेयर के साथ लेपित होने के लिए तैयार हैं। ग्रिड कोटिंग गर्त को अधिक डीआई पानी से भरें ताकि पानी की सतह ग्रिड से कम से कम 5 मिमी ऊपर हो।

10. ग्रिड में ग्राफीन स्थानांतरित करें

  1. ग्राफीन फिल्म से कुछ दूरी पर एक कोण पर कवरस्लिप को धीरे-धीरे नीचे करके एक साफ कवरस्लिप के साथ क्रिस्टलाइजिंग डिश से एमएमए / ग्राफीन फिल्म को सावधानीपूर्वक बाहर निकालें। ग्राफीन-एमएमए शीट के नीचे कवरस्लिप रखें ताकि शीट और कवरस्लिप के किनारे समानांतर हों, और फिर कवरस्लिप को पानी से लंबवत रूप से उठाएं, जिससे एमएमए / ग्राफीन फिल्म इसके साथ आ सके।
  2. एमएमए / ग्राफीन फिल्म को ~ 45 ° कोण पर पानी में कवरस्लिप को कम करके गर्त में स्थानांतरित करें, ताकि एमएमए / ग्राफीन फिल्म कवरस्लिप से अलग हो जाए और पानी की सतह पर तैरने लगे।
  3. पानी के स्तर को कम करने से पहले एमएमए / ग्राफीन फिल्म को सीधे ग्रिड के ऊपर रखें। एक ग्लास पाश्चर पिपेट का उपयोग करें जिसकी नोक को एमएमए / ग्राफीन फिल्म की स्थिति में सावधानीपूर्वक हेरफेर करने के लिए उद्घाटन को सील करने के लिए पिघलाया गया है।
  4. धीरे-धीरे सिरिंज के साथ पानी के स्तर को कम करें, लगभग 1.25 एमएल / मिनट पर ताकि एमएमए / ग्राफीन फिल्म पूरी तरह से ग्रिड सतहों को कवर करे क्योंकि यह फिल्टर पेपर पर उतरता है।
    नोट: पानी के स्तर में गिरावट के रूप में ग्रिड के ऊपर अपनी स्थिति बनाए रखने के लिए ग्राफीन-एमएमए शीट का और हेरफेर आवश्यक हो सकता है।
  5. ग्रिड को एक साफ, सूखी, धूल मुक्त पेट्री डिश में रखने वाले ब्लॉटिंग पेपर को उठाने के लिए साफ, सूखी चिमटी की एक जोड़ी का उपयोग करें, या पूरे स्टेनलेस-स्टील प्लेटफॉर्म को स्थानांतरित करें।
  6. फ्यूम हुड के नीचे कम से कम 30 मिनट के लिए एमएमए / ग्राफीन ग्रिड को हवा में सुखाएं। धूल के कणों से किसी भी संदूषण को रोकने के लिए ग्रिड को एल्यूमीनियम पन्नी या ढक्कन से ढककर रखें।
  7. ग्रिड को इनक्यूबेटर में स्थानांतरित करें और ग्रिड को 30 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में बेक करें।
  8. इनक्यूबेटर से ग्रिड निकालें और ग्रिड को कमरे के तापमान पर ठंडा करने के लिए उन्हें कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए कवर छोड़ दें।

11. एमएमए को हटाना और ग्रिड की सफाई करना

नोट: ग्राफीन-लेपित ग्रिड पर किसी भी अवशिष्ट एमएमए को रोकने के लिए एमएमए को एसीटोन में अच्छी तरह से धोया जाना चाहिए।

  1. फ्यूम हुड में, कमरे के तापमान पर 200 एमएल एसीटोन युक्त दो क्रिस्टलीकृत व्यंजन और 200 एमएल आइसोप्रोपेनोल (आईपीए) युक्त एक क्रिस्टलीकृत डिश तैयार करें। कार्बनिक सॉल्वैंट्स के वाष्पीकरण को कम करने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी के साथ क्रिस्टलीकरण व्यंजनों को कवर करें।
    सावधानी: एसीटोन को संभालते समय पीपीई पहनें क्योंकि यह त्वचा में जलन पैदा कर सकता है और सांस लेने पर हानिकारक हो सकता है।
  2. क्लैंपिंग टीईएम ग्रिड होल्डर ब्लॉक के आधार को पहले क्रिस्टलाइजिंग डिश के निचले हिस्से में रखें जिसमें 200 एमएल ताजा एसीटोन होता है।
  3. प्रत्येक ग्रिड को व्यक्तिगत रूप से ब्लॉटिंग पेपर से ग्रिड होल्डर ब्लॉक में एक कुएं में स्थानांतरित करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि एमएमए पक्ष ऊपर की ओर है। पन्नी के साथ क्रिस्टलीकृत पकवान को कवर करें, इसे एक कक्षीय शेकर पर रखें, और धीरे से 30 मिनट के लिए हिलाएं।
  4. ग्रिड होल्डर ब्लॉक पर धातु का ढक्कन रखें, जो अगले क्रिस्टलीकरण डिश में स्थानांतरण के दौरान ग्रिड को सुरक्षित करेगा। ग्रिड होल्डर ब्लॉक को एक मुड़े हुए फोर्क और लंबे चिमटी के साथ क्रिस्टलीकृत डिश से सावधानीपूर्वक उठाएं और इसे 200 एमएल ताजा एसीटोन युक्त दूसरे क्रिस्टलीकरण डिश के निचले हिस्से में रखें। ग्रिड होल्डर ब्लॉक से ढक्कन निकालें और 30 मिनट के लिए ऑर्बिटल शेकर पर धीरे से हिलाएं।
  5. ग्रिड होल्डर ब्लॉक पर ढक्कन रखें और एसीटोन अवशेषों को साफ करने के लिए 200 एमएल आईपीए समाधान युक्त क्रिस्टलाइजिंग डिश में स्थानांतरित करें। ग्रिड होल्डर ब्लॉक से ढक्कन निकालें और 20 मिनट के लिए धीरे से हिलाएं।
  6. ग्रिड को ब्लोटिंग पेपर से ढके एक छोटे ग्लास पेट्री डिश में स्थानांतरित करें और कम से कम 10 मिनट के लिए ग्रिड को हवा से सुखाएं। धूल के कणों से किसी भी संदूषण को रोकने के लिए ग्रिड को ढक्कन से ढककर रखें।
  7. ग्रिड एक वैक्यूम डेसिकेटर के अंदर एल्यूमीनियम पन्नी से लिपटे ग्रिड बॉक्स में उपयोग या स्थानांतरित करने के लिए तैयार हैं।
    नोट: एक वैक्यूम डेसिकेटर के अंदर ग्राफीन ग्रिड को संग्रहीत करने से परिवेश की स्थितियों से हाइड्रोफोबिक कणों के संदूषण को रोका जा सकता है। इन ग्रिडोंको उपयोग करने से पहले कई महीनों तक संग्रहीत किया जा सकता है।

12. यूवी / ओजोन उपचार के साथ ग्राफीन ग्रिड हाइड्रोफिलिक प्रस्तुत करें।

नोट: ग्राफीन बेहद हाइड्रोफोबिक है, जो क्रायोईएम नमूना तैयारी के साथ संगत नहीं है, क्योंकि ब्लोट-डुबकी दृष्टिकोण के लिए एक हाइड्रोफिलिक सतह की आवश्यकता होती है जिस पर नमूने की एक बूंद समान रूप से फैल सकती है। जबकि पारंपरिक चमक-निर्वहन उपकरणों को ग्राफीन सतह हाइड्रोफिलिक बनाने के लिए प्लाज्मा को धीरे से पल्स करने के लिए कॉन्फ़िगर किया जा सकता है, ये उपकरण पतले ग्राफीन मोनोलेयर को नष्ट कर देते हैं। यह पहले दिखाया गया था कि एक यूवी / ओजोन क्लीनर का उपयोग ग्राफीन25 की सतह को आंशिक रूप से ऑक्सीजन करने के लिए किया जा सकता है, जिससे मोनोलेयर को नुकसान पहुंचाए बिना क्रायोईएम नमूना तैयारी के लिए हाइड्रोफिलिक हो जाता है।

  1. यदि यूवी / ओजोन सिस्टम का उपयोग कर रहे हैं जिसके लिए प्राइमिंग की आवश्यकता होती है, तो सिस्टम को चालू करें और 10 मिनट के लिए लैंप को प्राइम करें (इस चरण में, सुनिश्चित करें कि कोई ग्रिड उजागर नहीं हुआ है)। जबकि यूवी / ओजोन क्लीनर प्राइमिंग है, वैक्यूम डेसिकेटर से ग्रिड को हटा दें और उन्हें एक साफ कवरस्लिप में स्थानांतरित करें।
  2. जब यूवी/ओजोन प्रणाली तैयार हो जाए, तो ग्रिड युक्त कवरस्लिप को ग्रेफीन साइड के साथ यूवी/ओजोन क्लीनर में रखें, और ग्रिड को 4 मिनट के लिए ओजोन गैस के संपर्क में लाएं।
  3. ओजोन के संपर्क में आने के बाद, क्रायोईएम नमूना तैयार करने के लिए तुरंत ग्रिड का उपयोग करें।
    नोट: यदि यूवी / ओजोन प्रणाली का उपयोग करना जिसके लिए प्राइमिंग की आवश्यकता होती है, तो लैंप को 10 मिनट के लिए प्राइम करने के तुरंत बाद ग्रिड को क्लीनर में रखा जाना चाहिए, या नमूना तैयार करने के लिए ग्राफीन को ऑक्सीजन करने के लिए पर्याप्त ओजोन गैस का उत्पादन करना बहुत ठंडा होगा। ग्रिड को 6 मिनट से अधिक समय तक ओजोन गैस के संपर्क में न रखें, क्योंकि यह ग्राफीन परत को नष्ट कर देगा।

Representative Results

यहां वर्णित ग्राफीन ग्रिड निर्माण प्रोटोकॉल के सफल निष्पादन के परिणामस्वरूप ईएम ग्रिड होंगे जो ग्राफीन के एकल मोनोलेयर के साथ पूरी तरह से लेपित हैं। ग्रिड के ग्राफीन कवरेज को किसी भी टीईएम का उपयोग करके जांचा जा सकता है। चूंकि स्वच्छ ग्राफीन का एक मोनोलेयर टीईएम में लगभग अदृश्य है, इसलिए माइक्रोस्कोप के विवर्तन मोड का उपयोग करके इसकी जांच करनी चाहिए और ग्राफीन (चित्रा 3 ए) में शामिल कार्बन परमाणुओं के हेक्सागोनल संगठन के अनुरूप ब्रैग स्पॉट का निरीक्षण करना चाहिए। कभी-कभी मोनोलेयर ग्राफीन की कुछ झुर्रियों का निरीक्षण करना सामान्य है, जो एमएमए-कोटिंग (चित्रा 3 बी) के दौरान पेश किए जाते हैं। ग्राफीन से ढके छेदों में से एक के केंद्र में उच्च आवर्धन छवि प्राप्त करके ग्राफीन पर मौजूद संदूषण के स्तर की भी जांच की जा सकती है (चित्रा 3 सी)। यदि उच्च-रिज़ॉल्यूशन डिटेक्टर के साथ प्राप्त किया जाता है, तो इस छवि के फूरियर ट्रांसफॉर्म में 2.14 ° (चित्रा 4 सी) पर कार्बन-कार्बन स्पेसिंग के अनुरूप ब्रैग स्पॉट होने चाहिए। कार्बन परमाणुओं का एक मोनोलेयर चरण कंट्रास्ट उत्पन्न करने के लिए पर्याप्त इलेक्ट्रॉन प्रकीर्णन का उत्पादन नहीं करता है, और इस प्रकार स्वच्छ ग्राफीन की एक छवि छवि के फूरियर ट्रांसफॉर्म में कंट्रास्ट ट्रांसफर फ़ंक्शन से जुड़े थोन रिंग्स को पेश नहीं करेगी। हालांकि, उत्पादन के बाद ग्राफीन ग्रिड के संदूषण को रोकना बहुत मुश्किल है, और ईएम ग्रिड की अपर्याप्त धुलाई या ग्राफीन कोटिंग के बाद एमएमए को हटाने के परिणामस्वरूप ग्रिड पर उल्लेखनीय दूषित पदार्थ होंगे जो वास्तविक अंतरिक्ष छवियों में दिखाई देते हैं (चित्रा 3 सी)। जैसा कि चित्र 4 में दिखाया गया है, ग्राफीन ग्रिड का एक नमूने पर ध्यान केंद्रित प्रभाव पड़ता है, जैसा कि 0.5 मिलीग्राम / एमएल की तुलना करते समय देखा जाता है जब एपोफेरिटिन के 0.5 मिलीग्राम / एमएल की तुलना की जाती है (चित्रा 4 ए) और ग्राफीन समर्थन के बिना (चित्रा 4 बी)। इसी तरह के ग्राफीन निर्माण प्रोटोकॉल को पहले उच्च रिज़ॉल्यूशन25,27 पर एपोफेरिटिन जैसे प्रोटीन की क्रायोईएम संरचनाओं को हल करने के लिए वर्णित किया गया है।

Figure 1
चित्रा 1: ग्राफीन-लेपित क्रायोईएम ग्रिड तैयार करने के लिए योजनाबद्ध। ग्राफीन ग्रिड निर्माण की प्रक्रिया में प्रमुख कदम सचित्र हैं। संक्षेप: क्रायोईएम = क्रायोजेनिक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी; एमएमए = मिथाइल मेथैक्रिलेट; एपीएस = अमोनियम परसल्फेट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: ग्राफीन ग्रिड बनाने के लिए आवश्यक सामग्री। (ए) क्रायो-ईएम ग्रिड कोटिंग के लिए आवश्यक सामग्री तदनुसार लेबल की जाती है। (बी) ग्लास स्लाइड पर ब्लोटिंग पेपर पर टेप किए गए ग्राफीन/क्यू शीट के साथ कोटर का क्लोजअप दृश्य। स्पिन कोटर को स्थानीय कंप्यूटर / हार्डवेयर स्टोर से भागों को खरीदकर इकट्ठा किया जा सकता है। (सी) एक सिरिंज से जुड़े ग्रिड कोटिंग गर्त का क्लोजअप दृश्य जिसका उपयोग जल स्तर को नियंत्रित करने के लिए किया जा सकता है। ग्रिड को स्टेनलेस-स्टील जाल पर एक ब्लोटिंग पेपर के शीर्ष पर रखा जाता है। ब्लोटिंग पेपर ग्रिड के स्थान को पैंतरेबाज़ी करने में सहायता करता है ताकि ग्राफीन शीट को इससे मिलान किया जा सके। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: एक प्रतिनिधि विवर्तन पैटर्न छवि और एक ग्राफीन ग्रिड की उज्ज्वल क्षेत्र छवियां जो झुर्रियों या एमएमए संदूषण को दिखाती हैं । (ए) ग्राफीन के मोनोलेयर से ढके ईएम ग्रिड विवर्तन मोड में टीईएम में चित्रित होने पर ग्राफीन की हेक्सागोनल जाली के अनुरूप ब्रैग चोटियों को दिखाएंगे। ब्रैग पीक को 2.14 ° कार्बन-कार्बन स्पेसिंग के अनुरूप सर्कल किया जाता है और एक तीर के साथ निरूपित किया जाता है। (बी) ग्राफीन मोनोलेयर में कुछ झुर्रियों (एक तीर के साथ चिह्नित) के साथ एक मोनोलेयर ग्राफीन ग्रिड की एक उज्ज्वल-क्षेत्र छवि। (सी) एमएमए संदूषण के साथ मोनोलेयर ग्राफीन की एक उज्ज्वल-क्षेत्र छवि (एक तीर के साथ चिह्नित)। स्केल बार = 100 एनएम (बी, सी)। संक्षेप: ईएम = इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी; एमएमए = मिथाइल मेथैक्रिलेट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: ग्राफीन से ढके सोने के ग्रिड पर एपोफेरिटिन: (ए) ग्राफीन से ढके सोने के ग्रिड पर 0.5 मिलीग्राम / एमएल एपोफेरिटिन का क्रायोईएम माइक्रोग्राफ। (बी) एक ही सांद्रता पर चित्रित एपोफेरिटिन ग्राफीन के बिना छिद्रित सोने के ग्रिड का उपयोग करके तैयार होने पर काफी कम सांद्रता पर दिखाई देता है। (सी) ग्राफीन से ढके सोने के ग्रिड पर 0.5 मिलीग्राम / एमएल एपोफेरिटिन के क्रायोईएम माइक्रोग्राफ का एफएफटी, जिसमें ब्रैग चोटियां हेक्सागोनल ग्राफीन जाली के अनुरूप हैं। स्केल बार = 100 एनएम (ए, बी)। संक्षेप: क्रायोईएम = क्रायोजेनिक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी; एफएफटी = फास्ट फूरियर ट्रांसफॉर्म। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

विट्रियस बर्फ की एक पतली परत में जैविक नमूनों का संरक्षण उच्च-रिज़ॉल्यूशन क्रायोईएम संरचना निर्धारण के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है। हालांकि, शोधकर्ताओं को अक्सर एडब्ल्यूआई के साथ बातचीत से उत्पन्न होने वाली समस्याओं का सामना करना पड़ता है, जो पसंदीदा अभिविन्यास, जटिल विघटन, विकृतीकरण और एकत्रीकरण का परिचय देता है। इसके अलावा, नमूने हमेशा एक फेनेस्टेड फिल्म के छेद में निलंबित पतली बर्फ को आबाद करने के लिए पर्याप्त रूप से केंद्रित नहीं किए जा सकते हैं। कई शोध समूहों ने इन सीमाओं में से कुछ24,25,26,27,28,29,30 को दूर करने में मदद करने के लिए ग्राफीन के मोनोलेयर के साथ ईएम ग्रिड को कोट करने के तरीके विकसित किए हैं, और ग्राफीन ग्रिड का उपयोग बड़ी सफलता के साथ किया गया है। यहां, हम घर में ग्राफीन ग्रिड के बैचों को प्रभावी ढंग से तैयार करने और टीईएम द्वारा ग्राफीन ग्रिड की गुणवत्ता की जांच करने के लिए चरण-दर-चरण निर्देश प्रदान करते हैं। हम इस बात पर जोर देते हैं कि कुछ महत्वपूर्ण चरणों के दौरान विशेष देखभाल की जानी चाहिए, जिसे हम नीचे रेखांकित करते हैं।

ग्राफीन में हवाई दूषित पदार्थों को आकर्षित करने की एक मजबूत प्रवृत्ति है। इसलिए, ग्राफीन ग्रिड निर्माण प्रक्रिया के दौरान, यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि ग्राफीन / क्यू शीट या ग्रिड के साथ संपर्क करने वाले सभी उपकरण साफ और धूल मुक्त हैं। ग्राफीन को स्थानांतरित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले ग्लास कवरलिप्स को इथेनॉल और डीआई पानी से धोकर या एयर-डस्टर का उपयोग करके साफ किया जा सकता है। यह भी सलाह दी जाती है कि फ्यूम हुड के तहत काम करें और ग्राफीन शीट और ग्रिड को हर समय पन्नी या साफ ग्लास प्लेट से ढककर रखें। ग्रिड पर धूल या दूषित पदार्थ ग्राफीन को ईएम ग्रिड का पूरी तरह से पालन करने से रोक सकते हैं। ग्राफीन या ग्राफीन-लेपित ग्रिड को संभालते समय, स्थिर निर्वहन से ग्राफीन फिल्म को नुकसान को रोकने के लिए विद्युत रूप से जमीन पर होना महत्वपूर्ण है। कलाई ग्राउंडिंग स्ट्रैप का उपयोग करके, हर बार ग्राफीन या ग्राफीन ग्रिड को संभालने के दौरान एक ग्राउंडेड धातु की वस्तु को छूने, और / या चिमटी को पकड़ने वाले हाथ पर दस्ताने न पहनने से स्थैतिक निर्वहन से बचा जा सकताहै।

चूंकि ग्राफीन का एक मोनोलेयर बहुत पतला (कार्बन परमाणु की चौड़ाई) है, इसलिए ग्रिड में ग्राफीन के हस्तांतरण के दौरान एमएमए या पॉली-एमएमए (पीएमएमए) जैसी कार्बनिक परत के साथ ग्राफीन का समर्थन करना महत्वपूर्ण है। पीएमएमए ग्राफीन हस्तांतरण के लिए सबसे व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली सामग्री है। हालांकि, पीएमएमए का ग्राफीन के साथ एक मजबूत संबंध है और अक्सर ग्राफीन फिल्म पर बहुलक संदूषण हो सकता है। एमएमए का उपयोग इस प्रोटोकॉल में किया जाता है, क्योंकि यह कम अवशिष्ट संदूषण25 छोड़ देता है। हालांकि, पीएमएमए और एमएमए दोनों में झुर्रियों और दरारें बनाने का नुकसान है जो ग्राफीन फिल्म (चित्रा 3 बी) के कुछ क्षेत्रों में देखा जा सकता है। इन झुर्रियों से बचना चुनौतीपूर्ण हो सकता है क्योंकि वे आमतौर पर सीवीडी विधि31 द्वारा ग्राफीन विकास के दौरान होते हैं। झुर्रियों के बिना अल्ट्रा-फ्लैट ग्राफीन उगाने के लिए हाल ही में एक विधि विकसित की गई है, जिससे तांबे की पन्नी को विकास सब्सट्रेट32 के रूप में सीयू (111)/नीलम वेफर द्वारा प्रतिस्थापित किया जाता है।

हमारे अनुभव के आधार पर, निर्माताओं से बहुलक-कवर क्यू-ग्राफीन शीट खरीदने की तुलना में ग्राफीन / सीयू शीट खरीदना और एमएमए के साथ ग्राफीन का समर्थन करना बेहतर है, जो तांबे की नक़्क़ाशी के बाद भंगुर हो जाते हैं और बाद के चरणों में संभालना मुश्किल होता है। एमएमए कोटिंग के लिए हमने जिस स्पिन कोटर का उपयोग किया है, उसे स्थानीय कंप्यूटर / हार्डवेयर स्टोर से भागों का उपयोग करके सस्ते में बनाया जा सकता है, जैसा कि पहले वर्णित25 है।

एमएमए कोटिंग के चरण के दौरान, एमएमए के साथ क्यू-ग्राफीन शीट पर ग्राफीन सतह की संपूर्णता को कवर करना महत्वपूर्ण है। सीयू को दूर करने के बाद, एमएमए-ग्राफीन अर्ध-पारदर्शी हो जाएगा, और एमएमए कवरेज की कमी वाले क्षेत्र खाली छेद की तरह दिखेंगे। तांबे की तरफ एमएमए कोटिंग को रोकने के लिए, कोटिंग के दौरान इसके नीचे ब्लोटिंग पेपर का एक छोटा टुकड़ा रखना महत्वपूर्ण है ताकि यह सीवीडी फिल्म से बाहर निकलने वाले किसी भी अतिरिक्त एमएमए को सोख ले।

नक़्क़ाशी और कुल्ला करने के बाद, एमएमए / ग्राफीन शीट को पानी के स्तर को नियंत्रित करने के लिए सिरिंज या पेरिस्टालिक पंप के साथ वाणिज्यिक या होममेड ट्रफ सिस्टम का उपयोग करके ईएम ग्रिड में स्थानांतरित करने के लिए तैयार किया जाता है। स्थानांतरण चरण से पहले, क्लोरोफॉर्म, एसीटोन और आईपीए के लगातार स्नान में ग्रिड को अच्छी तरह से पूर्वनिर्धारित करना महत्वपूर्ण है। 65 डिग्री सेल्सियस पर बेकिंग ग्राफीन-लेपित ग्रिड ग्राफीन अखंडता को संरक्षित करने में मदद करता है और ग्रिड में ग्राफीन के सोखने को बढ़ावा देता है। अंत में, ग्रिड पर एमएमए संदूषण को रोकने के लिए, एसीटोन स्नान में एमएमए को अच्छी तरह से हटाना और आईपीए में ग्रिड को साफ करना महत्वपूर्ण है। ईएम ग्रिड पर किसी भी बिना धोए एमएमए अवशेष ों को देखा जाएगा और छवियों के सिग्नल-टू-शोर अनुपात को कम किया जाएगा (चित्रा 3 सी)। एसीटोन-आईपीए धोने की प्रक्रिया को ग्राफीन सतहों को और साफ करने के लिए दोहराया जा सकता है।

ग्राफीन ग्रिड को हाइड्रोफिलिक प्रस्तुत करने के लिए, हमने ग्रिड को यूवी / ओजोन से अवगत कराया। ओजोन क्लीनर के विभिन्न मॉडलों को ग्राफीन को नुकसान पहुंचाए बिना क्रायोईएम नमूना तैयारी के लिए ग्राफीन परत को पर्याप्त रूप से ऑक्सीजन करने के लिए अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है। सिस्टम के बावजूद, यूवी / ओजोन उपचार के तुरंत बाद क्रायोईएम नमूना आवेदन के लिए इन ग्रिडों का उपयोग करना महत्वपूर्ण है। ग्राफीन ग्रिड हाइड्रोफिलिक प्रस्तुत करने के वैकल्पिक तरीकों को अन्य अध्ययनों33,34 में वर्णित किया गया है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

हम स्क्रिप्स रिसर्च में इन विधियों को स्थापित करते समय सहायक चर्चाओं के लिए डॉ जिओ फैन को धन्यवाद देते हैं। बीबी को हेविट फाउंडेशन फॉर मेडिकल रिसर्च से एक पोस्टडॉक्टरल रिसर्च फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था। डब्ल्यू.सी. को नेशनल साइंस फाउंडेशन प्रीडॉक्टोरल फैलोशिप द्वारा समर्थित किया जाता है। डी.ई.पी. को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) अनुदान NS095892 जीसीएल द्वारा समर्थित है। इस परियोजना को एनआईएच अनुदान GM142196, GM143805 और जीसीएल को S10OD032467 द्वारा भी समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
70% EtOH Pharmco (190 pf EtOH) 241000190CSGL
Acetone Sigma Aldrich 650501-4L
Ammonium persulfate (APS) Sigma Aldrich 215589-500g Hazardous; use extreme caution
Chloroform Sigma Aldrich C2432-1L
Clamping TEM Grid Holder Block for 45 Grids PELCO 16830-45
Computer fan Amazon (Noctua) B07CG2PGY6
Cover slip Bellco Glass 1203J71 Standard cover slips
Crystallizing dish Pyrex 3140-100
Electronics duster Falcon Safety Products 75-37-6
Falcon Dust-off Air Duster Staples N/A
Filter papers Whatman 1001-055
Fine tip tweezer Dumont 0508-L4-PO
Flask Pyrex 4980-500
Fork Supermarket N/A
Glass pasteur pipette VWR 14672-608
Graphene/Cu Graphenea N/A CVD monolayer graphene cu
Grid Coating Trough Ladd Research Industries 10840 Fragile
Isopropanol Fisher Scientific 67-63-0
Kapton Tape Amazon (MYJOR) MY-RZY001 Polyimide tape
Kimwipes Fisher Scientific 06-666
Long twzeer Cole Parmer Essentials UX-07387-15
Metal grid holder Ted Pella 16820-81
MMA(8.5)MMA EL 6 KAYAKU Advanced Materials M31006 0500L 1GL Flammable
Model 10 Lab Oven Quincy Lab, Inc. FO19013
Petri dish Pyrex 3610-102
Plasma cleaner (Solarus 950) Gatan, Inc. N/A
Scissors Fiskars 194813-1010
Standard Analog Orbital Shaker VWR 89032-088
UltrAuFoil R1.2/1.3 - Au300 Quantifoil N/A Holey gold grids
Ultraviolet Ozone Cleaning Systems UVOCS model T10X10/OES

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Li, X., Zheng, S. Q., Egami, K., Agard, D. A., Cheng, Y. Influence of electron dose rate on electron counting images recorded with the K2 camera. Journal of Structural Biology. 184 (2), 251-260 (2013).
  2. Tang, G., et al. EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).
  3. Zivanov, J., et al. New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3. eLife. 7, 1-22 (2018).
  4. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. CryoSPARC: Algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  5. Grigorieff, N., Harrison, S. C. Near-atomic resolution reconstructions of icosahedral viruses from electron cryo-microscopy. Current Opinion in Structural Biology. 21 (2), 265-273 (2011).
  6. Nakane, T., et al. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).
  7. Zhang, K., Pintilie, G. D., Li, S., Schmid, M. F., Chiu, W. Resolving individual atoms of protein complex by cryo-electron microscopy. Cell Research. 30 (12), 1136-1139 (2020).
  8. Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM. Nature. 587 (7832), 157-161 (2020).
  9. Schultz, P. Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Quarterly Reviews of Biophysics. 21 (2), 129-228 (1988).
  10. Nguyen, H. P. M., McGuire, K. L., Cook, B. D., Herzik, M. A. Manual blot-and-plunge freezing of biological specimens for single-particle cryogenic electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. 2022 (180), 1-16 (2022).
  11. Glaeser, R. M. Proteins, interfaces, and cryo-em grids. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 25 (3), 289-313 (2016).
  12. Glaeser, R. M., Han, B. -G. Opinion: hazards faced by macromolecules when confined to thin aqueous films. Biophysics Reports. 3 (1-3), 1-7 (2017).
  13. Han, B. G., Watson, Z., Cate, J. H. D., Glaeser, R. M. Monolayer-crystal streptavidin support films provide an internal standard of cryo-EM image quality. Journal of Structural Biology. 200 (3), 307-313 (2017).
  14. Noble, A. J., et al. Routine single particle CryoEM sample and grid characterization by tomography. eLife. 7, 1-42 (2018).
  15. Drulyte, I., et al. Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 74 (6), 560-571 (2018).
  16. Liu, N., Wang, H. W. Better cryo-EM specimen preparation: how to deal with the air-water interface. Journal of Molecular Biology. 435 (9), 167926 (2022).
  17. Noble, A. J., et al. Reducing effects of particle adsorption to the air-water interface in cryo-EM. Nature Methods. 15 (10), 793-795 (2018).
  18. Palovcak, E., et al. A simple and robust procedure for preparing graphene-oxide cryo-EM grids. Journal of Structural Biology. 204 (1), 80-84 (2018).
  19. Patel, A., Toso, D., Litvak, A., Nogales, E. Efficient graphene oxide coating improves cryo-EM sample preparation and data collection from tilted grids. bioRxiv. , (2021).
  20. Marr, C. R., Benlekbir, S., Rubinstein, J. L. Fabrication of carbon films with ~500nm holes for cryo-EM with a direct detector device. Journal of Structural Biology. 185 (1), 42-47 (2014).
  21. Pantelic, R. S., Meyer, J. C., Kaiser, U., Baumeister, W., Plitzko, J. M. Graphene oxide: A substrate for optimizing preparations of frozen-hydrated samples. Journal of Structural Biology. 170 (1), 152-156 (2010).
  22. Pantelic, R. S., et al. Graphene: substrate preparation and introduction. Journal of Structural Biology. 174 (1), 234-238 (2011).
  23. Russo, C. J., Passmore, L. A. Progress towards an optimal specimen support for electron cryomicroscopy. Current Opinion in Structural Biology. 37, 81-89 (2016).
  24. Passmore, L. A., Russo, C. J. Specimen preparation for high-resolution cryo-EM. Methods in Enzymology. 579, 51-86 (2016).
  25. Han, Y., et al. High-yield monolayer graphene grids for near-atomic resolution cryoelectron microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (2), 1009-1014 (2020).
  26. Zheng, L., et al. Robust ultraclean atomically thin membranes for atomic-resolution electron microscopy. Nature Communications. 11 (1), 541 (2020).
  27. Ahn, E., Kim, B., Cho, U. -S. Batch production of high-quality graphene grids for cryo-EM: cryo-EM structure of Methylococcus capsulatus soluble methane monooxygenase hydroxylase. bioRxiv. (Cvd), (2021).
  28. Naydenova, K., Peet, M. J., Russo, C. J. Multifunctional graphene supports for electron cryomicroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (24), 11718-11724 (2019).
  29. Fan, H., Sun, F. Developing graphene grids for cryoelectron microscopy. Frontiers in Molecular Biosciences. 9, 937253 (2022).
  30. D'Imprima, E., et al. Protein denaturation at the air-water interface and how to prevent it. eLife. 8, e42747 (2019).
  31. Zhang, X., et al. Evolution of copper step beams during graphene growth by CVD method. Applied Surface Science. 610, 155518 (2023).
  32. Zheng, L., et al. Uniform thin ice on ultraflat graphene for high-resolution cryo-EM. Nature Methods. 20 (1), 123-130 (2023).
  33. Fujita, J., et al. Epoxidized graphene grid for highly efficient high-resolution cryoEM structural analysis. Scientific Reports. 13, 2279 (2023).
  34. Lu, Y., et al. Functionalized graphene grids with various charges for single-particle cryo-EM. Nature Communications. 13, 6718 (2022).

Tags

निर्माण मोनोलेयर ग्राफीन-लेपित ग्रिड क्रायोइलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी नमूना तैयारी विट्रस बर्फ फेनेस्टेड सपोर्ट फिल्म हाइड्रोफोबिक प्रभाव विकृतीकरण एकत्रीकरण जटिल पृथक्करण हाइड्रोफोबिक इंटरैक्शन 3 डी पुनर्निर्माण अनिसोट्रोपिक दिशात्मक संकल्प ग्राफीन समर्थन पृष्ठभूमि शोर प्रोटीन एकाग्रता क्रायोईएम इमेजिंग व्यय बड़े पैमाने पर उत्पादन
क्रायोइलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए मोनोलेयर ग्राफीन-लेपित ग्रिड का निर्माण
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Basanta, B., Chen, W., Pride, D. E., … More

Basanta, B., Chen, W., Pride, D. E., Lander, G. C. Fabrication of Monolayer Graphene-Coated Grids for Cryoelectron Microscopy. J. Vis. Exp. (199), e65702, doi:10.3791/65702 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter