Summary
В этой статье мы опишем протокол нанесения одного монослоя графена на сетки электронной микроскопии и способы их подготовки к использованию в криоЭМ-определении.
Abstract
Криогенная электронная микроскопия (криоЭМ) стала мощным методом исследования атомной структуры высокомолекулярных комплексов. Подготовка образцов для криоЭМ требует сохранения образцов в тонком слое стекловидного льда, обычно подвешенного в отверстиях фенестрированной пленки. Тем не менее, все широко используемые подходы к подготовке образцов для криоЭМ-исследований подвергают образец воздействию границы раздела воздух-вода, оказывая на образец сильное гидрофобное воздействие, которое часто приводит к денатурации, агрегации и сложной диссоциации. Кроме того, предпочтительные гидрофобные взаимодействия между областями образца и границей раздела воздух-вода влияют на ориентацию, принятую макромолекулами, что приводит к 3D-реконструкции с анизотропным направленным разрешением.
Было показано, что адсорбция криоЭМ-образцов в монослой графена помогает смягчить взаимодействие с границей раздела воздух-вода, сводя к минимуму введение фонового шума. Преимущества графеновых носителей также заключаются в существенном снижении требуемой концентрации белков, необходимых для криоЭМ-визуализации. Несмотря на преимущества этих опор, сетки с графеновым покрытием не получили широкого распространения в сообществе криоЭМ из-за непомерно высокой стоимости коммерческих вариантов и проблем, связанных с крупномасштабным собственным производством. В данной работе описан эффективный метод получения партий криоЭМ-сеток, практически полностью покрытых монослойным графеном.
Introduction
Одночастичная криогенная электронная микроскопия (криоЭМ) становится все более применимой технологией, используемой для исследования 3D-структур биомакромолекул. Технологические достижения в области оптики электронного микроскопа, прямого детектирования электронов1 и компьютерных алгоритмов 2,3,4 за последнее десятилетие позволили пользователям криоЭМ определять структуры биохимически стабильных макромолекулярных комплексов с околоатомным разрешением 5,6,7,8 . Несмотря на эти достижения, остаются заметные препятствия для сохранения образцов для криоЭМ-визуализации, которые не позволяют большинству биологических образцов получить такое высокое разрешение.
Подготовка образцов для криоЭМ-анализа с высоким разрешением включает в себя захват макромолекул, которые равномерно распределены в широком диапазоне ориентаций в тонком слое стекловидного льда. Методы замораживания «блот и погружение» являются наиболее широко используемыми методами, применяемыми для получения тонких пленок биологических образцов на сетках для криоЭМ-исследований 9,10. Эти методы включают нанесение нескольких микролитров раствора образца на ЭМ-решетку, содержащую фенестрированную пленку, которая была сделана гидрофильной пленкой, и последующее промывание большей части образца фильтровальной бумагой перед быстрым погружением сетки в криоген жидкого этана или этан-пропановую смесь9.
Несмотря на то, что этот метод успешно используется для определения структуры широкого спектра биологических образцов, все широко используемые методы подготовки криоЭМ-образцов подвергают образцы воздействию гидрофобной границы воздух-вода (AWI), что часто приводит к проблемам, ограничивающим определение структуры с высоким разрешением. Установлено, что биологические образцы обладают высокой склонностью к денатурации при воздействии AWI, что может привести к сложной агрегации и разборке11,12,13,14. Кроме того, гидрофобные пятна на поверхности биологических образцов приводят к тому, что частицы принимают предпочтительную ориентацию во льду12. Во многих сценариях одна гидрофобная область образца вынуждает все частицы принимать единственную ориентацию во льду, тем самым лишая возможности создать надежную реконструкцию. В дополнение к проблемам с AWI, образцы могут демонстрировать сродство к поверхности фенестрированного слоя пленки, ограничивая количество частиц, взвешенных во льду в пределах отверстий15.
Было разработано несколько методологических и технологических решений, чтобы уменьшить эти проблемы, возникающие при взаимодействии с AWI или фильмами16,17. Один из популярных подходов заключается в покрытии фенестрированной пленки ЭМ-сеток тонким (десятки нанометров) слоем аморфного углерода. Это покрытие обеспечивает непрерывную поверхность через отверстия, к которой частицы могут адсорбироваться, с преимуществом частичного экранирования образца от взаимодействия с AWI 15,18,19,20. Однако дополнительный углеродный слой увеличивает количество фонового сигнала в областях изображения, внося шум, который может поставить под угрозу достижимое разрешение, особенно для небольших (<150 кДа) образцов. В последние годы было показано, что использование хлопьев оксида графена (GO) для производства поддерживающих пленок на криоЭМ-сетках имеет преимущества по сравнению с традиционным аморфным углеродом. Чешуйки GO образуются путем окисления слоев графита, в результате чего образуются псевдокристаллические листы монослойного графита, которые являются гидрофильными из-за значительного содержания кислорода в виде карбоксильных, гидроксильных и эпоксидных групп на поверхностях и кромках. Коммерческие хлопья ГО в водных суспензиях стоят недорого, и существует множество опубликованных методов нанесения хлопьев ГО на ЭМ-сетки18,21. Однако эти методы часто приводят к тому, что сетки лишь частично покрыты чешуйками GO, а также области, содержащие несколько слоев чешуек GO. Кроме того, хлопья GO вносят заметный фоновый сигнал в криоЭМ-изображения, близкий к тому, который наблюдается у тонкого аморфного углерода22,23.
Первозданный монослойный графен, состоящий из одной двумерной кристаллической матрицы атомов углерода, отличается от ГО тем, что он не создает фазового контраста в электронном микроскопе. Таким образом, монослойный графен может быть использован для создания невидимого поддерживающего слоя для визуализации биологических образцов. Монослойный графен также прочнее, чем GO, и может применяться как один монослой на электромагнитной сетке, а недавние достижения в производстве EM-сеток с графеновым покрытием позволили приготовить монослойные графеновые сетки с высоким покрытием на собственном производстве 24,25,26,27,28,29,30. Однако, несмотря на преимущества использования сеток с графеновым покрытием для определения криоЭМ-структуры, они не получили широкого распространения из-за непомерно высокой стоимости коммерческих вариантов и сложности собственного производства. В данной статье мы опишем пошаговое руководство по эффективному получению ЭМ-сеток, покрытых монослоем графена, для криоЭМ-определения структуры биологических образцов (рис. 1). Следуя этому подробному протоколу, исследователи криоЭМ могут воспроизводимо подготовить десятки высококачественных графеновых опорных сеток за один день. Качество сеток с графеновым покрытием можно легко проверить с помощью низкоклассного просвечивающего электронного микроскопа (ПЭМ), оснащенного нитью LaB6.
Protocol
1. Подготовка материалов и принадлежностей, необходимых для изготовления графеновых сеток
ПРИМЕЧАНИЕ: Графен легко загрязняется, что снижает эффективность графенового покрытия и качество графеновых сеток; Поэтому важно тщательно очищать все материалы, которые вступают в контакт с графеном. Подготовка материалов и все этапы должны осуществляться в вытяжном шкафу.
- Соберите необходимые материалы, которые будут использоваться для покрытия решеток графеном (рисунок 2А).
- Промойте стеклянную посуду несколько раз деионизированной (DI) водой, чтобы удалить пыль, ворс и маслянистые остатки.
- Используйте одноразовые салфетки для очистки стеклянных покрытий с 75% этанолом и используйте воздушную тряпку для удаления любых загрязнений.
ПРИМЕЧАНИЕ: Зажимной блок держателя сетки TEM, используемый в этом протоколе, может вмещать до 45 сеток. Для производства больших партий графеновых сеток можно приготовить сразу 45 сеток или меньше. Тем не менее, рекомендуется начинать с мелкосерийного производства (от четырех до шести сеток) до тех пор, пока метод не будет внедрен в лаборатории.
2. Приготовление 0,2 М персульфата аммония (АФС) в воде
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот раствор APS используется в качестве травления для удаления медной (Cu) основы с листа графена/Cu на более позднем этапе. Всегда готовьте свежий раствор APS. Повторно используемые или старые растворы не будут эффективно травить медь и могут оставить медный остаток на графене на более поздних этапах.
- Промойте колбу объемом 500 мл деионизированной водой (DI), затем добавьте 200 мл дедиционизированной воды и поставьте в микроволновую печь, используя максимальные настройки, примерно на 1 минуту, чтобы дегазировать воду.
- Добавьте 9 г персульфата аммония к 200 мл деионизированной воды, чтобы получить раствор 0,2 М АФС.
ВНИМАНИЕ: APS токсичен, рекомендуется использовать средства индивидуальной защиты (СИЗ) при работе с APS. Утилизируйте отходы APS на утвержденном заводе по утилизации отходов. - Перемешайте раствор мешалкой на магнитной мешалке, подключив колбу к источнику вакуума под вытяжным шкафом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Дегазация раствора APS поможет предотвратить образование пузырьков, которые могут снизить эффективность травления Cu на этапе 6.
3. Перенесите графен/медь на чистый покровный лист с помощью промокательной бумаги.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мы используем графеновую пленку 15 x 15 см для химического осаждения из газовой фазы (CVD) на Cu от поставщика графена. Коммерчески приобретенные монослойные листы графена/меди следует хранить в вакууме. Поскольку графен выращивается по обе стороны от Cu методом CVD, поставщики графена, как правило, проводят проверки качества и рекомендуют лучшую сторону для использования. Мы называем эту рекомендуемую сторону графена «верхней» стороной, в то время как другая сторона является «задней» стороной в этом протоколе.
- Отрежьте кусок промокательной бумаги в прямоугольную форму примерно 20 мм х 40 мм. Эта промокательная бумага используется в качестве прокладки для листа графена / меди и поглощает избыток метилметакрилата (MMA (8,5) MMA EL6), используемого для покрытия листа графена / меди; поэтому обязательно нарежьте его на размер, который больше, чем лист графена/меди, который будет использоваться.
- Используйте полиимидную ленту, чтобы прикрепить четыре угла промокательной бумаги к верхней части чистого покровного стекла, которое поместится в самодельную машину для нанесения покрытий.
ПРИМЕЧАНИЕ: Полиимидная лента используется, потому что она тонкая и легко снимается, что облегчает обращение. - Извлеките один кусок листа графена/меди из вакуумного хранилища.
- Используйте чистые и очищенные от пыли ножницы, чтобы аккуратно вырезать небольшой квадрат листа медного графена, которого будет достаточно, чтобы полностью покрыть количество готовых сеток. Например, для 25 сеток, расположенных в массиве 5 x 5, отрежьте кусок размером 18 мм x 18 мм. Положите лист графена/меди поверх промокательной бумаги чистым сухим пинцетом. Убедитесь, что тыльная сторона листа графена/меди обращена вниз, и будьте осторожны, чтобы случайно не перевернуть лист графена/меди, так как трудно отличить верхнюю сторону от обратной стороны.
- Прикрепите скотчем четыре угла листа графена/меди к промокательной бумаге/покровному листу, сводя к минимуму количество контакта между лентой и листом графена/меди, так как любые области, покрытые лентой, не будут покрыты MMA на следующем этапе.
ПРИМЕЧАНИЕ: Статический разряд может повредить графеновые пленки, поэтому рекомендуется оставаться электрически заземленным и свести к минимуму накопление статического заряда при работе с графеном или графеновыми сетками. Это можно сделать, надев заземляющий ремень на запястье или прикоснувшись к заземленному металлическому предмету непосредственно перед работой с графеном или графеновыми сетками.
4. Покройте однослойный лист графена/меди тонким слоем MMA(8.5)MMA EL6 (MMA)
ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как Cu будет вытравлен, этот слой MMA будет поддерживать монослой графена, чтобы обеспечить работу с графеновым листом на будущих этапах. Покрытие MMA также позволяет визуализировать графеновую пленку, поскольку монослой графена сам по себе будет прозрачным.
- Поместите защитный лист с приклеенным листом графена/меди на самодельную установку для нанесения покрытий (ее можно собрать с помощью компьютерного вентилятора) в вытяжной шкаф (рис. 2B), как ранее описано Han et al.25.
- Надев защитные очки, добавьте две капли ММА с помощью стеклянной пипетки на лист графена и сразу же начинайте вращаться на максимальной скорости.
- Во время отжима добавьте еще две капли в центр. Вращайте в течение 1 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что нанесено достаточное количество MMA для полного покрытия графена. Если не уверены, добавьте еще несколько капель. Если графен покрыт не полностью, то после травления Cu в пленке появляются «дыры». - Дайте высохнуть на воздухе в течение 10 минут в вытяжном шкафу.
5. Удалите графен с обратной стороны листа графена/меди.
ПРИМЕЧАНИЕ: Графен, выращенный на обратной стороне меди (стороне, не покрытой MMA), должен быть удален перед переходом к последующим шагам, потому что этот избыток графена снизит эффективность травления Cu. Мы удаляем этот графен, подвергая графен воздействию плазмы, что может быть достигнуто с помощью любого устройства тлеющего разряда, обычно используемого для подготовки электромагнитных решеток к подготовке биологических образцов.
- Осторожно снимите ленту и снимите лист графена/меди с покрытием MMA с покровного стекла чистым сухим пинцетом.
- Приклейте кусок листа MMA/графена/Cu стороной MMA вниз к чистому стеклянному защитному листу без пыли.
- Поместите покровный лист с листом MMA/графена/Cu в устройство тлеющего разряда и примените настройки, которые обычно используются при подготовке сеток для подготовки негативного пятна или криоЭМ-пробы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Следует избегать длительного тлеющего разряда, чтобы предотвратить окисление Cu на обратной стороне, что может привести к загрязнению частиц оксида меди (CuO) (нано)на графеновой пленке.
6. Вытравите Cu с листа MMA/графена/Cu в растворе APS.
- В вытяжном шкафу вылейте 200 мл свежеприготовленного раствора APS в чистую и очищенную от пыли кристаллизационную чашку (150 x 75 мм).
- Снимите лист MMA/графена/Cu со предметного стекла. Следите за тем, на чьей стороне находится ММА.
- Чтобы начать травление, поместите лист MMA/графена/Cu обработанной плазмой Cu стороной вниз на поверхность раствора APS. Накройте широкий стеклянный стакан куском алюминиевой фольги или крышкой, чтобы предотвратить попадание пыли.
- Выдерживают в течение 3 ч. Если большая часть Cu не протравливается через 1 ч, повторите шаги, описанные в разделах 2-6, а затем переходите к следующему шагу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если большая часть Cu не протравливается через 1 ч, вероятно, сторона пленки MMA/графена была помещена на поверхность раствора APS, а не сторона Cu. Cu должен быть полностью вытравлен через 3 ч, а пленка MMA/графена бесцветна, если Cu протравлен полностью. Графен легко загрязняется, поэтому обязательно накройте все контейнеры, чтобы избежать скопления ворса или любых жирных остатков на поверхностях, так как это негативно повлияет на качество графена.
7. Промойте пленку MMA/графена в деионизированной воде.
- В вытяжном шкафу наполните чистую и очищенную от пыли кристаллизующую чашку деионизированной водой.
- Аккуратно зачерпните графеновую пленку MMA чистым, очищенным от пыли стеклянным покровным стеклом, расположенным под углом ~45° по отношению к поверхности раствора APS.
- Расположите предметное стекло под углом почти 90 ° к воде и осторожно опустите стеклянный покров в воду так, чтобы MMA/графен медленно соскользнул с предметного стекла и плавал на поверхности воды.
- Оставьте пленку MMA/graphene на поверхности воды на 1 час, чтобы смыть APS.
8. Очистите сетки, подлежащие покрытию, монослоем графена.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сетки, на которые будет переноситься графен, должны быть как можно более чистыми, чтобы максимизировать прикрепление графена к поверхности сетки из фольги. Коммерчески приобретенные сетки часто содержат остаточные загрязняющие вещества, которые должны быть удалены перед переносом графена.
- Очистите и высушите три кристаллизующиеся чашки, чтобы на них не было пыли.
- В вытяжном шкафу налейте по 200 мл хлороформа, ацетона и изопропилового спирта (IPA) в каждую из трех кристаллизующихся чаш. Накройте кристаллизующую посуду алюминиевой фольгой, чтобы свести к минимуму испарение органических растворителей.
ВНИМАНИЕ: Хлороформ и ацетон вызывают раздражение кожи и могут быть токсичными при вдыхании. Ограничьте воздействие этих органических растворителей и носите СИЗ. - Поместите основание зажимного блока держателя сетки ПЭМ на дно первой кристаллизационной чашки, содержащей 200 мл хлороформа.
- Переместите каждую сетку по отдельности из коробки сетки в колодец в блоке держателя решетки, убедившись, что сторона фенестрированной пленки обращена вверх. Накройте форму для кристаллизации алюминиевой фольгой, поместите ее на орбитальный шейкер и аккуратно встряхивайте в течение 30 минут.
- Поместите металлическую крышку на блок держателя решетки, который закрепит решетки во время переноса в следующую кристаллизационную чашку. Изогнутой вилкой и длинным пинцетом осторожно извлеките блок держателя решетки из кристаллизационной чашки и поместите его на дно второй кристаллизационной чашки, содержащей 200 мл ацетона. Снимите крышку с блока держателя решетки и аккуратно встряхните на орбитальном шейкере в течение 30 минут.
- Накройте крышкой блок держателя решетки и переложите в кристаллизующую чашку, содержащую 200 мл раствора изопропилового спирта, чтобы удалить остатки ацетона. Снимите крышку с блока держателя решетки и аккуратно встряхивайте в течение 20 минут.
- По отдельности перенесите сетки стороной фенестрированной пленки вверх из блока держателя сетки в стеклянную чашку Петри, покрытую промокательной бумагой.
- Сушите решетки не менее 30 минут под вытяжным шкафом, следя за тем, чтобы решетки были накрыты, чтобы на них не попадала пыль.
9. Переложите чистые сетки на промокательную бумагу, помещенную на проволочную сетку из нержавеющей стали или перфорированный лоток под деионизированную воду.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сетки должны быть погружены в воду DI на плоской поверхности, чтобы графен можно было всплыть на воду и опустить на решетки. Это может быть выполнено с помощью коммерческого желоба с сетчатым покрытием или с помощью чашки Петри и перистальтического насоса, который используется для генерации сеток из оксида графена, как описано Palovcak et al.18.
- Поместите сетку или лоток из нержавеющей стали в желоб с решетчатым покрытием и промойте деионизированной водой.
- Отрежьте промокательную бумагу, которая немного меньше, чем сетка/лоток из нержавеющей стали, и положите ее на платформу, погрузив в воду DI.
ПРИМЕЧАНИЕ: Промокательная бумага немного меньше, чем платформа, чтобы облегчить перемещение и погрузочно-разгрузочные работы. - Аккуратно перенесите очищенные сетки фенестрированной пленкой стороной вверх на промокательную бумагу. Решетки, скорее всего, будут гидрофобными, поэтому погружайте решетки в воду вертикально, иначе они могут согнуться из-за натяжения воды. Расположите сетки в квадратном массиве так, чтобы они находились как можно ближе друг к другу, но не перекрывали друг друга (рис. 2C).
- Теперь сетки готовы к покрытию монослоем графена. Наполните желоб для покрытия решетки большим количеством DI-воды так, чтобы поверхность воды была не менее чем на 5 мм выше решетки.
10. Перенос графена в сетки
- Осторожно вычерпайте пленку MMA/графена из кристаллизующей чашки чистым покровным стеклом, медленно опустив покровное стекло в желоб под углом, на некотором расстоянии от графеновой пленки. Расположите покровный лист под листом графена-MMA так, чтобы края листа и покровного стекла были параллельны, а затем поднимите покровный лист вертикально из воды, прихватив с собой пленку MMA/графена.
- Перенесите пленку MMA/графена в желоб, опустив покровное стекло в воду под углом ~45°, чтобы пленка MMA/графена отделилась от покровного стекла и плавала на поверхности воды.
- Расположите пленку MMA/графена прямо над решетками до того, как уровень воды опустится. Используйте стеклянную пипетку Пастера, наконечник которой был оплавлен, чтобы закрыть отверстие, чтобы осторожно манипулировать положением пленки MMA/графена.
- Медленно понизьте уровень воды с помощью шприца примерно на 1,25 мл/мин так, чтобы пленка MMA/графена полностью покрывала поверхности сетки при попадании на фильтровальную бумагу
ПРИМЕЧАНИЕ: Могут потребоваться дальнейшие манипуляции с листом графена-MMA, чтобы сохранить его положение над сетками при падении уровня воды. - Используйте чистый, сухой пинцет, чтобы поднять промокательную бумагу, удерживающую решетки, в чистую, сухую, очищенную от пыли чашку Петри, или перенесите всю платформу из нержавеющей стали.
- Высушите решетки MMA/графена на воздухе не менее 30 минут под вытяжным шкафом. Держите решетки накрытыми алюминиевой фольгой или крышкой, чтобы предотвратить загрязнение частицами пыли.
- Переложите решетки в инкубатор и запекайте их в инкубаторе при температуре 65 °C в течение 30 минут.
- Выньте решетки из инкубатора и оставьте их накрытыми на 5 минут при комнатной температуре, чтобы решетки остыли до комнатной температуры.
11. Удаление MMA и очистка решеток
ПРИМЕЧАНИЕ: MMA необходимо тщательно смыть ацетоном, чтобы предотвратить остаточное содержание MMA на сетках с графеновым покрытием.
- В вытяжном шкафу приготовьте две кристаллизующие чашки, содержащие 200 мл ацетона, и одну кристаллизационную чашку, содержащую 200 мл изопропанола (IPA) комнатной температуры. Накройте кристаллизующую посуду алюминиевой фольгой, чтобы свести к минимуму испарение органических растворителей.
ВНИМАНИЕ: Надевайте СИЗ при работе с ацетоном, так как он может вызвать раздражение кожи и может быть вреден при вдыхании. - Поместите основание зажимного блока держателя решетки TEM на дно первой кристаллизационной чашки, содержащей 200 мл свежего ацетона.
- Перенесите каждую сетку по отдельности с промокательной бумаги в углубление в блоке держателя сетки, убедившись, что сторона MMA обращена вверх. Накройте форму для кристаллизации фольгой, поместите ее на орбитальный шейкер и аккуратно встряхивайте в течение 30 минут.
- Поместите металлическую крышку на блок держателя решетки, который закрепит решетки во время переноса в следующую кристаллизационную чашку. Изогнутой вилкой и длинным пинцетом осторожно извлеките блок держателя решетки из чашки для кристаллизации и поместите его на дно второй кристаллизационной чашки, содержащей 200 мл свежего ацетона. Снимите крышку с блока держателя решетки и аккуратно встряхните на орбитальном шейкере в течение 30 минут.
- Накройте крышкой блок сетчатого держателя и переложите в кристаллизационную чашку, содержащую 200 мл раствора изопропилового спирта, чтобы удалить остатки ацетона. Снимите крышку с блока держателя решетки и аккуратно встряхивайте в течение 20 минут.
- Переложите сетки в небольшую стеклянную чашку Петри, покрытую промокательной бумагой, и высушите сетки на воздухе не менее 10 минут. Держите решетки накрытыми крышкой, чтобы предотвратить загрязнение частицами пыли.
- Сетки готовы к использованию или переносу в сетчатую коробку, обернутую алюминиевой фольгой внутри вакуумного эксикатора.
ПРИМЕЧАНИЕ: Хранение графеновых решеток внутри вакуумного эксикатора может предотвратить загрязнение гидрофобными частицами из условий окружающей среды. Эти решетки могут храниться до нескольких месяцев перед использованием27.
12. Сделайте графеновые сетки гидрофильными с помощью обработки УФ-озоном.
ПРИМЕЧАНИЕ: Графен чрезвычайно гидрофобен, что несовместимо с криоЭМ-пробоподготовкой, поскольку для блот-плунжерного подхода требуется гидрофильная поверхность, на которой капля образца может равномерно растекаться. В то время как традиционные тлеющие разрядные устройства могут быть сконфигурированы для мягкого импульсирования плазмы, чтобы сделать поверхность графена гидрофильной , эти устройства имеют тенденцию разрушать тонкий монослой графена. Ранее было показано, что УФ/озоновый очиститель может быть использован для частичного насыщения кислородом поверхности графена25, что делает его гидрофильным для подготовки криоЭМ-образцов без повреждения монослоя.
- Если вы используете УФ/озоновую систему, требующую грунтовки, включите систему и заправьте лампу на 10 минут (на этом этапе убедитесь, что решетки не открыты). Пока УФ/озоновый очиститель грунтуется, снимите решетки с вакуумного эксикатора и перенесите их на чистый покровный листок.
- Когда система УФ/озона будет готова, поместите защитное стекло с сетками графеновой стороной вверх в очиститель УФ/озона и подвергните решетки воздействию озонового газа на 4 минуты.
- После воздействия озона немедленно используйте решетки для подготовки криоЭМ-образцов.
ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании УФ/озоновой системы, требующей грунтовки, решетки должны быть помещены в очиститель сразу после того, как лампа будет заправлена в течение 10 минут, иначе он будет слишком холодным, чтобы произвести достаточное количество озона для насыщения графена кислородом для подготовки образца. Не подвергайте решетки воздействию озонового слоя более 6 минут, так как это разрушит слой графена.
Representative Results
Успешное выполнение описанного здесь протокола изготовления графеновой сетки приведет к созданию электромагнитных сеток, полностью покрытых одним монослоем графена. Графеновое покрытие сеток можно проверить с помощью любого ПЭМ. Поскольку монослой чистого графена практически незаметен в ПЭМ, необходимо исследовать его в дифракционном режиме микроскопа и наблюдать брэгговские пятна, соответствующие гексагональной организации атомов углерода, составляющих графен (рис. 3А). В норме изредка наблюдаются некоторые морщины монослойного графена, которые появляются при нанесении ММА-покрытия (рис. 3Б). Можно также проверить уровень загрязнения графена, получив изображение с большим увеличением в центре одного из покрытых графеном отверстий (рис. 3C). При получении с помощью детектора высокого разрешения преобразование Фурье этого изображения должно содержать брэгговские пятна, соответствующие расстоянию между углеродом и углеродом при 2,14 Å (рис. 4C). Монослой атомов углерода не производит достаточного рассеяния электронов для создания фазового контраста, и, таким образом, изображение чистого графена не будет представлять колец Тона, связанных с функцией переноса контраста в преобразовании Фурье изображения. Тем не менее, очень трудно предотвратить загрязнение графеновых сеток после их изготовления, а недостаточная промывка ЭМ-сеток или удаление ММА после графенового покрытия приведет к появлению заметных загрязнений на сетках, которые видны на изображениях в реальном пространстве (рис. 3C). Как показано на рисунке 4, графеновые сетки оказывают концентрирующее действие на образец, что наблюдается при сравнении 0,5 мг/мл апоферритина, нанесенного на дырчатые золотые сетки с (рис. 4A) и без графеновой основы (рис. 4B). Аналогичные протоколы изготовления графена были описаны ранее для решения криоЭМ-структур белков, таких как апоферритин, при высоком разрешении25,27.
Рисунок 1: Схема приготовления криоЭМ сеток с графеновым покрытием. Проиллюстрированы основные этапы процесса изготовления графеновой сетки. Сокращения: криоЭМ = криогенная электронная микроскопия; ММА = метилметакрилат; APS = персульфат аммония. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Необходимые материалы для изготовления графеновых сеток . (A) Необходимые материалы для нанесения покрытия на крио-ЭМ сетки маркируются соответствующим образом. (B) Крупный план установки для нанесения покрытий с листом графена/меди, приклеенным к промокательной бумаге на предметном стекле. Установку для нанесения покрытий методом центрифугирования можно собрать, купив детали в местном магазине компьютеров/оборудования. (C) Крупный план желоба для покрытия решеткой, прикрепленного к шприцу, который можно использовать для контроля уровня воды. Сетки кладутся поверх промокательной бумаги на сетку из нержавеющей стали. Промокательная бумага помогает маневрировать расположением сетки, чтобы графеновый лист мог быть подобран к ней. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Репрезентативное изображение дифракционной картины и изображения яркого поля графеновой сетки, показывающие морщины или загрязнение MMA . (A) ЭМ-сетки, покрытые монослоем графена, будут показывать брэгговские пики, соответствующие гексагональной решетке графена, при изображении в ПЭМ в дифракционном режиме. Пик Брэгга, соответствующий расстоянию углерод-углерод 2,14 Å, обведен кружком и обозначен стрелкой. (B) Светлопольное изображение монослойной графеновой сетки с некоторыми морщинами (обозначены стрелкой) в монослое графена. (C) Светлопольное изображение монослойного графена с загрязнением ММА (обозначено стрелкой). Масштабные линейки = 100 нм (B,C). Сокращения: ЭМ = электронная микроскопия; ММА = метилметакрилат. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Апоферритин на покрытых графеном золотых сетках: (A) КриоЭМ микрофотография 0,5 мг/мл апоферритина на покрытых графеном золотых сетках. (B) Апоферритин, визуализированный в той же концентрации, виден при значительно более низкой концентрации, когда он приготовлен с использованием дырявых золотых сеток без графена. (C) БПФ криоЭМ-микрофотографии апоферритина 0,5 мг/мл на покрытых графеном золотых сетках, с брэгговскими пиками, соответствующими гексагональной графеновой решетке. Масштабные линейки = 100 нм (A,B). Сокращения: криоЭМ = криогенная электронная микроскопия; БПФ = быстрое преобразование Фурье. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Discussion
Сохранение биологических образцов в тонком слое стекловидного льда является критически важным этапом для определения структуры криоЭМ с высоким разрешением. Тем не менее, исследователи часто сталкиваются с проблемами, возникающими при взаимодействии с AWI, что приводит к предпочтительной ориентации, сложной разборке, денатурации и агрегации. Кроме того, образцы не всегда могут быть достаточно концентрированы, чтобы заполнить тонкий лед, взвешенный в отверстиях фенестрированной пленки. Несколько исследовательских групп разработали методы покрытия электромагнитных сеток монослоем графена, чтобы помочь преодолеть некоторые из этих ограничений 24,25,26,27,28,29,30, и графеновые сетки были использованы с большим успехом. Здесь мы приводим пошаговые инструкции по эффективному приготовлению партий графеновых сеток на собственном предприятии и проверке качества графеновых сеток компанией TEM. Мы подчеркиваем, что особую осторожность следует проявлять во время некоторых критических шагов, которые мы опишем ниже.
Графен имеет сильную тенденцию притягивать загрязняющие вещества, переносимые по воздуху. Поэтому в процессе изготовления графеновой сетки важно убедиться, что все инструменты, контактирующие с листом графена/меди или сетками, чистые и без пыли. Стеклянные покровные стекла, используемые для переноса графена, можно очистить, промыв этанолом и дедиционной водой или используя воздушную тряпку. Также рекомендуется работать под вытяжным шкафом и всегда держать графеновые листы и решетки, накрытые фольгой или чистой стеклянной пластиной. Пыль или загрязняющие вещества на решетках могут препятствовать полному прилипанию графена к электромагнитным сеткам. При работе с графеновыми сетками или сетками с графеновым покрытием важно быть электрически заземленными, чтобы предотвратить повреждение графеновой пленки от статического разряда. Статического разряда можно избежать, используя заземляющий ремень на запястье, прикасаясь к заземленному металлическому предмету каждый раз при работе с графеном или графеновыми сетками и/или не надевая перчатку на руку, держащую пинцет24.
Поскольку монослой графена очень тонкий (ширина атома углерода), важно поддерживать графен органическим слоем, таким как MMA или poly-MMA (PMMA) во время переноса графена на сетки. ПММА является наиболее широко используемым материалом для переноса графена. Тем не менее, ПММА имеет сильное сродство с графеном и часто может привести к загрязнению полимера на графеновой пленке. В этом протоколе используется ММА, так как он оставляет меньше остаточных загрязнений25. Однако и ПММА, и ММА имеют недостаток, заключающийся в образовании морщин и трещин, которые могут наблюдаться на некоторых участках графеновой пленки (рис. 3B). Избежать этих морщин может быть непросто, поскольку они обычно возникают во время роста графена методом CVD31. Недавно был разработан метод выращивания ультраплоского графена без морщин, при котором медная фольга заменяется пластиной Cu(111)/сапфир в качестве субстратадля роста 32.
Исходя из нашего опыта, лучше приобрести листы графена/меди и поддерживать графен с помощью MMA на месте, чем покупать листы медного графена с полимерным покрытием у производителей, которые становятся хрупкими после травления меди и с ними трудно обращаться на последующих этапах. Установка для нанесения покрытий MMA, которую мы использовали для нанесения покрытия MMA, может быть дешево изготовлена из деталей из местного компьютерного/хозяйственного магазина, как описано ранее25.
На этапе нанесения покрытия MMA важно покрыть MMA всю поверхность графена на листе Cu-graphen. После того, как Cu будет вытравлен, ММА-графен станет полупрозрачным, а участки без покрытия ММА будут выглядеть как пустые дыры. Чтобы предотвратить покрытие MMA на медной стороне, важно подложить под нее небольшой кусочек промокательной бумаги во время нанесения покрытия, чтобы он впитал излишки MMA, которые вытекают из CVD-пленки.
После травления и промывки лист MMA/графена готов к переносу на электромагнитные решетки с помощью коммерческой или самодельной системы желобов со шприцем или перистальтическим насосом для контроля уровня воды. Перед этапом перекачки важно тщательно промыть решетки в последовательных ваннах с хлороформом, ацетоном и изопропиловым спиртом. Обжиг сеток с графеновым покрытием при 65 °C помогает сохранить целостность графена и способствует адсорбции графена сетками. Наконец, чтобы предотвратить загрязнение сеток MMA, важно тщательно удалить MMA в ацетоновой ванне и очистить решетки в IPA. Любые несмытые остатки ММА будут наблюдаться на электромагнитных сетках и уменьшать отношение сигнал/шум на изображениях (рис. 3C). Процесс промывки ацетоном-изопропиловым спиртом можно повторить для дальнейшей очистки графеновых поверхностей.
Чтобы сделать графеновые сетки гидрофильными, мы подвергли их воздействию ультрафиолета/озона. Различные модели УФ/озоновых очистителей могут потребовать оптимизации для достаточного насыщения кислородом графенового слоя для подготовки криоЭМ-образцов без повреждения графена. Независимо от системы, очень важно использовать эти решетки для нанесения криоЭМ-образца сразу после обработки УФ-озоном. Альтернативные методы придания графеновым сеткам гидрофильности описаны в других исследованиях33,34.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.
Acknowledgments
Мы благодарим д-ра Сяо Фаня (Xiao Fan) за полезные дискуссии при внедрении этих методов в Scripps Research. Бакалавр получил стипендию для постдокторских исследований от Фонда медицинских исследований Хьюитта. W.C. поддерживается стипендией Национального научного фонда. D.E.P поддерживается грантом Национальных институтов здравоохранения (NIH) NS095892 для G.C.L. Этот проект также был поддержан грантами NIH GM142196, GM143805 и S10OD032467 G.C.L.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70% EtOH | Pharmco (190 pf EtOH) | 241000190CSGL | |
| Acetone | Sigma Aldrich | 650501-4L | |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma Aldrich | 215589-500g | Hazardous; use extreme caution |
| Chloroform | Sigma Aldrich | C2432-1L | |
| Clamping TEM Grid Holder Block for 45 Grids | PELCO | 16830-45 | |
| Computer fan | Amazon (Noctua) | B07CG2PGY6 | |
| Cover slip | Bellco Glass | 1203J71 | Standard cover slips |
| Crystallizing dish | Pyrex | 3140-100 | |
| Electronics duster | Falcon Safety Products | 75-37-6 | |
| Falcon Dust-off Air Duster | Staples | N/A | |
| Filter papers | Whatman | 1001-055 | |
| Fine tip tweezer | Dumont | 0508-L4-PO | |
| Flask | Pyrex | 4980-500 | |
| Fork | Supermarket | N/A | |
| Glass pasteur pipette | VWR | 14672-608 | |
| Graphene/Cu | Graphenea | N/A | CVD monolayer graphene cu |
| Grid Coating Trough | Ladd Research Industries | 10840 | Fragile |
| Isopropanol | Fisher Scientific | 67-63-0 | |
| Kapton Tape | Amazon (MYJOR) | MY-RZY001 | Polyimide tape |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666 | |
| Long twzeer | Cole Parmer Essentials | UX-07387-15 | |
| Metal grid holder | Ted Pella | 16820-81 | |
| MMA(8.5)MMA EL 6 | KAYAKU Advanced Materials | M31006 0500L 1GL | Flammable |
| Model 10 Lab Oven | Quincy Lab, Inc. | FO19013 | |
| Petri dish | Pyrex | 3610-102 | |
| Plasma cleaner (Solarus 950) | Gatan, Inc. | N/A | |
| Scissors | Fiskars | 194813-1010 | |
| Standard Analog Orbital Shaker | VWR | 89032-088 | |
| UltrAuFoil R1.2/1.3 - Au300 | Quantifoil | N/A | Holey gold grids |
| Ultraviolet Ozone Cleaning Systems | UVOCS | model T10X10/OES |
References
- Li, X., Zheng, S. Q., Egami, K., Agard, D. A., Cheng, Y. Influence of electron dose rate on electron counting images recorded with the K2 camera. Journal of Structural Biology. 184 (2), 251-260 (2013).
- Tang, G., et al. EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).
- Zivanov, J., et al. New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3. eLife. 7, 1-22 (2018).
- Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. CryoSPARC: Algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
- Grigorieff, N., Harrison, S. C. Near-atomic resolution reconstructions of icosahedral viruses from electron cryo-microscopy. Current Opinion in Structural Biology. 21 (2), 265-273 (2011).
- Nakane, T., et al. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).
- Zhang, K., Pintilie, G. D., Li, S., Schmid, M. F., Chiu, W. Resolving individual atoms of protein complex by cryo-electron microscopy. Cell Research. 30 (12), 1136-1139 (2020).
- Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM. Nature. 587 (7832), 157-161 (2020).
- Schultz, P.
- Nguyen, H. P. M., McGuire, K. L., Cook, B. D., Herzik, M. A. Manual blot-and-plunge freezing of biological specimens for single-particle cryogenic electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. 2022 (180), 1-16 (2022).
- Glaeser, R. M. Proteins, interfaces, and cryo-em grids. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 25 (3), 289-313 (2016).
- Glaeser, R. M., Han, B. -G. Opinion: hazards faced by macromolecules when confined to thin aqueous films. Biophysics Reports. 3 (1-3), 1-7 (2017).
- Han, B. G., Watson, Z., Cate, J. H. D., Glaeser, R. M. Monolayer-crystal streptavidin support films provide an internal standard of cryo-EM image quality. Journal of Structural Biology. 200 (3), 307-313 (2017).
- Noble, A. J., et al. Routine single particle CryoEM sample and grid characterization by tomography. eLife. 7, 1-42 (2018).
- Drulyte, I., et al. Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 74 (6), 560-571 (2018).
- Liu, N., Wang, H. W. Better cryo-EM specimen preparation: how to deal with the air-water interface. Journal of Molecular Biology. 435 (9), 167926 (2022).
- Noble, A. J., et al. Reducing effects of particle adsorption to the air-water interface in cryo-EM. Nature Methods. 15 (10), 793-795 (2018).
- Palovcak, E., et al. A simple and robust procedure for preparing graphene-oxide cryo-EM grids. Journal of Structural Biology. 204 (1), 80-84 (2018).
- Patel, A., Toso, D., Litvak, A., Nogales, E. Efficient graphene oxide coating improves cryo-EM sample preparation and data collection from tilted grids. bioRxiv. , (2021).
- Marr, C. R., Benlekbir, S., Rubinstein, J. L. Fabrication of carbon films with ~500nm holes for cryo-EM with a direct detector device. Journal of Structural Biology. 185 (1), 42-47 (2014).
- Pantelic, R. S., Meyer, J. C., Kaiser, U., Baumeister, W., Plitzko, J. M. Graphene oxide: A substrate for optimizing preparations of frozen-hydrated samples. Journal of Structural Biology. 170 (1), 152-156 (2010).
- Pantelic, R. S., et al. Graphene: substrate preparation and introduction. Journal of Structural Biology. 174 (1), 234-238 (2011).
- Russo, C. J., Passmore, L. A. Progress towards an optimal specimen support for electron cryomicroscopy. Current Opinion in Structural Biology. 37, 81-89 (2016).
- Passmore, L. A., Russo, C. J. Specimen preparation for high-resolution cryo-EM. Methods in Enzymology. 579, 51-86 (2016).
- Han, Y., et al. High-yield monolayer graphene grids for near-atomic resolution cryoelectron microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (2), 1009-1014 (2020).
- Zheng, L., et al. Robust ultraclean atomically thin membranes for atomic-resolution electron microscopy. Nature Communications. 11 (1), 541 (2020).
- Ahn, E., Kim, B., Cho, U. -S. Batch production of high-quality graphene grids for cryo-EM: cryo-EM structure of Methylococcus capsulatus soluble methane monooxygenase hydroxylase. bioRxiv. (Cvd), (2021).
- Naydenova, K., Peet, M. J., Russo, C. J. Multifunctional graphene supports for electron cryomicroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (24), 11718-11724 (2019).
- Fan, H., Sun, F. Developing graphene grids for cryoelectron microscopy. Frontiers in Molecular Biosciences. 9, 937253 (2022).
- D'Imprima, E., et al. Protein denaturation at the air-water interface and how to prevent it. eLife. 8, e42747 (2019).
- Zhang, X., et al. Evolution of copper step beams during graphene growth by CVD method. Applied Surface Science. 610, 155518 (2023).
- Zheng, L., et al. Uniform thin ice on ultraflat graphene for high-resolution cryo-EM. Nature Methods. 20 (1), 123-130 (2023).
- Fujita, J., et al. Epoxidized graphene grid for highly efficient high-resolution cryoEM structural analysis. Scientific Reports. 13, 2279 (2023).
- Lu, Y., et al. Functionalized graphene grids with various charges for single-particle cryo-EM. Nature Communications. 13, 6718 (2022).
