Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Fabrikasjon av monolags grafenbelagte rister for kryoelektronmikroskopi

Published: September 8, 2023 doi: 10.3791/65702
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Department of Structural and Computational Biology, Scripps Research
* These authors contributed equally

Summary

Her beskriver vi en protokoll for å påføre et enkelt monolag av grafen til elektronmikroskopigitter og hvordan de skal klargjøres for bruk i kryoEM-strukturbestemmelse.

Abstract

Kryogen elektronmikroskopi (cryoEM) har dukket opp som en kraftig teknikk for å undersøke atomstrukturen til makromolekylære komplekser. Prøvepreparering for kryoEM krever konservering av prøver i et tynt lag av glassaktig is, vanligvis suspendert i hullene i en fenestrert støttefilm. Imidlertid eksponerer alle vanlige prøveprepareringsmetoder for kryoEM-studier prøven for luft-vanngrensesnittet, noe som introduserer en sterk hydrofob effekt på prøven som ofte resulterer i denaturering, aggregering og kompleks dissosiasjon. Videre påvirker foretrukne hydrofobe interaksjoner mellom regioner av prøven og luft-vanngrensesnittet orienteringene som er vedtatt av makromolekylene, noe som resulterer i 3D-rekonstruksjoner med anisotrop retningsoppløsning.

Adsorbsjon av cryoEM-prøver til et monolag av grafen har vist seg å bidra til å redusere interaksjoner med luft-vanngrensesnittet samtidig som innføringen av bakgrunnsstøy minimeres. Grafenstøtter gir også fordelen av å redusere den nødvendige konsentrasjonen av proteiner som kreves for kryoEM-avbildning betydelig. Til tross for fordelene med disse støttene, er grafenbelagte nett ikke mye brukt av kryoEM-samfunnet på grunn av uoverkommelige kostnader for kommersielle alternativer og utfordringene forbundet med storskala intern produksjon. Dette papiret beskriver en effektiv metode for å forberede partier av kryoEM-nett som har nesten full dekning av monolags grafen.

Introduction

Enkeltpartikkelkryogen elektronmikroskopi (kryoEM) er en stadig mer anvendelig teknologi som brukes til å undersøke 3D-strukturer av biomakromolekyler. Teknologiske fremskritt innen elektronmikroskoptikk, direkte elektrondeteksjon1 og datamaskinalgoritmer 2,3,4 i løpet av det siste tiåret har gjort det mulig for cryoEM-brukere å bestemme strukturene til biokjemisk stabile makromolekylære komplekser til nær atomoppløsning 5,6,7,8 . Til tross for disse fremskrittene er det fortsatt bemerkelsesverdige barrierer for å bevare prøver for kryoEM-avbildning, noe som forhindrer at flertallet av biologiske prøver blir løst til slike høye oppløsninger.

Prøvepreparering for høyoppløselig kryoEM-analyse innebærer å fange makromolekyler som er jevnt fordelt i et bredt spekter av orienteringer i et tynt lag av forglasset is. "Blot and plunge" -metodene for frysing er de mest brukte metodene som brukes til å generere tynne filmer av biologiske prøver på rutenett for cryoEM-studier 9,10. Disse metodene innebærer å påføre noen mikroliter prøveløsning på et EM-rutenett som inneholder en fenestrert film som er gjort hydrofil og deretter blotte bort størstedelen av prøven med filterpapir før du raskt kaster rutenettet inn i en kryogen av flytende etan eller etan-propanblanding9.

Selv om denne metoden med hell har blitt brukt til å bestemme strukturer av et bredt spekter av biologiske prøver, eksponerer alle vanlige kryoEM-prøveprepareringsmetoder prøver for det hydrofobe luft-vanngrensesnittet (AWI), som ofte introduserer problemer som begrenser strukturbestemmelse med høy oppløsning. Det er fastslått at biologiske prøver har en høy tilbøyelighet til å denaturere når de utsettes for AWI, noe som kan føre til kompleks aggregering og demontering11,12,13,14. Videre fører hydrofobe flekker på overflaten av biologiske prøver til at partikler får foretrukne retninger i isen12. I mange scenarier tvinger en enkelt hydrofob region av prøven alle partikler til å vedta en singulær orientering i isen, og dermed avskaffe evnen til å generere en pålitelig rekonstruksjon. I tillegg til problemer med AWI, kan prøver demonstrere en affinitet for overflaten av det fenestrerte laget av film, noe som begrenser antall partikler suspendert i isen i hullene15.

Flere metodiske og teknologiske løsninger er utviklet for å redusere disse problemene som oppstår ved interaksjon med AWI eller filmene16,17. En populær tilnærming er å belegge den fenestrerte filmen til EM-nettene med et tynt (titalls nanometer) lag av amorft karbon. Dette belegget gir en kontinuerlig overflate over hullene som partikler kan adsorbere, med fordelen av delvis skjerming av prøven fra interaksjoner med AWI15,18,19,20. Det ekstra karbonlaget øker imidlertid mengden bakgrunnssignal i de avbildede områdene, og introduserer støy som kan kompromittere oppnåelig oppløsning, spesielt for små (<150 kDa) prøver. I de senere år har bruken av grafenoksid (GO) flak for å produsere støttefilmer på kryoEM-nett vist seg å ha fordeler i forhold til tradisjonelt amorft karbon. GO-flak produseres gjennom oksidasjon av grafittlag, noe som resulterer i pseudokrystallinske ark av monolagsgrafitt som er hydrofile på grunn av deres betydelige oksygeninnhold i form av karboksyl-, hydroksyl- og epoksygrupper på overflatene og kantene. Kommersielle GO-flak i vandige suspensjoner er billige, og det er mange publiserte metoder for å påføre GO-flak på EM-nett18,21. Imidlertid resulterer disse metodene ofte i rutenett som bare er delvis dekket med GO-flak, samt regioner som inneholder flere lag med GO-flak. Videre bidrar GO-flak med et merkbart bakgrunnssignal til cryoEM-bilder som er nær det som er observert med tynt amorft karbon22,23.

Uberørt monolagsgrafen, som består av et enkelt 2D-krystallinsk utvalg av karbonatomer, er forskjellig fra GO ved at det ikke produserer fasekontrast i elektronmikroskopet. Monolags grafén kan dermed brukes til å generere et usynlig støttelag for avbildning av biologiske prøver. Monolagsgrafen er også sterkere enn GO og kan påføres som et enkelt monolag på et EM-rutenett, og nylige fremskritt innen fabrikasjon av grafenbelagte EM-nett har gjort det mulig å forberede høydekkende monolags grafengitter internt 24,25,26,27,28,29,30 . Til tross for fordelene ved å bruke grafenbelagte nett for bestemmelse av kryoEM-struktur, er de imidlertid ikke mye brukt på grunn av den uoverkommelige kostnaden for kommersielle alternativer og kompleksiteten i intern produksjon. Her beskriver vi en trinnvis veiledning for effektivt å produsere EM-nett dekket med et monolag grafen for kryoEM-strukturbestemmelse av biologiske prøver (figur 1). Ved å følge denne detaljerte protokollen kan cryoEM-forskere reproduserbart forberede dusinvis av høykvalitets grafenstøttenett på en enkelt dag. Kvaliteten på de grafenbelagte nettene kan lett undersøkes ved hjelp av et lav-end transmisjonselektronmikroskop (TEM) utstyrt med et LaB6-filament.

Protocol

1. Forberedelse av materialer og tilbehør som er nødvendig for fremstilling av grafennett

MERK: Grafen forurenser lett, noe som reduserer effektiviteten av grafenbelegg og kvaliteten på grafennettene; Derfor er det viktig å rengjøre alle materialer som kommer i kontakt med grafen grundig. Klargjøring av materialer og alle trinn skal skjæres ut i en avtrekkshette.

  1. Samle de nødvendige materialene som skal brukes til å belegge ristene med grafen (figur 2A).
  2. Skyll glasset flere ganger med avionisert (DI) vann for å fjerne støv, lo og oljeaktige rester.
  3. Bruk engangskluter til å rengjøre glassdeksler med 75% etanol og bruk en luftstøver for å fjerne forurensninger.
    MERK: Den klemmende TEM-gitterholderblokken som brukes i denne protokollen, kan inneholde opptil 45 rutenett. For en stor batchproduksjon av grafennett kan 45 nett eller mindre utarbeides samtidig. Det anbefales imidlertid å starte med en liten batchproduksjon (fire til seks nett) til metoden er etablert i laboratoriet.

2. Fremstilling av 0,2 M ammoniumpersulfat (APS) i vann

MERK: Denne APS-løsningen brukes som en etsemiddel for å fjerne kobberstøtten (Cu) fra grafen / Cu-arket i et senere trinn. Forbered alltid fersk APS-løsning. Gjenbrukte eller gamle løsninger vil ikke etse kobber effektivt og kan etterlate kobberrester på grafen i de senere trinnene.

  1. Skyll en 500 ml kolbe med avionisert vann (DI) vann, tilsett deretter 200 ml DI-vann og mikrobølgeovn med maksimale innstillinger i ca. 1 min for å avgasse vannet.
  2. Tilsett 9 g ammoniumpersulfat til 200 ml DI-vann for å produsere en løsning på 0,2 M APS.
    FORSIKTIG: APS er giftig, det anbefales å bruke personlig verneutstyr (PPE) ved håndtering av APS. Kast APS-avfall i et godkjent avfallsanlegg.
  3. Rør oppløsningen med en rørestang på en magnetomrører mens kolben kobles til en vakuumkilde under en avtrekkshette.
    MERK: Avgassing av APS-løsning vil bidra til å forhindre dannelse av bobler, noe som kan redusere effektiviteten til Cu-etsing i trinn 6.

3. Overfør grafen / kobber til et rent deksel med et stykke blottingspapir

MERK: Vi bruker en 15 x 15 cm kjemisk dampavsetning (CVD) grafenfilm på Cu fra en grafenleverandør. Kommersielt kjøpte monolags grafen / Cu-ark skal lagres under vakuum. Siden grafen dyrkes på begge sider av Cu ved CVD-metoden, utfører grafenleverandører generelt kvalitetskontroller og anbefaler den bedre siden for bruk. Vi refererer til denne anbefalte siden av grafén som "topp" side mens den andre siden er "baksiden" i denne protokollen.

  1. Klipp et stykke blottingspapir i en rektangulær form ca. 20 mm x 40 mm. Dette blottingspapiret brukes som polstring for grafen / Cu-arket og vil absorbere overflødig metylmetakrylat (MMA (8.5) MMA EL6) som brukes til å belegge grafen / Cu-arket; Sørg derfor for å kutte den i en størrelse som er større enn grafen / Cu-arket som skal brukes.
  2. Bruk polyimidtape til å tape de fire hjørnene på blottpapiret til toppen av et rent deksel som passer inn i en hjemmelaget spinnfrakk.
    MERK: Polyimidtape brukes fordi den er tynn og lett kan fjernes, noe som gjør håndteringen enkel.
  3. Fjern ett stykke av grafen / Cu-arket fra vakuumlageret.
  4. Bruk ren og støvfri saks til å forsiktig kutte en liten firkant av Cu-graphene-arket som vil være tilstrekkelig til å dekke antall rutenett som skal tilberedes. For 25 rutenett arrangert i en 5 x 5 matrise, for eksempel, kutt et stykke som er 18 mm x 18 mm. Legg grafen / Cu-arket på toppen av blottpapiret med ren, tørr pinsett. Forsikre deg om at baksiden av grafen / Cu-arket vender ned, og vær forsiktig så du ikke ved et uhell vender grafen / Cu-arket, siden det er vanskelig å skille oversiden fra baksiden.
  5. Tape de fire hjørnene av grafen / Cu-arket til blottpapiret / omslagsseddelen, og minimer kontakten mellom båndet og grafen / Cu-arket, siden eventuelle regioner dekket med tape ikke vil bli dekket med MMA i neste trinn.
    MERK: Statisk utladning kan skade grafenfilmer, og det anbefales derfor å forbli elektrisk jordet og minimere akkumulering av statisk ladning ved håndtering av grafen eller grafennett. Dette kan oppnås ved å bruke en jordingsstropp på håndleddet eller berøre en jordet metallgjenstand umiddelbart før håndtering av grafen eller grafengitter.

4. Belegg enkeltlags grafen / Cu-arket med et tynt lag MMA (8.5) MMA EL6 (MMA)

MERK: Etter at Cu er etset bort, vil dette laget av MMA støtte grafenmonolaget for å muliggjøre håndtering av grafenarket i fremtidige trinn. MMA-belegg muliggjør også visualisering av grafenfilmen, siden et monolag av grafen alene ville være gjennomsiktig.

  1. Plasser dekselet med tapet grafen / Cu-arket på en hjemmelaget spinnbelegger (dette kan monteres ved hjelp av en datamaskinvifte) inne i en avtrekkshette (figur 2B), som tidligere beskrevet av Han et al.25.
  2. Bruk vernebriller, tilsett to dråper MMA ved hjelp av en glasspipette på grafenarket og begynn umiddelbart å spinne med maksimal hastighet.
  3. Mens du spinner, legg til to dråper i midten. Spinn i 1 min.
    MERK: Pass på at tilstrekkelig MMA er påført for å belegge grafén helt. Hvis du er usikker, legg til noen flere dråper. Hvis grafen ikke er fullstendig belagt, vises "hull" i filmen etter at Cu er etset bort.
  4. La lufttørke i 10 minutter inne i en avtrekkshette.

5. Fjern grafen på baksiden av grafen / Cu-arket

MERK: Grafen dyrket på baksiden av kobberet (siden som ikke er belagt med MMA) må fjernes før du går videre til de påfølgende trinnene fordi dette overskytende grafen vil redusere effektiviteten av Cu-etsing. Vi fjerner denne grafen ved å utsette grafen for plasma, som kan oppnås ved hjelp av en hvilken som helst glødeutladningsanordning som vanligvis brukes til å forberede EM-rutenett for biologisk prøvepreparering.

  1. Fjern båndet forsiktig og løft det MMA-belagte grafen / Cu-arket fra dekselet med ren, tørr pinsett.
  2. Teip biten av MMA / grafen / Cu-arket med MMA-siden ned til et rent og støvfritt glassdeksel.
  3. Plasser dekselet med MMA / grafen / Cu-arket i glødeutladningsenheten og bruk innstillinger som vanligvis vil bli brukt når du forbereder rister for negativ flekk eller klargjøring av kryoEM-prøver.
    MERK: Langvarig glødutladning bør unngås for å forhindre oksidasjon av Cu på baksiden, noe som kan føre til forurensning av kobberoksid (CuO) (nano) partikler på grafenfilm.

6. Ets bort Cu fra MMA / grafen / Cu-arket i APS-løsningen

  1. Hell 200 ml av den nylagde APS-oppløsningen i en avtrekkshette i en ren og støvfri krystalliserende skål (150 x 75 mm).
  2. Fjern MMA / grafen / Cu-arket fra glassglasset. Hold oversikt over hvilken side som inneholder MMA.
  3. For å begynne etsningen, plasser MMA / grafen / Cu-arket med den plasmabehandlede Cu-siden ned på overflaten av APS-løsningen. Dekk det brede glassbegeret med et stykke aluminiumsfolie eller et lokk for å forhindre at støv kommer inn.
  4. Inkubere i 3 timer. Hvis mesteparten av Cu-en ikke er etset etter 1 time, gjentar du trinnene i del 2-6 og fortsetter deretter til neste trinn.
    MERK: Hvis det meste av Cu ikke er etset etter 1 time, er det sannsynlig at MMA / grafensiden av filmen er plassert ned på overflaten av APS-løsningen i stedet for Cu-siden. Cu skal etses helt etter 3 timer, og MMA / grafenfilmen er fargeløs hvis Cu er etset helt. Grafen forurenser lett, så sørg for å dekke eventuelle beholdere for å unngå opphopning av lo eller fettete rester på overflater, da dette vil påvirke kvaliteten på grafen negativt.

7. Skyll MMA/grafenfilmen i DI-vann

  1. Fyll en ren og støvfri krystalliserende tallerken med DI-vann i en avtrekkshette.
  2. Øs forsiktig opp grafen-MMA-filmen med et rent, støvfritt glassdeksel plassert i ~ 45 ° vinkel i forhold til APS-løsningsoverflaten.
  3. Plasser glasssklien i nesten 90° vinkel mot vannet, og senk glassdekselet forsiktig ned i vannet slik at MMA/grafén sakte glir av sklien og flyter på vannoverflaten.
  4. La MMA / grafenfilmen ligge på vannoverflaten i 1 time for å vaske av eventuelle APS.

8. Rengjør ristene som skal belegges med et monolag av grafen

MERKNAD: Ristene som grafen skal overføres til, må være så rene som mulig for å maksimere festingen av grafen til gitterfolieoverflaten. Kommersielt innkjøpte nett inneholder ofte restforurensninger som må fjernes før grafenoverføring.

  1. Rengjør og tørk tre krystalliserende tallerkener slik at de er fri for støv.
  2. Hell 200 ml kloroform, aceton og isopropylalkohol (IPA) i hver av de tre krystalliserende fatene i en avtrekkshette. Dekk krystalliserende skåler med aluminiumsfolie for å minimere fordampningen av de organiske løsningsmidlene.
    FORSIKTIG: Kloroform og aceton forårsaker hudirritasjon og kan være giftig ved innånding. Begrens eksponeringen for disse organiske løsemidlene og bruk PPE.
  3. Plasser bunnen av klemmeholderblokken TEM i bunnen av den første krystalliseringsfatet som inneholder 200 ml kloroform.
  4. Overfør hvert rutenett individuelt fra gitterboksen til en brønn i gitterholderblokken, slik at den fenestrerte filmsiden vender oppover. Dekk krystalliseringsfatet med aluminiumsfolie, legg det på en orbital shaker og rist forsiktig i 30 minutter.
  5. Plasser metalllokket på gitterholderblokken, som vil sikre ristene under overføringen til neste krystalliseringsfat. Løft gitterholderblokken forsiktig ut av krystalliseringsfatet med en bøyd gaffel og lang pinsett og legg den i bunnen av den andre krystalliseringsfatet som inneholder 200 ml aceton. Fjern lokket fra gitterholderblokken og rist forsiktig på en orbital shaker i 30 minutter.
  6. Plasser lokket på gitterholderblokken og overfør til en krystalliserende tallerken som inneholder 200 ml IPA-oppløsning for å rense av acetonrester. Fjern lokket fra gitterholderblokken og rist forsiktig i 20 minutter.
  7. Overfør rutenettene individuelt med den fenestrerte filmsiden vendt opp fra gitterholderblokken til en glassfatfat dekket med blottingspapir.
  8. Tørk ristene i minst 30 minutter under avtrekkshetten, og sørg for at ristene er dekket for å forhindre at støv lander på den.

9. Overfør de rene ristene til blottpapir plassert på et netting av rustfritt stål eller perforert brett under DI-vann

MERK: Rister må være nedsenket under DI-vann på en flat overflate slik at grafen kan flyte på vannet og senkes ned på ristene. Dette kan utføres ved hjelp av et kommersielt rutenettbelegg eller med en petriskål og en peristaltisk pumpe, som brukes til å generere grafenoksydgitter, som beskrevet av Palovcak et al.18.

  1. Plasser nettet eller brettet i rustfritt stål i et rutenett og skyll med DI-vann.
  2. Klipp blottpapiret som er litt mindre enn nettet / brettet i rustfritt stål og legg det på toppen av plattformen, nedsenket i DI-vannet.
    MERK: Blottpapiret er litt mindre enn plattformen for å muliggjøre bevegelse og håndtering.
  3. Overfør forsiktig de rengjorte ristene med den fenestrerte filmsiden vendt opp på toppen av blottpapiret. Ristene vil sannsynligvis være hydrofobe, så senk ristene ned i vannet vertikalt, eller de kan bøye seg på grunn av vannspenning. Plasser rutenettene i en firkantet matrise slik at de er så nær hverandre som mulig, men ikke overlappende (figur 2C).
  4. Ristene er nå klare til å bli belagt med et grafenmonolag. Fyll rutenettbeleggstrauet med mer DI-vann slik at vannoverflaten er minst 5 mm over ristene.

10. Overfør grafén til nettene

  1. Ta forsiktig ut MMA / grafenfilmen fra krystalliseringsfatet med et rent deksel ved å senke dekselet sakte ned i trauet i en vinkel, et stykke unna grafenfilmen. Plasser dekselet under grafen-MMA-arket slik at kantene på arket og dekselet er parallelle, og løft deretter dekselet vertikalt ut av vannet, og ta MMA / grafenfilmen med den.
  2. Overfør MMA / grafenfilmen til trauet ved å senke dekselet i vannet i en ~ 45 ° vinkel, slik at MMA / grafenfilmen løsner fra dekselet og flyter på overflaten av vannet.
  3. Plasser MMA/grafénfilmen rett over ristene før vannstanden senkes. Bruk en Pasteur-pipette av glass hvis spiss er smeltet for å forsegle åpningen for å forsiktig manipulere posisjonen til MMA / grafenfilmen.
  4. Senk vannstanden langsomt med sprøyten ved ca. 1,25 ml/min, slik at MMA/grafenfilmen dekker ristflatene fullstendig når den lander på filterpapiret
    MERK: Ytterligere manipulering av grafen-MMA-arket kan være nødvendig for å opprettholde sin posisjon over ristene når vannstanden synker.
  5. Bruk en ren, tørr pinsett til å løfte blottpapiret som holder ristene til en ren, tørr, støvfri petriskål, eller overfør hele plattformen i rustfritt stål.
  6. Lufttørk MMA/grafénristene i minst 30 minutter under avtrekkshetten. Hold ristene dekket med aluminiumsfolie eller et lokk for å forhindre forurensning fra støvpartikler.
  7. Overfør ristene til en inkubator og stek ristene i en 65 ° C inkubator i 30 minutter.
  8. Fjern ristene fra inkubatoren og la dem være dekket i 5 minutter ved romtemperatur for å avkjøle ristene til romtemperatur.

11. Fjerne MMA og rengjøre ristene

MERK: MMA må vaskes grundig av i aceton for å forhindre gjenværende MMA på de grafenbelagte ristene.

  1. I en avtrekksventilator tilberedes to krystalliserende tallerkener som inneholder 200 ml aceton og en krystalliserende tallerken som inneholder 200 ml isopropanol (IPA) ved romtemperatur. Dekk krystalliserende skåler med aluminiumsfolie for å minimere fordampningen av de organiske løsningsmidlene.
    FORSIKTIG: Bruk PPE når du håndterer aceton, da det kan forårsake hudirritasjon og kan være skadelig ved innånding.
  2. Plasser basen av klemmeholderblokken TEM i bunnen av den første krystalliseringsfatet som inneholder 200 ml fersk aceton.
  3. Overfør hvert rutenett individuelt fra blottpapiret til en brønn i gitterholderblokken, slik at MMA-siden vender oppover. Dekk krystalliseringsfatet med folie, legg det på en orbital shaker og rist forsiktig i 30 minutter.
  4. Plasser metalllokket på gitterholderblokken, som vil sikre ristene under overføringen til neste krystalliseringsfat. Løft gitterholderblokken forsiktig ut av krystalliseringsfatet med en bøyd gaffel og lang pinsett og legg den i bunnen av den andre krystalliseringsfatet som inneholder 200 ml fersk aceton. Fjern lokket fra gitterholderblokken og rist forsiktig på en orbital shaker i 30 minutter.
  5. Plasser lokket på gitterholderblokken og overfør til krystalliseringsfatet som inneholder 200 ml IPA-oppløsning for å rense av acetonrester. Fjern lokket fra gitterholderblokken og rist forsiktig i 20 minutter.
  6. Overfør ristene til et lite glass petriskål dekket med blottpapir og lufttørk ristene i minst 10 minutter. Hold ristene dekket med et lokk for å forhindre forurensning fra støvpartikler.
  7. Rister er klare til bruk eller overføres til en gitterkasse innpakket med aluminiumsfolie inne i en vakuumtørker.
    MERK: Lagring av grafengitter inne i en vakuumtørker kan forhindre forurensning av hydrofobe partikler fra omgivelsesforhold. Disse ristene kan lagres i opptil flere måneder før bruk27.

12. Gjør grafengitter hydrofile med UV / ozonbehandling

MERK: Grafen er ekstremt hydrofob, noe som ikke er kompatibelt med cryoEM-prøvepreparering, siden blot-stupe-tilnærminger krever en hydrofil overflate hvorpå en dråpe prøve kan spre seg jevnt. Mens tradisjonelle glødeutladningsanordninger kan konfigureres til å forsiktig pulsere plasma for å gjøre grafenoverflaten hydrofil, har disse enhetene en tendens til å ødelegge det tynne grafenmonolaget. Det ble tidligere vist at en UV / ozonrenser kan brukes til å delvis oksygenere overflaten av grafen25, noe som gjør den hydrofil for kryoEM-prøvepreparering uten å skade monolaget.

  1. Hvis du bruker et UV/ozon-system som krever grunning, må du slå på systemet og klargjøre lampen i 10 minutter (sørg for at ingen rister eksponeres på dette trinnet). Mens UV/ozon-renseren grunner, fjern ristene fra vakuumtørkeren og overfør dem til et rent deksel.
  2. Når UV / Ozon-systemet er klart, plasser dekselet som inneholder ristene med grafensiden vendt opp i UV / ozonrenseren, og utsett ristene for ozongassen i 4 minutter.
  3. Etter eksponering for ozon, bruk ristene umiddelbart for klargjøring av cryoEM-prøver.
    MERK: Hvis du bruker et UV / ozonsystem som krever grunning, må ristene plasseres i rengjøringsmiddelet umiddelbart etter at lampen har blitt primet i 10 minutter, eller det vil være for kjølig til å produsere tilstrekkelig ozongass til å oksygenere grafenet for prøvepreparering. Ikke utsett ristene for ozongassen i mer enn 6 minutter, da det vil ødelegge grafenlaget.

Representative Results

Vellykket utførelse av grafengitterprotokollen beskrevet her vil resultere i EM-nett som er fullt belagt med et enkelt monolag av grafen. Graféndekning av nettene kan kontrolleres ved hjelp av hvilken som helst TEM. Siden et monolag av ren grafen er nesten usynlig i TEM, må man undersøke det ved hjelp av mikroskopets diffraksjonsmodus og observere Bragg-flekker som svarer til den sekskantede organisasjonen av karbonatomer som utgjør grafen (figur 3A). Det er normalt å av og til observere noen rynker av monolags grafen, som introduseres under MMA-belegg (figur 3B). Man kan også sjekke forurensningsnivået som er tilstede på grafen ved å skaffe seg et høyt forstørrelsesbilde i midten av et av de grafendekkede hullene (figur 3C). Hvis det er tatt med en høyoppløselig detektor, bør en Fourier-transformasjon av dette bildet inneholde Bragg-flekker som tilsvarer karbon-karbonavstand ved 2,14 Å (figur 4C). Et monolag av karbonatomer produserer ikke tilstrekkelig elektronspredning til å generere fasekontrast, og dermed vil et bilde av ren grafen ikke presentere Thon-ringer assosiert med kontrastoverføringsfunksjonen i en Fouriertransformasjon av bildet. Det er imidlertid svært vanskelig å forhindre forurensning av grafengitter etter at de er produsert, og utilstrekkelig vask av EM-ristene eller fjerning av MMA etter grafenbelegg vil resultere i merkbare forurensninger på ristene som er synlige i de virkelige bildene (figur 3C). Som vist i figur 4 har grafennett en konsentrerende effekt på en prøve, som observert ved sammenligning av 0,5 mg / ml apoferritin påføres holey gullgitter med (figur 4A) og uten grafenstøtte (figur 4B). Lignende grafenfabrikasjonsprotokoller har tidligere blitt beskrevet for å løse kryoEM-strukturer av proteiner som apoferritin med høy oppløsning25,27.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk fremstilling av grafenbelagte kryoEM-nett. Viktige trinn i prosessen med grafengitterfabrikasjon er illustrert. Forkortelser: cryoEM = kryogen elektronmikroskopi; MMA = metylmetakrylat; APS = ammoniumpersulfat. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Nødvendige materialer for å lage grafengitter. (A) Nødvendige materialer for å belegge kryo-EM-gitter er merket tilsvarende. (B) Nærbilde av frakken med grafen / Cu-ark tapet på et blottingspapir på et glassglass. Spinnbeleggeren kan monteres ved å kjøpe deler fra en lokal datamaskin/jernvarehandel. (C) Nærbilde av gitterbeleggstrauet festet til en sprøyte som kan brukes til å kontrollere vannstanden. Rister er plassert på toppen av et blottingspapir på et rustfritt stålnett. Blottpapiret hjelper til med å manøvrere plasseringen av rutenettene, slik at grafenarket kan tilpasses det. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Et representativt diffraksjonsmønsterbilde og lyse feltbilder av et grafenrutenett som viser rynker eller MMA-forurensning . (A) EM-rutenett dekket med et monolag av grafen vil vise Bragg-topper som tilsvarer det sekskantede gitteret til grafen når de avbildes i en TEM i diffraksjonsmodus. Bragg-toppen som tilsvarer karbon-karbonavstanden på 2,14 Å er sirklet og betegnet med en pil. (B) Et lyst feltbilde av et monolags grafenrutenett med noen rynker (betegnet med en pil) i grafenmonolaget. (C) Et lysfeltbilde av monolags grafen med MMA-forurensning (betegnet med en pil). Skalastenger = 100 nm (B,C). Forkortelser: EM = elektronmikroskopi; MMA = metylmetakrylat. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Apoferritin på grafendekkede gullgitter: (A) CryoEM-mikrografi av 0,5 mg/ml apoferritin på grafenbelagte gullgitter. (B) Apoferritin avbildet i samme konsentrasjon er synlig ved vesentlig lavere konsentrasjon når den fremstilles ved hjelp av holey gullgitter uten grafen. (C) FFT av kryoEM-mikrografen på 0,5 mg / ml apoferritin på grafenbelagte gullgitter, med Bragg-toppene som tilsvarer det sekskantede grafengitteret betegnet. Skalastenger = 100 nm (A,B). Forkortelser: cryoEM = kryogen elektronmikroskopi; FFT = rask Fourier-transformasjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Bevaring av biologiske prøver i et tynt lag av glassaktig is er et kritisk viktig skritt for høyoppløselig kryoEM-strukturbestemmelse. Imidlertid støter forskere ofte på problemer som oppstår ved interaksjoner med AWI, som introduserer foretrukket orientering, kompleks demontering, denaturering og aggregering. Videre kan prøvene ikke alltid konsentreres tilstrekkelig til å fylle den tynne isen som henger over hullene i en fenestrert film. Flere forskningsgrupper har utviklet metoder for å belegge EM-nett med et monolag av grafen for å overvinne noen av disse begrensningene 24,25,26,27,28,29,30, og grafennett har blitt brukt med stor suksess. Her gir vi trinnvise instruksjoner for effektivt å forberede batcher av grafennett internt og undersøke kvaliteten på grafennettene av TEM. Vi understreker at det bør utvises spesiell forsiktighet under noen av de kritiske trinnene, som vi skisserer nedenfor.

Grafen har en sterk tendens til å tiltrekke seg luftbårne forurensninger. Derfor, under grafengitterfabrikasjonsprosessen, er det viktig å sørge for at alle verktøyene som kommer i kontakt med grafen / Cu-arket eller ristene er rene og støvfrie. Glassdeksler som brukes til å overføre grafen kan rengjøres ved å skylle med etanol og DI-vann eller bruke en luftstøver. Det anbefales også å arbeide under en avtrekkshette og holde grafenplater og rister dekket med folie eller en ren glassplate til enhver tid. Støv eller forurensninger på nettene kan forhindre grafen i å feste seg grundig til EM-nettene. Ved håndtering av grafen eller grafenbelagte nett er det viktig å være elektrisk jordet for å forhindre skade på grafenfilmen fra statisk utladning. Statisk utladning kan unngås ved å bruke en jordingsstropp på håndleddet, berøre en jordet metallgjenstand hver gang grafen- eller grafengitter håndteres, og / eller ikke ha på seg en hanske på hånden som holder pinsetten24.

Siden et monolag av grafen er veldig tynt (bredden på et karbonatom), er det viktig å støtte grafen med et organisk lag som MMA eller poly-MMA (PMMA) under overføring av grafen til nett. PMMA er det mest brukte materialet for grafenoverføring. PMMA har imidlertid en sterk affinitet med grafen og kan ofte resultere i polymerforurensning på grafenfilmen. MMA brukes i denne protokollen, da den etterlater mindre restforurensning25. Imidlertid har både PMMA og MMA den ulempen at de danner rynker og sprekker som kan observeres i enkelte områder av grafenfilmen (figur 3B). Det kan være utfordrende å unngå disse rynkene da de ofte forekommer under grafenvekst ved CVD-metoden31. Det er nylig utviklet en metode for dyrking av ultraflatt grafén uten rynker, der kobberfolien erstattes av en Cu(111)/safirskive som vekstsubstrat32.

Basert på vår erfaring er det bedre å kjøpe grafen / Cu-ark og støtte grafen med MMA internt enn å kjøpe polymerbelagte Cu-graphen-ark fra produsenter, som blir sprø etter kobberetsing og er vanskelige å håndtere i etterfølgende trinn. Spinnbelegget vi brukte til MMA-belegg kan bygges billig ved hjelp av deler fra en lokal datamaskin/jernvarehandel, som tidligere beskrevet25.

Under trinnet med MMA-belegg er det viktig å dekke hele grafenoverflaten på Cu-graphene-arket med MMA. Etter at Cu har blitt etset bort, vil MMA-grafen bli semi-gjennomsiktig, og områder som mangler MMA-dekning vil se ut som tomme hull. For å forhindre MMA-belegg på kobbersiden, er det viktig å plassere et lite stykke blottingspapir under det under belegget slik at det suger opp overflødig MMA som spinner ut fra CVD-filmen.

Etter etsing og skylling er MMA / grafenarket klart til å overføres til EM-nett ved å bruke et kommersielt eller hjemmelaget trausystem med sprøyte eller peristaltisk pumpe for å kontrollere vannstanden. Før overføringstrinnet er det viktig å skylle ristene grundig i påfølgende bad av kloroform, aceton og IPA. Baking av grafenbelagte rister ved 65 ° C bidrar til å bevare grafenintegritet og fremmer adsorpsjon av grafen til rutenettene. Til slutt, for å forhindre MMA-forurensning på ristene, er det viktig å fjerne MMA grundig i et acetonbad og rengjøre ristene i IPA. Eventuelle uvaskede MMA-rester vil bli observert på EM-rutenett og redusere signal-støy-forholdet mellom bildene (figur 3C). Aceton-IPA-vaskeprosessen kan gjentas for å rengjøre grafenoverflatene ytterligere.

For å gjøre graféngitter hydrofile, utsatte vi nettene for UV/ozon. Ulike modeller av UV / ozonrensere kan kreve optimalisering for å oksygenere grafenlaget tilstrekkelig for cryoEM-prøvepreparering uten å skade grafen. Uavhengig av systemet er det avgjørende å bruke disse ristene til cryoEM-prøveapplikasjon umiddelbart etter UV/ozonbehandling. Alternative metoder for å gjøre grafengitter hydrofile er beskrevet i andre studier33,34.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse.

Acknowledgments

Vi takker Dr. Xiao Fan for nyttige diskusjoner mens vi etablerte disse metodene på Scripps Research. B.B. ble støttet av et postdoktorstipendiat fra Hewitt Foundation for Medical Research. WC støttes av et National Science Foundation predoktorstipend. DEP støttes av National Institutes of Health (NIH) tilskudd NS095892 til GCL Dette prosjektet ble også støttet av NIH-tilskudd GM142196, GM143805 og S10OD032467 til G.C.L.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
70% EtOH Pharmco (190 pf EtOH) 241000190CSGL
Acetone Sigma Aldrich 650501-4L
Ammonium persulfate (APS) Sigma Aldrich 215589-500g Hazardous; use extreme caution
Chloroform Sigma Aldrich C2432-1L
Clamping TEM Grid Holder Block for 45 Grids PELCO 16830-45
Computer fan Amazon (Noctua) B07CG2PGY6
Cover slip Bellco Glass 1203J71 Standard cover slips
Crystallizing dish Pyrex 3140-100
Electronics duster Falcon Safety Products 75-37-6
Falcon Dust-off Air Duster Staples N/A
Filter papers Whatman 1001-055
Fine tip tweezer Dumont 0508-L4-PO
Flask Pyrex 4980-500
Fork Supermarket N/A
Glass pasteur pipette VWR 14672-608
Graphene/Cu Graphenea N/A CVD monolayer graphene cu
Grid Coating Trough Ladd Research Industries 10840 Fragile
Isopropanol Fisher Scientific 67-63-0
Kapton Tape Amazon (MYJOR) MY-RZY001 Polyimide tape
Kimwipes Fisher Scientific 06-666
Long twzeer Cole Parmer Essentials UX-07387-15
Metal grid holder Ted Pella 16820-81
MMA(8.5)MMA EL 6 KAYAKU Advanced Materials M31006 0500L 1GL Flammable
Model 10 Lab Oven Quincy Lab, Inc. FO19013
Petri dish Pyrex 3610-102
Plasma cleaner (Solarus 950) Gatan, Inc. N/A
Scissors Fiskars 194813-1010
Standard Analog Orbital Shaker VWR 89032-088
UltrAuFoil R1.2/1.3 - Au300 Quantifoil N/A Holey gold grids
Ultraviolet Ozone Cleaning Systems UVOCS model T10X10/OES

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Li, X., Zheng, S. Q., Egami, K., Agard, D. A., Cheng, Y. Influence of electron dose rate on electron counting images recorded with the K2 camera. Journal of Structural Biology. 184 (2), 251-260 (2013).
  2. Tang, G., et al. EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).
  3. Zivanov, J., et al. New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3. eLife. 7, 1-22 (2018).
  4. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. CryoSPARC: Algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  5. Grigorieff, N., Harrison, S. C. Near-atomic resolution reconstructions of icosahedral viruses from electron cryo-microscopy. Current Opinion in Structural Biology. 21 (2), 265-273 (2011).
  6. Nakane, T., et al. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).
  7. Zhang, K., Pintilie, G. D., Li, S., Schmid, M. F., Chiu, W. Resolving individual atoms of protein complex by cryo-electron microscopy. Cell Research. 30 (12), 1136-1139 (2020).
  8. Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM. Nature. 587 (7832), 157-161 (2020).
  9. Schultz, P. Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Quarterly Reviews of Biophysics. 21 (2), 129-228 (1988).
  10. Nguyen, H. P. M., McGuire, K. L., Cook, B. D., Herzik, M. A. Manual blot-and-plunge freezing of biological specimens for single-particle cryogenic electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. 2022 (180), 1-16 (2022).
  11. Glaeser, R. M. Proteins, interfaces, and cryo-em grids. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 25 (3), 289-313 (2016).
  12. Glaeser, R. M., Han, B. -G. Opinion: hazards faced by macromolecules when confined to thin aqueous films. Biophysics Reports. 3 (1-3), 1-7 (2017).
  13. Han, B. G., Watson, Z., Cate, J. H. D., Glaeser, R. M. Monolayer-crystal streptavidin support films provide an internal standard of cryo-EM image quality. Journal of Structural Biology. 200 (3), 307-313 (2017).
  14. Noble, A. J., et al. Routine single particle CryoEM sample and grid characterization by tomography. eLife. 7, 1-42 (2018).
  15. Drulyte, I., et al. Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 74 (6), 560-571 (2018).
  16. Liu, N., Wang, H. W. Better cryo-EM specimen preparation: how to deal with the air-water interface. Journal of Molecular Biology. 435 (9), 167926 (2022).
  17. Noble, A. J., et al. Reducing effects of particle adsorption to the air-water interface in cryo-EM. Nature Methods. 15 (10), 793-795 (2018).
  18. Palovcak, E., et al. A simple and robust procedure for preparing graphene-oxide cryo-EM grids. Journal of Structural Biology. 204 (1), 80-84 (2018).
  19. Patel, A., Toso, D., Litvak, A., Nogales, E. Efficient graphene oxide coating improves cryo-EM sample preparation and data collection from tilted grids. bioRxiv. , (2021).
  20. Marr, C. R., Benlekbir, S., Rubinstein, J. L. Fabrication of carbon films with ~500nm holes for cryo-EM with a direct detector device. Journal of Structural Biology. 185 (1), 42-47 (2014).
  21. Pantelic, R. S., Meyer, J. C., Kaiser, U., Baumeister, W., Plitzko, J. M. Graphene oxide: A substrate for optimizing preparations of frozen-hydrated samples. Journal of Structural Biology. 170 (1), 152-156 (2010).
  22. Pantelic, R. S., et al. Graphene: substrate preparation and introduction. Journal of Structural Biology. 174 (1), 234-238 (2011).
  23. Russo, C. J., Passmore, L. A. Progress towards an optimal specimen support for electron cryomicroscopy. Current Opinion in Structural Biology. 37, 81-89 (2016).
  24. Passmore, L. A., Russo, C. J. Specimen preparation for high-resolution cryo-EM. Methods in Enzymology. 579, 51-86 (2016).
  25. Han, Y., et al. High-yield monolayer graphene grids for near-atomic resolution cryoelectron microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (2), 1009-1014 (2020).
  26. Zheng, L., et al. Robust ultraclean atomically thin membranes for atomic-resolution electron microscopy. Nature Communications. 11 (1), 541 (2020).
  27. Ahn, E., Kim, B., Cho, U. -S. Batch production of high-quality graphene grids for cryo-EM: cryo-EM structure of Methylococcus capsulatus soluble methane monooxygenase hydroxylase. bioRxiv. (Cvd), (2021).
  28. Naydenova, K., Peet, M. J., Russo, C. J. Multifunctional graphene supports for electron cryomicroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (24), 11718-11724 (2019).
  29. Fan, H., Sun, F. Developing graphene grids for cryoelectron microscopy. Frontiers in Molecular Biosciences. 9, 937253 (2022).
  30. D'Imprima, E., et al. Protein denaturation at the air-water interface and how to prevent it. eLife. 8, e42747 (2019).
  31. Zhang, X., et al. Evolution of copper step beams during graphene growth by CVD method. Applied Surface Science. 610, 155518 (2023).
  32. Zheng, L., et al. Uniform thin ice on ultraflat graphene for high-resolution cryo-EM. Nature Methods. 20 (1), 123-130 (2023).
  33. Fujita, J., et al. Epoxidized graphene grid for highly efficient high-resolution cryoEM structural analysis. Scientific Reports. 13, 2279 (2023).
  34. Lu, Y., et al. Functionalized graphene grids with various charges for single-particle cryo-EM. Nature Communications. 13, 6718 (2022).

Tags

Fabrikasjon monolags grafenbelagte gitter kryoelektronmikroskopi prøvepreparering glassaktig is fenestrert støttefilm hydrofob effekt denaturering aggregering kompleks dissosiasjon hydrofobe interaksjoner 3D-rekonstruksjoner anisotrop retningsoppløsning grafenstøtter bakgrunnsstøy proteinkonsentrasjon kryoEM-avbildning utgifter storskala produksjon
Fabrikasjon av monolags grafenbelagte rister for kryoelektronmikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Basanta, B., Chen, W., Pride, D. E., … More

Basanta, B., Chen, W., Pride, D. E., Lander, G. C. Fabrication of Monolayer Graphene-Coated Grids for Cryoelectron Microscopy. J. Vis. Exp. (199), e65702, doi:10.3791/65702 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter